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La présente invention se rapporte à la séparation de la tétracycli- ne de la chlortétracycline, et plus spécialement à la séparation de la té- tracycline de la chlortétracycline dans des bouillons de fermentation et d'autres solutions aqueuses contenant des mélanges de ces antibiotiques.
La tétracycline est un antibiotique à large spectre d'activité dont la structure a été donnée pour la première fois dans le Journal of the
American Chemical Society, Vol. 74, page 4976 (1952). La préparation de cet antibiotique par réduction catalytique de la chlortétracycline a été également décrite (Journal of the American Chemical Society, Vol. 74, pages 4621-23,1953).
La chlortétracycline est également un antibiotique à large spectre d'activité et peut être séparée des produits du métabolisme de Streptomyces aureofaciens, comme décrit dans le Brevet Américain n 2.482.055, qui donne à l'antibiotique son appellation commerciale "Auréomycine".
Bien qu'il soit possible de produire de la tétracycline par réduc- tion catalytique de la chlortétracycline, sa production par un processus de fermentation directe présente de nombreux avantages. Par exemple, l'ap- pareil de traitement généralement nécessaire pour l'hydrogénation de la chlortétracycline peut être supprimé. En oute, il n'est pas nécessaire d'utiliser des catalyseurs d'hydrogénation coûteux et les dangers inhérents à ces réactions d'hydrogénation sont évités. La production de tétracycline directement par des procédés de fermentation a été à présent obtenue en cul- tivant des souches sélectionnées de microorganismes du genre Streptomyces dans des solutions nutritives et dans des conditions aérobies.
Toutefois, dans la plupart des procédés qui ont été mis au point,de la chlortétracycli- ne se trouve dans le bouillon de fermentation dans la tétracycline désirée.
La proportion de chlortétracycline ainsi obtenue varie considérablement sui- vant l'organisme particulier employé dans la fermentation et la composition du milieu de fermentation, entre autres facteurs. Dans le cas de quantités appréciables, un problème de séparation sérieux est créé par les similitudes entre les propriétés physiques et chimiques des deux antibiotiques. Dans ces circonstances, les procédés de séparation connus ne donnent que des mé- langes des deux antibiotiques qui doivent être soumis à de nouveaux traite- ments, par exemple à une réduction catalytique de la chlortétracycline, avant qu'on puisse obtenir de la tétracycline pure.
Un problème semblable peut se poser dans la réduction catalytique de la chlortétracycline si la réduction n'est pas complète, puisqu'on ob- tient alors des mélanges de tétracycline et de chlortétracycline résiduelle.
L'importance de trouver un moyen de séparer la tétracycline de la chlortétra- cycline sera donc facilement reconnue.
On a trouvé à présent que la tétracycline peut être séparée de la hlortétracycline dans des bouillons de fermentation ou d'autres solutions aqueuses contenant les deux antibiotiques, en extrayant les antibiotiques Par un solvant organique immiscible à l'eau dans des conditions de pH acide, puis en précipitant la tétracycline de l'extrait par le solvant en neutrali- sant ce dernier, ce qui laisse la chlortétracycline dans l'extrait.
Suivant la présente invention, on acidifie unmélange de tétracycli- le et de chlortétracycline en solution aqueuse à un pH d'environ 0,5 à 3,5, le préférence voisin de 2, par un acide inorganique approprié, comme l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, etc. Les antibio- siques peuvent être en solution aqueuse obtenue à partir du bouillon de fer- lentation ou sous la forme de solides bruts obtenus par fermentation ou L'autres sources, solides, qu'on met en suspension dans l'eau. Ils peuvent 'gaiement être sous la forme de leursbases libres, de leurs sels ou de leurs
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complexes, etc.. obtenus par divers procédés de séparation connus dans la partie.
Après l'acidification de la solution aqueuse contenant les anti- 'biotiques, divers agents peuvent être utilisés si on le désire pour amélio- rer la qualité du produit final de tétracycline. C'est ainsi qu'on peut a- jouter du ferrocyanure de potassium pour éliminer les matières colorantes indésirables et empêcher leur précipitation lorsque la tétracycline est sé- parée par la suite. En outre,on peut.se servir d'oxalate d'ammonium pour empêcher la précipitation subséquente des sels de calcium, si la solution contient une quantité particulièrement élevée d'ions calcium. La solution acidifiée ainsi traitée est ensuite soumise à l'extraction par un solvant organique immiscible à l'eau, particulièrement des alcools inférieurs comme le butanol, l'isobutanol, les pentanols, les hexanols, etc. Le butanol est très avantageux à cette fin.
