"Procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe".
La présente invention a trait à la médecine et plus précisément à un procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe, que l'on peut utiliser pour le diagnostic de la grippe, l'étude de la structure antigénique des virus et l'obtention de vaccins.
On connaît un procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe (W.Lin, K.Oishi a Ko Aida "Agricultural and biological chemistry", 1975, 39, n[deg.]3, pages
759-765).
Ce procédé consiste à mettre le producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase en culture en milieu nutritif contenant des sources de carbone et d'azote, des sels minéraux, des stimulants de la croissance. Comme producteurs, on utilise des actinomycètes. Après la culture du producteur, on sépare le liquide de culture et on le traite par l'éthanol à plusieurs reprises. Le précipité obtenu est solubilisé dans un tampon phosphaté et dialysé dans un tampon phosphaté. La durée du procédé d'extraction et de purification de la substance est de 12 heures sans compter le temps nécessaire à l'obtention et à. l'identification de l'inhibiteur actif de la neuraminidase. Le rendement en produit final est de 33 mg par litre de liquide de culture. Le produit final obtenu assure l'inhibition de 80 % de la neuraminidase du virus de la grippe du type A2.
Le procédé mentionné est caractérisé par une longue durée du processus, une activité insuffisante et un rendement médiocre en inhibiteur de la neuraminidase.
Le problème posé dans la présente invention est celui de l'augmentation du rendement et de l'activité de l'inhibiteur de la neuraminidase obtenu ainsi que la diminution de la durée du procédé grâce à une modification du producteur et de la technologie de purification de la culture recherchée.
Ce problème se voit résolu par le fait que, dans un procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe par la mise en culture du producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase en milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, des sels minéraux et des stimulants de la croissance, la séparation du liquide de culture, son traitement par l'alcool éthylique avec extraction subséquente et purification du produit final, selon l'invention on utilise, comme producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase, un microorganisme du genre Staphylococcus aureus.
Le nouveau producteur du genre Staphylococcus utilisé dans le procédé selon l'invention possède une haute activité antineuraminidase.
Le procédé selon l'invention est simple, caractérisé par un bon rendement et une haute activité du produit final. L'inhibiteur de la neuraminidase des virus de la grippe obtenu assure à 100% l'inhibition de cette enzyme et est 10 fois plus actif que l'inhibiteur obtenu par le procédé connu. L'inhibiteur obtenu selon l'invention est résistant à la chaleur et ne subit aucun changement d'activité sous l'action des acides ou des bases.
L'inhibiteur obtenu selon l'invention augmente la reproduction des virus de la grippe, ce qui peut être utilisé pour l'accélération et l'augmentation de la précision du diagnostic, pour l'obtention rapide de vaccins contre les souches circulantes des virus de la grippe et d'un monovaccin destiné à la prévention de la grippe.
Dans le but de simplifier la technologie, il est avantageux d'effectuer la purification par la méthode de filtration sur gel. Le prccédé selon l'invention permet de diminuer la durée du processus d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase. Le procédé s'effectue de la façon suivante.
Comme producteur de l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe, on utilise n'importe quelle souche de Staphylococcus aureus. Le producteur est mis en culture en milieu nutritif contenant des sources de carbone, d'azote, des sels minéraux et des stimulants de la croissance. La souche d'origine de Staphylococcus aureus est mise en culture dans 5 ml de milieu nutritif pendant 24 heures pour l'accumulation de la culture d'ensemencement, puis dans 100 ml de milieu nutritif pendant 24 heures supplémentaires. La culture d'ensemencement obtenue est introduite dans le milieu nutritif de fermentation et mise en culture pendant 24 heures en mélangeant continuellement. Ensuite, on sépare le liquide de culture et on le soumet à l'action de l'alcool éthylique. On sépare le précipité obtenu et on enlève le liquide surnageant.
Le précipité est lavé à l'alcool éthylique, ensuite solubilisé dans un tampon phosphaté et de nouveau précipité par l'alcool éthylique. Le précipité obtenu est solubilisé, la solution réchauffée et le précipité obtenu enlevé.
Le produit final est obtenu à partir du liquide surnageant purifié par filtration sur gel au moyen de Séphadex et séchage subséquent par lyophilisation.
La durée de la séparation du produit final selon l'invention est de 5 jours. Le rendement en produit final est de 67 à 70 mg par litre de milieu de culture.
La substance obtenue est caractérisée par une haute activité inhibitrice, puisqu'une solution à 1% de cette substance assure l'inhibition de 90 à
100% de la neuraminidase des virus de la grippe de type A.
