Inducteur d'interféron et son procédé de fabrication.
<EMI ID=1.1>
ou facteur inhibiteur de virus, est une substance capable
d'agir sur les cellules animales pour inhiber la croissance
d'un virus et elle est constituée d'un type de protéine libérée par la cellule en réponse à l'infection virale. L'activité
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et non spécifique vis-à-vis d'une espèce virale, et elle peut
être variable dans les différentes conditions utilisées pour son induction. On sait aussi que la croissance de certains virus du type de tumeurs animales peut être inhibée de façon appréciable
par le FI dans certaines conditions.
Une substance capable d'agir sur les cellules animales
pour induire le FI est dénommée inducteur de FI. Un inducteur
de FI présente donc un intérêt potentiel pour la prévention et
le traitement de diverses maladies humaines et animales causées
par l'infection virale. On n'a toutefois jamais utilisé dans la pratique divers inducteurs connus de FI, en raison de certains inconvénients sérieux. C'est ainsi, par exemple, que le brevet
des Etats-Unis d'Amérique No. 3.583.893 décrit, comme inducteur
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lisant un microorganisme et mentionne, dans la description de l'art antérieur, qu'un grand nombre de substances, comprenant
des bactéries, des virus, des polysaccharides, des agents mitogéniques, l'endotoxine et autres substances semblables, stimulent la formation d'interféron, mais qu'aucune d'entre elles
n'est intéressante pour un usage courant à cause, inter alias,
de leur toxicité, de leur caractère antigène tique et de leur nature infectieuse. D'autres inducteurs de FI connus sont décrits, par exemple, dans les brevets des Etats-Unis d'Am6rique
Non. 3.773.924 et 3.884.845 et dans la demande de brevet japonais Kokai Koho No. 121919/78. Ces inducteurs de FI ne sont toutefois pas isolés a partir de plantes, et il est également connu
<EMI ID=4.1>
général désavantageux pour des applications thérapeutiques, en raison de leur haute toxicité.
Des exemples d'agents mitogéniques connus sont donnés <EMI ID=5.1>
partir des tissus du flageolet, de la phytolaque et de la fèverole. Cependant, en raison de leur activité inductrice de FI
<EMI ID=6.1>
demande de brevet japonais !tokai Koho No. 32107/78, on décrit un inducteur de FI que l'on suppose être une espèce de saccharide hétéropolymère, contenant comme constituants principaux
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(40 9), d'un poids moléculaire supérieur à 100.000, qui est
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(nom japonais Toki) on l'extrait par l'eau chaude, pour obtenir une solution d'extraction, que l'on soumet à la dialyse pour obtenir un résidu, auquel on ajoute de l'acétone pour obtenir un précipité, que l'on lyophilise. On peut, si on le désire, ajuster la solution d'extraction à une quantité convenable en la concentrant nous pression réduite, ou en utilisant une mem-
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un inducteur de FI, d'un poids moléculaire de plue de 20.000
(principalement de plus de 100.000), contenant comme consti-
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l'eau chaude, on ajoute un solvant organique a la solution d'extraction pour obtenir un précipité, on ajoute une petite quantité d'eau au précipité, on soumet la solution à la dialyse pour obtenir un résidu et on lyophilise ce dernier. On peut, si
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un volume convenable par concentration août pression réduite ou <EMI ID=12.1>
Ces deux inducteurs de FI présentent une faible toxicité et sont d'une production aisée.-Toutefois, les sources abondantes et peu coûteuses des tissus de plantes dont on les extrait peuvent venir à manquer, par suite de l'usage continuel qui en est fait depuis plusieurs années, comme sources de médi-
<EMI ID=13.1>
de propriétés excellentes, ainsi que leur procédé de fabrication. L'invention est basée sur la découverte qu'une substance, isolée des tissus de diverses plantes appartenant au genre
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présente une excellente activité inductrice de FI et une faible
<EMI ID=15.1>
dea tissus de plantes, facilement et IL bon marché.
Selon un mode de réalisation de l'invention, on obtient une substance présentant une activité inductrice de FI, qui est stable sous forme d'une poudre blanchâtre amorphe et qui, sous une forme sensiblement pure, présente les caractéristiques physicochimiques suivantes.
(1) Analyse élémentaire.
<EMI ID=16.1>
Roshi K.K., et par filtration sur gel, en utilisant le produit de dénomination commerciale Sephadex G-200, vendu par la Société dite Pharmacia Fine Chemical AB).
(3) Point de fusion ou de décomposition.
<EMI ID=17.1>
Tel que représenté à la figure 1, décrite ci-après <EMI ID=18.1>
(5) Spectre d'absorption IR.
Tel que représenté à la figure 2, décrite ci-après (par la méthode au KBr).
(6) Solubilité dans divers solvants.
Soluble dans l'eau et les solutions aqueuses de soude, potasse et ammoniaque pratiquement insoluble dans les solvants méthanol, éthanol, propanol, butanol, acétone, chloroforme et éther éthylique.
(7) Réactions colorées.
Positive dans les réactions de Ninhydrine, de phénol/
<EMI ID=19.1>
négative dans la réaction d'Elson-Morgan.
(8) Nature acide.
(9) Principaux constituants chimiques.
<EMI ID=20.1>
On mesure les amino-acides présents, par hydrolyse par
<EMI ID=21.1> en utilisant l'auto-analyseur d'amino-acides, vendu sous la dénomination commerciale de Technicon type NC-1, et on mesure
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par la Société dite Technicon Corp.).
(10) Rotation optique.
<EMI ID=23.1>
(c - 0,49 % dans NaOH O,1N).
Caractéristiques biologiques.
1) Activité inductrice de FI.