En général, 0,2 à 2,0 volumes du solvant orga- nique par volume de solution aqueuse permettent d'obtenir le résultat dési- ré, mais des volumes de solvant plus élevés peuvent être utilisés, si on le désire.
On a trouvé que l'extraction des deux antibiotiques par le solvant organique est fortement facilitée en traitant la solution aqueuse acidifiée par un sel inorganique-soluble dans l'eau comme le chlorure de sodium, le sulfate de sodium, le sulfate de potassium, le chlorure de potassium, le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, etc. avant l'extraction. Ce traitement semble avoir un effet de "relarguage" sur les deux antibiotiques et permet l'emploi de volumes de solvant organique beaucoup plus faibles . qu'il n'en faudrait sinon pour l'extraction. La quantité de sel utilisée à cette fin peut varier considérablement suivant la teneur totale en antibio- tiques de la solution aqueuse et la concentration des antibiotiques dans cet- te solution.
Toutefois, une quantité de sel suffisante pour former une con- centration d'environ 3,0 à 25,0% dans le mélange traité est généralement suffisante dans la plupart des cas.
Lorsque l'extraction est achevée, les extraits par le solvant or- ganique sont préférablement filtrés pour éliminer les matières insolubles, puis traités par de l'eau et une matière alcaline pour régler le mélange à un pH pratiquement neutre. Des exemples de matières alcalines appropriées sont l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, l'hydroxyde d'ammonium, la triéthylamine et diverses autres amines aliphatiques. Ce traitement s'ef- fectue facilement en mélangeant de l'eau à l'extrait par le solvant et en ajoutant graduellement la matière alcaline jusqu'à ce que le pH de la couche aqueuse reste entre 5 et 8, de préférence entre 6 et 7. Ensuite, la tétra- cycline sous la forme de la base peut être précipitée par un certain nombre de procédés différents.
Par exemple, le mélange d'eau et de solvant organi- que peut être agité ou laissé au repos pendant un certain temps, par exemple de 8 à 12 heures, pendant lequel la base libre de tétracycline se sépare par cristallisation. D'une autre manière, le mélange peut être concentré dans le vide pour éliminer entièrement ou en partie le solvant organique et lais- ser assez d'eau dans le produit concentré pour former le tétracycline trihy- dratée. La tétracycline cristallisée par ces procédés est facilement séparée par filtration ou par un autre moyen et peut être encore purifiée par recris- tallisation de l'acétone, de mono-éthers d'éthylène glycol ou d'autres sol- vants organiques si on le désire.
La chlortétracycline présente dans l'extrait initial reste dans la solution ou dans le filtrat après élimination de la tétracycline. Ce filtrat peut être soumis à de nouveaux traitements comme indiqué plus haut pour sépa- rer et récupérer de nouvelles quantités de tétracycline restant éventuelle- ment dans le filtrat avec la chlortétracycline, La chlortétracycline peut
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être séparée par évaporation de la matière retraitée jusqu'à siccité ou en soumettant celle-ci à différents processus de purification connus dans la partie.
La précipitation de la tétracycline par le procédé décrit ci-des- sus est particulièrement inattendue vu les similitudes entre les propriétés physiques et chimiques de la tétracycline et de la chlortétracycline. Par exemple, tous deux forment des sels avec les acides et sous cette forme sont facilement extraits par des solvants organiques par acidification de solu- tions aqueuses contenant les deux antibiotiques. En outre, leurs deux sels d'acide sont facilement neutralisés en donnant les bases libres par addition d'une matière alcaline. Toutefois, la tétracycline neutralisée précipite facilement de la solution, tandis qie la chlortétracycline reste dans la so- lution dans les conditions indiquées.
L'invention est encore illustrée par les exemples qui suivent, qui ne peuvent être considérés comme limitatifs.
EXEMPLE 1.-
On cultive sur agar une souche sélectionnée de Streptomyces dépo- sée à l'American Type Culture Collection, Washington D.C., sous le n ATCC 11654, dans des conditions déterminées pour développer des spores afin d'en- semencer un milieu nutritif de la composition suivante.
