<EMI ID=1.1>
Cette invention concerne un nouveau micro-organisme et les
produits qu'il produit. Plus particulièrement, cette invention
concerne une nouvelle souche appartenant au genre Streptomyces,
un procédé de production de diverses procidines par utilisation
de ladite souche, et les nouvelles procidines obtenues par ledit procédé.
On a fait des études importantes sur les produits obtenu par
culture de micro-organismes en cherchant de nouveaux inhibiteurs
des protéases, et l'on a découvert qu'une nouvelle couche
appartenant au genre Streptomyces produit et accumule dans le
milieu de culture des substances pouvant inhiber de façon importante
les activités de la pepsine et de plusieurs protéases acides.
Par suite de diverses études, on a réussi à isoler sous forme des cristaux les inhibiteurs de protéase ainsi produits.
Le micro-organisme utilisé dans la présente invention est
une nouvelle souche que l'on a isolée du sol de Fukuzaki-cho,
préfecture de Hyogo, Japon, et il a été nommé Streptomvces
procidinanus. Le micro-organisme a été déposé au Fermentation
Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
Chiba, Japon , sous le numéro d'acceptation FERM-P N[deg.]3156. Il a
été également été déposé à la American Type Culture Collection,
le 29 juillet 1976 et a reçu le numéro ATCC N[deg.] 31233.
Dans ce qui suit, on décrit en détail les propriétés bactériologiques du micro-organisme de cette invention, appelé
ci-après "souche SC-4708". En ce qui concerne la description des couleurs, on se référa aux normes des couleurs du Japan Color Institute.
Propriétés bactériologiques de la souche SC-4708
I. Caractéristiques morphologiques
On examine au microscope la croissance du mycélium aérien légèrement ondulé, à partir du mycélium de base bien ramifié. Il
n'y a pas de formation de spirales et de boucles. La chaîne de
spores arrivée à maturité a dix spores ou plus, ayant une dimension
de 1,4 - 1,8 x 0,8 - 1,0 micron, avec une surface lisse.
II. Croissance sur divers milieux de culture :
(1) Gélose saccharose-nitrate (cultivée à 27[deg.]C) . croissance médiocre, incolore. Pas de mycélium aérien. Pas de pigment soluble.
(2) Gélose glycérol-asparagine (cultivée à 27[deg.]C) ; culture jaunâtre pâle. Mycélium aérien, gris brillant. Pigment soluble légèrement jaune pâle.
<EMI ID=2.1>
médiocre, culture jaune pâle ; mycélium aérien rare et blanc. Pigment soluble, légèrement jaune pâle.
(4) Gélose au glucose de Czapeck (cultivée à 27[deg.]C) : culture jaune rougeâtre pâle. Pas de mycélium aérien. Pigment légèrement jaune rougeâtre.
(5) Gélose d'amidon (cultivée à 27[deg.]C) : culture jaune pâle; mycélium aérien blanc. Pigment soluble légèrement jaune pâle.
(6) Gélose nutritive (cultivée à 27[deg.]C): croissance très faible, couleur incolore. Pas de mycélium aérien. Pas de pigment soluble.
(7) Gélose peptone-glucose (cultivée à 27[deg.]C): culture jaune rougeâtre terne. Mycélium aérien rare et blanc. Pigment soluble légèrement jaune rougeâtre terne.
(8) Gélose d'extrait;de Malte (cultivée à 27[deg.]C) : culture jaune grisâtre. Mycélium aérien blanc. Pigment soluble légèrement jaune grisâtre.
(9) Gélose de Tyrosine (cultivée à 27[deg.]C) . culture jaune pâle. Mycélium aérien très légèrement blanc. Pas de pigment soluble. Réaction négative à la tyrosinase.
(10) Gélose de malate de calcium (cultivée à 27[deg.]C) : croissance médiocre. Pas de mycélium aérien. Pas de pigment soluble. Le malate de calcium à la circonférence de la culture n'est pas dissous.
(11) Gélose de pomme de terre (cultivée à 27[deg.]C) : pas de croissance même au bout de 21 jours.
(12) Gélose de carotte (cultivée à 27[deg.]C) : pas de croissance même après 21 jours.
(13) Sérum de cheval (cultivé à 30[deg.]C) : pas de croissance même après 21 jours.
(14) Cellulose (cultivée à 25[deg.]C) : pas de croissance
même après 21 jours.
(15) Gélose de levure et de malt (cultivée à 27[deg.]C) : culture abondante rose jaunâtre à rose pâle. Mycélium aérien gris brillant.
Pas de pigment soluble.
(16) Gélose de farine d'avoine (cultivée à 27[deg.]C) : pas de croissance même après 21 jours.
(17) Oeuf (cultivé à 27[deg.]C) : pas de croissance même après
21 jours.
(18) Lait (cultivé à 37[deg.]C) : pas de croissance même après <EMI ID=3.1>
à jaune pâle. Mycélium aérien blanc. Pas de pigment soluble. Pas de liquéfaction importante de la gélatine.
<EMI ID=4.1>
même après 21 jours.
III. Caractéristiques physiologiques
(1) Intervalle de température de croissance :
<EMI ID=5.1>
et d'asparagine, montrent qu'il y a une croissance à chaque température sauf à 37[deg.]C. La température optimale de croissance semble
<EMI ID=6.1>
(2) Utilisation des sources de carbone (culture sur gélose de pridham-Gottrieb à 27[deg.]Ç) . bonne croissance avec utilisation du glucose et du galactose. Le xylose, l'arabinose, le rhamnose, le fructose, le saccharose., le maltose, le lactose, le raffinose, l'inuline, le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, l'inositol et la salicine ne sont pas utilisés.
