Procédé de préparation de bromtétracycline La présente invention est relative à un procédé de préparation d'une nouvelle substance antibiotique à large spectre utilisable en thérapeutique, la brom- tétracycline. Conformément au procédé de la présente inven tion, on obtient la bromtétracycline en soumettant un milieu nutritif aqueux contenant au moins 50 par ties d'ions bromure pour 1 million de parties du mi lieu et présentant une teneur en ions chlorure ne dé passant pas 50 parties pour 1 million de parties du milieu,
à une fermentation en aérobiose à l'aide d'une souche de Streptomyces aureofaciens produc trice de bromtétracycline..
La substance antibiotique ainsi obtenue est dif férente de celles connues jusqu'à présent et différente, en particulier, de l'antibiotique dénommé chlortétra- cycline produit jusqu'à présent au départ des mêmes microorganismes.
La substance antibiotique nouvellement décou verte a été dénommée bromtétracycline, car on a constaté que sa structure est identique à celle de la chlortétracycline, sauf que l'atome de chlore est rem placé par un atome de brome. . La bromtétracycline a donc la composition C,H2sN20sBr et la formule développée suivante
EMI0001.0017
La bromtétracycline, sous forme libre, est am photère et forme des sels tant avec des acides qu'avec des bases.
Ainsi, la bromtétracychne forme des sels d'addition avec des acides organiques et inorganiques et peut être obtenue sous forme de chlorhydrate, bromhydrate, sulfate, borate, nitrate, phosphate, as- corbate, citrate, succinate, acétate, sulfamate et au tres sels d'addition avec des acides de nature simi- laire. La bromtétracycline forme également des sels monobasiques et bibasiques avec des bases,
notam ment avec celles des métaux alcalins ou alcalino- terreux, avec les bases d'ammonium et les bases ami nées. Comme exemples spécifiques, on peut citer les sels de calcium, baryum, strontium, magnésium, éthy- lène-diamine, triéthylamine, pipéridine, potassium et lithium. La bromtétracycline forme également des sels ou plus exactement des sels complexes avec des sels basiques d'acide borique, tels que le borate sodique.
Les sels des types décrits plus haut présentent de la valeur dans les procédés d'isolement et de purifi cation, car ils peuvent être transformés, par neutra lisation ou métathèse, en matière amphotère libre ou d'une forme en une autre. Ces sels possèdent éga lement des propriétés antiseptiques et thérapeutiques. La solubilité de la bromtétracycline dans l'eau varie avec le pH, cette solubilité étant plus grande lorsque le pH augmente et moindre à partir d'un pH d'envi ron 6. La forme qui est la moins soluble- dans l'eau à un pH intermédiaire est dite isoélectrique, ou ma tière amphotère ou libre.
Des essais<I>in vitro</I> ont révélé que les sels d'acides et de bases, de même que la matière isoélectrique ou libre, sont actifs vis-à-vis d'un grand nombre de bactéries, y compris des bacté ries Gram-positives et Gram-négatives.
Les sels d'acides de la bromtétracycline peuvent se préparer aisément en dissolvant l'antibiotique libre dans de l'eau ou dans un autre solvant approprié aci difié à l'aide d'un acide organique ou minéral. De même, les sels basiques peuvent être préparés aisé ment en ajoutant une base organique ou inorganique à une solution de l'antibiotique libre.
Le spectre d'absorption dans infrarouge de l'an tibiotique libre dissout dans une huile hydrocarbonée présente des bandes d'absorption caractéristiques au voisinage de 3460, 3320, 3050, 1645, 1610, 1575, 1525 et 830 cm-1. Le spectre infrarouge de ce com posé, bien que similaire à maints égards à celui de la chlortétracycline libre, notamment en ce qui con cerne les bandes d'absorption de part et d'autre de 950 cm-', révèle des différences ;
ainsi, ce spectre ne présente aucune bande triple d'absorption corres pondant à celle que présente la chlortétracycline au voisinage de 800 cm-', tandis que des différences se manifestent dans les rapports d'intensité d'absorption, comme on peut s'y attendre avec de faibles différen ces moléculaires.
Le spectre antibiotique de la bromtétracycline est à maints égards similaire à celui de la chlortétracy- cline.