EMI3.1
<tb>
Enzymine <SEP> B <SEP> 10 <SEP> g/1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cérélose <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> Calcium <SEP> 1
<tb>
Le mélange de ces éléments nutritifs est dilué à un volume de 1 litre avec de l'eau, réglé à un pH de 6,7 et soumis à la stérilisation par la chaleur. On refroidit ensuite le mélange et on ajoute les spores dans des conditions aseptiques.
Après culture de l'organisme dans des récipients agités, pendant deux jours, le mélange de bouillon et de mycélium ainsi for- mé est placé dans 25 gallons (95 1, env.) d'un milieu de fermentation stéri- le de la composition suivante :
EMI3.2
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> 4,0 <SEP> %
<tb>
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> Sodium <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb> Huile <SEP> de <SEP> soya <SEP> 5 <SEP> cm3/1.
<tb>
Ce mélange est réglé au pH 6, 25 et stérilisé de la façon habituel- le avant d'y faire passer le bouillon et le mycélium venant des récipients agités. Le milieu est ensuite ensemencé avec l'organisme et soumis à une agitation et à une aération dans des conditions stériles pendant 26 heures à la vitesse de 1 volume d'air par volume de bouillon par minute. La tempé- rature pendant cette période est maintenue à 28 C.
Les 25 gallons d'inoculum ainsi préparés sont ensuite introduits dans 150 gallons (570 1 env.) de milieu de la même composition et stérilisés comme indiqué plus haut. La fermentation s'effectue également dans des con- ditions stériles en utilisant 3/4 de volume d'air par volume de bouillon par minute à une température de 28 C pendant 67 heures. L'activité du bouillon à ce moment est 715 mcg/cm3.
Les 108 gallons (410 1. env.) du bouillon de fermentation ainsi pré- paré sont acidifiés à un pH de 2,5 à 3 par de l'acide sulfurique et filtrés à l'aide de Supercel pour éliminer le mycélium. Après avoir lavé le gâteau de filtration à l'eau, on ajoute 0,4 % en poids/volume d'acide citrique au
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bouillon filtré, puis 2,3 cm3/1 d'amines quaternaires à longue chaîne alkyli- que à 50% vendues sous la dénomination "Arquad C". Ces amines sont principalement de la dodécyl-amine.
Ensuite, on ajoute 6 cm3 d'une solution de chlo- rure de calcium à 3% en poids/volume par litre de bouillon et on règle le pH à 9 à 9,5 environ par de la soude caustique pour précipiter les sels d'ammo- nium quaternaires de tétracycline et de chlortétracyc line. Ces sels préci- pités sont filtrés à l'aide de Supercel, lavés à l'eau et séchés.
On met en suspension 50 g de ces sels mélangés, contenant environ 30. 000 mcg d'activité totale d'antibiotique par gramme, dans 200 cm3 d'eau et on règle le pH à 2 par de l'acide chlorhydrique 6 N. On ajoute ensuite 2g de ferrocyanure de potassium et 25 cm3 d'une solution d'oxalate d'ammonium à 5% et on agite le mélange pendant 15 minutes, puis on règle à nouveau le pH3 à 2. Le mélange est filtré et le gâteau de filtration est lavé avec 100 cm3 d'eau également réglée au pH 2. On combine cette eau de lavage au fil- trat pour obtenir 305 cm3 de solution contenant une activité totale d'antibio- tique de 1.690.000 mcg.
La solution obtenue est ensuite extrait six fois par des portions de 100 cm3 de n-butanol, ce qui laisse 217 cm3 d'une couche aqueuse extraite contenant 211.000 mcg d'activité totale d'antibiotique, soit 12,4% de l'activité totale de la solution initiale.
Les extraits par le butanol sont filtrés, combinés et agités avec 100 cm3 d'eau, et on ajoute lentement une solution d'hydroxyde de sodium à 10% jusqu'à ce que le pH de la couche aqueuse reste entre 6 et 7. Le mé- lange de butanol et d'eau est ensuite concentré dans levide, en ajoutant de nouvelles quantités d'eau pour faciliter l'élimination du butanol. On ob- tient ainsi 80 à 100 cm3 d'une solution aqueuse contenant des cristaux de la base libre de tétracycline. La solution ainsi obtenue est réglée à un pH de 5 à 6,8 par une nouvelle solution d'hydroxyde de sodium à 10%, puis on la refroidit et on la filtre. Le filtrat aqueux obtenu contient 374.000 mcg d'activité totale d'antibiotique, soit 22,1 % de l'activité totale de la so- lution initiale.
