DE3543267A1 - Acylglykan-extrakte von klebsiella, deren gewinnungsverfahren, deren verwendung als arzneimittel und die sie enthaltenden zusammensetzungen - Google Patents

Acylglykan-extrakte von klebsiella, deren gewinnungsverfahren, deren verwendung als arzneimittel und die sie enthaltenden zusammensetzungen

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DE3543267A1 DE19853543267 DE3543267A DE3543267A1 DE 3543267 A1 DE3543267 A1 DE 3543267A1 DE 19853543267 DE19853543267 DE 19853543267 DE 3543267 A DE3543267 A DE 3543267A DE 3543267 A1 DE3543267 A1 DE 3543267A1
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    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins

Description

ROUSSEL-UCLAF
Paris, Frankreich
Acylglykan-Extrakte von Klebsiella, deren Gewinnungsverfahren, deren Verwendung als Arzneimittel und die sie enthaltenden Zusammensetzungen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Acylglykan-Extrakte von Klebsiella, deren Gewinnungsverfahren, deren Verwendung als Arzneimittel und diese enthaltenden Zusammenset zungen.
In einer bestimmten Anzahl französischer Patentschriften wurden Glykoprotein-Extrakte lysierter Mikroorganismenkörper von Klebsiella und/oder deren Herstellungsverfahren beschrieben. Dies trifft beispielsweise für die . FR-PSen 2 043 475, 2 088 112, 2 171 907, 2 462 477, 2 490 495, 2 490 496 und 2 540 136 zu.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue bakterielle Extrakte und hat somit Acylglykan-Extrakte von Klebsiella zum Gegenstand, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie im wesentlichen aus etwa 80% neutralen Ösen und 20% Lipiden, die weniger als 2% Proteine enthalten, bestehen und ein Molekulargewicht von etwa 12 500 besitzen.
Mit neutralen Ösen bezeichnet man Ösen, die keinen basischen oder sauren Rest besitzen, insbesondere neutrale Hexosen, wie Glucose, Galactose oder Mannose.
Sie werden nach der Methode von Tillmans und Philippi (Biochem.Z., 1929, 215» 36), die von Riraington (Biochem. J., 1931, 25, 1062) modifiziert wurde, bestimmt.
Die Proteine werden nach der Methode von Lowry (J.Biol. Chem. 1951, 193, 265-273) bestimmt.
Die Lipide werden durch Chromatographie in der Gasphase nach Methanolyse bestimmt.
Das Molekulargewicht der Acylglykane der vorliegenden Erfindung wurde durch Filtration an hydrophilem und unlöslichem Gel auf Dextran-Basis, wie Sephadex^· ', mit einer chromatographischen Schwelle bzw. Retentionsschwelle t entsprechend 50 000 bestimmt.
Die bevorzugten Acylglykane sind diejenigen, bei denen die Ösen in den folgenden, annähernden, relativen Anteilen je 1 Glucose vorliegen: etwa 4 Galactose, etwa 1 Mannose und etwa 1 Heptose. Diese Bestimmung kann beispielsweise durch Chromatographie in der Gasphase erfolgen.
Bevorzugtere Acylglykane enthalten eine Galactosenkette mit ß 1 —> 3-Verknüpfung mit einem Molekulargewicht von etwa 9000.
Die erfindungsgemäßen Acylglykane können Extrakte von
C verschiedenen Klebsiella-Gattungen sein. Man greift indessen insbesondere auf diejenigen zurück, die Klebsieila pneumoniae entstammen, und vor allem auf diejenigen, die dem Stamm entstammen, der im Pasteur-Institut oder in der Collection Nationale de Culture de Microorganismes die Nummern 52145 und 1-163 und in der National Culture Type Collection die Nummer 5 055 bestitzt. Dieser Stamm befindet sich seit langem im Handel und ist der Öffentlichkeit frei verfügbar, insbesondere über das Pasteur-Institut in Paris unter der Referenz 52145. Dieser Stamm wurde überdies von der Anmelderin am
25. Juni 1981 unter der Nr. 1-163 im Institut Pasteur (noch bezeichnet als Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) hinterlegt.
Außer durch die Ösen und Lipide sind die erfindungsgemäßen Acylglykane durch die Anwesenheit von 2-Keto-3-desoxy-octolosonsäure, von Glucosaminen, von Phosphaten, von α- und ß-Hydroxy-myristinsäure und von Palmitinsäure gekennzeichnet.
Die erfindungsgemäßen Acylglykane liegen in Form eines wasserlöslichen, geruchlosen, weißen Pulvers vor.
