<EMI ID=1.1>
La présente invention concerne des nouveaux antibiotiques anti-tumeurs de type glycoside d'anthracycline, leur
production et leur récupération, ainsi que leur utilisation thérapeutique. Plus particulièrement, l'invention concerne
des nouvelles substances antibiotiques anti-tumeurs désignées
<EMI ID=2.1>
procédés pour leur préparation par fermentation de souches
<EMI ID=3.1>
récupération et leur purification, et leur application comme
agents chimiothérapoutiques pour l'inhibition de la croissance des tumeurs malignes et pour le traitement de maladies infectieuses provoquées par les bactéries Gram-positives-
Divers types de glycosides d'anthracycline ont été
trouvés dans le bouillon de culture de micro-organismes,
et ils ont été décrits dans la littérature. Parmi ceux-ci, <EMI ID=4.1>
nain cliniques de grand intérêt se portant sur la chimiothérapie du cancer.
Grâce à des cultures sélectionnées de streptomyces pour des métabolites ayant une activité anti-tumeur, les auteurs de la présente invention ont découvert des nouveaux composés et après purification et carastérisatioa basée sur leurs propriétés physico-chimiques, il s'est confirmé que les antibio-
<EMI ID=5.1>
Les antibiotiques d'anthracycline ayant un groupe aklavinone aglycone sont décrits dans les références suivantes.
(a) aclacinomycine A et B dans le bravât des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3.988.315 et par Oki et al. dans J. Antibiotica
28:830 (1975). (b) Aklavine dans J. Bacteriol. 72:90 (1956).
<EMI ID=6.1>
pyrromycinone aglycone sont décrits dans les références suivantes.
<EMI ID=7.1>
crits dans les références suivantes.
(f) Nogalamycine dans J. Amer. Chem. Soc. 99:542 (1977).
<EMI ID=8.1>
brevet de la R.F.A. n[deg.] 2.362.707 et dans J. Amer. Chem. Soc.
97:5955 (1975).
<EMI ID=9.1>
Abst. 67:90573z (1967).
Pour une illustration complémentaire et des descriptions sommaires des antibiotiques d'anthracycline, voir comme
<EMI ID=10.1>
Collège, Pensylvanie, E.U.A. (1967) :
<EMI ID=11.1>
<EMI ID=12.1> <EMI ID=13.1>
anthracyclines et leurs dérivés.
La présente invention concerne des nouveaux antibiotiques de type glycoside d'anthracycline, des procédés pour leur préparation, des compositions pharmaceutiques les contenant et l'utilisation de ces antibiotiques ou compositions dans le traitement des infections bactériennes et dans l'inhi. bition.. des tumeurs chez les mammifères. Plus Particulièrement,
<EMI ID=14.1>
chélation avec des ions métalliques et modes opératoires standards de chromatographie sur colonne.
<EMI ID=15.1> solides purifiés, de leurs sels et de leurs complexes DMA, ainsi que le procédé de préparation des composés ci-desaus
<EMI ID=16.1> lyophiliséa après addition d'au moins une substance choisie parai le groupe consistant en acide déoxyribonucléique, glycérol, sucres, amino acides et acides inorganiques ou organiques.
La présente invention fournit donc les antibiotiques
<EMI ID=17.1>
qui <EMI ID=18.1> téries gras-positives ;
(b) sont efficaces pour l'inhibition de la croissance des <EMI ID=19.1>
rouge, a un point de fusion de 152 à 156*C.; est un glycoside d'anthracyclina faiblement basiqua;
<EMI ID=20.1>
<EMI ID=21.1>
romycinona, ayant la formule empirique 36 il 45-
014 NI
<EMI ID=22.1>
<EMI ID=23.1>
Fig. 1 présente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet et la lumière visible du MA144-G1 dans du méthanol <EMI ID=24.1> Fig. 2 présente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet et la lumière visible du MA144-G2 dans du méthanol <EMI ID=25.1> <EMI ID=26.1> <EMI ID=27.1> <EMI ID=28.1> Fig. 7 présente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet <EMI ID=29.1>
<EMI ID=30.1> Fig. 8 présente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet et la lumière visible du MA144-U2 dans du méthanol à <EMI ID=31.1> Fig. 9 présente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet et la lumière visible du MA144-T dans du méthanol à <EMI ID=32.1> <EMI ID=33.1> <EMI ID=34.1> lièrement, les composés de la présente invention présentent une activité vis-à-vis des bactéries gram-positives) inhibent la croissance de diverses tumeurs chez les mammifères comme
<EMI ID=35.1>
faible toxicité. Par conséquent, les composés de la présente invention sont utilisables comme agents antibactériens et anti-tumeurs. Les termes" composants MA144 " utilisés ici désignent un antibiotique comprenant, au moins un composé chois:
<EMI ID=36.1>
Ces composés sont produits en cultivant une souche de streptomyces produisant le MAI44 dans une solution aqueuse de carbohydrate contenant des agents nutritifs organiques azotés sous des conditions d'immersion aérobique, ou par réduction chimique et hydrolyse de glycosides d'anthracycline connus et particuliers, ou par conversion enzymatique de glycoside d'anthracycline connus et particuliers. Les composée dans les
<EMI ID=37.1>
et enzymatiques ainsi produits peuvent être extraits et purifiés par des procédés conventionnels utilisés pour l'extraction et la purification d'antibiotiques insolubles dans l'eau.
<EMI ID=38.1>
de solides bruts, de solides purifiés, de leurs sels et de
<EMI ID=39.1>
La production des composés de la présente invention est effectuée par un procédé de fermentation, et plusieurs
<EMI ID=40.1>
Pour la production par fermentation des composés suivant la présente invention, on peut utiliser les souches pro-
<EMI ID=41.1>
ATCC 31273 et leurs mutants.