On utilise des échantillons de l'inducteur de FI de l'invention pour l'induction du FI dans les cellules et le sérum d'animaux d'essai et on mesure l'activité du FI obtenu, suivant la méthode décrite ci-après dans l'essai 1. Les résultats sont indiqués aux tableaux I et II qui montrent l'activité inductrice de FI positive.
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<EMI ID=25.1>
<EMI ID=26.1>
<EMI ID=27.1>
Le tableau II, donnant les résultats obtenue suivant la méthode décrite ci-après dans l'essai 1, utilisant deux lapins, <EMI ID=28.1> est induit dans le corps de l'animal d'essai par l'action de l'inducteur de FI de la présente invention.
2) Stabilité de l'activité inductrice de FI.
On dissout des échantillons (chacun de. 1 mg) de l'in-
<EMI ID=29.1>
<EMI ID=30.1>
température donnée pendant 1 heure. On traite ensuite chaque échantillon suivant la méthode de l'essai 1 (méthode in vitro) pour obtenir les résultats donnés aux tableaux III et IV, qui montrent que l'inducteur de FI de l'invention présente une haute stabilité a la chaleur.
TABLEAU III
<EMI ID=31.1>
<EMI ID=32.1>
TABLEAU IV
<EMI ID=33.1>
3) Toxicité aiguë.
On utilise comme animaux d'essai des souris maies et
<EMI ID=34.1>
groupes constitués chacun de 10 souris),. On administre aux souris une solution physiologique de chlorure de sodium, contenant
<EMI ID=35.1>
ment) . On n'observe aucune différence appréciable entre les souris miles et femelles.
4) Activité anti-tumorale.
On utilise comme animaux d'essai des souris de même race,
<EMI ID=36.1>
<EMI ID=37.1>
de 8-180 Sarcoma (2x2x2 2 mm) ou de tumeur ascitique d'Ehrlich (2,5 x 10 cellules). Après 24 heures, on administre oralement a chaque souris, l'inducteur de FI de l'invention
(0,2 mg) dissous dans l'eau. On effectue une administration par jour, qu'on poursuit pendant 14 jours. On observe un effet anti-tumoral appréciable.
D'après les caractéristiques précédemment indiquées, on
<EMI ID=38.1>
de protéines et de sucres, contenant de l'acide phosphorique, <EMI ID=39.1>
cipalement d'environ 500.000 à 1.000.000). Cette substance est également conforme a la définition généralement admise pour tout inducteur de PI, car elle induit le FI dans les cellule* ou le sérum de l'animal, in vivo ou in vitro, elle est inacti-
<EMI ID=40.1>
espèces animales et non spécifiques vis-à-vis des espèces virales. On suppose donc que la substance de l'invention constitue non seulement un nouvel inducteur de FI, mais aussi une substance nouvelle per se, car elle présente des caractéristiques
<EMI ID=41.1>
jour.
<EMI ID=42.1>
une activité inductrice de FI (comme la phytohémagglutinine, le mitogëne de phytolaque et la concanavaline A) sont des types
de protéines de poids moléculaires supérieurs a 100.000 et . d'une fret faible activité inductrice de FI, qui est désactivée par chauffage à 56[deg.]C pendant 5 heures. Au contraire, l'inducteur de FI de l'invention a des constituants chimiques différents, il est thermiquement stable mime à 100"C pendant plusieurs heures et son activité inductrice de FI est excellente. L'inducteur de FI connu, isolé dans la racine de Angellica acutiloba Kitagawa a aussi un haut poids moléculaire (supérieur
<EMI ID=43.1>
vée par chauffage à 100[deg.]C pendant 1 heure. Toutefois, ses cons-
<EMI ID=44.1>
5 %) et son spectre d'absorption IR sont différents de ceux de l'inducteur de l'invention. L'inducteur connu, isolé dans les pelures de racines du mûrier contient, comme constituant prin-
<EMI ID=45.1>
laire est supérieur à 20.000 (principalement supérieur à
60.000) il diffère donc également de l'inducteur de FI de l'invention. De plus, l'activité mitogénique rencontrée dans des inducteurs connus de FI, provenant de l'endotoxine bactérienne et des plantes supérieures, est très faible dans l'inducteur de FI de l'invention.
Diverses plantes, appartenant au genre Carthamus, qui <EMI ID=46.1>
teur de FI de l'invention en ce qui concerne leur* caractéristiques physico-chimiques et biologiques et ne présentent. pas
<EMI ID=47.1>
différentes de celles de l'inducteur de FI de l'invention.
L'inducteur de FI de l'invention présente un intérêt potentiel comme médicament pour la prévention et le traitement de diverses maladies virales chez l'homme et l'animal, telles que celles causées par les virus du type des virus des tumeurs animales, car son activité inductrice de FI est excellente,
<EMI ID=48.1>
<EMI ID=49.1>
des virua du type de ceux des tumeurs animale*. De plus, sa toxicité est très faible lorsqu'on l'administre oralement à
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L'invention a encore pour objet un procédé de fabrication d'une substance présentant une activité inductrice d'interféron, selon lequel on extrait ladite substance d'une plante du genre Carthamus, de la famille de Compositae, ou de ses variantes contenant ladite substance, et on récupère la substance dans l'extrait obtenu.
Les plantes convenant au procédé de l'invention croissent en abondance, a l'état sauvage ou cultivé, dans un grand nombre de paya, ces plantes étant susceptibles de former diverses variantes, mutantes et hybrides, de façon naturelle ou arti-
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est cultivé et utilisé depuis longtemps pour ses pigments jaunes et rouges et, à présent, on le cultive principalement dans divers pays, pour l'huile dans les akènes. Sa fleur a aussi été longtemps utilisée pour la fabrication de boissons sino-japonai-
<EMI ID=52.1>
tant une activité inductrice de FI était inconnue jusqu'à présent.