Les cristaux pèsent 0,89 g,contiennent à l'essai 882.000 mcg d'activité totale de tétracycline ou 990 mcg d'activité de tétracycline par mg. Ceci correspond environ à 52% de l'activité totale de la solution aqueuse initiale et montre qu'une partie importante de la tétracycline pré- sente dans cette solution en a été récupérée. L'analyse dans l'ultra-violet et les mesures par chromatographie sur papier montrent que seule la tétracy- cline est présenté, dans le produit cristallin. L'analyse du produit est la suivante :
Calculé : pour C22H24N2O8 : C : 59,45 ; H 5,44.
Trouvé : C : 59,59 : H : 5,44.
Le procédé ci-dessus est repris avec un. mélange de sels d'ammonium quaternaires de tétracycline et de chlortétracycline sans extraction par le butanol. On obtient un produit brut de tétracycline contenant 30% en poids de chlortétracycline.
EXEMPLE II.
On met en suspension dans 1500 cm3 d'eau au pH 2, 500 mg des sels d'ammonium quaternaires combinés detétracycline et de chlortétracycline et on ajoute 20 g de ferrocyanure de sodium. La solution obtenue est ensuite filtrée et lavée avec 1000 cm3 d'eau au pH 2. Le filtrat combiné à l'eau de lavage contient 61.100.000 mcg d'activité totale d'antibiotique.
La solu- tion est ensuite traitée par 340 g de chlorure de sodium, puis extraite trois fois par des portions de 800 cm3 de n-butanol. La solution aqueuse épuisée contient 870.000 mcg d'activité totale d'antibiotique ou 1,4% de l'activité totale de la solution initiale avant l'extraction. Les extraits par le buta- nol sont combinés, agités avec de l'eau et neutralisés par de l'hydroxyde de
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sodium à 10%, jusqu'à ce que le pH de la couche aqueuse soit 6,8. Ensuite, le butanol est partiellement éliminé dans le vide etle mélange est laissé au repos toute une nuit sous réfrigération. On détermine ainsi la cristal- lisation de la base libre de tétracycline qu'on sépare de la solution par filtration et qu'on sèche dans le vide.
Le produit ainsi obtenu pèse 22,1 g et contient à l'essai 1047 mcg/mg, ayant une activité totale de tétracy- --lino de 23. 100.000 mcg ou 37,7 % de l'activité totale de la solution ini- tiale. Le produit cristallisé ne contient pas de chlortétracycline.
Le butanol restant dans le filtrat est éliminé dans le vide et on obtient encore 5, 9 g de tétracycline contenant à l'essai 950 mcg/mg.
L'activité totale de cette tétracycline supplémentaire est 5.610.000 mog, représentant 9,2% de l'activité totale de la solution initiale. D'autre part, les filtrats combinés contiennent 28.500.000 mcg d'activité dont 30 à 40% sont de la chlortétracycline. En reprenant le même procédé, on obtient encore de la tétracycline des liqueurs mères, ce qui permet d'en séparer la chlortétracycline par des procédés connus,par exemple par extraction par du butanol.
Diverses modifications peuvent être apportées au procédé de l'in- vention sans sortir de cadre de celle-ci.
REVENDICATIONS.
1. - Procédé pour séparer la tétracycline de la chlortétracycline dans des solutions aqueuses en contenant, caractérisé en ce qu'on règle la solution à un pH acide, on extrait les deux antibiotiques par un solvant or- ganique immiscible à l'eau, on sépare l'extrait obtenu, on neutralise cet extrait en présence d'eau et on cristallise la tétracycline du mélange neutra- lisé.
2. - Procédé pour séparer la tétracycline de la chlortétracycline dans des solutions aqueuses en contenant, caractérisé en ce qu'on règle la solution à un pH compris entre 0,5 et 3,5, on extrait les deux antibiotiques par un solvant organique immiscible à l'eau, on sépare l'extrait obtenu, on lave cet extrait à l'eau en réglant le pH de la phase aqueuse entre 5 et 8 et on cristallise la tétracycline du mélange neutralisé.
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The present invention relates to the separation of tetracycline from chlortetracycline, and more especially to the separation of tetracycline from chlortetracycline in fermentation broths and other aqueous solutions containing mixtures of these antibiotics.