La production de tous les composés de la présente invention est effectuée en cultivant les souches de straptomyces mentionnées ci-dessus dans un milieu aqueux nutritif conventionnel des sources nutritives connues pour les actinomycetes, c.-à-d. des sources de carbone, d'azote et de sels inorganiques. Une culture aérobique immergée est de préférence utilisée pour la production de quantités substantielles
<EMI ID=42.1>
tiques. Les modes opératoires généralement utilisés pour la culture des autres actinomycetes sont applicables à la cul- <EMI ID=43.1>
ses, etc., à l'état brut ou purifié, et des sources d'azote commercialement disponibles comme poudre de soya, extrait
<EMI ID=44.1>
extrait de céréales ou des sels inorganiques comme sulfate d'ammonium, nitrate de sodium ou chlorure d'ammonium. Comme sels inorganiques, on utilise de préférence le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, ou des phosphates et on peut aussi ajouter, si nécessaire, des ions métalliques an traces et des agents anti-mousse comme l'Adekanol (marque déposée, Asahi Denka Ind. Co.) ou du silicone (marque dope-
<EMI ID=45.1>
la gamme d'environ 6 à 9. La production des composants MA144 dans le bouillon de culture atteint un maximum après 2 à 7
<EMI ID=46.1>
tion aérobique immergée avec aération et agitation effectués comme dans les exemples donnés ci-dessous.
<EMI ID=47.1>
MA144-M2, MA144-N1, MA144-G1, MA144-G2, MA144-U1, MA144-U2, MA144-Y ou un de leurs mélanges, sont chimiquement convertis en MA144-S1, -S2, -NI ou un de leurs mélanges. Les substances de départ peuvent être utilisées sous forme purifiée, comme
<EMI ID=48.1>
substances contenant les composés de type anthracycline comme bouillons de fermentation ou extraits bruts provenant da ses bouillons.
La conversion chimique peut être plus aisément comprise par la lecture du schéma réactionnel suivant
<EMI ID=49.1>
<EMI ID=50.1>
<EMI ID=51.1>
parte etc. et on choisit de préférence des conditions permettant d'obtenir un rendement et une vitesse de réaction les plus élevée possible- <EMI ID=52.1> stances de départ peuvent âtre utilisées sous forme purifiée, comme des sels, ou sous une forme impure, par exemple sous forme de substances contenant les substrats de type anthracycline comme bouillons de fermentation ou extraits bruts provenant de ces bouillons.
La conversion enzymatique peut être plus' aisément comprise par la lecture du schéma réactionnel suivant
<EMI ID=53.1>
<EMI ID=54.1>
A par le système enzymatique qui est obtenu à partir de mammifères et de microorganismes. Le système enzymatique utilisé
<EMI ID=55.1>
et provenant de tissus de mammifères, par exemple tissus provenant de singes, de chiens, de lapins, de hamsters, de rats
<EMI ID=56.1>
organismes, les souches appartenant aux streptomyces peuvent être utilisées sous forme de bouillon de culture, de suspension de cellules, de cellules sèches, d'un homogénat de cellules, d'enzyme partiellement purifié et d'enzyme immobilisé
<EMI ID=57.1>
tiqua telles que pH, température, concentration du substrat, duréa de la réaction, co-enzyme, etc., dépendent de l'état de l'enzyme, de la substance de départ utilisée, etc. En gé-
<EMI ID=58.1>
lèrent la réaction enzymatique et qui n'inactivent pas le système enzymatique. En général, il est préférable d'utiliser
<EMI ID=59.1>
<EMI ID=60.1>
solution avec liquide surnageant, d'enzyme partiellement ou totalement purifié et d'enzyme immobilisé obtenu à partir de ces apurées.
Les conditions de la réaction enzymatique comme pH, température, concentration du substrat, durée de la réaction, etc.,dépendent de l'état de l'enzyme,, de la substance de départ utilisée, etc. En général, il est préférable de choisir des conditions qui accélèrent la réaction enzymatique et qui n'inhibent pas la réaction enzymatique. En général, il convient d'utiliser une température comprise entre 20 et 50*Ce, un pH de 4,0 à 9,0, une concontration du substrat inférieure à 5 % et une durée de réaction de 10 minutes à 5 heures selon la quantité d'oxygène dissous. La réaction enzymatique deman-
<EMI ID=61.1>
L'activité enzymatique de divers streptomyces utilisés dans la présente invention est donnée ci-dessous.
<EMI ID=62.1>
<EMI ID=63.1>
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1>
<EMI ID=66.1>
par minute.
Pour la purification de l'enzyme provenant des 7 sou-
<EMI ID=67.1>
des procédés conventionnels de purification d'enzyme. Par exemple, la préparation enzymatique purifiée homogénéisée par électrophorèse peut être obtenue à partir du filtrat de culture par précipitation à partir d'une solution de sulfate
<EMI ID=68.1>
dex G-75. Les propriétés générales de l'enzyme purifié obtenu <EMI ID=69.1>
les suivantes.
<EMI ID=70.1>
<EMI ID=71.1>
lon peut être filtré et le filtrat peut ensuite être extrait avec un solvant organique non miscible dans l'eau comas chlo-
<EMI ID=72.1>
etc., dans un état neutre à faiblement acide Les composants MA144 dans le mycélium peuvent être récupérés par extraction avec un solvant organique comme chloroforme, acétone, n-butanol, méthanol, éthanol, acétate d'éthyle ou une
<EMI ID=73.1>
ment à partir du bouillon de culture par les modes opératoires d'extraction mentionnés ci-dessus, sans séparation préa-lable du mycélium. Après concentration sous vide, les extraits de MAI 44 peuvent être de nouveau extraits avec un solvant organique non miscible dans l'eau à un pH compris entre 6 et 9 et après concentration sous pression réduite les concentrais
<EMI ID=74.1>
dessus, les composants MA144- peuvent être obtenus sous une forme purifiée. Au lieu d'utiliser un procédé de récupération par extraction avec un solvant pour- récupérer le MA144 du bouillon de culture, on peut employer, seul ou en combinaison avec le procédé d'extraction avec un solvant, une chro-
<EMI ID=75.1>
carbone actif, de l'alumine, de l'acide silicique, ou du dextrane modifié comme celui qui est commercialement disponible
<EMI ID=76.1>
matographie sur liquide en utilisant des solvants organiques appropriés. Les extraies actifs obtenus par ces procédés sont concentrés sous pression réduite et obtenus sous forage de
<EMI ID=77.1>
Les composants MA144 dans les mélanges chimiques et enzymatiques sont extraits après addition d'eau, purifiés et obtenus sous forme d'une poudre brute, suivant les sodés opératoires mentionnés ci-dessus. La solution contenant les
<EMI ID=78.1>
au moins une substance choisie parmi le groupe consistant en sérum, albumine de sérum, globuline, gélatine, glycérol, su-
<EMI ID=79.1>
organiques ou inorganiques comme acide chlorhydrique, acide phosphorique, acide acétique, acide succinique et acide pantothénique.