Pour résumer les caractéristiques précédentes, la souche SC-4708 appartient du genre Streptomyces ; son mycélium aérien
ne forme ni boucle ni spirale, les spores ayant.une surface lisse ;
la souche a de manière spécifique une croissance médiocre sauf sur la gélose de levure et de malt , et la croissance est particulièrement mauvaise à 37[deg.]C ; en dépit de cette croissance médiocre, elle a une activité particulière dans l'hydrolisati,on de l'amidon ; elle appartient à un micro-organisme du type non chromogène avec une culture incolore, jaune pâle ou brun pâle, formation faible d'un mycélium aérien blanc ou gris brillant et difficulté de détecter un pigment soluble ; elle a une réaction négative à la liquéfaction de la gélatine, à la coagulation et. à la formation de peptone dans le lait débarrassé des matières grasses, à la dissolution du malate de calcium et à la réduction de nitrate. Si l'on recherche des micro-organismes connus ayant de telles caractéristiques, on ne trouve pas de souche similaire.
Mais on trouve que Streptomyces omiyaensis est une souche ayant des caractéristiques relativement similaires. On a comparé les caractéristiques de la souche SC-4708 avec la description de cette souche dans la littérature, (1) dans le "Manual of Determinative Bacteriology" de Bergey, 8ème édition, page 762-1964 et dans "The Actinomycetes", de Waksman, vol.2, page <EMI ID=7.1>
<EMI ID=8.1>
Comme on le voit dans le tableau précédent, la souche SC-4708 ressemble à Streptomyces omyaensis mais en diffère par la protéolyse et l'utilisation des sources de carbone, et en diffère en outre en ce qu'elle.ne produit pas de chloramphénicol; En conséquence, il convient de conclure que la souche 4708 est une nouvelle souche et on l'a donc appelée Streptomyces procidinanus.
Les actinomycètes en général sont susceptibles de subir des mutations de façon artificielle ou naturelle. Donc, Streptomyces procidinanu� selon cette invention comprend tous ses mutants.
Les nouvelles procidines que l'on peut obtenir selon le procédé de cette invention sont représentées par la formule générale:
<EMI ID=9.1>
<EMI ID=10.1>
<EMI ID=11.1>
<EMI ID=12.1>
i sopropyl méthyle, ladite prccidine existant sous forme d'un mélange
<EMI ID=13.1>
Pour être plus précis, la souche SC-4708 de cette invention produit et accumule les nouvelles procidines décrites ci-dessous, qui sont utiles dans la prévention des ulcères gastriques ou duodénaux :
<EMI ID=14.1>
<EMI ID=15.1>
<EMI ID=16.1>
un mélange de
<EMI ID=17.1>
<EMI ID=18.1>
S-346
<EMI ID=19.1>
en outre, la souche SC-4708 produit la procidine (S-735 A)
<EMI ID=20.1>
est donnée ci-dessous, qui est utile comme agent anti-ulcères gastriques ou duodénaux et son dérivé ester méthylique (S-735 M) que l'on retrouve dans le produit de la culture de cette souche, et on peut donc utiliser cette couche pour produire ces composés.
<EMI ID=21.1>
<EMI ID=22.1>
En conséquence, dans son aspect le plus large, la présente invention fournit un procédé de production d'au moins l'une des procidines de formule générale :
<EMI ID=23.1>
<EMI ID=24.1>
représentent un groupement propyle ou isopropylméthyle ; et R4 représente un atome d'hydrogène, un groupement carboxylique ou carboxylate de méthyle quand R et R sont tous deux un groupement
<EMI ID=25.1>
différents ou quand Ri et R2 sont tous deux un groupement isopropylméthyle, ladite procidine existant sous forme d'un mélange de
<EMI ID=26.1> <EMI ID=27.1>
Dans les dessins annexés, les figures 1, 3, 5, 7 et 9 représentent respectivement les spectres infrarouges des procidines S-735, S-114, S-346, S-735A et S-735 M ; et les figures 2, 4, 6,
8 et 10 représentent les spectres RMN des procidines S-735, . S-114, S-346, S-735 A et S-735 M.
Le milieu de culture utilisé dans la présente invention peut être liquide ou solide. Généralement cependant en utilisant un milieu liquide on peut effectuer une culture agitée ou une culture dans des conditions aérobies . On peut utiliser un quelconque milieu pour autant que le micro-organisme de la présente invention puisse s'y développer en accumulant la procidine dans le milieu.
Notamment, on peut y utiliser des sources de carbone comme le glucose, le lactose, la glycérine, l'amidon, le saccharose, la dextrine, les mélasses, les acides organiques , etc..., et des sources d'azote comme les produits de protéolyse, par exemple la peptone, le casamino-acide ou la N-Z-amine, l'extrait de viande, l'extrait de levure, les graines de soja, la liqueur de macération de mais . les amino-acides, les sels d'ammonium, les nitrates et d'autres composés azotés organiques ou minéraux. On trouve que l'addition de L-leucine au milieu est nécessaire pour la production de S-114 et S-346. La quantité de L-leucine ajoutée est de préfé-
<EMI ID=28.1>
sels minéraux, on peut ajouter divers phosphates, du sulfate de magnésium, du chlorure de sodium, etc... pour l'accélération de
la croissance du micro-organisme, on peut également ajouter des vitamines ou des composés apparentés aux acides nucléiques. Dans certains cas, l'addition d'un agent anti-moussant comme un silicone, des dérivés de propylèneglycol ou de l'huile de soja, peut également permettre d'augmenter la quantité de procidines accumulées dans le milieu.