Wie alle Moleküle biologischen Ursprungs, sind sie hydratisiert oder sind leicht hydratisierbar. Ihr Infrarot-Spektrum ist somit nicht charakteristisch, wobei die zahlreichen Peaks untereinander verschmelzen. Ihr Schmelzpunkt ist nicht charakteristischer, da es sich um eine Carbonisierung handelt, die innerhalb eines breiten Temperaturbereichs erfolgt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung von Acylglykanen, wie vorstehend definiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen wasserlöslichen Bakterienextrakt von Klebsieila, der 30 bis h5% Proteine, 30 bis 40% neutrale Ösen, einen geringen Anteil an Uronsäuren, 2 bis 5% Osamine umfaßt und ein Molekulargewicht von etwa 350 000 aufweist, mit einem Detergens behandelt, auf etwa 800C erhitzt, an hydrophobem, verzweigtem Siliciumdioxid chromatographiert und die dem Elutionspeak entsprechende Fraktion, die durch Spektrometrie bei 200 nm festgestellt wird, bei 280 nm verschwindet und bei 492 nm nach Färbung mit Phenols chwefelsäure erscheint, zurückgewinnt.
Unter einem geringen Anteil an Uronsäuren versteht man weniger als 6% Uronsäuren und vorzugsweise weniger als 4%
Die wasserlöslichen Bakterienextrakte von Klebsiella, von denen das Verfahren ausgeht, können insbesondere erhalten werden durch Kultivierung von der Gattung Klebsiella angehörenden Stämmen, Lyse der Stämme, Trocknung, Delipidation durch Extraktion mit Lösungsmitteln für Lipide, Ultrafiltration, Behandlung der so erhaltenen, wäßrigen Lösung mit einem quaternären Ammoniumsalz, Eliminierung des Niederschlags, danach entweder Behandlung des Überstands in der Kälte mit einem Alkanol mit niedrigem Molekulargewicht, Isolierung, danach Auflösung in Wasser, Dialyse und Trocknung des erhaltenen Produkts, Wiederauflösung, Filtration an einem Gel, anschließende Isolierung der ersten eluierten Fraktion und Trocknung oder Einengung des Überstände unter Verwendung von wenigstens einer Vorrichtung bzw. Maßnahme zur Selektionierung von Molekülen, Behandlung des Konzentrats in der Kälte mit einem Alkanol und Isolierung des erhaltenen Niederschlags.
Derartige Herstellungen wurden bereits insbesondere in der FR-PS 2 490 496 und in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0.049.182, die unter der Nr.29.070 E von Derwent Publications Farmdoc book Nr.1500 vom 2. Juni 1980 veröffentlicht wurde, sowie in der FR-PS 2 540 136 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Gewinnung von Acylglykanen, wie vorstehend definiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen wasserlöslichen Bakterienextrakt von Klebsiella,
der wie vorstehend hergestellt wurde, mit einem Detergens behandelt, auf etwa 800C erhitzt, an verzweigtem, hydrophobem Siliciumdioxid chromatographiert, die dem dritten Elutionspeak entsprechende Fraktion, der durch Spektrometrie bei 200 nm festgestellt wird, bei 280 nm verschwindet und bei 492 nm nach Färbung mit Phenolschwefelsäure erscheint, zurückgewinnt.
Andere wasserlösliche Bakterien-Ausgangsextrakte von Klebsiella, die für die Durchführung des Verfahrens geeignet sind, werden beispielsweise durch Kultivierung von Stämmen, Lyse der Stämme durch Zerkleinerung, fraktioniertes Zentrifugieren, um die Zellenbruchstücke unter einer Beschleunigung von etwa 8000 g, danach die Membranen unter einer Beschleunigung von 20 000 bis 40 000 g zu sedimentieren, Abtrennung des rohen Extrakts durch fraktioniertes Zentrifugieren in Salzlösung und in Wasser, Behandlung mit einer Base oder einem Hypobromit, Eliminierung von Reagensüberschuß und unlöslichem Rückstand, Behandlung mit einer wäßrigen Essigsäurelösung bei einer Temperatur von 70 bis 10O0C, Eliminierung der unlöslichen Fraktion, Delipidation durch Extraktion mit Lösungsmitteln für Lipide, Behandlung mit Lysozym, Abtrennung der Fraktion mit einem Molekulargewicht von etwa 350 000 und Trocknen. Ein Beispiel für eine derartige Herstellung findet sich z.B. in der europäischen Anmeldung Nr. 0089266.
Die Produkte, die Detergenseigenschaften besitzen, sind gut bekannt. Es handelt sich z.B. um quaternäre Ammoniumsalze, insbesondere um quaternäre Ammoniumhalogenide, wie Tetraethy!ammoniumjodid, N-Hexadecyl-NiN-dimethylbenzol-methanaminiumchlorid, N-Hexadecyl-2-hydroxy-N,N, N-trimethyl-1-hexadecanaminiumbromid, die Ν,Ν,Ν-Trimethy1-1-hexadecanaminiumhalogenide oder die Cetylpyridiniumhalogenide.