La haute activité de la substance ne diminue pas après une ébullition prolongée de 10 à
60 minutes et une incubation de 24 heures en milieu à un pH variant de 1,0 à 10,0.
Pour une meilleure compréhension de la présente invention, les exemples suivants non limitatifs illustrent la rélisation du procédé d'obtention de l'inhibiteur de la neuraminidase.
Exemple 1
La souche Staphylococcus aureus n[deg.] 392 du groupe phage IIIn de sérotype 18 selon Pillet est mise en culture sur un milieu neutritif de la composition suivante, en % en poids :
<EMI ID=1.1>
<EMI ID=2.1>
tampon phosphaté le complément à 100 pH du milieu : 7,2
Pour l'accumulation de la culture d'ensemencement, on met la souche d'origine en culture dans 5 ml du milieu nutritif de la composition sus-mentionnée pendant 1 jour, puis dans 100 ml pendant un jour supplémentaire. La culture s'effectue à une température de 37[deg.]C. La culture d'ensemencement obtenue est introduite dans 3 litres de milieu nutritif et est cultivée pendant 1 jour en mélangeant continuellement. Ensuite, on sépare le liquide de culture par centrifugation à
8000 tours à la minute pendant 15 minutes. Le liquide surnageant obtenu est précipité à l'aide d'alcool éthylique à la proportion de 1: 1,5, est maintenu à +4[deg.]C pendant 12 heures et est centrifugé pendant 15 minutes entre 6 et 8000 t/mn. On enlève le liquide surnageant. Le précipité est lavé à l'aide d'alcool éthylique à 60 % et solubilisé au moyen d'un tampon phosphaté de pH 7,2.
Ensuite on effectue de nouveau la précipitation à l'alcool éthylique à 60% à une proportion de 1:1,5 et on
<EMI ID=3.1>
Le précipité obtenu est de nouveau solubilisé dans un tampon phosphaté de pH 7,2, la solution est portée à 100[deg.]C pendant 10 minutes, centrifugée
15 minutes entre 6 et 8000 t/min, le précipité est enlevé. Le liquide surnageant est filtré sur gel dans une cclonne de 2,0 x 30,0 cm de Séphadex G200.
La substance éluée est séchée par lyophilisation jusqu'à obtention d'une masse poudreuse homogène sèche. Le rendement en produit final est de 67 mg par litre du volume initial du milieu de culture.
Le produit final obtenu a une masse moléculaire de 94000 à 12COOO, contient des protéines et des hydrocarbures en proportion de 1:10 et des acides gras comprenant de 11 à 20 atomes de carbone. La composition des protéines en acides aminés est la suivante : phénylalanine, thyrosine, isoleucine, leucine, méthionine, valine, alanine, glycine, proline, glu.ta.mine, sérine, thréonine, asparagine, histidine, lysine.
Les hydrocarbures de l'inhibiteur sont représentés par les monosaccharides mannose et glucose à la proportion de 24:1 et par deux hexosamines, galactosamine et glucosamine, en proportion de 1:3,5.
Le pic de densité optique de la substance obtenue se situe dans les longueurs d'onde de
210 nm.
Du point de vue composition chimique, la substance obtenue est un complexe gluco-lipoprotéinique analogue à l'inhibiteur de la neuraminidase du virus de la grippe.
La substance obtenue possède une activité inhibitrice sur la neuraminidase des virus de la grippe. Des essais en laboratoire de l'activité inhibitrice de la substance obtenue ont été effectués avec la neuraminidase des virus de la
<EMI ID=4.1>
solution aqueuse à 10% de la substance obtenue. Le mélange est incubé pendant 30 minutes dans un bain d'eau à une température de 37[deg.]C. A une émulsicn analogue de virus de la grippe témoin, on ajoute 0,2 ml de solution saline physiologique. On détermine l'activité de la neuraminidase des virus de la grippe dans tous les échantillons selon la méthode connue. Les essais ont été effectués en comparaison avec l'activité de l'inhibiteur obtenu par le procédé connu. Les résultats de ces essais sont présentés dans le tableau.
Exemple 2
Le procédé est conduit de la même manière que dans l'exemple 1. Comme souche productrice, on prend la souche de Staphylococcus aureus n[deg.] 1025. Le rendement en produit final est de 7C,3 mg par litre de milieu de culture. La substance obtenue est identique, par sa composition chimique, à celle décrite dans l'exemple 1.
L'essai de l'activité inhibitrice de la substance obtenue sur la neuraminidase des virus de
<EMI ID=5.1>
que dans l'exemple 1.