Dans la mise en oeuvre de la culture, il est indiqué d'inoculer le milieu à l'aide d'un milieu d'ensemencement obtenu par une pré-incubation effectuée précédemment sur une petite échelle. On choisit et on règle de façon appropriée les conditions de culture comme la température et la durée de la culture, de façon à obtenir la quantité maximale de procidines accumulées. Dans de nombreux cas, on effectue la culture de préférence dans des conditions aérobies à 25[deg.]C, 35[deg.]C pendant 2 à 7 jours, à un pH compris entre 4 et 9,5.
Dans le produit ainsi cultive, des procidines se forment et <EMI ID=29.1>
s'accumulent. Quand on effectue la culture en utilisant un milieu liquide, le produit s'accumule principalement dans la partie liquide. En conséquence, on soumet d'abord le produit cultivé à
<EMI ID=30.1>
du micro-organisme, puis on sépare le produit du filtrat ou de la liqueur surnageante obtenue. Ou bien, on peut directement séparer le produit du milieu cultivé sans élimination des cellules du micro-organisme. On peut facilement effectuer la séparation et la purification du produit désiré à partir du produit cultivé, en combinant de façon variée des méthodes basées sur les propriétés chimiques des procidines.
Par exemple, on peut effectivement utiliser des procédés comme : la précipitation par addition d'un agent de précipitation comme le sulfate d'ammonium ; l'extraction par un solvant organique, comme le n-butanol, qui n'est pas facile- ment miscible avec l'eau mais qui peut dissoudre les procidines : la dissolution dans un solvant polaire comme l'éthanol ou le méthanol ; l'élimination des impuretés par traitement avec l'hexane, etc... ; la filtration sur gel de Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals); chromatographie d'échange d'ions avec divers échangeurs d'ions comme les résines échangeuses d'ions, la cellulose échangeuse d'ions, le Sephadex échangeur d'ions (pharmacia Fine Chemicals) ;
et la chromatographie d'adsorption avec des adsorbants comme le charbon activé, l'alumine, le gel de silice, l'amberlite SAD-1,2, etc... En outre, on peut disposer de façon appropriée d'autres procédés de purification basés sur les propriétés des procidines. Dans une combinaison appropriée de ces procédés, on peut isoler les procidines à partir du milieu cultivé, sous forme de cristaux.
<EMI ID=31.1>
S-735A et S-735-M, mesurées par chromatographie sur couche mince, dans divers systèmes de solvants. On utilise comme couche mince, 'une couche mince de gel de silice produite par Merck Co. (N[deg.] de
<EMI ID=32.1>
développement à la température ambiante.
<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
Notes) Système A : chloroforme-méthanol-acide acétique (92,5:6:1,<2>)
Système B : chloroforme-méthanol-acide acétique (86:12:2) Système C : butanol-acétate de butyle-acide acétique-eau
(10:20:1:1)
On effectue la mesure de l'activité d'inhibition de la pepsine selon le procédé suivant
à 1,9 ml d'un mélange réactionnel comprenant 1,0 ml d'une solution à 0,6% de caséine dans laquelle la caséine utilisée comme substrat (Wako Gunyaku Co., Japon) est dissoute dans une solution tampon 0,08 M en acide lactique (pH 2,2), 0,7 ml d'une solution tampon 0,02 N en chlorure de potassium et 0,02 N en acide chlorhydrique (pH 2,2) et 0,2 ml d'une solution échantillon contenant
<EMI ID=35.1>
(Sigma Chemical Company) à une concentration de 40pg/ml. Une fois la réaction effectuée à 37[deg.]C pendant 30 minutes, on l'arrête par
<EMI ID=36.1>
<EMI ID=37.1>
'pendant une heure supplémentaire puis on le centrifuge, et on mesure \ l'absorbance A de la liqueur surnageante résultante, à 280�m .
<EMI ID=38.1>
bance B d'un échantillon de référence préparé en utilisant seulement la solution tampon sans procidine. On calcule le degré d'inhibition i à partir de l'équation (B - A)/B x 100. La quantité de procidine
<EMI ID=39.1>
donnée dans le tableau 2 suivant :
TABLEAU 2
<EMI ID=40.1>
Pour expliquer en détail l'action anti-ulcère de la procidine type de la présente invention, à savoir S-735, on donne dans le tableau 2 l'effet de S-735 sur un ulcère gastrique provoqué par ligature du pylore (rat Shay).
TABLEAU 3
Action anti-ulcère de S-735
<EMI ID=41.1>
Notes) 1. Les rats utilisés sont des rats mâles Wister type HLA, d'un poids de 180 à 240 g.
2. Immédiatement après ligature du pylore, on administre S-735 par voie orale. Après 18 heures, on extrait l'estomac pour observer à l'oeil nu s'il y a ulcération. On évalue le degré d'ulcération avec six possibilités de 0 à 6.
La toxicité de S-735 est extrêmement faible et la DL50 pour
<EMI ID=42.1>
et 0,5 g/kg ou plus par injection intra-abdominale. Ainsi, les procidines de la présente invention ont une très faible toxicité
et ont cependant une très forte activité d'inhibition de la. pepsine.
Elles sont donc utiles comme médicament pour empêcher ou guérir
les ulcères gastriques et duodénaux dont on considère que la pepsine est l'une des causes.