Es handelt sich auch um Alkalisulfate oder -sulfonate vom Alkylester- oder Alkarylester-Typ, wie das Natriumdioctylsulfosuccinat, das Natriumdodecylbenzolsulfonat, das Natriumdodecylsulfat, das Natriumtetradecylsulfat, das Lithiumdodecylsulfat, die Polyethylenglykol-mono-(nony!phenyl)-ether, wie Triton Ν*1 ', die Polyethylenglykol-p-isooctylphenylether, wie Triton x' , oder die Polymeren von 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)-phenol mit Formaldehyd und Oxiran, wie Triton' 'A20.
Vorzugsweise handelt es sich um ein Alkalisulfat vom Alkylester-Typ, wie Natriumdodecylsulfat.
Das Detergens wird in Lösung in einem pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel verwendet, das dem Detergens dessen detersive Eigenschaften beläßt, vorzugsweise in Lösung in Wasser. Entsprechend der Detergensstärke wird es in einer Konzentration von etwa Λ% im Falle von sehr starken Detergensprodukten, wie Natriumdodecylsulf at, verwendet oder konzentrierter, z.B. 2 bis 10% im Falle von quaternären Ammoniumsalzen.
Die Temperatur von etwa 800C wird einige Minuten, vorzugsweise etwa 5 Minuten, beibehalten.
Das für die Chromatographie verwendete Siliciumdioxidgel besteht aus Siliciumdioxid, dem hydrophobe Gruppen, vorzugsweise von Fettsäuren, aufgepfropft sind. Die Fettsäuren können z.B. C-r ,q- und. insbesondere C,
Fettsäuren sein. Vorzugsweise verwendet man das unter der Be
te Gel
wei
der Bezeichnung Aquapore^ 'RP300 in den Handel gebrachDie Bestimmung der interessanten Fraktion von Kohlenhydrat-Natur, die im wesentlichen von Proteinen frei ist, er-
folgt beispielsweise durch Spektrophotometrie bei 200 nm (Nachweis der Kohlen/ uncLavon Proteinen), 280 nra (alleiniger Nachweis der Proteine), 492 nm nach Färbimg mit Phenolschwefelsäure (alleiniger Nachweis von Zuckern).
Die Elution erfolgt vorzugsweise mit einem Acetonitril-0,1%ige pH 1,8 wäßrige Trifluoressigsäurelösung-Gemisch, das als Gradient verwendet wird. Vorteilhafterweise besteht der Gradient sukzessive aus einem Aceton!tril-Trifluoressigsäurelösung-Gemisch 20/80, dann 50/50. Unter diesen Bedingungen entsprechen die gewünschten Acylglykane dem dritten, bei 200 nm festgestellten Peak, wenn man ein Cg-GeI verwendet. Dieser Peak verschwindet bei 280 nm und erscheint nach Färbung mit Phenolschwefelsäure bei 492 nm.
Die Isolierung der Acylglykane erfolgt nach einer klassischen Arbeitsweise für mit kleinen Molekülen gemischten Makromolekülen, d.h. beispielsweise durch Ultrafiltration mit Membranen mit einer Retentionsschwelle von 5000 beispielsweise, durch Dialyse oder durch Gelchromatographie .
jt Die Acylglykane können dann z.B. durch Lyophilisierung, Verdampfen oder Zerstäuben getrocknet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Acylglykane, die nach den vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten werden, d.h. wenn sie aufgrund der Durchführung dieser Verfahren erhalten werden oder wenn sie physiochemische Merkmale besitzen, die denjenigen der Acylglykane analog sind, die aufgrund der Durchführung dieser Verfahren erhalten werden.
Die erfindungsgeraäßen Acylglykane besitzen sehr interessante pharmakologisehe Eigenschaften; sie sind insbesondere mit bemerkenswerten anti-allergischen und immunomodulatorischen Eigenschaften versehen. Sie stimulieren insbesondere die Immunität über die zelluläre Einwirkung.
Unter den immuno-modulatorisehen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Acylglykane kann man insbesondere die Eigenschaften einer Stimulierung der Interleukine I-Sekretion und des Colony Stimulating Factor sowie von mitogenen Eigenschaften nennen.
Diese Eigenschaften werden nachstehend im experimentellen Teil veranschaulicht.
Diese Eigenschaften rechtfertigen die Verwendung der erfindungsgemäßen Acylglykane als Arzneimittel.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Anwendung der Acylglykane, wie vorstehend definiert, als Arzneimittel bei deren Verwendung bei einer heilenden oder präventiven therapeutischen Behandlungsmethode des menschlichen oder tierischen Körpers.