On peut utiliser l'une quelconque des plantée du genre
<EMI ID=53.1>
tion. Des exemples de telles plantes convenant' l'invention
<EMI ID=54.1>
<EMI ID=55.1>
Press, CA. (1965).
En générale parmi les tissus d'une plante, c'est la fleur qui est riche de la substance active de l'invention.
Pour une meilleure conservation et extraction, il est préférable d'utiliser la plante séchée, bien qu'on puisse aussi
<EMI ID=56.1>
chage est quelconque (séchage naturel, par l'air chaud, etc.) et on peut, si on le désire, laver la matière à l'eau avant de l'utiliser.
<EMI ID=57.1>
ture convenable, par exemple entre la température ambiante et le point d'ébullition du mélange d'extraction. Etant donné que la substance active de l'invention est particulièrement soluble dans l'eau dans des conditions alcalines (par exemple, . pH
<EMI ID=58.1>
avant l'emploi, par exemple avec une solution tampon convenable, ou de la soude, de la potasse ou de l'ammoniaque. La durée
<EMI ID=59.1>
à température ambiante, durée qui peut être diminuée si on élève la température de l'extraction. C'est ainsi que l'on peut
<EMI ID=60.1>
<EMI ID=61.1>
d'extraire une portion prépondérante de la substance active contenue dans le produit de départ (dans certains cas, plus de <EMI ID=62.1>
d'extraction excessivement élevée, car la quantité d'impuretés indésirables, telles que des pigments, des substances de bas poids moléculaire, etc., apparaissant dans l'extrait peut alors augmenter. On peut aussi ajouter, si on le désire, un agent
<EMI ID=63.1>
l'extraction en continu ou de façon intermittente, et on peut utiliser tout rapport commode de l'eau d'extraction a la substance brute.
Selon une variante, on peut extraire la substance acti-
<EMI ID=64.1>
organique hydrophile (tel que méthanol, éthanol, propanol, butanol, acétone, etc.), en toutes proportions convenables, de
<EMI ID=65.1>
<EMI ID=66.1>
des solvants organiques hydrophiles, malgré l'insolubilité du produit pur de l'invention dans de tels solvants, lorsque la solution extraite contient un mélange ou un complexe de substances coma les acides grau, les stéroldes, les protéines, la saponine, les mono- ou poly-saccharides et analogues. On suppose que l'extraction avec de tels solvants est rendue possible par effet tampon.
On sépare le résidu du tissu de la plante, de la solution extraite, selon les moyens usuels, par exemple par filtration, pressage, centrifugation, etc. On élimine ensuite les Impuretés indésirables, telles que pigments et substances de bas poids moléculaire, de la liqueur surnageante, afin de permettre la récupération de la fraction active. Des exemples des méthodes préférées utilisées dans ce but sont donnés ci-après.
A) On fractionne la liqueur surnageante par ultrafiltration, par exemple 1 l'aide d'une membrane convenable pour frac- <EMI ID=67.1>
100.000, car la substance active de l'invention est présente sous forme de fractions de poids moléculaires d'environ 100.000 à 3.000.000 (principalement d'environ 500.000 a 1.000.000) . On peut effectuer l'ultrafiltration sous une pression convenable, <EMI ID=68.1>
100.000 ou 200.000. On recueille alors les fractions actives qu'on combine, puis lyophilise, pour obtenir des- poudres brunes.
B) On concentre, si nécessaire, la liqueur surnageante, sous pression réduite, puis on la traite par un solvant organique hydrophile (par exemple méthanol, éthanol, propanol, nbutanol, acétone, etc.) à des concentrations convenables (comme <EMI ID=69.1>
tenant la substance active, puis lyophiliser les précipités pour obtenir des poudres brunes.
C) Au lieu du solvant organique, on peut ajouter à la liqueur surnageante un sel d'ammonium (comme du chlorure ou du <EMI ID=70.1>
logues) , ou un sel minéral métallique (comme le chlorure de zinc
<EMI ID=71.1>
<EMI ID=72.1>
précipité est ensuite soumis au dessalage en utilisant une membrane de dialyse ou un ultrafiltre capable de retenir les subs-
<EMI ID=73.1>
lyophilise pour obtenir une poudre brune.
Il est possible de récupérer la majeure partie de la substance active contenue dans le produit de départ (dans cer-
<EMI ID=74.1>
contenues dans la poudre brute est la plus faible dans le cas
<EMI ID=75.1>
plus, on constate que l'on peut éviter tout effet secondaire
<EMI ID=76.1>
l'animal une grande quantité de cette poudre brute obtenue .suivant la méthode (A) ; on peut donc utiliser cette poudre brute, sans purification ultérieure, pour l'administration orale. A ce.sujet, on remarque que l'on a utilisé par exemple le Safranum (Carthamus tictorius L.) pendant de nombreuses années dans le monde comme boisson populaire sino- japonaise et comme matière première pour la préparation de rouge et d'huile comestible.
On peut, si on la détire, purifier encore la poudre brute obtenue, par exemple par chromatographie sur colonne, en utilisant un agent convenable pour'la filtration sur gel, ou
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l'eau, bien qu'il soit possible d'utiliser une solution tampon convenable. Dans le second cas. on peut éluer avec une solution tampon convenable. Des exemples d'agents préférés pour la filtration sur gel sont donnée par ceux vendue sous les dénomina-
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<EMI ID=79.1>
Bio-Rad Laboratories Ltd. et par celui vendu sous la dénomination commerciale de Sagavac par la Société dite Seravac Laboratories Ltd. des agents préférés pour le traitement par échange d'ions sont, par exemple, ceux *vendue sous les d6nomi-
<EMI ID=80.1>
par la Société Pharmacia Fine Chemicals AB. On peut aussi utiliser pour la purification une cellulose convenable, échangeuse d'anions ou de cations. Le produit ainsi obtenu peut contenir certaines impuretés, bien que son activité inductrice de FI soit suffisante pour son application pratique. On peut, si on le désire, diminuer encore ces impuretés en combinant ces traitements.