La présente invention est décrite plus en détail en se référant aux exemples suivants qui ne sont pas considérés comme limitatifs de la présente invention mais qui sont donnés uniquement à titre i llustratif .
EXEMPLE 1
On inocule Streptomyces procidinanus dans un ballon de Sakaguchi d'une capacité de 500 ml, contenant 100 ml d'un milieu liquide stérilisé de pH 7,0 ayant la composition suivante
<EMI ID=43.1>
<EMI ID=44.1>
pendant 7 jours sous agitation de va-et-vient, pour obtenir 3,0 1 de bouillon de culture. On filtre ledit bouillon de culture et l'on traite le filtrat résultant deux fois avec 2,0 1 de n-butanol pour extraire les substances actives. On concentre l'extrait nbutanolique et l'on mélange le concentré obtenu avec 200 ml de méthanol pour l'y dissoudre. Puis on fait passer la solution sur une colonne de 100 ml de charbon activé. On recueille 500 ml d'éluat et on les concentre pour obtenir 1,8g de poudre jaune pâle. On place la poudre, après dissolution dans le méthanol et dépôt sur 2g de gel de silice, sur 150g de gel de silice que l'onaa introduit dans une colonne (diamètre 2,6 cm) et que l'on /équilibré avec un mélange de solvant comprenant du chloroforme, du méthanol et de l'acide acétique (92,5:6:1,2) puis on élue avec ledit mélangé de solvant.
On analyse par chromatographie sur couche mince l'éluat obtenu en fractions de 15g chacune. On trouve que S-735-M est élue dans les fractions 43 à 51, S-735 dans les fractions 53 à 67, et S-735-A dans les fractions 72 à 85. On recueille les fractions correspondantes, on les concentre et on les sèche, puis on recristallise deux fois dans le méthanol anhydre, et l'on obtient respectivement sous forme de fines aiguilles 20 mg de S-735-M,
18 mg de S-735 et 180 mg de S-735-A.
EXEMPLE 2
On inocule la souche Streptomyces procidinanus dans quatre flacons de Sakaguchi d'une capacité de 500 ml, contenant chacun
100 ml d'un milieu liquide stérilisé de pH 7,0 ayant la composition suivante :
<EMI ID=45.1>
<EMI ID=46.1>
On effectue la culture à 28[deg.]C pendant deux heures, sous une agitation en va-et-vient, et on obtient 400 ml d'un bouillon de culture. On tranfère le bouillon de culture dans deux réservoirs d'une capacité de 25 <1>, contenant chacun 121 du milieu liquide stérilisé précédent. Tout en ajoutant environ 100 ml de silicone dans chaque réservoir, on effectue la culture à 28[deg.]C pendant 72 heures, sous agitation avec aération. On filtre le bouillon de culture et on traite le filtrat résultant avec environ 151 de n-butanol pour extraire les substances actives. On concentre l'ex- trait n-butanolique. Après lavage du concentré avec 1 1 d'hexane, on ajoute 500 ml de méthanol pour dissoudre le produit concentré. On fait passer la solution sur une colonne de 300 ml de charbon activé et l'on recueille 1,51 d'éluat.
On concentre l'éluat pour obtenir 5,6g d'une poudre brun jaunâtre. Après dissolution de la poudre dans du méthanol et dépôt sur 3g de gel de silice, on dépose cette poudre sur 200g de gel de silice introduit dans une colonne d'un diamètre de 4,5 cm et équilibré avec un mélange de solvant comprenant du chloroforme, du méthanol et de l'acide acétique (92,5:6:1,2), et on élue avec ledit mélange de solvant. Quand on recueille l'éluat en fractions de 15g chacune, on trouve que S-735-M est élue dans les fractions N[deg.]93 à 101, S-735 dans les fractions 109 à 121 et S-735-A dans les fractions 125 à 134. On recueille les fractions correspondantes, on les concentre et on les
<EMI ID=47.1>
et l'on obtient respectivement sous forme d'aiguilles blanches l40mg de S-735-M, 160 mg de'S-735 et 1680mg de S-735-A.
EXEMPLE 3
(1) On inocule la couche Streptomyces procidinanus dans un flacon de Sakaguchi d'une capacité de 500ml, contenant 100 ml d'un milieu liquide stérilisé de pH 7,0, ayant la composition suivante :
<EMI ID=48.1>
<EMI ID=49.1>
On effectue la culture avec agitation à 28[deg.]C pendant 2 jours. On répartit ensuite le bouillon de culture, à raison de 10ml par portion dans 10 flacons de Sakaguchi d'une capacité de 2 1, contenant chacun 500 ml d'un milieu liquide stérilisé à pH 7,0, ayant la composition suivante :
<EMI ID=50.1>
On effectue la culture dans chaque flacon à 28[deg.]C pendant 7 jours, avec une agitation de va-et-vient, et l'on obtient 7,0 1 de bouillon de culture. On filtre le bouillon de culture et on fait passer le filtrat résultant sur une colonne de 3,3cm de diamètre dans lequel on a introduit 120g de charbon activé pour chromato-
<EMI ID=51.1>
concentre l'éluat obtenu avec du méthanol, sous pression réduite,
<EMI ID=52.1>
poudre brute dans du méthanol et on fait passer sur une colonne de 2,2 cm de diamètre dans laquelle on a introduit 40g de charbon active pour chromatographie, mouillé avec du méthanol. On concentx
<EMI ID=53.1>
l'on obtient 2,3g d'une poudre blanche.