Unter den erfindungsgemäßen Acylglykanen greift man vor allem auf die Acylglykane zurück, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus den Acylglykanen bestehen, wie sie nach erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, zu deren Verwendung bei einer heilenden oder präventiven therapeutischen Behandlungsmethode des menschlichen oder tierischen Körpers.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel finden beispielsweise bei der Behandlung oder Vorbeugung bei Mensch und Tier
von infektiösen Erkrankungen Verwendung, die von Bakterien oder Viren verursacht werden, bei der Behandlung von Erkrankungen aufgrund von Parasiten, von Toxi-Infektionen, bei der Behandlung von post-hospitalen und postchirurgischen Infektionen und von Allergien jeglichen Ursprungs.
Zu Präventivzwecken können die erfindungsgemäßen Acylglykane allein eingesetzt werden. Sie können auch als Adjuvans in Vakzinen verwendet werden.
Die übliche Dosis, die entsprechend dem verwendeten Derivat, dem Patienten und der jeweiligen Erkrankung^variieren kann, kann beispielsweise 1 mg bis 15 mg/Tag betragen. Bei der oralen Verabreichung an den Menschen kann das Derivat des Beispiels 1 in einer Tagesdosis von 2 mg bis 10 mg, z.B. bei der Behandlung der chronischen Bronchitis, entsprechend etwa 0,03 mg bis 0,15 mg/kg Körpergewicht, verwendet werden.
Die Erfindung betrifft schließlich pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Acylglykane als Wirkstoff enthalten.
Als Arzneimittel werden die erfindungsgemäßen Acylglykane über den Verdauungsweg, den parenteralen Weg oder den lokalen Weg verabreicht.
Die entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können z.B. Feststoffe oder Flüssigkeiten sein und in pharmazeutischen Formen vorliegen, wie sie üblicherweise in der Humanmedizin verwendet werden, wie z.B. einfache oder dragierte Tabletten, Gelkapseln, Granulate, Lösungen, Sirupe, Suppositorien, lyophilisierte oder
nicht-lyophilisierte, injizierbare Präparate, Ovula, Cremes, Pomaden, Lotionen, Tropfen, Augentropfen, Aerosole. Sie werden nach üblichen Methoden hergestellt. Der oder die · Wirkstoffe können hierbei Exzipienten einverleibt werden, die üblicherweise in derartigen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, wie Talk, Gummiarabikum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige oder nicht-wäßrige Träger, Fettkörper tierischen oder pflanzliehen Ursprungs, Paraffinderivate, Glykole, verschiedene Netz-, Dispergier- oder Emulgiermittel und Konservierungsmittel.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Man gibt 7,83 ml einer i&Lgen wäßrigen Natriumdodecylsulfat-Lösung zu 235 mg wasserlöslichem Bakterienextrakt von Klebsiella, der, wie nachstehend,gemäß Variante b hergestellt wurde, und erhitzt 5 niin auf 800C. Nach dem Abkühlen Chromatographiert man in Fraktionen von 0,5 ml an einer Kolonne für Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) von mit Cp-Fettsäuren gepfropftem Siliciumdioxid (Aquapore^ 'RP300 von 4,6 χ 25 cm), wobei man mit einem Acetonitril-0,1^ige pH 1,8 wäßrige Trifluoressigsäurelösung-Gradienten bei einem Durchsatz von 2 ml/min unter den folgenden Bedingungen eluiert (siehe nachstehende Tabelle):
Zeitdauer
10 20 35 45 60 80
Acetonitril wasse
0 100
0 100
20 80
20 80
50 50
50 50
100 0
Man isoliert die dem dritten Peak, der durch Spektrometrie bei 200 nm bestimmt wird, entsprechenden Fraktionen, eliminiert die kleinen Moleküle durch Dialyse und bringt zur Trockene. Man erhält 67,85 mg erwartete Acylglykane.
Analyse:
C = 42%, H = 7,8% N = 0,3%
Proteine 0,8%, Zucker 80%, Lipide 24,5%.
Herstellung des wasserlöslichen Bakterienextrakts von Klebsiella, von dem ausgegangen wird: Stufe Ai Kultur
Man stellt ein Kulturmilieu der folgenden Formulierung her:
Fleischextrakt ■ 690 g
Natriumchlorid 690 g
Caseinpeptan 690 g
Hefeautolysat 690 g
Bikaliumphosphat 483 g
Monokaliumphosphat 207 g
Glucose 4104 g
Soja-Papainpepton 2760 g
destilliertes Wasser q.s. für 138 1
Man stellt das Kulturmilieu her, indem man nacheinander den Fleischextrakt, das Natriumchlorid, das Caseinpepton, das Hefeautolysat, das Bikaliumphosphat und das Monokaliumphosphat in etwa 20 1 destilliertem Wasser mischt. Man stellt den pH auf etwa 7 ein.