Les résultats de ces essais sont présentés dans le tableau.
Exemple 3
Le procédé est conduit de la même manière que dans l'exemple 1. On utilise la souche
<EMI ID=6.1>
produit final est de 66,7 mg par litre de milieu de culture. La substance obtenue est identique par sa composition chimique à celle décrite dans l'exemple
1. L'essai de l'activité inhibitrice de la substance obtenue s'effectue de manière analogue à celle de l'exemple 1.
Les résultats des essais sont présentés dans le tableau.
TABLEAU
Activité inhibitrice (en %) de la substance obtenue à partir de différentes souches de Staphylococcus aureus vis à vis de la neuraminidase des virus de la grippe A
<EMI ID=7.1>
"Method for obtaining the neuraminidase inhibitor of the influenza virus".
The present invention relates to medicine and more specifically to a process for obtaining the inhibitor of the neuraminidase of the influenza virus, which can be used for the diagnosis of influenza, the study of the antigenic structure. viruses and getting vaccines.
A method of obtaining the inhibitor of the neuraminidase of the influenza virus is known (W. Lin, K. Oishi a Ko Aida "Agricultural and biological chemistry", 1975, 39, n [deg.] 3, pages
759-765).
This process consists in placing the producer of the neuraminidase inhibitor in culture in a nutrient medium containing carbon and nitrogen sources, mineral salts, growth stimulants. Actinomycetes are used as producers. After cultivation of the producer, the culture liquid is separated and treated with ethanol several times. The precipitate obtained is dissolved in a phosphate buffer and dialyzed in a phosphate buffer. The duration of the process of extraction and purification of the substance is 12 hours without counting the time necessary to obtain and to. identification of the active neuraminidase inhibitor. The yield of final product is 33 mg per liter of culture liquid. The final product obtained ensures the inhibition of 80% of the neuraminidase of the influenza virus type A2.
The mentioned method is characterized by a long duration of the process, insufficient activity and a poor yield of neuraminidase inhibitor.
The problem posed in the present invention is that of increasing the yield and the activity of the neuraminidase inhibitor obtained as well as the reduction in the duration of the process thanks to a modification of the producer and of the purification technology of the desired culture.
This problem is solved by the fact that, in a process for obtaining the neuraminidase inhibitor of the influenza virus by culturing the producer of the neuraminidase inhibitor in a nutrient medium containing carbon sources , nitrogen, mineral salts and growth stimulants, the separation of the culture liquid, its treatment with ethyl alcohol with subsequent extraction and purification of the final product, according to the invention used, as producer of neuraminidase inhibitor, a microorganism of the genus Staphylococcus aureus.
The new producer of the genus Staphylococcus used in the process according to the invention has a high antineuraminidase activity.
The process according to the invention is simple, characterized by good yield and high activity of the final product. The influenza virus neuraminidase inhibitor obtained 100% inhibits this enzyme and is 10 times more active than the inhibitor obtained by the known method. The inhibitor obtained according to the invention is resistant to heat and undergoes no change in activity under the action of acids or bases.
The inhibitor obtained according to the invention increases the reproduction of influenza viruses, which can be used for accelerating and increasing the accuracy of the diagnosis, for rapid obtaining of vaccines against the circulating strains of influenza viruses. flu and a single vaccine for the prevention of influenza.
In order to simplify the technology, it is advantageous to carry out the purification by the gel filtration method. The method according to the invention makes it possible to reduce the duration of the process for obtaining the neuraminidase inhibitor. The process is carried out as follows.
As the producer of the influenza virus neuraminidase inhibitor, any strain of Staphylococcus aureus is used. The producer is cultivated in a nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen, mineral salts and growth stimulants. The original Staphylococcus aureus strain is cultured in 5 ml of nutrient medium for 24 hours for the accumulation of the seed culture, then in 100 ml of nutrient medium for an additional 24 hours. The seed culture obtained is introduced into the nutritive fermentation medium and cultured for 24 hours with continuous mixing. Then, the culture liquid is separated and subjected to the action of ethyl alcohol. The precipitate obtained is separated and the supernatant liquid is removed.
The precipitate is washed with ethyl alcohol, then dissolved in a phosphate buffer and again precipitated with ethyl alcohol. The precipitate obtained is dissolved, the solution reheated and the precipitate obtained removed.
The final product is obtained from the purified supernatant liquid by gel filtration using Sephadex and subsequent drying by lyophilization.
The duration of the separation of the final product according to the invention is 5 days. The yield of final product is 67 to 70 mg per liter of culture medium.