L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique comprenant comme ingrédient actif la substance de l'invention, telle que précédemment définie, en association avec une substance porteuse ou un excipient pharmaceutiques.
La composition peut être sous une forme convenable pour son administration orale, rectale ou parentérale. Les compositions pour l'administration orale peuvent être solides ou liquides, nous forme de granules, de comprimés, enrobés ou non, de capsules, de sirops, d'émulsions, de suspensions ou de gouttes, de telles compositions contenant des substances porteuses ou des excipients pharmaceutiquement acceptables. Des excipients conve-
<EMI ID=81.1>
du lactose, des amidons de pomme de terre, des amidons solubles et du stéarate de Magnésium..
<EMI ID=82.1>
comme l'eau stérilisée, ou une huile, comme l'huile d'arachide, contenu en ampoules. Pour l'administration rectale, nous forme de suppositoires, la substance porteuse comprend une base
pour suppositoires.
On peut avantageusement formuler la composition sous forme de doses unitaires, dont chacune fournit une.dose fixe de l'ingrédient actif. Les comprimés, enroba. ou non, les capsules, les suppositoires et les ampoules constituent des exemples de formes convenables de doses unitaires.
L'invention a également pour objet la substance telle que précédemment définie, utilisée comme médicament.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la
<EMI ID=83.1>
dessins annexés, qui représentent plusieurs modes de réalisation suivant l'invention. Sur ces dessins, les figures 1 et 2 représentent, respectivement, les spectres d'absorption dans l'ultraviolet et dans l'infrarouge de la substance active de l'invention.
EXEMPLE 1
Dans une première opération, on lave à l'eau des fleurs
<EMI ID=84.1>
reposer dans l'eau (40 litres) à température ambiante pendant
3 jours, pour effectuer l'extraction, 'suivie de centrifugation
(6.000 tours/minute) pendant 20 minutes pour séparer le résidu, que l'on lave deux fois à l'eau (10 litres chaque fois). On réunit le liquide de lavage avec la liqueur surnageante.. La teneur totale en solides des solutions réunies est de 562,037 grammes (en poids sec). On fractionne les solutions réunies, par ultrafiltration avec un ultrafiltre vendu sous la dénomination commerciale de "Model UD-6 par la Société dite Bio Engineering K.K., et une membrane, vendue sous la dénomination
<EMI ID=85.1>
pour retenir les substances de poids moléculaire supérieur à
200.000, sous une pression de 3 kg/cm2 , et obtenir un résidu qui est alors lyophilisé en donnant une poudre brune (89,46 g).
<EMI ID=86.1>
A titre de comparaison, on effectue un traitement semblable en utilisant la membrane vendue sous la dénomination commerciale
<EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
nir une poudre brune (93,50 grammes) .
Dans une seconde opération, on dissout La première poudre brune (2 grammes) dans l'eau (5 ml) et on transfère la solution dans une colonne (4,5 x 70 cm) garnie de Sephadex G-
<EMI ID=89.1>
divise l'effluent en fractions (chacune de 3 ml) . On recueille les fractions No. 25 à 55, qu'on réunit et lyophilise pour obtenir une poudre blanchâtre (155,04 mg).
Dans une troisième opération, pour purifier davantage, on dissout cette poudre (100 mg) dans une solution tampon de
<EMI ID=90.1>
lution dans une colonne (2,5 x 70 cm) garnie de DEAE-Sephadex A-50 (échangeur d'ions), ; on élue avec une solution tampon de
<EMI ID=91.1>
divise l'effluent en fractions, chacune de 3 ml. On recueille
<EMI ID=92.1>
obtenir une poudre amorphe blanchâtre (72,3 mg) contenant moins d'impuretés et présentant une activité inductrice de FI pratiquement semblable à celle de la première poudre blanchâtre. Le produit final a les caractéristiques physicochimiques telles
que précédemment décrites et sa haute pureté est confirmée par ultracentrifugation et électrophorèse.
A titre de comparaison, on mesure les activités inductrices de FI des substances obtenues dans les opérations respectives de cet exemple, suivant la méthode décrite ci-après dans l'essai 1 (in vitro), pour obtenir les résultats suivants.
<EMI ID=93.1>
<EMI ID=94.1>
EXEMPLE 2
On effectue le môme traitement que celui décrit dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on extrait Carthamus lanatus Linne en laissant les fleurs reposer dans l'eau à température ambiante pendant 2 heures, puis on extrait encore à 100[deg.]C pendant 2 lieu-
<EMI ID=95.1>
(70,3 mg) sont pratiquement les mêmes que celles du produit final de l'exemple 1.
ESSAI 1 - Mesure de l'activité inductrice de FI :
[Référence : Y. Kojima, Kitasato Arch. Exp.
Med., 43:35 (1970)].
(a) Induction de FI in vitro.
On sacrifie un lapin blanc (SPF de Nouvelle-Zélande poids d'environ 1 kg) par piqûre cardiaque, on recueille les cellules de sa rate, de sa moelle épinière et de sa lymphe nodale, qu'on réunit pour préparer une solution contenant les cellules mixtes (10 cellules), qu'on divise en échantillons de 1 ml chacun. On ajoute indépendamment à quatre échantillons, 10,
<EMI ID=96.1>
trifuge pour obtenir des liqueurs surnageantes, dont chacune est utilisée comme échantillon pour la mesure de l'activité inductrice de FI.