Man sterilisiert das Milieu 40 min bei 1200C. Die Lösungen der Glucose und des Soja-Papainpeptons werden in das Kulturmilieu zum Zeitpunkt der Impfung bzw. des Ansetzens der Kultur nach vorangegangener Sterilisierung eingebracht.
Der Klebsiella-Stamm (Institut Pasteur Nr. 1-163) wird in 50 ecm Kulturmilieu angesetzt. Diese Lösung, die als Inokulum dient, wird in den Rest der Kulturbrühe eingebracht. Man stellt das Gesamtvolumen des Kulturmilieus durch Zugabe von sterilem, destilliertem Wasser auf 138 1 ein.
Das Kulturmilieu wird bei 370C gehalten und der pH automatisch auf etwa 7 eingestellt (durch Zugabe einer Ammoniaklösung oder durch Zugabe einer Chlorwasserstoffsäurelösung) .
Das Wachstum der Stämme wird photometrisch bewertet.
Stufe B: Lyse
Zu 138 1 Kulturbrühe mit vollständiger Entwicklung, die in der vorstehenden Stufe A erhalten wurde, gibt man eine wäßrige Lysozymhydrochlorid-Lösung (sterilisiert durch Filtrieren an einer Membran) zu, um eine Endkonzentration von 1βΟ γ Lysozymhydrochlorid/cm Kulturmilieu zu erhalten.
Man hält 1 h bei 560C in Gegenwart von 0,25 g EDTA/l Brühe, 862,5 mg Natriummercurothiolat und 80 g PoIysorbat (unter der Bezeichnung Tween 80 in den Handel gebracht) je Liter Kulturbrühe in Kontakt.
Man setzt die Lyse etwa 10 Tage bei 370C unter sterilen Bedingungen fort.
Man gewinnt das Lysat, homogenisiert durch Rühren bzw. Bewegen und lyophilisiert dann.
Stufe C: Behandlung
a) mit Aceton:
Man suspendiert in 138 1 Aceton das in der vorangegangenen Stufe B erhaltene Pulver und rührt dann kräftig etwa 3 h.
Die Suspension wird dann zentrifugiert und man gewinnt ein Pulver, das man absaugt.
b) mit Methanol:
Das vorstehend erhaltene Pulver wird in 138 1 Methanol suspendiert und kräftig etwa 3 h gerührt.
Die erhaltene Suspension wird dann zentrifugiert.
Das abgesaugte Pulver wird bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet.
Stufe D: Ultrafiltration
Man löst in 6 χ 10 1 destilliertem Wasser, das 1 g/l Merthiolat enthält, sechs gleiche Teile des in der vorangegangenen Stufe C erhaltenen Pulvers.
Man hält die Lösung 24 h bei +40C unter Rühren, zentrifugiert etwa 2 h bei 20 000 g, dann bei 60 000 g.
Man gewinnt die Lösung, die man mit filtriertem, destilliertem Wasser (an einer Sterilisationsmembran) auf 10 auffüllt. Man bringt die erhaltene Lösung in eine Diafiltrationsvorrichtung ein, die mit porösen Membranen für die Ultrafiltration ausgestattet ist, deren Retentionsschwelle 300 000 beträgt und die einen scheinbaren Porendurchmesser von etwa 2 % besitzen (unter der Bezeichnung XM 300 von der Firma Amicon und der Firma Romicon in den Handel gebrachte Membranen).
Man läßt in der Vorrichtung 50 Volumina destilliertes Wasser entsprechend einem Volumen von 500 1 zirkulieren.
Die diafiltrierte Lösung wird gewonnen und dann bei 60 000 g zentrifugiert und die erhaltene Lösung lyophilisiert.
Stufe E; Variante a
Man löst 20 g des in der vorhergehenden Stufe D erhaltenen Produkts in 2 1 permutiertem Wasser.
Man gibt langsam etwa 1,6 1 Cetyltrimethylammoniumbromid zu 3% in Wasser zu, rührt das Ganze 1 h und zentrifugiert dann bei 10 000 U/min während 15 min. Man entfernt den Niederschlag, gibt hierauf zu dem isolierten Überstand 3 1 Ethanol von 95° innerhalb 15 min. Nach einstündigem Rühren zentrifugiert man bei 10 000 U/ min 15 min lang. Der so erhaltene Überstand wird entfernt und der Niederschlag in 1 1 Wasser wieder aufgelöst und dann 48 h in Visking^ '-Rohren gegen permutiertes Wasser bei +40C dialysiert. Am Ende dieser Dialyse wird die Lösung lyophilisiert. Man gewinnt 6,2 g Glycoproteine, von denen man 1 g in 19 ml einer 0,1 M wäßrigen Ammoniumcarbonatlösung löst. Die Lösung leitet man über eine Kolonne mit einem Durchmesser von 2,5 cm, die 1 1 Ultragel^R^ACA34 enthält (Elutionsmittel: 0,1 M wäßrige Ammoniumcarbonatlösung); die dem ersten EIutionspeak entsprechenden Fraktionen (Nachweis mit UV bei 280 mn) werden gesammelt und lyophilisiert, und man gewinnt 0,51 g wasserlöslichen Bakterienextrakt von Klebsieila.