Pour obtenir les composants MA144 individuels, c.-à-d.
<EMI ID=80.1>
cation et une séparation ultérieures peuvent être effectuées en utilisant des techniques de séparation standards comme une chromatographie sur colonne employant divers adsorbants comme acide silicique, dextranes modifiés, résines échangeuses d'ions faiblement acidifiées ou carbone actif, une séparation à contre-courant, uns chromatographie sur liquide en employant des solvants organiques appropriés, ou la chélation avec divers ions métalliques, ou une combinaison de un ou plusieurs des procédés mentionnés ci-dessuso :
<EMI ID=81.1>
(Cf. tableaux ci-après.)
<EMI ID=82.1>
<EMI ID=83.1>
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
<EMI ID=89.1>
-U2 et -I dans la présente invention a été déterminée comme suit.
Après hydrolyse acide avec de l'acide chlorhydrique
<EMI ID=90.1>
ques comme le spectre d'absorption dans les gammes de l'ultraviolet, du visible et de l'infrarouge, le spectre de résonance magnétique nucléaire, le point de fusion, l'analyse élémentaire et les valeurs Rf sur une coucha mince d'acide sili-
<EMI ID=91.1>
-L, -NI, -SI, -Ul et -Y coïncidaient totalement avec celles de l'aklavinone (Tetrahedron Lett. n[deg.] 8, 28-34, 1960), et <EMI ID=92.1> mycinone (Chem. Ber. 92, 1880-1903, 1959). D'autre part, les groupas sucres existant dans la fraction soluble dans l'eau des hydrolysats ci-dessus ont été déterminés pas chromatographie en couche mince d'acide silicique (Merck Co.
<EMI ID=93.1>
comparant leurs valeurs Rf avec celles do sucres réels obte-
<EMI ID=94.1>
3592-3594, 1972). Les valeurs Rf des groupes sucres obtenus à partir des composants MA144 sont indiquées dans le tableau
<EMI ID=95.1> et -U2. <EMI ID=96.1>
MA144.
<EMI ID=97.1>
<EMI ID=98.1>
du méthanol contenant de l'acide chlorhydrique 0,01N à
<EMI ID=99.1>
de fusion, les spectres d'absorption IR, UV et lumière visible et le spectre RMN, et les saccharides méthylés cor-
<EMI ID=100.1> <EMI ID=101.1>
et IR de ces componée et ceux de leur disaccharide méthylé.
<EMI ID=102.1>
<EMI ID=103.1>
comme suit :
<EMI ID=104.1>
<EMI ID=105.1>
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
pes de groupes sucre : la L-rhodosamina, le 2-déoxy-L-fucose et le L-rhodinose. Afin de déterminer la série sucre, on a effectué une hydrolyse modérée dans de l'acide chlorhydrique
<EMI ID=108.1>
et le L-rhodinose a été libéré et il y a eu formation simultanée de MA144-S1. Donc, la structure chimique du MA144-N1 pout être déterminée comme suit :
<EMI ID=109.1>
<EMI ID=110.1>
ainsi la structure chimique suivante a été proposée :
<EMI ID=111.1>
<EMI ID=112.1>
Sephadex LH-20 (marque déposée) at a été ensuite cristallisé sons ferme de cristaux en aiguilles blanches dans du benzène. Les propriétés physico-chimiques du diaaccharide
<EMI ID=113.1>
<EMI ID=114.1>
<EMI ID=115.1>
Spectre d'absorption dans l'ultraviolet et la lumière visible (dans du méthanol) <EMI ID=116.1>
A partir de l'analyse des résultats ci-dessus, la structure du disaccharide méthyle s'est révélée être celle
<EMI ID=117.1>
<EMI ID=118.1>
<EMI ID=119.1>
<EMI ID=120.1>
De nombreux antibiotiques consistant en glycoside
<EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
nus, en ce qui concerne des. caractéristiques telles que formule moléculaire, produits de dégradation par hydrolyse <EMI ID=123.1>
frarouge, etc., comme décrit ci-dessus. Parmi les glycosides d'anthracycline connus, l'aklavine et la pyrromycine consis-
<EMI ID=124.1>
en trois groupes sucre : le L-cinérulosyl-2-déoxy-L-fucosylL-rhodosaminyl-, le MA144-M1 et -M2 (demande de brevet japo-
<EMI ID=125.1>
même que celui du MA144-N1 dans la présente invention, mais l'aglycone du MA144-N1 est l'aklavinone et se distingue de
<EMI ID=126.1> sont des nouvelles substances,
<EMI ID=127.1>
présentent des activités anti-microbiennes vis-à-vis de di-
<EMI ID=128.1>
tion minimum des antibiotiques de l'invention, déterminée par la procédé de dilution du bouillon, est indiquée dans le tableau suivant.
<EMI ID=129.1>
<EMI ID=130.1>
<EMI ID=131.1>
<EMI ID=132.1>
le pourcentage de la prolongation do durée de survit) par rapport au témoin a été indiqué dans le tableau suivant
<EMI ID=133.1> <EMI ID=134.1>
<EMI ID=135.1>
<EMI ID=136.1>
en culture, spécialement en faibles concentrations, et inhibaient complètement la synthèse RNA. Dans cette expérience, des cellules L1210 ont été inoculées dans un milieu RPMI
<EMI ID=137.1>
jour les composés de la présente invention en une concentration de 0,1/ug/ml. Dans l'expérience d'incorporation de
<EMI ID=138.1>
RNA ont été indiqués par le pourcentage d'inhibition par rapport au témoin, comme indiqué dans la tableau suivant,
A partir des résultats, on peut constater que les composants
<EMI ID=139.1>
de cellules L1210 cultivées, en faiblo concentration. Ces résultats se confirmaient par l'efficacité thérapeutique sur des tumeurs animales expérimentales., <EMI ID=140.1>
la synthèse macromoléculaire dans des cellules L1210 cultivées.