(b) Induction de FI in vitro.
On dissout dans 2 ml d'eau le produit final de l'exemple <EMI ID=97.1>
de chaque échantillon et l'utilise comme échantillon pour mesurer l'activité inductrice de FI.
(c) Mesure de l'activité FI.
Dans les deux méthodes (a) et (b) , on utilise comme virus d'attaque le virus Vesicular Stomatitis, pour la mesure de l'activité du FI induit, de la manière suivante. On place une culture monocouche des cellules doublées de RK-13 de lapin, dans un récipient et on lui ajoute une quantité prédéterminée de l'échantillon de solution obtenu en (a) ou (b) ci-dessus. On incube la culture.. 37[deg.]C pendant la nuit, avec addition du virus Vesicular stomatitis comme virus d'attaque. On mesure l'activité FI en fonction du taux de réduction des plaques.
On exprime l'unité d'activité FI selon le nombre Inverse de la plus grande dilution d'échantillon requise pour réduire le nom-
<EMI ID=98.1>
ESSAI 2 - Définition de l'inducteur de FI.
On constate que les échantillons préparée suivant les
<EMI ID=99.1>
stomatitis et du virus Vaccinia dans les cellules doublées de RK-13, provenant de lapins de la même espèce, alors qu'ils n'inhibent pas la croissance du virus Vaccinia dans
les cellules L provenant de souris, d'une espèce animale différente. De plus leurs activités de FI sont désactivées lorsqu'on
selon un processus usuel, en utilisant l'appareil vendu sous la dénomination commerciale de Model AE-2 par la Société dite Toyo Xagaku Sangyo K.R.,, avec une plaque de gel de polyacrylamide (épaisseur 3 mm) et un tampon d'acide borique 0,3M (pH 8,4). La bande unique formée indique que l'échantillon essayé est d'une haute pureté.
<EMI ID=100.1>
Ces constatations confirment que la substance active de la présente invention représente un inducteur de FI.
ESSAI 3.
<EMI ID=101.1>
<EMI ID=102.1>
Bien entendu, l'invention n'eet nullement limitée aux exemples décrits, elle est susceptible de nombreuses variante! accessibles a l'homme de l'art, suivant les applications envisagées et sans s'écarter pour cela du cadre de l'invention.
Interferon inducer and its manufacturing process.
<EMI ID = 1.1>
or virus inhibiting factor, is a substance capable
act on animal cells to inhibit growth
of a virus and it is made up of a type of protein released by the cell in response to viral infection. The activity
<EMI ID = 2.1>
and not specific to a viral species, and it can
be variable in the different conditions used for its induction. It is also known that the growth of certain viruses of the animal tumor type can be appreciably inhibited
by the FI under certain conditions.
A substance capable of acting on animal cells
to induce the FI is called the FI inducer. An inductor
of FI is therefore of potential interest for prevention and
the treatment of various human and animal diseases caused
by viral infection. However, various known IF inducers have never been used in practice, due to some serious drawbacks. This is how, for example, the patent
of the United States of America No. 3,583,893 described, as an inducer
<EMI ID = 3.1>
reading a microorganism and mentions, in the description of the prior art, that a large number of substances, including
bacteria, viruses, polysaccharides, mitogenic agents, endotoxin and other similar substances stimulate the formation of interferon, but none of them
is not interesting for a common use because, inter alias,
their toxicity, their antigenic tick character and their infectious nature. Other known IF inducers are described, for example, in the United States of America patents
No. 3,773,924 and 3,884,845 and in the Japanese patent application Kokai Koho No. 121919/78. These IF inducers are not, however, isolated from plants, and it is also known
<EMI ID = 4.1>
generally disadvantageous for therapeutic applications, due to their high toxicity.
Examples of known mitogenic agents are given <EMI ID = 5.1>
from the tissues of the flageolet, the phytolaque and the faba bean. However, due to their IF inducing activity
<EMI ID = 6.1>
Japanese patent application! tokai Koho No. 32107/78, an IF inducer is described which is supposed to be a species of heteropolymeric saccharide, containing as main constituents
<EMI ID = 7.1>
(40 9), of a molecular weight greater than 100,000, which is
<EMI ID = 8.1>
(Japanese name Toki) it is extracted with hot water to obtain an extraction solution, which is subjected to dialysis to obtain a residue, to which acetone is added to obtain a precipitate, which l 'we are freeze-dried. If desired, the extraction solution can be adjusted to a suitable amount by concentrating it under reduced pressure, or by using a mem-
<EMI ID = 9.1>
an IF inductor, with a molecular weight of over 20,000
(mainly over 100,000), containing as a constituent
<EMI ID = 10.1>
hot water, an organic solvent is added to the extraction solution to obtain a precipitate, a small amount of water is added to the precipitate, the solution is subjected to dialysis to obtain a residue and the latter is lyophilized. We can, if
<EMI ID = 11.1>
a suitable volume per concentration at reduced pressure or <EMI ID = 12.1>
These two IF inducers have low toxicity and are easy to produce. However, the abundant and inexpensive sources of plant tissue from which they are extracted may be lacking, due to the continuous use which is made of them. for several years, as sources of medi-
<EMI ID = 13.1>
excellent properties, as well as their manufacturing process. The invention is based on the discovery that a substance, isolated from the tissues of various plants belonging to the genus
<EMI ID = 14.1>
exhibits excellent IF inducing activity and low
<EMI ID = 15.1>
plant tissue, easily and inexpensively.