(2) Après dissolution dans le méthanol et dépôt sur 3,0 g de
gel de silice, on place la poudre blanche ainsi obtenue sur 200 g de gel de silice introduits d'une colonne de 2,6 cm de diamètre et équilibrés avec un mélange de solvants, comprenant du chlorofoi
<EMI ID=54.1>
mélange de solvants. On analyse par chromatographie sur couche <EMI ID=55.1>
mince l'éluat obtenu en fractions de 20g chacune. On trouve que S-114 et S-345 sont élues dans les fractions 64 à 68. On recueille lesdites fractions et on les concentre sous pression réduite, et l'on obtient 1,4 g d'une poudre blanche. Après dissolution dans le méthanol et dépôt sur 2,0 g de gel de silice, on place les poudres sur 200 g de gel de silice introduits dans une colonne de 2,6 cm de diamètre et équilibrés avec un mélange de solvants comprenant du butanol, de l'acétate de butyle, de l'acide acétique et de l'eau
(10:20:1:1), et on élue avec ledit mélange de solvants.On analyse par chromatographie sur couche mince l'éluat obtenu en fractions de 15g chacune. On trouve que S-346 est élué dans les fractions
64 à 70 et S-114 dans les fractions 73 à 85. On recueille les fractions correspondantes, on les concentre et on les sèche. Après
<EMI ID=56.1>
solutions reposer dans un;.lieu refroidi, ce qui permet d'obtenir respectivement sous forme. d'aiguilles 178mg de S-346 et 303mg de S-114.
Les propriétés chimiques et physiques de diverses procidines obtenues selon le procédé de cette invention sont déterminées et l'on obtient les résultats donnés dans le tableau 4.
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
<EMI ID=60.1>
<EMI ID=61.1>
1. procidine de formule générale :
<EMI ID=62.1>
<EMI ID=63.1>
représentent un groupement isopropyle ou isopropylméthyle ; et
<EMI ID=64.1>
un groupement isopropyle, ou un groupement carboxylique quand
<EMI ID=65.1>
<EMI ID = 1.1>
This invention relates to a novel microorganism and the
products it produces. More particularly, this invention
concerns a new strain belonging to the genus Streptomyces,
a method of producing various procidins by use
of said strain, and the new procidins obtained by said process.
Significant studies have been made on the products obtained by
culture of microorganisms looking for new inhibitors
proteases, and it was discovered that a new layer
belonging to the genus Streptomyces produces and accumulates in the
culture medium for substances that can significantly inhibit
the activities of pepsin and several acid proteases.
As a result of various studies, it has been possible to isolate the protease inhibitors thus produced as crystals.
The microorganism used in the present invention is
a new strain that was isolated from the soil of Fukuzaki-cho,
Hyogo Prefecture, Japan, and it was named Streptomvces
procidinanus. The microorganism has been deposited in Fermentation
Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
Chiba, Japan, under the acceptance number FERM-P N [deg.] 3156. He has
has also been deposited in the American Type Culture Collection,
on July 29, 1976 and received ATCC number N [deg.] 31233.
In the following, the bacteriological properties of the microorganism of this invention, referred to as
hereinafter "strain SC-4708". As regards the description of the colors, reference is made to the color standards of the Japan Color Institute.
Bacteriological properties of strain SC-4708
I. Morphological characteristics
The growth of the slightly wavy aerial mycelium is examined under a microscope from the well branched base mycelium. he
there is no formation of spirals and loops. The chain of
mature spores has ten or more spores, having one dimension
1.4 - 1.8 x 0.8 - 1.0 micron, with a smooth surface.
II. Growth on various culture media:
(1) Sucrose-nitrate agar (cultured at 27 [deg.] C). poor growth, colorless. No aerial mycelium. No soluble pigment.
(2) Glycerol-Asparagine Agar (cultured at 27 [deg.] C); pale yellowish culture. Aerial mycelium, shiny gray. Slightly pale yellow soluble pigment.
<EMI ID = 2.1>
poor, pale yellow culture; rare, white aerial mycelium. Soluble pigment, slightly pale yellow.
(4) Czapeck glucose agar (cultured at 27 [deg.] C): pale reddish yellow culture. No aerial mycelium. Slightly reddish yellow pigment.
(5) Starch agar (cultured at 27 [deg.] C): pale yellow culture; white aerial mycelium. Slightly pale yellow soluble pigment.
(6) Nutrient agar (cultured at 27 [deg.] C): very weak growth, colorless in color. No aerial mycelium. No soluble pigment.
(7) Peptone-glucose agar (cultured at 27 [deg.] C): dull reddish yellow culture. Rare and white aerial mycelium. Slightly dull reddish yellow soluble pigment.
(8) Extract agar from Malta (cultured at 27 [deg.] C): greyish yellow culture. White aerial mycelium. Slightly greyish yellow soluble pigment.
(9) Tyrosine agar (cultured at 27 [deg.] C). pale yellow culture. Very slightly white aerial mycelium. No soluble pigment. Negative reaction to tyrosinase.
(10) Calcium malate agar (cultured at 27 [deg.] C): poor growth. No aerial mycelium. No soluble pigment. The calcium malate at the circumference of the culture is not dissolved.
(11) Potato agar (cultured at 27 [deg.] C): no growth even after 21 days.
(12) Carrot agar (cultured at 27 [deg.] C): no growth even after 21 days.
(13) Horse serum (cultured at 30 [deg.] C): no growth even after 21 days.