<EMI ID=141.1>
<EMI ID=142.1>
<EMI ID=143.1>
Gram-positives*
L'invention comprend dans son cadra les compositions pharmaceutiques contenant au moins un des composés antibiotiques mentionnés ci-dessus avec un porteur compatible
<EMI ID=144.1>
être élaborées en n'importe quelle forme pharmaceutique convenant au mode d'administration. Des exemples de telles
<EMI ID=145.1>
<EMI ID=146.1>
Iules, poudres et granulée, des compositions liquides pour administration par voie orale comme solutions, suspensions, sirops et élixirs et des préparations pour administration par voie parentérale comme solutions stériles, suspensions ou émulsions.
Les composés de la présente invention forment des sels par addition d'acide non toxique avec de nombreux réactifs organiques et inorganiques formant des sels et forment des complexes non toxiques avec l'acide désoxyribonucléiqus.
<EMI ID=147.1>
pharMaeeutiquement acceptables comme l'acide sulfurique, phosphorique, chlorhydrique, acétique, propionique, oléique,
<EMI ID=148.1>
avec l'acide désoxyribonucléique peuvent être utilisés de
<EMI ID=149.1>
Il faut remarquer que les quantités réelles préférées des composés utilisés suivant la présente invention peuvent varier suivant le composé particulier utilisé, la composi-
<EMI ID=150.1>
particulier, le patient et la maladie à traiter. En général, les composants MA144 sont injectés par voie intrapéritoniale, intraveineuse, subcutanée ou locale, ou bien administrés par voie orale chez les animaux et par voia intraveineuse, intrapéritoniale, locale ou orale chez les humains, Les exports en la matière doivent tenir compte de plusieurs fac-
<EMI ID=151.1>
ple, Age, poids du corps, sexe, régime, durée de l'administration, voie de l'administration, vitesse d'excrétion, condition du patient, combinaisons de médicaments, sensibilités réactionnelles, et sévérité de la maladie. L'administration peut être effectuée en continu ou périodiquement, en respectant la dose maximum tolérée. Des taux d'application optimaux pour une gamme donnée de condition peuvent être déterminés par les e xperta en cette matière en utilisant des tests de détermination de dosage conventionnels et en tenant compte des données fournies ci-dessus.
Pour une utilisation comme agent anti-bactérien, les composants MA144 sont en général administrés de telle s or te que la concentration de l'ingrédient actif soit plus élevée que la concentration d'inhibition minimum pour l'organisme particulier à traiter.
Les exemples suivants sont aonnés à titre d'illustration uniquement, et ils ne limitent en aucun cas le cadre de l'invention.
Exemple 1.
On a préparé un milieu nutritif ayant la composition suivante
<EMI ID=152.1>
Cinquante ml. de ce milieu ont été stérilisés à 120
<EMI ID=153.1>
du milieu) .préalablement stérilisé dans un fermentateur en acier inoxydable de 20 litres ont été aseptiquement inoculés avec 200 ml. de la culture ensemencée ci-dessus. La
<EMI ID=154.1>
agitation (300 tpm) et aération (5 1/min.). Ensuite, 10 litres de cette culture ont été transférés dans 600 litres du milieu préalablement stérilisé, dans un réservoir en acier
<EMI ID=155.1>
Le bouillon de culture obtenu (580 1.) a été ajusté à pH 5,0 avec de l'acide sulfurique et a été filtré avec de la terre diatomée. Le gâteau de filtration rédultant (56 kg) a été mis en suspension dans 50 litres d'acétone et filtré après agitation durant une heure. Le résidu a de nouveau été extrait avec 50 litres d'acétone. les deux extraits ont été concentrés jusqu'à 25 litres sous pression réduite, ajoutés à 20 litres d'acétate d'éthyle et agités. Après séparation de la couche d'acétate d'éthyle en concentrant jusqu'à 1 litre sous pression réduite, le mélange de MA144 brut a été précipité par addition de 15 1. de n-hexane au concentrât, et ensuite 36 grammes d'une poudre rouge ont été obtenus après lavage deux fois avec du n-hexane. D'autre part, le filtrat de culture obtenu ci-dessus a été ajusté
à pH 6,8 avec de l'hydroxyde de sodium et a été extrait
<EMI ID=156.1>
Exemple 2.
La poudre brute du mélange de MA144 obtenue à partir du gâteau de filtration comme dans l'exemple 1 (10 grammes) a été dissoute dans 100 ml. de toluène et soumise à chro�a.tographie sur une colonne (5 x 40 cm.) garnie de 300 go d'acide silicique, et après élimination de l'éluat initial avec
<EMI ID=157.1>
ont été éludes avec du toluène contenant 5 % de méthanol, successivement. Après concentration de chaque fraction obtenue ci-dessus, on a obtenu, par addition de n-hexane, des poudres brutes rouge-orange consistant en 210 mg. d'un mé-
<EMI ID=158.1>
<EMI ID=159.1>
<EMI ID=160.1>
à partir du filtrat de culture comme dans l'exemple 1 ont été dissous dans 6 ml. de toluène, soumis à chromatographie sur colonne garnie de 100 g. d'acide silicique et ensuite la
<EMI ID=161.1>
<EMI ID=162.1>
210 mg de mélange de MA144-G1 et -G2 obtenus dans
<EMI ID=163.1>
te d'éthyle et soumis à chromatographie sur colonne garnis de 30 g. de Column-Lite (marque déposée, Fuji Chem. Co., pour l'acide silicique) et ont été élues avec un mélange d'acétate d'éthyle-méthanol (1:1). La fraction jaune a été concentrée jusqu'à siccité sous pression réduite et le résidu obtenu a été dissous dans 50 ml. de chloroforme, agité
<EMI ID=164.1>
duels, et la coucha de chloroforme a été lavée deux fois avec de l'eau, séchée avec du sulfate de sodium anhydre et ensuite concentrée jusqu'à siccité sous pression réduite.
<EMI ID=165.1>
résultant a été évaporé jusqu'à siccité. dissous dans une petite quantité de chloroforme et débarrassé des ions métalliques résiduels suivant le procédé mentionné plus haut, et
<EMI ID=166.1>
MA144-L. Par le même mode opératoire que celui décrit cidessus pour le MA144-G1 et -G2, on a obtenu une poudre puri- <EMI ID=167.1>
les composés de la présente invention ont été obtenus comme suit en utilisant les souches de Streptomyces indiquées.