According to one embodiment of the invention, a substance is obtained having an IF-inducing activity, which is stable in the form of an amorphous whitish powder and which, in a substantially pure form, has the following physicochemical characteristics.
(1) Elementary analysis.
<EMI ID = 16.1>
Roshi K.K., and by gel filtration, using the product of trade name Sephadex G-200, sold by the company known as Pharmacia Fine Chemical AB).
(3) Melting or decomposition point.
<EMI ID = 17.1>
As shown in Figure 1, described below <EMI ID = 18.1>
(5) IR absorption spectrum.
As shown in Figure 2, described below (by the KBr method).
(6) Solubility in various solvents.
Soluble in water and aqueous solutions of soda, potash and ammonia practically insoluble in the solvents methanol, ethanol, propanol, butanol, acetone, chloroform and ethyl ether.
(7) Colored reactions.
Positive in reactions of Ninhydrin, phenol /
<EMI ID = 19.1>
negative in Elson-Morgan's reaction.
(8) Acidic nature.
(9) Main chemical constituents.
<EMI ID = 20.1>
The amino acids present are measured by hydrolysis with
<EMI ID = 21.1> using the amino acid auto-analyzer, sold under the trade name of Technicon type NC-1, and we measure
<EMI ID = 22.1>
by the company known as Technicon Corp.).
(10) Optical rotation.
<EMI ID = 23.1>
(c - 0.49% in NaOH O, 1N).
Biological characteristics.
1) Inductive activity of FI.
Samples of the IF inducer of the invention are used for the induction of IF in the cells and the serum of test animals and the activity of the IF obtained is measured, according to the method described below in test 1. The results are indicated in Tables I and II which show the inductive activity of positive IF.
<EMI ID = 24.1>
<EMI ID = 25.1>
<EMI ID = 26.1>
<EMI ID = 27.1>
Table II, giving the results obtained according to the method described below in test 1, using two rabbits, <EMI ID = 28.1> is induced in the body of the test animal by the action of IF inducer of the present invention.
2) Stability of the inducing activity of FI.
Samples (each of. 1 mg) of the ingredient are dissolved
<EMI ID = 29.1>
<EMI ID = 30.1>
temperature given for 1 hour. Each sample is then treated according to the method of test 1 (in vitro method) to obtain the results given in Tables III and IV, which show that the IF inducer of the invention has a high heat stability.
TABLE III
<EMI ID = 31.1>
<EMI ID = 32.1>
TABLE IV
<EMI ID = 33.1>
3) Acute toxicity.
Maize mice are used as test animals and
<EMI ID = 34.1>
groups each made up of 10 mice). The mice are administered a physiological solution of sodium chloride, containing
<EMI ID = 35.1>
is lying) . No appreciable difference was observed between the mile and female mice.
4) Anti-tumor activity.
Same breed mice are used as test animals,
<EMI ID = 36.1>
<EMI ID = 37.1>
8-180 Sarcoma (2x2x2 2 mm) or Ehrlich's ascites tumor (2.5 x 10 cells). After 24 hours, the IF inducer of the invention is administered orally to each mouse.
(0.2 mg) dissolved in water. One administration is carried out per day, which is continued for 14 days. There is an appreciable anti-tumor effect.
According to the characteristics previously indicated,
<EMI ID = 38.1>
of proteins and sugars, containing phosphoric acid, <EMI ID = 39.1>
approximately 500,000 to 1,000,000). This substance also conforms to the definition generally accepted for any PI inducer, because it induces IF in the cells * or the serum of the animal, in vivo or in vitro, it is inactivated
<EMI ID = 40.1>
animal species and not specific to viral species. It is therefore assumed that the substance of the invention constitutes not only a new IF inducer, but also a new substance per se, because it has characteristics
<EMI ID = 41.1>
day.
<EMI ID = 42.1>
IF inducing activity (such as phytohemagglutinin, phytolaque mitogen and concanavalin A) are types
proteins with molecular weights greater than 100,000 and. a low IF-inducing activity freight, which is deactivated by heating at 56 [deg.] C for 5 hours. On the contrary, the IF inductor of the invention has different chemical constituents, it is thermally stable mime at 100 "C for several hours and its IF inducing activity is excellent. The known IF inducer, isolated in the root of Angellica acutiloba Kitagawa also has a high molecular weight (higher
<EMI ID = 43.1>
heat by heating at 100 [deg.] C for 1 hour. However, its cons-
<EMI ID = 44.1>
5%) and its IR absorption spectrum are different from those of the inductor of the invention. The known inductor, isolated in the peels of mulberry roots contains, as a main constituent
<EMI ID = 45.1>
area is greater than 20,000 (mainly greater than
60,000) it therefore also differs from the IF inductor of the invention. In addition, the mitogenic activity encountered in known IF inducers, originating from bacterial endotoxin and higher plants, is very low in the IF inducer of the invention.
Various plants, belonging to the genus Carthamus, which <EMI ID = 46.1>
FI of the invention with regard to their * physico-chemical and biological characteristics and do not present. not
<EMI ID = 47.1>
different from those of the FI inductor of the invention.
The IF inducer of the invention is of potential interest as a drug for the prevention and treatment of various viral diseases in humans and animals, such as those caused by viruses of the animal tumor virus type, since its IF inducing activity is excellent,
<EMI ID = 48.1>
<EMI ID = 49.1>
viruses of the type of those of animal tumors *. In addition, its toxicity is very low when administered orally to
<EMI ID = 50.1>
The subject of the invention is also a process for the manufacture of a substance having an interferon-inducing activity, according to which said substance is extracted from a plant of the genus Carthamus, of the family of Compositae, or from its variants containing said substance , and the substance is recovered in the extract obtained.