Variante b
Man bringt in eine wäßrige Lösung von 10 g/l 1 kg des in der vorstehenden Stufe D erhaltenen Produkts ein.
Man gibt 0,8 Volumina 3%ige wäßrige Cetyltrimethylammoniumbromid-Lösung in einer Menge von etwa 1 l/min zu und rührt mäßig während 1 h. Man entfernt den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren kontinuierlich mit einem Durchsatz von etwa 5 l/h bei 62 000 g.
Der Überstand wird durch Ultrafiltration an Hohlfasern mit einer bei 5000 fixierten Retentionsschwelle (Hollow Fibers H10P5 von Amicon und Romicon in den Handel gebracht) in zwei Behandlungszyklen in den Verhältnissen 5/1 konzentriert. Man gibt in einer Geschwindigkeit von 3 l/min 6 Volumina 96%iges Ethanol zu und rührt 15 min mäßig. Man läßt dekantieren, saugt ab und spült den Niederschlag, trocknet bei weniger als 40°C in Gegenwart eines Dehydratationsmittels, homogenisiert durch mechanisches Zerkleinern und gewinnt 200 g wassserlöslichen Bakterienextrakt von Klebsiella.
Beispiel 2
Man stellte Tabletten der folgenden Formulierung her: Produkt von Beispiel 1 1 mg
Exzipient q.s. für eine Tablatte mit einem Endgewicht von 100 mg
(Bestandteile des Exzipienten: Lactose, Stärke, Talk, Magnesiumstearat).
Beispiel 3
Man stellte Aerosole her, die Dosen mit dem folgenden Inhalt freisetzten:
Produkt von Beispiel 1 0,5 mg
Emulgiermittel 0,15 mg
Treibmittel 50 mg
Beispiel 4
Man stellte eine Creme mit der folgenden Formulierung her:
Produkt von Beispiel 1 1 mg
Exzipient: 2-Octyldodecanolalkohol, Cetostearylalkohol, Natriumketostearylsulfat,
Methyl- und Propyl-p-hydroxybenzoat, gereinigtes Wasser 10 mg
Pharmakologische Untersuchungen
1. Test der verzögerten Hypersensibilitätsreaktion (HSR)
gegenüber roten Blutkörperchen des Schafes (GRM) Methode
Die Untersuchung wurde an Gruppen von 10 weiblichen Mäusen mit einem Alter von 9 bis 10 Wochen und einem Gewicht von etwa 20 g durchgeführt.
Die Behandlung erfolgte 3 h vor der Immunisierung mit
den GRM durch intraperitoneale Injektion von 0,5 ml NaCl von 9%o,enthaltend das zu untersuchende Produkt. Die un-
—6
tersuchten Dosen betragen 10, 100 und 1000 χ 10 g/kg.
Die Immunisierung erfolgte 3 h nach der Behandlung durch intravenöse Injektion von GRM (10 GRM/Maus).
Die Sichtbarmachung der HSR erfolgte 4 Tage später durch intraplantare Injektion in die linke Hinterpfote von
40 χ 10 1 einer GRM-Suspension.
Die Bewertung wurde 24 h nach der Sichtbarmachung durch
Messung der Dicke der linken und rechten Hinterpfote
durchgeführt.
Die Ergebnisse werden durch den Unterschied zwischen den Dicken der linken und rechten Hinterpfote einer jeden
Maus ausgedrückt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle angegeben.
Behandlung Unterschied 10" g/kg nm
Vergleichsgruppe O 3,23 ± 0,76
behandelte 10 4,74+0,95
Gruppen 100 6,33+0,93
1000 9,00 ± 1,80
Jede Erhöhung der Unterschiede zwischen linker und rechter Pfote in bezug auf die Vergleichsgruppe drückt eine Erhöhung der verzögerten Hypersensibilitätsreaktianen aus. Man beobachtet, daß bei allen untersuchten Dosen (10, 100, 1000 χ 10 g/kg) die erfindungsgemäßen Acylglykane erheblich die HSR-Reaktionen erhöhen.
2. Akute Toxizität
Die letale Dosis 50 (IAr0) "bei intraperitonealer Verabreichung bei der Maus wurde nach der Methode von Behrens und Karber bestimmt.
Sie beträgt etwa 20 mg/kg für die Acylglykane von Beispiel 1.