<EMI ID=168.1>
<EMI ID=169.1> a été stoppée par l'addition de deux volumes d'un mélange de chloroforme/méthanol froid (1:1). Cette solution a été convenablement mélangée et séparée de la couche de chloroforme et la fraction active restant dans la couche aqueuse a été de nouveau extraite avec un volume égal de chloroforme. Les deux couches de chloroforme ont été combinées, concentrées sous pression réduite, appliquées sur des plaques
<EMI ID=170.1>
veloppées avec un mélange de chloroforme méthanol (10:1) pour préparation. Après chromatographie, la bande correspon-
<EMI ID=171.1>
avec un mélange de chloroforme-méthanol (10:1), et concentré sous pression réduite. On a ainsi obtenu 62,3 mg d'une
<EMI ID=172.1>
<EMI ID=173.1>
Un gramme d'aclacinomycine A a été dissous dans 40 ml. d'acétate d'éthyle, mélangé avec 40 ml. d'eau contenant 100
<EMI ID=174.1>
près déshydratation avec du sulfata de sodium anhydre. Après chromatographie sur une colonne d'acide silicique (colonne de 3 x 20 en.) en utilisant un mélange de toluène-méthanol
<EMI ID=175.1>
de MA144-M. sous forma d'une poudre jaune.
<EMI ID=176.1>
<EMI ID=177.1> ont été rassemblées et concentrées sous pression réduite. Les fractions actives contenant le MA144-N1 qui ont été obtenues par chromatographie sur colonne d'acide silicique
<EMI ID=178.1>
toluène (5 : 100) ont été rassemblées, concentrées et ajoutées à du n-hexane. On a ainsi obtenu 237 mg d'une poudre
<EMI ID=179.1>
Exemple 9.
On a préparé � milieu nutritif ayant la composition suivante ;
<EMI ID=180.1>
<EMI ID=181.1>
en collodion. On a obtenu environ 1.000 unités/ml. d'une préparatioa d'enzyme brut.
<EMI ID=182.1>
<EMI ID = 1.1>
The present invention relates to novel anti-tumor antibiotics of the anthracycline glycoside type, their
production and recovery, as well as their therapeutic use. More particularly, the invention relates to
new designated anti-tumor antibiotic substances
<EMI ID = 2.1>
processes for their preparation by fermentation of strains
<EMI ID = 3.1>
recovery and purification, and their application as
chemotherapeutic agents for inhibiting the growth of malignant tumors and for the treatment of infectious diseases caused by Gram-positive bacteria
Various types of anthracycline glycosides have been
found in the culture broth of microorganisms,
and they have been described in the literature. Of these, <EMI ID = 4.1>
dwarf clinics of great interest in cancer chemotherapy.
Thanks to cultures of streptomyces selected for metabolites having anti-tumor activity, the authors of the present invention discovered new compounds and after purification and characterization based on their physicochemical properties, it was confirmed that the antibiotics
<EMI ID = 5.1>
Anthracycline antibiotics having an aglycone aklavinone group are described in the following references.
(a) aclacinomycin A and B in the United States of America bravât [deg.] 3,988,315 and by Oki et al. in J. Antibiotica
28: 830 (1975). (b) Aklavine in J. Bacteriol. 72:90 (1956).
<EMI ID = 6.1>
pyrromycinone aglycon are described in the following references.
<EMI ID = 7.1>
written in the following references.
(f) Nogalamycin in J. Amer. Chem. Soc. 99: 542 (1977).
<EMI ID = 8.1>
R.F.A. patent n [deg.] 2,362,707 and in J. Amer. Chem. Soc.
97: 5955 (1975).
<EMI ID = 9.1>
Abst. 67: 90573z (1967).
For additional illustration and summary descriptions of anthracycline antibiotics, see as
<EMI ID = 10.1>
College, Pennsylvania, E.U.A. (1967):
<EMI ID = 11.1>
<EMI ID = 12.1> <EMI ID = 13.1>
anthracyclines and their derivatives.
The present invention relates to novel anthracycline glycoside antibiotics, processes for their preparation, pharmaceutical compositions containing them and the use of such antibiotics or compositions in the treatment of bacterial infections and in inhi. bition .. tumors in mammals. More particularly,
<EMI ID = 14.1>
chelation with metal ions and standard column chromatography procedures.
<EMI ID = 15.1> purified solids, their salts and DMA complexes, as well as the process for the preparation of the above compounds
<EMI ID = 16.1> lyophilized after addition of at least one substance selected from the group consisting of deoxyribonucleic acid, glycerol, sugars, amino acids and inorganic or organic acids.
The present invention therefore provides the antibiotics
<EMI ID = 17.1>
which <EMI ID = 18.1> fat-positive series;
(b) are effective in inhibiting the growth of <EMI ID = 19.1>
red, has a melting point of 152-156 ° C .; is a weakly basic anthracyclina glycoside;
<EMI ID = 20.1>
<EMI ID = 21.1>
romycinona, having the empirical formula 36 il 45-
014 NI
<EMI ID = 22.1>
<EMI ID = 23.1>
Fig. 1 shows the ultraviolet and visible light absorption spectrum of MA144-G1 in methanol <EMI ID = 24.1> Fig. 2 shows the ultraviolet and visible light absorption spectrum of MA144-G2 in methanol <EMI ID = 25.1> <EMI ID = 26.1> <EMI ID = 27.1> <EMI ID = 28.1> Fig. 7 shows the absorption spectrum in the ultraviolet <EMI ID = 29.1>
<EMI ID = 30.1> Fig. 8 shows the ultraviolet and visible light absorption spectrum of MA144-U2 in methanol at <EMI ID = 31.1> Fig. 9 shows the ultraviolet and visible light absorption spectrum of MA144-T in methanol at <EMI ID = 32.1> <EMI ID = 33.1> <EMI ID = 34.1> Finally, the compounds of the present invention exhibit Gram-positive bacteria activity) inhibit the growth of various tumors in mammals such as
<EMI ID = 35.1>
low toxicity. Therefore, the compounds of the present invention are useful as antibacterial and anti-tumor agents. The terms “MA144 components” used here denote an antibiotic comprising at least one compound chosen:
<EMI ID = 36.1>
These compounds are produced by culturing a strain of streptomyces producing MAI44 in an aqueous carbohydrate solution containing nitrogenous organic nutrients under aerobic immersion conditions, or by chemical reduction and hydrolysis of known and specific anthracycline glycosides, or by known and particular anthracycline glycoside enzymatic conversion. The composed in
<EMI ID = 37.1>
and enzymes thus produced can be extracted and purified by conventional methods used for the extraction and purification of water-insoluble antibiotics.