The plants suitable for the process of the invention grow in abundance, in the wild or cultivated, in a large number of countries, these plants being capable of forming various variants, mutants and hybrids, naturally or artificially.
<EMI ID = 51.1>
has been cultivated and used for a long time for its yellow and red pigments and now it is mainly grown in various countries, for oil in achenes. Its flower has also been used for a long time for the manufacture of Sino-Japanese drinks.
<EMI ID = 52.1>
so much an inducing activity of FI was unknown until now.
You can use any plant of the genus
<EMI ID = 53.1>
tion. Examples of such plants suitable for the invention
<EMI ID = 54.1>
<EMI ID = 55.1>
Press, CA. (1965).
In general, among the tissues of a plant, it is the flower which is rich in the active substance of the invention.
For a better conservation and extraction, it is preferable to use the dried plant, although one can also
<EMI ID = 56.1>
chage is arbitrary (natural drying, by hot air, etc.) and one can, if desired, wash the material with water before using it.
<EMI ID = 57.1>
ture suitable, for example between room temperature and the boiling point of the extraction mixture. Since the active substance of the invention is particularly soluble in water under alkaline conditions (for example,. PH
<EMI ID = 58.1>
before use, for example with a suitable buffer solution, or soda, potash or ammonia. The duration
<EMI ID = 59.1>
at room temperature, time which can be reduced if the extraction temperature is raised. This is how we can
<EMI ID = 60.1>
<EMI ID = 61.1>
extract a predominant portion of the active substance from the starting material (in some cases more than <EMI ID = 62.1>
excessively high extraction, since the amount of undesirable impurities, such as pigments, low molecular weight substances, etc., appearing in the extract may then increase. We can also add, if desired, an agent
<EMI ID = 63.1>
continuous or intermittent extraction, and any convenient ratio of extraction water to the crude can be used.
Alternatively, the active substance can be extracted
<EMI ID = 64.1>
hydrophilic organic (such as methanol, ethanol, propanol, butanol, acetone, etc.), in all suitable proportions, of
<EMI ID = 65.1>
<EMI ID = 66.1>
hydrophilic organic solvents, despite the insolubility of the pure product of the invention in such solvents, when the extracted solution contains a mixture or a complex of substances such as fatty acids, sterids, proteins, saponin, mono- or polysaccharides and the like. It is assumed that extraction with such solvents is made possible by the buffering effect.
The residue from the plant tissue and the extracted solution is separated, according to the usual means, for example by filtration, pressing, centrifugation, etc. Unwanted impurities, such as pigments and low molecular weight substances, are then removed from the supernatant liquor to allow recovery of the active fraction. Examples of the preferred methods used for this purpose are given below.
A) The supernatant liquor is fractionated by ultrafiltration, for example 1 using a membrane suitable for frac- <EMI ID = 67.1>
100,000, since the active substance of the invention is present in the form of molecular weight fractions of about 100,000 to 3,000,000 (mainly about 500,000 to 1,000,000). Ultrafiltration can be carried out under suitable pressure, <EMI ID = 68.1>
100,000 or 200,000. The active fractions are then collected which are combined, then lyophilized, to obtain brown powders.
B) The supernatant liquor is concentrated, if necessary, under reduced pressure, then it is treated with a hydrophilic organic solvent (for example methanol, ethanol, propanol, nbutanol, acetone, etc.) at suitable concentrations (such as <EMI ID = 69.1>
holding the active substance, then lyophilize the precipitates to obtain brown powders.
C) Instead of the organic solvent, an ammonium salt (such as chloride or <EMI ID = 70.1>) can be added to the supernatant liquor
logues), or a metallic mineral salt (such as zinc chloride
<EMI ID = 71.1>
<EMI ID = 72.1>
precipitate is then subjected to desalting using a dialysis membrane or an ultrafilter capable of retaining the
<EMI ID = 73.1>
freeze-drying to obtain a brown powder.
It is possible to recover most of the active substance contained in the starting material (in some
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contained in the raw powder is the lowest in the case
<EMI ID = 75.1>
more, we find that we can avoid any side effect
<EMI ID = 76.1>
the animal a large quantity of this raw powder obtained. following method (A); this raw powder can therefore be used, without further purification, for oral administration. On this subject, we note that we have used for example Safranum (Carthamus tictorius L.) for many years in the world as a popular Sino-Japanese drink and as a raw material for the preparation of red and edible oil .
It is possible, if it is removed, to further purify the crude powder obtained, for example by column chromatography, using an agent suitable for gel filtration, or
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water, although it is possible to use a suitable buffer solution. In the second case. can be eluted with a suitable buffer solution. Examples of preferred agents for gel filtration are given by those sold under the names
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<EMI ID = 79.1>
Bio-Rad Laboratories Ltd. and by that sold under the trade name of Sagavac by the company known as Seravac Laboratories Ltd. preferred agents for ion exchange treatment are, for example, those sold under the names
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by the company Pharmacia Fine Chemicals AB. One can also use for the purification a suitable cellulose, anion or cation exchange. The product thus obtained may contain certain impurities, although its IF-inducing activity is sufficient for its practical application. We can, if desired, further reduce these impurities by combining these treatments.
The subject of the invention is also a pharmaceutical composition comprising as active ingredient the substance of the invention, as defined above, in combination with a carrier substance or a pharmaceutical excipient.
The composition may be in a form suitable for its oral, rectal or parenteral administration. The compositions for oral administration may be solid or liquid, in the form of granules, tablets, coated or not, capsules, syrups, emulsions, suspensions or drops, such compositions containing carrier substances or pharmaceutically acceptable excipients. Suitable excipients
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lactose, potato starches, soluble starches and magnesium stearate.