Tetracycline is a broad spectrum antibiotic whose structure was first given in the Journal of the
American Chemical Society, Vol. 74, page 4976 (1952). The preparation of this antibiotic by catalytic reduction of chlortetracycline has also been described (Journal of the American Chemical Society, Vol. 74, pages 4621-23,1953).
Chlortetracycline is also a broad spectrum antibiotic and can be separated from the metabolism products of Streptomyces aureofaciens, as described in U.S. Patent No. 2,482,055, which gives the antibiotic its trade name "Aureomycin".
Although it is possible to produce tetracycline by catalytic reduction of chlortetracycline, its production by a direct fermentation process has many advantages. For example, the processing apparatus generally required for the hydrogenation of chlortetracycline can be omitted. In addition, it is not necessary to use expensive hydrogenation catalysts and the dangers inherent in these hydrogenation reactions are avoided. The production of tetracycline directly by fermentation methods has now been achieved by culturing selected strains of microorganisms of the genus Streptomyces in nutrient solutions and under aerobic conditions.
However, in most of the processes that have been developed, chlortetracycline is found in the fermentation broth in the desired tetracycline.
The proportion of chlortetracycline thus obtained varies considerably depending on the particular organism employed in the fermentation and the composition of the fermentation medium, among other factors. In the case of appreciable quantities, a serious separation problem is created by the similarities between the physical and chemical properties of the two antibiotics. Under these circumstances, the known separation methods yield only mixtures of the two antibiotics which must be subjected to further treatment, for example catalytic reduction of chlortetracycline, before pure tetracycline can be obtained. .
A similar problem can arise in the catalytic reduction of chlortetracycline if the reduction is not complete, since mixtures of tetracycline and residual chlortetracycline are then obtained.
The importance of finding a way to separate tetracycline from chlortetracyclin will therefore be readily recognized.
It has now been found that tetracycline can be separated from hlortetracycline in fermentation broths or other aqueous solutions containing both antibiotics, by extracting the antibiotics by an organic solvent immiscible in water under acidic pH conditions, then precipitating the tetracycline from the extract by the solvent neutralizing the latter, leaving the chlortetracycline in the extract.
According to the present invention, a mixture of tetracycline and chlortetracycline in aqueous solution is acidified to a pH of about 0.5 to 3.5, preferably close to 2, with a suitable inorganic acid, such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc. Antibiotics can be in aqueous solution obtained from the fermentation broth or in the form of crude solids obtained by fermentation or other sources, solids, which are suspended in water. They can happily be in the form of their free bases, their salts or their
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complexes, etc. obtained by various separation methods known in the section.
After acidification of the aqueous solution containing the antibiotics, various agents can be used if desired to improve the quality of the final tetracycline product. Thus, potassium ferrocyanide can be added to remove unwanted coloring matters and prevent their precipitation when the tetracycline is subsequently separated. In addition, ammonium oxalate can be used to prevent the subsequent precipitation of calcium salts, if the solution contains a particularly high amount of calcium ions. The acidified solution thus treated is then subjected to extraction with an organic solvent immiscible in water, particularly lower alcohols such as butanol, isobutanol, pentanols, hexanols, etc. Butanol is very advantageous for this purpose.
In general, 0.2 to 2.0 volumes of organic solvent per volume of aqueous solution will achieve the desired result, but higher volumes of solvent can be used, if desired.
It has been found that the extraction of the two antibiotics by the organic solvent is greatly facilitated by treating the aqueous solution acidified with an inorganic-water-soluble salt such as sodium chloride, sodium sulfate, potassium sulfate, potassium chloride, ammonium chloride, ammonium sulfate, etc. before extraction. This treatment appears to have a “release” effect on the two antibiotics and allows the use of much smaller volumes of organic solvent. than it would otherwise be necessary for extraction. The amount of salt used for this purpose can vary considerably depending on the total antibiotic content of the aqueous solution and the concentration of the antibiotics in that solution.
However, an amount of salt sufficient to form a concentration of about 3.0 to 25.0% in the treated mixture is generally sufficient in most cases.
When the extraction is complete, the organic solvent extracts are preferably filtered to remove insolubles, then treated with water and an alkaline material to bring the mixture to a substantially neutral pH. Examples of suitable alkaline materials are sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, triethylamine and various other aliphatic amines. This treatment is easily accomplished by mixing water with the solvent extract and gradually adding the alkaline material until the pH of the aqueous layer remains between 5 and 8, preferably between 6 and 6. 7. Thereafter, the tetracyclin in the form of the base can be precipitated by a number of different methods.