On a constaté que, pendant la fermentation, il est souhaitable de faire croître les microorganismes précités dans des conditions d'aérobiose immergée en agitant et en aérant convenablement les cultures, par exemple dans un flacon sur une machine à agi ter ou dans un fermentateur agité, équipé d'un dispo sitif permettant d'y introduire, de manière continue, un courant d'air. La température ne paraît pas être déterminante dans la gamme de température de 25 à. 350 C, bien qu'on préfère opérer à une tempéra ture comprise entre 30 et 350 C. Le pH initial du.
milieu est de préférence voisin de la neutralité, bien qu'une certaine quantité d'antibiotique soit égale ment produite dans des milieux présentant des va leurs de pH initiales aussi faibles que 5,0 ou aussi 'levées que 8,5. Un milieu de fermentation convenant pour la production de bromtétracycline contient une source de carbone, telle qu'un hydrate de carbone assimi lable, une source d'azote assimilable, des sels inorga niques, tels que des phosphates, des sels de magné sium, etc., et des sources des oligo-éléments habituels. Des tampons sont ordinairement inclus dans le mi lieu de fermentation.
On ajoute une source d'ions bromure de sorte qu'au moins 50 parties par million d'ions bromure soient présentes, la quantité maxi mum requise pour une opération satisfaisante ne dépassant pas approximativement 1500 parties par million. La teneur du milieu nutritif en ions chlo rure ne doit pas dépasser 50 parties par million. Elle est de préférence inférieure à 10 parties par million.
La source de carbone peut être soit un hydrate de carbone soluble, tel que le saccharose, soit un hydrate de carbone insoluble, tel qu'un amidon, com me l'amidon de maïs. On peut également utiliser de la dextrine. Alors que le saccharose, qui constitue un sucre soluble, est très satisfaisant, le lactose et le glucose, qui constituent deux autres sucres solubles, sont relativement médiocres.
La quantité de source de carbone peut varier dans de larges limites, soit de 0,5 à 10,0 % en poids environ, par rapport au poids total du milieu de fermentation.
Comme source d'azote assimilable, on peut uti liser des sels d'ammonium inorganiques. Parmi ces sels, on peut citer le sulfate d'ammonium, le phos phate d'ammonium, etc. Il est également possible d'utiliser des sources d'azote organiques telles que des aminoacides et diverses matières protéiniques naturelles.
Parmi les sels inorganiques qui se sont révélés avantageux, on peut citer les phosphates, qui peu vent être présents sous forme de phosphate d'am monium ou d'un phosphate métallique, notamment sous forme de phosphate de potassium, et le sulfate de magnésium ; il est souhaitable que le phosphate de potassium soit présent, s'il n'y a pas d'autre source de potassium.
L'addition de faibles quantités de métaux lourds est désirable, à moins que de tels métaux soient pré sents dans les autres ingrédients. Parmi ces éléments, qui peuvent être présents sous forme de traces, par exemple comme impuretés, ou être ajoutés, on peut citer le cuivre, le zinc, le manganèse, le fer et le chrome.
Parmi les agents tampons, on peut citer le carbo nate de calcium et les sels d'acides organiques, tels que citrates, acétates et lactates, qui sont utiles pour maintenir le pH dans les limites voulues. En outre, les acides organiques peuvent servir comme sources de carbone dans le métabolisme du microorganisme. L'emploi d'un agent de destruction des mousses est souhaitable dans les fermentateurs à grande capa cité, même si, au cours de la fermentation la forma tion de mousse ne constitue pas un problème particu lièrement difficile et est aisément limitée par utilisa tion d'un agent antirnousse habituel, tel que l'octadé- canol dans de l'huile de lard ou un autre agent des tructeur ou inhibiteur de mousse du commerce.
Les microorganismes de l'espèce Streptomyces aureofaciens se divisent en deux catégories générales l'une comprenant les souches qui présentent une af finité particulière pour les ions chlorure et l'autre comprenant les souches qui ne présentent pas d'affi nité particulière pour les ions chlorure.
Les souches de la première catégorie tendent à utiliser tout ion chlorure présent dans le milieu nu tritif pour produire de la chlortétracycline. En l'ab sence d'ions chlorure, ces souches tendent à utiliser les ions bromure, à condition que le milieu nutritif en contienne, pour produire de la bromtétracycline. Une certaine quantité de tétracycline est invariable ment produite, même en présence d'un excès d'ions chlorure. La formation de l'un ou l'autre des anti biotiques est fonction des conditions prévalant dans le milieu nutritif.