<EMI ID = 38.1>
crude solids, purified solids, their salts and
<EMI ID = 39.1>
The production of the compounds of the present invention is carried out by a fermentation process, and several
<EMI ID = 40.1>
For the fermentation production of the compounds according to the present invention, the pro-
<EMI ID = 41.1>
ATCC 31273 and their mutants.
Production of all compounds of the present invention is accomplished by culturing the straptomyces strains mentioned above in a conventional aqueous nutrient medium from known nutrient sources for actinomycetes, i.e. sources of carbon, nitrogen and inorganic salts. An aerobic submerged culture is preferably used for the production of substantial quantities.
<EMI ID = 42.1>
ticks. The procedures generally used for the culture of other actinomycetes are applicable to the culture <EMI ID = 43.1>
ses, etc., raw or purified, and commercially available nitrogen sources such as soybean powder, extract
<EMI ID = 44.1>
grain extract or inorganic salts like ammonium sulphate, sodium nitrate or ammonium chloride. As inorganic salts, sodium chloride, potassium chloride, or phosphates are preferably used and one can also add, if necessary, trace metal ions and anti-foaming agents such as Adekanol (registered trademark, Asahi Denka Ind. Co.) or silicone (dope-
<EMI ID = 45.1>
the range of about 6 to 9. The production of MA144 components in the culture broth reaches a maximum after 2 to 7
<EMI ID = 46.1>
submerged aerobic tion with aeration and agitation carried out as in the examples given below.
<EMI ID = 47.1>
MA144-M2, MA144-N1, MA144-G1, MA144-G2, MA144-U1, MA144-U2, MA144-Y or a mixture thereof, are chemically converted into MA144-S1, -S2, -NI or one of their mixtures. The starting materials can be used in purified form, such as
<EMI ID = 48.1>
substances containing anthracycline-like compounds as fermentation broths or crude extracts from its broths.
The chemical conversion can be more easily understood by reading the following reaction scheme
<EMI ID = 49.1>
<EMI ID = 50.1>
<EMI ID = 51.1>
leave etc. and conditions are preferably chosen which make it possible to obtain the highest possible yield and reaction rate. The starting stances can be used in purified form, such as salts, or in impure form, for example. example in the form of substances containing the anthracycline-type substrates as fermentation broths or crude extracts from these broths.
The enzymatic conversion can be more easily understood by reading the following reaction scheme.
<EMI ID = 53.1>
<EMI ID = 54.1>
A by the enzymatic system which is obtained from mammals and microorganisms. The enzymatic system used
<EMI ID = 55.1>
and from mammalian tissue, e.g. tissue from monkeys, dogs, rabbits, hamsters, rats
<EMI ID = 56.1>
organisms, strains belonging to streptomyces can be used as culture broth, cell suspension, dry cells, cell homogenate, partially purified enzyme, and immobilized enzyme
<EMI ID = 57.1>
tiqua such as pH, temperature, substrate concentration, reaction time, coenzyme, etc., depend on the state of the enzyme, the starting material used, etc. In general
<EMI ID = 58.1>
which does not activate the enzyme reaction and does not inactivate the enzyme system. In general, it is better to use
<EMI ID = 59.1>
<EMI ID = 60.1>
solution with supernatant liquid, partially or totally purified enzyme and immobilized enzyme obtained from these clearings.
The conditions of the enzymatic reaction such as pH, temperature, substrate concentration, reaction time, etc., depend on the state of the enzyme, on the starting material used, etc. In general, it is preferable to choose conditions which accelerate the enzymatic reaction and which do not inhibit the enzymatic reaction. In general, it is appropriate to use a temperature between 20 and 50 * Ce, a pH of 4.0 to 9.0, a substrate concentration of less than 5% and a reaction time of 10 minutes to 5 hours depending on the amount of dissolved oxygen. The enzymatic reaction requires
<EMI ID = 61.1>
The enzymatic activity of various streptomyces used in the present invention is given below.
<EMI ID = 62.1>
<EMI ID = 63.1>
<EMI ID = 64.1>
<EMI ID = 65.1>
<EMI ID = 66.1>
per minute.
For the purification of the enzyme from the 7 bases
<EMI ID = 67.1>
conventional methods of enzyme purification. For example, the electrophoretically homogenized purified enzyme preparation can be obtained from the culture filtrate by precipitation from a sulfate solution.
<EMI ID = 68.1>
dex G-75. The general properties of the purified enzyme obtained <EMI ID = 69.1>
the following.
<EMI ID = 70.1>
<EMI ID = 71.1>
It can be filtered and the filtrate can then be extracted with an organic solvent immiscible in water comas chlo-
<EMI ID = 72.1>
etc., in neutral to weakly acidic state The MA144 components in the mycelium can be recovered by extraction with an organic solvent such as chloroform, acetone, n-butanol, methanol, ethanol, ethyl acetate or a
<EMI ID = 73.1>
ment from the culture broth by the extraction procedures mentioned above, without prea-lable separation of the mycelium. After concentration in vacuo, the extracts of MAI 44 can be extracted again with an organic solvent immiscible in water at a pH between 6 and 9 and after concentration under reduced pressure the concentrates
<EMI ID = 74.1>
Above, the MA144- components can be obtained in a purified form. Instead of using a solvent extraction recovery method to recover the MA144 from the culture broth, one can employ, alone or in combination with the solvent extraction method, a chromium.