(14) Cellulose (cultured at 25 [deg.] C): no growth
even after 21 days.
(15) Yeast and malt agar (cultured at 27 [deg.] C): abundant yellowish pink to pale pink culture. Shiny gray aerial mycelium.
No soluble pigment.
(16) Oatmeal agar (cultured at 27 [deg.] C): no growth even after 21 days.
(17) Egg (cultured at 27 [deg.] C): no growth even after
21 days.
(18) Milk (cultured at 37 [deg.] C): no growth even after <EMI ID = 3.1>
to pale yellow. White aerial mycelium. No soluble pigment. No significant liquefaction of the gelatin.
<EMI ID = 4.1>
even after 21 days.
III. Physiological characteristics
(1) Growth temperature interval:
<EMI ID = 5.1>
and asparagine, show that there is growth at every temperature except 37 [deg.] C. The optimum temperature for growth appears
<EMI ID = 6.1>
(2) Use of carbon sources (culture on pridham-Gottrieb agar at 27 [deg.] Ç). good growth with the use of glucose and galactose. Xylose, arabinose, rhamnose, fructose, sucrose., Maltose, lactose, raffinose, inulin, mannitol, sorbitol, dulcitol, inositol and salicin are not used.
To summarize the preceding characteristics, strain SC-4708 belongs to the genus Streptomyces; its aerial mycelium
does not form a loop or spiral, the spores having a smooth surface;
the strain typically exhibits poor growth except on yeast and malt agar, and growth is particularly poor at 37 [deg.] C; despite this poor growth, it has a particular activity in the hydrolysis of starch; it belongs to a microorganism of the non-chromogenic type with a colorless, pale yellow or pale brown culture, weak formation of a white or shiny gray aerial mycelium and difficulty in detecting a soluble pigment; it has a negative reaction to gelatin liquefaction, coagulation and. the formation of peptone in fat-free milk, the dissolution of calcium malate and the reduction of nitrate. If one looks for known microorganisms having such characteristics, one does not find a similar strain.
But Streptomyces omiyaensis is found to be a strain with relatively similar characteristics. The characteristics of strain SC-4708 were compared with the description of this strain in the literature, (1) in the "Manual of Determinative Bacteriology" by Bergey, 8th edition, page 762-1964 and in "The Actinomycetes", by Waksman, vol.2, page <EMI ID = 7.1>
<EMI ID = 8.1>
As seen in the previous table, strain SC-4708 resembles Streptomyces omyaensis but differs in proteolysis and use of carbon sources, and further differs in that it does not produce chloramphenicol; Therefore, it should be concluded that strain 4708 is a new strain and therefore it was named Streptomyces procidinanus.
Actinomycetes in general are susceptible to mutations either artificially or naturally. So, Streptomyces procidinanu � according to this invention includes all of its mutants.
The novel procidins obtainable by the process of this invention are represented by the general formula:
<EMI ID = 9.1>
<EMI ID = 10.1>
<EMI ID = 11.1>
<EMI ID = 12.1>
i sopropyl methyl, said prccidin existing in the form of a mixture
<EMI ID = 13.1>
To be more specific, strain SC-4708 of this invention produces and accumulates the novel procidins described below, which are useful in the prevention of gastric or duodenal ulcers:
<EMI ID = 14.1>
<EMI ID = 15.1>
<EMI ID = 16.1>
a mix of
<EMI ID = 17.1>
<EMI ID = 18.1>
S-346
<EMI ID = 19.1>
in addition, strain SC-4708 produces procidin (S-735 A)
<EMI ID = 20.1>
is given below, which is useful as an anti-gastric or duodenal ulcer agent and its methyl ester derivative (S-735 M) which is found in the culture product of this strain, and therefore this layer can be used to produce these compounds.
<EMI ID = 21.1>
<EMI ID = 22.1>
Accordingly, in its broadest aspect, the present invention provides a process for the production of at least one of procidins of general formula:
<EMI ID = 23.1>
<EMI ID = 24.1>
represent a propyl or isopropylmethyl group; and R4 represents a hydrogen atom, a carboxylic group or methyl carboxylate when R and R are both a group
<EMI ID = 25.1>
different or when R1 and R2 are both an isopropylmethyl group, said procidin existing as a mixture of
<EMI ID = 26.1> <EMI ID = 27.1>
In the accompanying drawings, Figures 1, 3, 5, 7 and 9 respectively show the infrared spectra of procidins S-735, S-114, S-346, S-735A and S-735 M; and Figures 2, 4, 6,
8 and 10 represent the NMR spectra of procidins S-735,. S-114, S-346, S-735 A and S-735 M.
The culture medium used in the present invention can be liquid or solid. Generally, however, using a liquid medium one can carry out shaking cultivation or cultivation under aerobic conditions. Any medium can be used as long as the microorganism of the present invention can grow therein by accumulating procidin in the medium.
In particular, carbon sources such as glucose, lactose, glycerin, starch, sucrose, dextrin, molasses, organic acids, etc., and nitrogen sources such as proteolysis products, for example peptone, casamino acid or NZ-amine, meat extract, yeast extract, soybeans, corn maceration liquor. amino acids, ammonium salts, nitrates and other organic or inorganic nitrogen compounds. The addition of L-leucine to the medium is found to be necessary for the production of S-114 and S-346. The amount of L-leucine added is preferably
<EMI ID = 28.1>
mineral salts, various phosphates, magnesium sulfate, sodium chloride, etc. can be added to accelerate
growth of the microorganism, vitamins or nucleic acid related compounds can also be added. In some cases, the addition of an anti-foaming agent such as a silicone, propylene glycol derivatives or soybean oil, can also make it possible to increase the amount of procidins accumulated in the medium.