Une souche de la première caté gorie, par exemple la souche S-77, cultivée dans un milieu renfermant des ions chlorure mais ne conte nant pas d'ions bromure, produira de la chlortétra- cycline et une faible quantité de tétracycline.
Dans un milieu exempt d'ions chlorure mais renfermant des ions bromure, il se formera de la bromtétracycline et de la tétracycline, la dernière en quantité notable ment plus élevée que dans un milieu de fermentation contenant des ions chlorure. L'ordre d'affinité de ces organismes est telle que la chlortétracycline est produite de préférence, la tétracycline et la brom- tétracycline prenant la seconde et la troisième place, respectivement.
En présence de quantités limitées d'ions chlorure et d'un excès d'ions bromure, les microorganismes de cette catégorie utiliseront d'abord les ions chlorure et commenceront ensuite à produire la bromtétracycline. La tétracycline sera également synthétisée. En présence d'un excès d'ions chlorure et d'ions bromure, les organismes ne produiront au cune quantité notable de bromtétracycline. Toute fois, les ions bromure exercent un effet inhibiteur sur les ions chlorure, de sorte que le rapport de la tétra cycline à la chlortétracycline est modifié en faveur de la tétracycline.
Les souches de la seconde catégorie se compor tent de manière très différente. Elles n'utilisent pas les ions bromure et, par conséquent, ne produisent pas de bromtétracycline, quelles que soient les con ditions de culture, en présence ou en l'absence d'ions chlorure. La tétracycline est synthétisée en quantités modérées et si des ions chlorure sont présents, un peu de chlortétracycline sera également produit. Ces microorganismes ne peuvent donc pas être utilisés dans le présent procédé.
Pour obtenir de la brom- tétracycline, il faut donc utiliser une souche d'orga nismes de la première espèce, possédant une affinité particulière pour les ions chlorure, et éliminer les ions chlorure ou du moins en limiter la quantité comme indiqué tout au début du présent exposé.
Il existe plusieurs manières de limiter la teneur en ions chlorure du milieu de fermentation. Une de ces manières consiste à séquestrer les ions chlorure dans un complexe inactif où le chlore n'est pas io nisé. Des résultats satisfaisants ont été obtenus par utilisation d'eau distillée et par utilisation dans le milieu de constituants ne contenant pas d'ions chlo rure. Des milieux synthétiques, dont des exemples sont donnés plus loin, peuvent être utilisés dans ce but.
De nombreuses matières naturelles, souvent uti lisées dans les milieux de fermentation, contiennent des ions chlorure. Leur emploi est néanmoins possi ble, à condition qu'elles soient préalablement désio- nisées, par traitement avec des échangeurs d'ions ou d'autres agents convenables pour en éliminer les ions chlorure.
La titulaire a mis au point un milieu synthétique qui est sensiblement exempt d'ions chlorure et qui donne des rendements supérieurs, tout en étant facile à préparer, de coût modique et de composition cons tante. Ce milieu contient, en général, du saccharose comme hydrate de carbone, du sulfate d'ammonium comme source d'azote, du phosphate de potassium comme sel inorganique, du sulfate de magnésium, du carbonate de calcium, du citrate de sodium et de l'acide acétique comme agents tampons, ainsi que du sulfate de cuivre, du sulfate de zinc et du sul fate de manganèse en petites quantités, comme sour ces d'oligo - éléments.
Des qualités sensiblement exemptes de chlorure de ces matières sont choisies et de l'eau distillée est utilisée, de façon que le mi lieu de fermentation ne contienne pas plus de 1 par tie par million d'ions chlorure. On ajoute alors une source d'ions bromure en quantité voulue.
Un inoculum pour la fermentation peut être pré paré à partir d'une culture obtenue sur des milieux de culture à plan incliné, inoculés au moyen de Streptomyces aureofaciens. Un milieu approprié pour les cultures à plan incliné est l'agar de Waksman de composition suivante Glucose . _ . . . . . . . . . . . . 10 g/1 Peptone .......... 5 g/1 KIH2P04 <B>....... ......</B> 1 g/1 MgS04 .71-120 <B>-----</B> . . . . . 0,5 g/1 Agar . . . . . . . . . . . . . .
20 g/1 La culture peut être transférée dans des flacons à agiter qui peuvent être utilisés comme fermenta- teurs de laboratoire ou pour la production d'inoculum pour fermentation à plus grande échelle.