<EMI ID = 75.1>
activated carbon, alumina, silicic acid, or modified dextran such as that which is commercially available
<EMI ID = 76.1>
liquid matography using suitable organic solvents. The active extracts obtained by these processes are concentrated under reduced pressure and obtained by drilling
<EMI ID = 77.1>
The MA144 components in the chemical and enzymatic mixtures are extracted after addition of water, purified and obtained in the form of a crude powder, according to the operating sodas mentioned above. The solution containing the
<EMI ID = 78.1>
at least one substance selected from the group consisting of serum, serum albumin, globulin, gelatin, glycerol, su-
<EMI ID = 79.1>
organic or inorganic such as hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, succinic acid and pantothenic acid.
To get the individual MA144 components, i.e.
<EMI ID = 80.1>
cation and subsequent separation can be performed using standard separation techniques such as column chromatography employing various adsorbents such as silicic acid, modified dextrans, weakly acidified ion exchange resins or activated carbon, countercurrent separation, chromatography on liquid using suitable organic solvents, or chelation with various metal ions, or a combination of one or more of the above-mentioned methods:
<EMI ID = 81.1>
(See tables below.)
<EMI ID = 82.1>
<EMI ID = 83.1>
<EMI ID = 84.1>
<EMI ID = 85.1>
<EMI ID = 86.1>
<EMI ID = 87.1>
<EMI ID = 88.1>
<EMI ID = 89.1>
-U2 and -I in the present invention was determined as follows.
After acid hydrolysis with hydrochloric acid
<EMI ID = 90.1>
issues such as absorption spectrum in the ultraviolet, visible and infrared ranges, nuclear magnetic resonance spectrum, melting point, elemental analysis and Rf values on a thin layer of acid sili-
<EMI ID = 91.1>
-L, -NI, -SI, -U1 and -Y completely coincided with those of aklavinone (Tetrahedron Lett. N [deg.] 8, 28-34, 1960), and <EMI ID = 92.1> mycinone (Chem . Ber. 92, 1880-1903, 1959). On the other hand, the sugar groups existing in the water soluble fraction of the above hydrolysates were determined by thin layer chromatography of silicic acid (Merck Co.
<EMI ID = 93.1>
comparing their Rf values with those of real sugars obtained
<EMI ID = 94.1>
3592-3594, 1972). The Rf values of the sugar groups obtained from the MA144 components are shown in the table
<EMI ID = 95.1> and -U2. <EMI ID = 96.1>
MA144.
<EMI ID = 97.1>
<EMI ID = 98.1>
methanol containing 0.01N hydrochloric acid to
<EMI ID = 99.1>
fusion, IR, UV and visible light absorption spectra and NMR spectrum, and methylated saccharides cor-
<EMI ID = 100.1> <EMI ID = 101.1>
and IR of these components and those of their methylated disaccharide.
<EMI ID = 102.1>
<EMI ID = 103.1>
as following :
<EMI ID = 104.1>
<EMI ID = 105.1>
<EMI ID = 106.1>
<EMI ID = 107.1>
of sugar groups: L-rhodosamina, 2-deoxy-L-fucose and L-rhodinose. In order to determine the sugar series, moderate hydrolysis was performed in hydrochloric acid.
<EMI ID = 108.1>
and L-rhodinose was released and there was concurrent formation of MA144-S1. Therefore, the chemical structure of MA144-N1 can be determined as follows:
<EMI ID = 109.1>
<EMI ID = 110.1>
thus the following chemical structure has been proposed:
<EMI ID = 111.1>
<EMI ID = 112.1>
Sephadex LH-20 (Trademark) was then crystallized firmly from white needle crystals in benzene. The physicochemical properties of the diaaccharide
<EMI ID = 113.1>
<EMI ID = 114.1>
<EMI ID = 115.1>
UV and visible light absorption spectrum (in methanol) <EMI ID = 116.1>
From the analysis of the above results, the structure of the methyl disaccharide was found to be that
<EMI ID = 117.1>
<EMI ID = 118.1>
<EMI ID = 119.1>
<EMI ID = 120.1>
Many antibiotics consisting of glycoside
<EMI ID = 121.1>
<EMI ID = 122.1>
naked, with regard to. characteristics such as molecular formula, degradation products by hydrolysis <EMI ID = 123.1>
frarouge, etc., as described above. Among the known anthracycline glycosides, aklavin and pyrromycin consist of
<EMI ID = 124.1>
into three sugar groups: L-cinerulosyl-2-deoxy-L-fucosylL-rhodosaminyl-, MA144-M1 and -M2 (Japanese patent application
<EMI ID = 125.1>
same as that of MA144-N1 in the present invention, but the aglycone of MA144-N1 is aklavinone and differs from
<EMI ID = 126.1> are new substances,
<EMI ID = 127.1>
exhibit anti-microbial activities against di-
<EMI ID = 128.1>
Minimum ration of the antibiotics of the invention, determined by the method of dilution of the broth, is shown in the following table.
<EMI ID = 129.1>
<EMI ID = 130.1>
<EMI ID = 131.1>
<EMI ID = 132.1>
the percentage of the extension of the survival time) compared to the control was indicated in the following table
<EMI ID = 133.1> <EMI ID = 134.1>
<EMI ID = 135.1>
<EMI ID = 136.1>
in culture, especially in low concentrations, and completely inhibited RNA synthesis. In this experiment, L1210 cells were inoculated into RPMI medium
<EMI ID = 137.1>
day the compounds of the present invention in a concentration of 0.1 µg / ml. In the experience of incorporating
<EMI ID = 138.1>
RNA were indicated by the percentage inhibition relative to the control, as indicated in the following table,
From the results, it can be seen that the components
<EMI ID = 139.1>
of cultured L1210 cells, in low concentration. These results were confirmed by the therapeutic efficacy on experimental animal tumors., <EMI ID = 140.1>
macromolecular synthesis in cultured L1210 cells.
<EMI ID = 141.1>
<EMI ID = 142.1>
<EMI ID = 143.1>
Gram-positive *
The invention includes within its scope pharmaceutical compositions containing at least one of the antibiotic compounds mentioned above with a compatible carrier
<EMI ID = 144.1>
be prepared in any pharmaceutical form suitable for the mode of administration. Examples of such
<EMI ID = 145.1>
<EMI ID = 146.1>
Iules, powders and granules, liquid compositions for oral administration as solutions, suspensions, syrups and elixirs and preparations for parenteral administration as sterile solutions, suspensions or emulsions.