In carrying out the culture, it is advisable to inoculate the medium with the aid of a seeding medium obtained by a pre-incubation carried out previously on a small scale. Cultivation conditions such as temperature and duration of cultivation are suitably selected and regulated so as to obtain the maximum amount of accumulated procidins. In many cases, cultivation is preferably carried out under aerobic conditions at 25 [deg.] C, 35 [deg.] C for 2 to 7 days, at a pH between 4 and 9.5.
In the product thus cultivated, procidins are formed and <EMI ID = 29.1>
accumulate. When cultivation is carried out using a liquid medium, the product mainly accumulates in the liquid part. Consequently, the cultivated product is first subjected to
<EMI ID = 30.1>
of the microorganism, then the product is separated from the filtrate or the supernatant liquor obtained. Or, the product can be separated directly from the cultured medium without removing the cells of the microorganism. The separation and purification of the desired product from the cultivated product can easily be effected by a variety of combinations of methods based on the chemical properties of procidins.
For example, methods such as: precipitation by addition of a precipitating agent such as ammonium sulfate can effectively be used; extraction with an organic solvent, such as n-butanol, which is not easily miscible with water but which can dissolve procidins: dissolution in a polar solvent such as ethanol or methanol; removal of impurities by treatment with hexane, etc ...; Sephadex gel filtration (Pharmacia Fine Chemicals); ion exchange chromatography with various ion exchangers such as ion exchange resins, ion exchange cellulose, ion exchange Sephadex (pharmacia Fine Chemicals);
and adsorption chromatography with adsorbents such as activated carbon, alumina, silica gel, amberlite SAD-1,2, etc. Further, other methods of determination can suitably be provided. purification based on the properties of procidins. In a suitable combination of these methods, the procidins can be isolated from the cultured medium as crystals.
<EMI ID = 31.1>
S-735A and S-735-M, measured by thin layer chromatography, in various solvent systems. A thin layer of silica gel produced by Merck Co. (N [deg.] Of
<EMI ID = 32.1>
development at room temperature.
<EMI ID = 33.1>
<EMI ID = 34.1>
Notes) System A: chloroform-methanol-acetic acid (92.5: 6: 1, <2>)
System B: chloroform-methanol-acetic acid (86: 12: 2) System C: butanol-butyl acetate-acetic acid-water
(10: 20: 1: 1)
The measurement of the inhibitory activity of pepsin is carried out according to the following method
to 1.9 ml of a reaction mixture comprising 1.0 ml of a 0.6% solution of casein in which the casein used as a substrate (Wako Gunyaku Co., Japan) is dissolved in a buffer solution 0.08 M in lactic acid (pH 2.2), 0.7 ml of a 0.02 N buffer solution in potassium chloride and 0.02 N in hydrochloric acid (pH 2.2) and 0.2 ml of a sample solution containing
<EMI ID = 35.1>
(Sigma Chemical Company) at a concentration of 40 µg / ml. Once the reaction has been carried out at 37 [deg.] C for 30 minutes, it is stopped by
<EMI ID = 36.1>
<EMI ID = 37.1>
for an additional hour and then centrifuged, and the absorbance A of the resulting supernatant liquor was measured at 280 µm.
<EMI ID = 38.1>
Bance B of a reference sample prepared using only the buffer solution without procidin. The degree of inhibition i is calculated from the equation (B - A) / B x 100. The amount of procidin
<EMI ID = 39.1>
given in table 2 below:
TABLE 2
<EMI ID = 40.1>
In order to explain in detail the anti-ulcer action of the typical procidin of the present invention, namely S-735, the effect of S-735 on a gastric ulcer caused by pyloric ligation (rat Shay ).
TABLE 3
Anti-ulcer action of S-735
<EMI ID = 41.1>
Notes) 1. The rats used are male HLA type Wister rats, weighing 180 to 240 g.
2. Immediately after pyloric ligation, S-735 is administered orally. After 18 hours, the stomach is extracted to observe with the naked eye if there is ulceration. The degree of ulceration is evaluated with six possibilities from 0 to 6.
The toxicity of S-735 is extremely low and the LD50 for
<EMI ID = 42.1>
and 0.5 g / kg or more by intra-abdominal injection. Thus, the procidins of the present invention have very low toxicity.
and yet have a very strong inhibitory activity. pepsin.
They are therefore useful as a medicine to prevent or cure
gastric and duodenal ulcers of which pepsin is considered to be one of the causes.
The present invention is described in more detail with reference to the following examples which are not considered as limiting of the present invention but which are given only by way of illustration.
EXAMPLE 1
Streptomyces procidinanus is inoculated into a Sakaguchi flask with a capacity of 500 ml, containing 100 ml of a sterilized liquid medium of pH 7.0 having the following composition
<EMI ID = 43.1>
<EMI ID = 44.1>
for 7 days with reciprocating stirring, to obtain 3.0 l of culture broth. Said culture broth is filtered and the resulting filtrate is treated twice with 2.0 L of n-butanol to extract the active substances. The nbutanol extract is concentrated and the resulting concentrate is mixed with 200 ml of methanol to dissolve it therein. Then the solution is passed through a column of 100 ml of activated charcoal. 500 ml of eluate are collected and concentrated to obtain 1.8 g of pale yellow powder. The powder is placed, after dissolving in methanol and depositing on 2 g of silica gel, on 150 g of silica gel which the ona has introduced into a column (diameter 2.6 cm) and which is / equilibrated with a mixture of solvent comprising chloroform, methanol and acetic acid (92.5: 6: 1.2) then elution is carried out with said mixture of solvent.