The substance obtained is characterized by a high inhibitory activity, since a 1% solution of this substance ensures inhibition from 90 to
100% neuraminidase from influenza A viruses.
The high activity of the substance does not decrease after a prolonged boiling from 10 to
60 minutes and a 24 hour incubation in a medium at a pH varying from 1.0 to 10.0.
For a better understanding of the present invention, the following nonlimiting examples illustrate the implementation of the process for obtaining the neuraminidase inhibitor.
Example 1
The Staphylococcus aureus n [deg.] 392 strain of the phage IIIn group of serotype 18 according to Pillet is cultured on a neutral medium of the following composition, in% by weight:
<EMI ID = 1.1>
<EMI ID = 2.1>
phosphate buffer the complement at 100 pH of the medium: 7.2
For the accumulation of the seed culture, the original strain is placed in culture in 5 ml of the nutrient medium of the composition mentioned above for 1 day, then in 100 ml for an additional day. The culture is carried out at a temperature of 37 [deg.] C. The seed culture obtained is introduced into 3 liters of nutritive medium and is cultivated for 1 day with continuous mixing. Then, the culture liquid is separated by centrifugation at
8000 revolutions per minute for 15 minutes. The supernatant obtained is precipitated using ethyl alcohol in the proportion of 1: 1.5, is kept at +4 [deg.] C for 12 hours and is centrifuged for 15 minutes at 6 to 8000 rpm . The supernatant liquid is removed. The precipitate is washed with 60% ethyl alcohol and dissolved using a phosphate buffer of pH 7.2.
Then the precipitation is carried out again with ethyl alcohol at 60% in a proportion of 1: 1.5 and
<EMI ID = 3.1>
The precipitate obtained is again dissolved in a phosphate buffer of pH 7.2, the solution is brought to 100 [deg.] C for 10 minutes, centrifuged
15 minutes between 6 and 8000 rpm, the precipitate is removed. The supernatant is filtered on a gel in a 2.0 x 30.0 cm column of Sephadex G200.
The eluted substance is dried by lyophilization until a dry homogeneous powdery mass is obtained. The yield of final product is 67 mg per liter of the initial volume of the culture medium.
The final product obtained has a molecular weight of 94,000 to 12,000, contains proteins and hydrocarbons in a proportion of 1:10 and fatty acids comprising from 11 to 20 carbon atoms. The amino acid protein composition is as follows: phenylalanine, thyrosine, isoleucine, leucine, methionine, valine, alanine, glycine, proline, glu.ta.mine, serine, threonine, asparagine, histidine, lysine.
The hydrocarbons of the inhibitor are represented by the monosaccharides mannose and glucose in the proportion of 24: 1 and by two hexosamines, galactosamine and glucosamine, in the proportion of 1: 3.5.
The peak of optical density of the substance obtained is located in the wavelengths of
210 nm.
From the chemical composition point of view, the substance obtained is a gluco-lipoprotein complex analogous to the neuraminidase inhibitor of the influenza virus.
The substance obtained has an inhibitory activity on the neuraminidase of influenza viruses. Laboratory tests for the inhibitory activity of the substance obtained were carried out with the neuraminidase of the viruses of
<EMI ID = 4.1>
10% aqueous solution of the substance obtained. The mixture is incubated for 30 minutes in a water bath at a temperature of 37 [deg.] C. 0.2 ml of physiological saline is added to an emulsion similar to the control influenza virus. Influenza virus neuraminidase activity is determined in all samples according to the known method. The tests were carried out in comparison with the activity of the inhibitor obtained by the known method. The results of these tests are presented in the table.
Example 2
The process is carried out in the same manner as in Example 1. As the producing strain, the Staphylococcus aureus n [deg.] 1025 strain is taken. The yield of final product is 7C, 3 mg per liter of culture medium. . The substance obtained is identical, by its chemical composition, to that described in Example 1.
The test for the inhibitory activity of the substance obtained on the neuraminidase of viral viruses
<EMI ID = 5.1>
as in example 1.
The results of these tests are presented in the table.
Example 3
The process is carried out in the same way as in Example 1. The strain is used
<EMI ID = 6.1>
final product is 66.7 mg per liter of culture medium. The substance obtained is identical in chemical composition to that described in the example
1. The test of the inhibitory activity of the substance obtained is carried out in a similar manner to that of Example 1.
The results of the tests are presented in the table.
BOARD
Inhibitory activity (in%) of the substance obtained from different strains of Staphylococcus aureus against the neuraminidase of influenza A viruses
<EMI ID = 7.1>