For example, the mixture of water and organic solvent can be stirred or left to stand for some time, for example 8 to 12 hours, during which time the tetracycline free base crystallizes out. Alternatively, the mixture can be concentrated in vacuo to remove all or part of the organic solvent and leave enough water in the concentrated product to form the tetracycline trihydrate. The tetracycline crystallized by these methods is easily separated by filtration or other means and can be further purified by recrystallization from acetone, ethylene glycol monoethers or other organic solvents if desired. .
The chlortetracycline present in the initial extract remains in the solution or in the filtrate after removal of the tetracycline. This filtrate can be subjected to new treatments as indicated above to separate and recover new quantities of tetracycline possibly remaining in the filtrate with the chlortetracycline. The chlortetracycline can
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be separated by evaporation of the reprocessed material to dryness or by subjecting it to various purification processes known in the section.
The precipitation of tetracycline by the process described above is particularly unexpected in view of the similarities between the physical and chemical properties of tetracycline and chlortetracycline. For example, both form salts with acids and in this form are easily extracted with organic solvents by acidification of aqueous solutions containing both antibiotics. Further, their two acid salts are easily neutralized to give the free bases by the addition of an alkaline material. However, neutralized tetracycline readily precipitates from solution, while chlortetracycline remains in solution under the conditions indicated.
The invention is further illustrated by the examples which follow, which cannot be considered as limiting.
EXAMPLE 1.-
A selected strain of Streptomyces deposited in the American Type Culture Collection, Washington DC, under ATCC No. 11654, is grown on agar under conditions determined to develop spores in order to seed a nutrient medium of the following composition .
EMI3.1
<tb>
Enzymine <SEP> B <SEP> 10 <SEP> g / 1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cerelosis <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Extract <SEP> of <SEP> yeast <SEP> 5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> Calcium <SEP> 1
<tb>
The mixture of these nutrients is diluted to a volume of 1 liter with water, adjusted to a pH of 6.7 and subjected to heat sterilization. The mixture is then cooled and the spores are added under aseptic conditions.
After culturing the organism in stirred vessels for two days, the mixture of broth and mycelium thus formed is placed in 25 gallons (95 L, approx.) Of a sterile fermentation medium of the composition. next :
EMI3.2
<tb> Soy <SEP> <SEP> flour <SEP> 4.0 <SEP>%
<tb>
<tb> Nitrate <SEP> of <SEP> Sodium <SEP> 0.5 <SEP>%
<tb> <SEP> soybean <SEP> oil <SEP> 5 <SEP> cm3 / 1.
<tb>
This mixture is adjusted to pH 6.25 and sterilized in the usual way before passing the broth and mycelium from the stirred vessels through it. The medium is then inoculated with the organism and subjected to agitation and aeration under sterile conditions for 26 hours at the rate of 1 volume of air per volume of broth per minute. The temperature during this period is maintained at 28 C.
The 25 gallons of inoculum thus prepared are then introduced into 150 gallons (570 1 approx.) Of medium of the same composition and sterilized as indicated above. Fermentation is also carried out under sterile conditions using 3/4 volume of air per volume of broth per minute at 28 ° C for 67 hours. The activity of the broth at this time is 715 mcg / cm3.
The 108 gallons (approx. 410 liters) of the fermentation broth thus prepared are acidified to a pH of 2.5 to 3 with sulfuric acid and filtered using Supercel to remove the mycelium. After washing the filter cake with water, 0.4% w / v citric acid is added to the
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filtered broth followed by 2.3 cc / l of 50% long chain quaternary alkyl amines sold under the name "Arquad C". These amines are mainly dodecyl-amine.
Then, 6 cm3 of a 3% w / v calcium chloride solution per liter of broth is added and the pH is adjusted to about 9 to 9.5 with caustic soda to precipitate the salts. Quaternary ammonium of tetracycline and chlortetracyc line. These precipitated salts are filtered off using Supercel, washed with water and dried.
50 g of these mixed salts, containing about 30,000 mcg of total antibiotic activity per gram, are suspended in 200 cm3 of water and the pH is adjusted to 2 with 6 N hydrochloric acid. then add 2g of potassium ferrocyanide and 25 cm3 of a 5% ammonium oxalate solution and the mixture is stirred for 15 minutes, then the pH3 is again adjusted to 2. The mixture is filtered and the cake of The filtration is washed with 100 cm 3 of water also adjusted to pH 2. This washing water is combined with the filtrate to give 305 cm 3 of solution containing a total antibiotic activity of 1,690,000 mcg.