<EMI ID = 82.1>
such as sterilized water, or an oil, such as peanut oil, contained in ampoules. For rectal administration, we form suppositories, the carrier substance includes a base
for suppositories.
The composition can advantageously be formulated in the form of unit doses, each of which provides a fixed dose of the active ingredient. Tablets, coated. or not, capsules, suppositories and ampoules are examples of suitable forms of unit doses.
A subject of the invention is also the substance as defined above, used as a medicament.
The invention will be better understood on reading the
<EMI ID = 83.1>
attached drawings, which represent several embodiments according to the invention. In these drawings, FIGS. 1 and 2 represent, respectively, the absorption spectra in the ultraviolet and in the infrared of the active substance of the invention.
EXAMPLE 1
In a first operation, flowers are washed with water
<EMI ID = 84.1>
stand in water (40 liters) at room temperature for
3 days, to carry out the extraction, 'followed by centrifugation
(6,000 rpm) for 20 minutes to separate the residue, which is washed twice with water (10 liters each time). The washing liquid is combined with the supernatant liquor. The total solid content of the combined solutions is 562.037 grams (dry weight). The combined solutions are fractionated, by ultrafiltration with an ultrafilter sold under the trade name "Model UD-6 by the company known as Bio Engineering K.K., and a membrane, sold under the name
<EMI ID = 85.1>
to retain substances of molecular weight greater than
200,000, under a pressure of 3 kg / cm2, and obtain a residue which is then lyophilized giving a brown powder (89.46 g).
<EMI ID = 86.1>
For comparison, a similar treatment is carried out using the membrane sold under the trade name.
<EMI ID = 87.1>
<EMI ID = 88.1>
a brown powder (93.50 grams).
In a second operation, the first brown powder (2 grams) is dissolved in water (5 ml) and the solution is transferred to a column (4.5 x 70 cm) packed with Sephadex G-
<EMI ID = 89.1>
divides the effluent into fractions (each 3 ml). Fractions No. 25 to 55 are collected, which are combined and lyophilized to obtain a whitish powder (155.04 mg).
In a third operation, to further purify, this powder (100 mg) is dissolved in a buffer solution of
<EMI ID = 90.1>
lution in a column (2.5 x 70 cm) packed with DEAE-Sephadex A-50 (ion exchanger),; eluted with a buffer solution of
<EMI ID = 91.1>
divides the effluent into fractions, each 3 ml. We collect
<EMI ID = 92.1>
obtain a whitish amorphous powder (72.3 mg) containing less impurities and having an IF-inducing activity practically similar to that of the first whitish powder. The final product has physicochemical characteristics such
as previously described and its high purity is confirmed by ultracentrifugation and electrophoresis.
For comparison, the IF inducing activities of the substances obtained in the respective operations of this example are measured, according to the method described below in test 1 (in vitro), to obtain the following results.
<EMI ID = 93.1>
<EMI ID = 94.1>
EXAMPLE 2
The same treatment is carried out as that described in Example 1, except that Carthamus lanatus Linne is extracted, leaving the flowers to stand in water at room temperature for 2 hours, then extraction is carried out again at 100 [deg .] C for 2 places-
<EMI ID = 95.1>
(70.3 mg) are practically the same as those of the final product of Example 1.
TEST 1 - Measurement of the inducing activity of FI:
[Reference: Y. Kojima, Kitasato Arch. Exp.
Med., 43:35 (1970)].
(a) Induction of IF in vitro.
A white rabbit is sacrificed (New Zealand SPF, weight about 1 kg) by heart bite, the cells of its spleen, spinal cord and nodal lymph are collected, which are combined to prepare a solution containing the mixed cells (10 cells), which are divided into samples of 1 ml each. We add independently to four samples, 10,
<EMI ID = 96.1>
trifuge to obtain supernatant liquors, each of which is used as a sample for the measurement of the inductive activity of FI.
(b) Induction of IF in vitro.
The final product of example <EMI ID = 97.1> is dissolved in 2 ml of water
of each sample and use it as a sample to measure the IF inducing activity.
(c) Measurement of FI activity.
In the two methods (a) and (b), the attack virus Vesicular Stomatitis is used, for the measurement of the activity of the induced IF, in the following manner. A monolayer culture of the rabbit RK-13 doubled cells is placed in a container and a predetermined quantity of the solution sample obtained in (a) or (b) above is added thereto. The culture is incubated .. 37 [deg.] C overnight, with the addition of the Vesicular stomatitis virus as the attack virus. The IF activity is measured as a function of the reduction rate of the plates.
The unit of activity FI is expressed as the inverse number of the largest sample dilution required to reduce the number
<EMI ID = 98.1>
TEST 2 - Definition of the IF inductor.
It can be seen that the samples prepared according to the
<EMI ID = 99.1>
stomatitis and Vaccinia virus in RK-13-doubled cells from rabbits of the same species, while they do not inhibit the growth of Vaccinia virus in
L cells from mice of a different animal species. In addition, their IF activities are deactivated when
according to a usual process, using the apparatus sold under the trade name of Model AE-2 by the company known as Toyo Xagaku Sangyo KR ,, with a polyacrylamide gel plate (thickness 3 mm) and a buffer of boric acid 0 , 3M (pH 8.4). The single strip formed indicates that the sample tested is of high purity.
<EMI ID = 100.1>
These findings confirm that the active substance of the present invention represents an IF inducer.
TEST 3.
<EMI ID = 101.1>
<EMI ID = 102.1>
Of course, the invention is in no way limited to the examples described, it is susceptible of numerous variants! accessible to those skilled in the art, depending on the applications envisaged and without departing from the scope of the invention.