Claims (11)

Dr. F. Zum stein seh.- Dr. B.-Äesmann 3543267 Dipl.-Ing. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun. PATENTANWÄLTE ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE- Gas 2114/D Patentansprüche
1. Acylglykan-Extrakte von Klebsiella, dadurch gei kennzeichnet, daß sie im wesentlichen aus etwa 80% neu-
; tralen Ösen und 20% Lipiden, die weniger als 2% Proteine
i enthalten, bestehen und ein Molekulargewicht von etwa
[ 12 500 besitzen.
j
2. Acylglykane gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich-
j net, daß die Ösen in den folgenden ungefähren relati-
i ven Anteilen je 1 Glucose vorliegen: etwa 4 Galactosen,
f etwa 1 Mannose und etwa 1 Heptose.
3. Acylglykane gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Kette von Galactosen, die
ß 1 —^ 3 verknüpft sind, mit einem Molekulargewicht von etwa 9000 umfassen.
4. Acylglykane gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie Klebsiella pneumoniae entstammen.
5. Acylglykane gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie dem Stamm entstammen, der im Pasteur-Institut oder in der Collection Nationale de Culture de Microorganismes die Nummern 52 145 und 1-163 und in der National Culture Type Collection die Nummer 5055 besitzt.
6. Verfahren zur Gewinnung von Acylglykanen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen wasserlöslichen Bakterienextrakt von Klebsieila, der 30 bis 45% Proteine, 30 bis 40% neutrale Ösen, einen geringen Anteil an Uronsäuren, 2 bis 5% Osamine besitzt und ein Molekulargewicht von etwa 350 000 aufweist, mit Hilfe eines Detergens auf etwa 800C erhitzt, an hydrophobem, verzweigten bzw. gepfropften Siliciumdioxid chromatographiert und die dem dritten Elutionspeak entsprechende
/Fraktion, die durch Spektrometrie bei 2C0nm festgestellt wird und bei 280 nm verschwindet, zurückgewinnt.
7. Verfahren zur Gewinnung von Acylglykanen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem man einen wasserlöslichen Bakterienextrakt von Klebsieila herstellt, wie eines solchen, der erhalten wird durch Kultivierung von der Gattung Klebsiella angehörenden Stämmen, Lyse der Stämme, Trocknung, Delipidation durch Extraktion mit Hilfe von Lösungsmitteln für Lipide, Ultrafiltration, Behandlung der so erhaltenen, wäßrigen Lösung mit einem quaternären Ammoniumsalz, Eliminierung des Niederschlags, anschließend entweder Behandlung des Überstands in der Kälte mit einem Alkanol mit niedrigem Molekulargewicht, Isolierung, anschließende Auflösung in Wasser, Dialyse und Trocknung des erhaltenen Produkts, erneute Auflösung, Filtration an einem Gel, anschließende Isolierung der ersten eluierten Fraktion und Trocknung oder
Einengung des Überstände unter Verwendung von zumindest
bzw. Maßnahme
einer Vorrichtung/zur Selektionierung von Molekülen, Behandlung des Konzentrats in der Kälte mit einem Alkanol und Isolierung des erhaltenen Niederschlags, dadurch gekennzeichnet, daß man den wasserlöslichen Bakterienextrakt von Klebsiella mit einem Detergens behandelt, auf etwa 8O0C erhitzt, an verzweigtem hydrophoben Siliciumdioxid chromatographiert und die dem Elutionspeak entsprechende Fraktion, die durch Spektrometrie bei 200 mn festgestellt wird, bei 280 nm verschwindet und bei 492 nm nach Färbung mit Phenolschwefelsäure erscheint, zurückgewinnt.
8. Verfahren gemäß Anspruch β oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß
das Detergens ein Alkalisulfat vom Alkylester-Typ ist und
die Elution mit einem Acetonitril-0,1%ige pH 1,8 wäßrige Trifluoressigsäurelösung-Gradienten durchgeführt wird.
9. Acylglykane, erhalten nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6, 7 oder 8.
10. Acylglykane gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 9 zur Verwendung bei einer präventiven oder heilenden therapeutischen Behandlungsmethode des menschlichen oder tierischen Körpers.
11. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff die Acylglykane gemäß Anspruch 10 enthalten.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0213099A3 (de) * 1985-08-23 1989-07-19 Cederroth Nordic Aktiebolag Mittel mit antiphlogistischer, immunstimulierender und zytoprotektiver Wirkung, ihre Herstellung und pharmazeutische Verwendungen
JPS62282592A (ja) * 1986-05-30 1987-12-08 Kureha Chem Ind Co Ltd 高粘性ｂｓ−１物質及びその製造法
FR2620130B1 (fr) * 1987-09-08 1990-01-12 Lipha Nouveaux polysaccharides hydrosolubles, leur procede d'obtention, leur application a titre de medicaments et preparation les renfermant
FR2648351A1 (fr) * 1989-06-20 1990-12-21 Roussel Uclaf Utilisation de complexes glycoproteiques extraits de bacteries gram(-) pour la fabrication d'un medicament facilitant la cicatrisation de la peau et procede de preparation
FR2650506B1 (fr) * 1989-07-11 1991-11-08 Roussel Uclaf Galactanne extrait de klebsiella, procede d'obtention et application a titre de medicament
FR2655267B1 (fr) * 1989-12-04 1992-04-03 Roussel Uclaf Nouveau derive sulfate du galactanne extrait de klebsiella, procede de preparation, application a titre de medicaments et compositions pharmaceutiques le renfermant.