The solution obtained is then extracted six times with 100 cm3 portions of n-butanol, which leaves 217 cm3 of an extracted aqueous layer containing 211,000 mcg of total antibiotic activity, or 12.4% of the activity. total of the initial solution.
The butanol extracts are filtered, combined and stirred with 100 cm3 of water, and 10% sodium hydroxide solution is slowly added until the pH of the aqueous layer remains between 6 and 7. The mixture of butanol and water is then concentrated in the acid, adding further quantities of water to facilitate the removal of the butanol. In this way 80 to 100 cm3 of an aqueous solution containing crystals of the free base of tetracycline are obtained. The solution thus obtained is adjusted to a pH of 5 to 6.8 with a new 10% sodium hydroxide solution, then it is cooled and filtered. The resulting aqueous filtrate contained 374,000 mcg of total antibiotic activity, or 22.1% of the total activity of the initial solution.
The crystals weigh 0.89 g, contain 882,000 mcg of total tetracycline activity or 990 mcg of tetracycline activity per mg when tested. This corresponds to approximately 52% of the total activity of the initial aqueous solution and shows that a significant part of the tetracycline present in this solution has been recovered therefrom. Ultraviolet analysis and measurements by chromatography on paper show that only tetracycline is presented in the crystalline product. The analysis of the product is as follows:
Calculated: For C22H24N2O8: C: 59.45; H 5.44.
Found: C: 59.59: H: 5.44.
The above process is repeated with a. mixture of quaternary ammonium salts of tetracycline and chlortetracycline without extraction with butanol. A crude tetracycline product is obtained containing 30% by weight of chlortetracycline.
EXAMPLE II.
Is suspended in 1500 cm3 of water at pH 2.5, 500 mg of the combined quaternary ammonium salts of tetracycline and chlortetracycline and 20 g of sodium ferrocyanide are added. The solution obtained is then filtered and washed with 1000 cm3 of water at pH 2. The filtrate combined with the washing water contains 61,100,000 mcg of total antibiotic activity.
The solution is then treated with 340 g of sodium chloride, then extracted three times with 800 cm3 portions of n-butanol. The spent aqueous solution contains 870,000 mcg of total antibiotic activity or 1.4% of the total activity of the initial solution before extraction. The butanol extracts are combined, stirred with water and neutralized with sodium hydroxide.
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10% sodium, until the pH of the aqueous layer is 6.8. Then the butanol is partially removed in a vacuum and the mixture is left to stand overnight under refrigeration. The crystallization of the free tetracycline base is thus determined, which is separated from the solution by filtration and dried in vacuo.
The product thus obtained weighs 22.1 g and contains in the test 1047 mcg / mg, having a total tetracy- --lino activity of 23. 100,000 mcg or 37.7% of the total activity of the solution ini- tial. The crystallized product does not contain chlortetracycline.
The butanol remaining in the filtrate is removed in vacuo and a further 5.6 g of tetracycline is obtained, containing 950 mcg / mg in the test.
The total activity of this additional tetracycline is 5,610,000 mog, representing 9.2% of the total activity of the initial solution. On the other hand, the combined filtrates contain 28,500,000 mcg of activity of which 30 to 40% is chlortetracycline. By repeating the same process, tetracycline is still obtained from the mother liquors, which makes it possible to separate the chlortetracycline therefrom by known processes, for example by extraction with butanol.
Various modifications can be made to the process of the invention without departing from the scope thereof.
CLAIMS.
1. - Process for separating tetracycline from chlortetracycline in aqueous solutions containing it, characterized in that the solution is adjusted to an acidic pH, the two antibiotics are extracted with an organic solvent immiscible in water, one the extract obtained is separated, this extract is neutralized in the presence of water and the tetracycline is crystallized from the neutralized mixture.
2. - Process for separating tetracycline from chlortetracycline in aqueous solutions containing it, characterized in that the solution is adjusted to a pH of between 0.5 and 3.5, the two antibiotics are extracted with an immiscible organic solvent with water, the extract obtained is separated, this extract is washed with water by adjusting the pH of the aqueous phase between 5 and 8 and the tetracycline is crystallized from the neutralized mixture.