The eluate obtained in fractions of 15 g each is analyzed by thin layer chromatography. It is found that S-735-M elutes in fractions 43 to 51, S-735 in fractions 53 to 67, and S-735-A in fractions 72 to 85. The corresponding fractions are collected, concentrated and they are dried, then recrystallized twice from anhydrous methanol, and 20 mg of S-735-M are obtained respectively in the form of fine needles,
18 mg of S-735 and 180 mg of S-735-A.
EXAMPLE 2
The Streptomyces procidinanus strain is inoculated into four vials of Sakaguchi with a capacity of 500 ml, each containing
100 ml of a sterilized liquid medium of pH 7.0 having the following composition:
<EMI ID = 45.1>
<EMI ID = 46.1>
Cultivation was carried out at 28 ° C. for two hours, with reciprocal stirring, and 400 ml of a culture broth were obtained. The culture broth is transferred to two reservoirs with a capacity of 25 <1>, each containing 121 of the previous sterilized liquid medium. While adding about 100 ml of silicone to each tank, cultivation is carried out at 28 ° C. for 72 hours, with stirring with aeration. The culture broth is filtered and the resulting filtrate is treated with about 151 n-butanol to extract the active substances. The n-butanol extract is concentrated. After washing the concentrate with 1 L of hexane, 500 ml of methanol are added to dissolve the concentrated product. The solution is passed through a column of 300 ml of activated charcoal and 1.51 of eluate is collected.
The eluate is concentrated to obtain 5.6 g of a yellowish-brown powder. After dissolving the powder in methanol and depositing on 3 g of silica gel, this powder is deposited on 200 g of silica gel introduced into a column with a diameter of 4.5 cm and equilibrated with a mixture of solvent comprising chloroform , methanol and acetic acid (92.5: 6: 1.2), and elution is carried out with said solvent mixture. When the eluate is collected in fractions of 15g each, it is found that S-735-M is eluted in fractions N [deg.] 93 to 101, S-735 in fractions 109 to 121 and S-735-A in fractions 125 to 134. The corresponding fractions are collected, concentrated and
<EMI ID = 47.1>
and one obtains respectively in the form of white needles 140 mg of S-735-M, 160 mg of'S-735 and 1680 mg of S-735-A.
EXAMPLE 3
(1) The Streptomyces procidinanus layer is inoculated in a Sakaguchi vial with a capacity of 500 ml, containing 100 ml of a sterilized liquid medium of pH 7.0, having the following composition:
<EMI ID = 48.1>
<EMI ID = 49.1>
Cultivation is carried out with stirring at 28 deg. C for 2 days. The culture broth is then distributed at a rate of 10 ml per portion in 10 flasks of Sakaguchi with a capacity of 2 L, each containing 500 ml of a liquid medium sterilized at pH 7.0, having the following composition:
<EMI ID = 50.1>
Cultivation in each flask was carried out at 28 ° C. for 7 days, with reciprocating stirring, and 7.0 L of culture broth was obtained. The culture broth is filtered and the resulting filtrate is passed through a column 3.3 cm in diameter into which 120 g of activated charcoal has been introduced for chromatography.
<EMI ID = 51.1>
concentrates the eluate obtained with methanol, under reduced pressure,
<EMI ID = 52.1>
crude powder in methanol and passed through a column 2.2 cm in diameter into which was introduced 40 g of activated carbon for chromatography, wetted with methanol. We concentx
<EMI ID = 53.1>
2.3 g of a white powder are obtained.
(2) After dissolution in methanol and deposit on 3.0 g of
silica gel, the white powder thus obtained is placed on 200 g of silica gel introduced from a column 2.6 cm in diameter and equilibrated with a mixture of solvents, comprising chlorofoi
<EMI ID = 54.1>
mixture of solvents. Analyzed by layer chromatography <EMI ID = 55.1>
thin the eluate obtained in fractions of 20 g each. It was found that S-114 and S-345 eluted in fractions 64-68. Said fractions were collected and concentrated under reduced pressure, to give 1.4 g of a white powder. After dissolution in methanol and depositing on 2.0 g of silica gel, the powders are placed on 200 g of silica gel introduced into a column 2.6 cm in diameter and equilibrated with a mixture of solvents comprising butanol, butyl acetate, acetic acid and water
(10: 20: 1: 1), and eluting with said mixture of solvents. The eluate obtained is analyzed by thin layer chromatography in fractions of 15 g each. S-346 is found to elute in fractions
64-70 and S-114 in fractions 73-85. The corresponding fractions are collected, concentrated and dried. After
<EMI ID = 56.1>
solutions stand in a; .cooled place, which allows to obtain respectively form. needles 178mg of S-346 and 303mg of S-114.
The chemical and physical properties of various procidins obtained according to the process of this invention were determined and the results given in Table 4 were obtained.
<EMI ID = 57.1>
<EMI ID = 58.1>
<EMI ID = 59.1>
<EMI ID = 60.1>
<EMI ID = 61.1>
1.procidin of general formula:
<EMI ID = 62.1>
<EMI ID = 63.1>
represent an isopropyl or isopropylmethyl group; and
<EMI ID = 64.1>
an isopropyl group, or a carboxylic group when
<EMI ID = 65.1>