The compounds of the present invention form salts by addition of non-toxic acid with numerous organic and inorganic salt-forming reagents and form non-toxic complexes with deoxyribonucleic acid.
<EMI ID = 147.1>
pharmaceutically acceptable such as sulfuric, phosphoric, hydrochloric, acetic, propionic, oleic acid,
<EMI ID = 148.1>
with deoxyribonucleic acid can be used from
<EMI ID = 149.1>
It should be noted that the actual preferred amounts of the compounds used in accordance with the present invention may vary depending on the particular compound used, the composition.
<EMI ID = 150.1>
particular, the patient and the disease to be treated. In general, the MA144 components are injected by the intraperitonial, intravenous, subcutaneous or local route, or else administered orally in animals and by intravenous, intraperitonial, local or oral route in humans. Exports in this matter must take into account several fac-
<EMI ID = 151.1>
ple, Age, body weight, sex, regimen, duration of administration, route of administration, rate of excretion, patient condition, drug combinations, reaction sensitivities, and severity of disease. The administration can be carried out continuously or periodically, respecting the maximum tolerated dose. Optimal application rates for a given range of conditions can be determined by those skilled in the art using conventional dosage determination tests and taking into account the data provided above.
For use as an anti-bacterial agent, the MA144 components are generally administered in such a way that the concentration of the active ingredient is greater than the minimum inhibitory concentration for the particular organism to be treated.
The following examples are given by way of illustration only, and they in no way limit the scope of the invention.
Example 1.
A nutrient medium was prepared having the following composition
<EMI ID = 152.1>
Fifty ml. of this medium were sterilized at 120
<EMI ID = 153.1>
media). Previously sterilized in a 20 liter stainless steel fermenter were aseptically inoculated with 200 ml. of the culture seeded above. The
<EMI ID = 154.1>
stirring (300 rpm) and aeration (5 1 / min.). Then, 10 liters of this culture were transferred into 600 liters of the previously sterilized medium, in a steel tank.
<EMI ID = 155.1>
The obtained culture broth (580 L) was adjusted to pH 5.0 with sulfuric acid and was filtered with diatomaceous earth. The reducing filter cake (56 kg) was suspended in 50 liters of acetone and filtered after stirring for one hour. The residue was again extracted with 50 liters of acetone. the two extracts were concentrated to 25 liters under reduced pressure, added to 20 liters of ethyl acetate and stirred. After separating the ethyl acetate layer by concentrating to 1 liter under reduced pressure, the crude MA144 mixture was precipitated by adding 15 liters of n-hexane to the concentrate, and then 36 grams of a. red powder were obtained after washing twice with n-hexane. On the other hand, the culture filtrate obtained above was adjusted
at pH 6.8 with sodium hydroxide and was extracted
<EMI ID = 156.1>
Example 2.
The crude powder of the MA144 mixture obtained from the filter cake as in Example 1 (10 grams) was dissolved in 100 ml. of toluene and subjected to chromatography on a column (5 x 40 cm.) packed with 300 gb of silicic acid, and after removal of the initial eluate with
<EMI ID = 157.1>
were studied with toluene containing 5% methanol, successively. After concentration of each fraction obtained above, there were obtained, by addition of n-hexane, crude red-orange powders consisting of 210 mg. of a m-
<EMI ID = 158.1>
<EMI ID = 159.1>
<EMI ID = 160.1>
from the culture filtrate as in Example 1 were dissolved in 6 ml. of toluene, subjected to chromatography on a column packed with 100 g. silicic acid and then the
<EMI ID = 161.1>
<EMI ID = 162.1>
210 mg of mixture of MA144-G1 and -G2 obtained in
<EMI ID = 163.1>
ethyl te and subjected to column chromatography packed with 30 g. by Column-Lite (trademark, Fuji Chem. Co., for silicic acid) and were eluted with ethyl acetate-methanol (1: 1). The yellow fraction was concentrated to dryness under reduced pressure and the residue obtained was dissolved in 50 ml. chloroform, stirred
<EMI ID = 164.1>
duels, and the chloroform layer was washed twice with water, dried with anhydrous sodium sulfate and then concentrated to dryness under reduced pressure.
<EMI ID = 165.1>
resulting was evaporated to dryness. dissolved in a small amount of chloroform and freed from residual metal ions according to the process mentioned above, and
<EMI ID = 166.1>
MA144-L. By the same procedure as that described above for MA144-G1 and -G2, a puri- <EMI ID = 167.1> powder was obtained.
the compounds of the present invention were obtained as follows using the strains of Streptomyces indicated.
<EMI ID = 168.1>
<EMI ID = 169.1> was stopped by the addition of two volumes of a mixture of cold chloroform / methanol (1: 1). This solution was well mixed and separated from the chloroform layer and the active fraction remaining in the aqueous layer was again extracted with an equal volume of chloroform. The two layers of chloroform were combined, concentrated under reduced pressure, applied to plates
<EMI ID = 170.1>
coated with a mixture of chloroform methanol (10: 1) for preparation. After chromatography, the corresponding band
<EMI ID = 171.1>
with a mixture of chloroform-methanol (10: 1), and concentrated under reduced pressure. This gave 62.3 mg of a
<EMI ID = 172.1>
<EMI ID = 173.1>
One gram of aclacinomycin A was dissolved in 40 ml. ethyl acetate, mixed with 40 ml. of water containing 100
<EMI ID = 174.1>
near dehydration with anhydrous sodium sulfata. After chromatography on a silicic acid column (3 x 20 in. Column) using a mixture of toluene-methanol
<EMI ID = 175.1>
by MA144-M. in the form of a yellow powder.
<EMI ID = 176.1>
<EMI ID = 177.1> were combined and concentrated under reduced pressure. The active fractions containing MA144-N1 which were obtained by chromatography on a silicic acid column
<EMI ID = 178.1>
toluene (5: 100) were combined, concentrated and added to n-hexane. There was thus obtained 237 mg of a powder
<EMI ID = 179.1>
Example 9.
We prepared � nutrient medium having the following composition;
<EMI ID = 180.1>
<EMI ID = 181.1>
in collodion. About 1,000 units / ml were obtained. of a crude enzyme preparation.
<EMI ID = 182.1>