GB9224956D0 (en) * 1992-11-28 1993-01-20 Euro Dpc Ltd Improvements relating to allergen testing & apparatus
FR2809014A1 (fr) * 2000-05-16 2001-11-23 Pf Medicament Utilisation d'une proteine ompa d'enterobacterie comme agent antimicrobien

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2043475A1 (de) * 1969-05-20 1971-02-19 Cassenne Lab Sa
FR2088112A2 (de) * 1970-05-20 1972-01-07 Cassenne Lab Sa
FR2171907A2 (de) * 1972-02-15 1973-09-28 Cassenne Lab Sa
FR2462477A1 (fr) * 1979-07-31 1981-02-13 Cassenne Lab Sa Nouvelles glycoproteines de klebsiella pneumoniae, procede d'obtention, application a titre de medicaments et compositions les renfermant
FR2490496A1 (fr) * 1980-09-19 1982-03-26 Roussel Uclaf Nouvelles glycoproteines immunostimulantes extraites de klebsiella pneumoniae, leur procede d'obtention, leur application a titre de medicaments et les compositions les renfermant
FR2490495A1 (fr) * 1980-09-19 1982-03-26 Roussel Uclaf Nouvelles glycoproteines hydrosolubles immunostimulantes extraites de klebsiella pneumoniae, leur procede d'obtention, leur application a titre de medicaments et les compositions les renfermant
EP0089266A1 (de) * 1982-03-09 1983-09-21 Pierre Fabre S.A. Verfahren zur Herstellung von interferoninduzierenden immunostimulierenden Proteoglykanen, die so erhaltenen Proteoglykane und das dieselben enthaltende Arzneimittel
FR2540136A1 (fr) * 1983-01-28 1984-08-03 Roussel Uclaf Nouveau procede de preparation d'acylglycoproteines immunostimulantes extraites de klebsiella pneumoniae, compositions pharmaceutiques et procede de lutte contre les maladies allergiques

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR7207M (de) * 1966-12-14 1969-08-25
US3929994A (en) * 1969-05-20 1975-12-30 Roussel Uclaf Anti-inflammatory glycoprotein compositions and method of use
DE3300633A1 (de) * 1982-08-10 1984-03-01 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur herstellung von rhamnose oder fucose

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2043475A1 (de) * 1969-05-20 1971-02-19 Cassenne Lab Sa
FR2088112A2 (de) * 1970-05-20 1972-01-07 Cassenne Lab Sa
FR2171907A2 (de) * 1972-02-15 1973-09-28 Cassenne Lab Sa
FR2462477A1 (fr) * 1979-07-31 1981-02-13 Cassenne Lab Sa Nouvelles glycoproteines de klebsiella pneumoniae, procede d'obtention, application a titre de medicaments et compositions les renfermant
FR2490496A1 (fr) * 1980-09-19 1982-03-26 Roussel Uclaf Nouvelles glycoproteines immunostimulantes extraites de klebsiella pneumoniae, leur procede d'obtention, leur application a titre de medicaments et les compositions les renfermant
FR2490495A1 (fr) * 1980-09-19 1982-03-26 Roussel Uclaf Nouvelles glycoproteines hydrosolubles immunostimulantes extraites de klebsiella pneumoniae, leur procede d'obtention, leur application a titre de medicaments et les compositions les renfermant
EP0049182A1 (de) * 1980-09-19 1982-04-07 Roussel-Uclaf Aus Klebsiella Pneumoniae extrahierte immunostimulierende Glycoproteine, Verfahren zu deren Gewinnung, ihre Anwendung als Arzneimittel und diese enthaltende Zusammensetzungen
EP0089266A1 (de) * 1982-03-09 1983-09-21 Pierre Fabre S.A. Verfahren zur Herstellung von interferoninduzierenden immunostimulierenden Proteoglykanen, die so erhaltenen Proteoglykane und das dieselben enthaltende Arzneimittel
FR2540136A1 (fr) * 1983-01-28 1984-08-03 Roussel Uclaf Nouveau procede de preparation d'acylglycoproteines immunostimulantes extraites de klebsiella pneumoniae, compositions pharmaceutiques et procede de lutte contre les maladies allergiques

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