Selon les dimensions du fermentateur, on peut utiliser de 0,5 à 1,5 volume d'air libre par volume de milieu liquide. La formation de mousse dans le milieu peut. être limitée par l'addition stérile d'un agent antimousse, tel que de l'huile de lard conte nant 2 % d'octadécanol.
<I>Récupération et purification</I> Comme indiqué, le produit de fermentation ren ferme en plus de la bromtétracycline une quantité inférieure de tétracycline. Pour certaines applications, il n'est pas nécessaire d'isoler la bromtétracycline à partir du milieu de fermentation. Ainsi, la matière fermentée peut être ajoutée directement à des aliments pour animaux, en sorte qu'on- obtient un produit convenant particu lièrement pour stimuler la croissance et/ou combat tre des maladies des animaux.
Lorsqu'on ne désire pas se servir des myceha et insolubles, le milieu de fermentation peut être filtré avec ou sans acidifica- tion et la liqueur claire put être ajoutée à l'eau de breuvage ou à des aliments pour animaux. Si on le désire, la liqueur contenant la bromtétracycline et la tétracycline peut être concentrée sous pression ré duite ou séchée par pulvérisation et l'antibiotique peut être utilisé sous forme brute pour stimuler la croissance ou traiter des maladies chez l'homme, les animaux et la volaille.
Lorsqu'on désire isoler la bromtétracycline et éventuellement la tétracycline sous forme pure, elles peuvent être récupérées du milieu de fermentation par un certain nombre de procédés comportant une ou plusieurs opératiôns, exécutées dans des ordres variés, d'adsorption, d'élution, d'extraction par sol vant avec ou sans agents auxiliaires, de cristallisation, de précipitation sous forme de sels insolubles, tels que les sels de calcium, baryum, strontium ou magnésium à des pH supérieurs à environ 6,5,
ou sous forme de sels insolubles avec des sulfates ou des acides sul- foniques du type agent mouillant ou colorant azoïque. On peut aussi faire passer la bromtétracycline et la tétracycline en solution dans un solvant organique, en utilisant, comme agents solubilisants des sulfates ou des sulfonates du type agent mouillant ou colo rant azoïque.
La bromtétracycline et la tétracycline peuvent, en outre, être séparées à partir du milieu ou moût de fermentation brut, par acidification à un pH de 3 environ ou moins, la bromtétracychne et la tétracycline passant ou restant en solution et les matières solides insolubles pouvant alors être sé parées et éliminées. La bromtétracycline et la tétra cycline peuvent être précipitées sous forme de sels de métaux alcalino-terreux dans des solutions aqueu ses à un pH supérieur à environ 6,5.
Ce précipité peut être extrait au moyen d'eau acidifiée ou au moyen de solvants organiques, tels que des alcools, alcoxy- alcanols ou cétones. L'extraction peut se faire en milieu acide, neutre ou basique. Similairement, une solution aqueuse contenant de la bromtétracycline et de la tétracycline peut être extraite par des solvants organiques non miscibles à la couche aqueuse, tels que des alcools inférieurs, des alcoxyalcanols, des es ters et des cétones non miscibles à la couche aqueuse.
Parmi les solvants connus tels que le butanol, le chloroforme et l'acétate d'éthyle, on préfère le bu- tanol pour l'extraction de la bromtétracycline et de la tétracycline. Certains alcools, tels que l'isopropa- nol, qui sont miscibles à l'eau, mais ne sont pas mis cibles à une solution saline, sont également utiles. L'addition d'une substance soluble dans l'eau et in soluble dans la couche organique, par exemple d'am- moniaque, d'amines, d'halogénures de métaux alca lins et de sulfates, facilite l'opération d'extraction.
La bromtétracycline et la tétracycline peuvent être précipitées dans des solutions aqueuses par addi tion de substances hydrosolubles, par exemple d'am moniaque, d'amines, d'halogénures de métaux al calins et de sulfates.
Si le moût de fermentation contient de la chlor- tétracycline, celle-ci est récupérée avec la brom- tétracycline et la tétracycline dans les procédés dé crits ci-dessus. La titulaire a également mis au point un nouveau procédé de récupération hautement efficace tant au point de vue de la récupération d'un produit exempt d'impuretés inactives qu'au point de vue de la récu pération d'un produit exempt d'autres substances antibiotiques formées en même temps dans le milieu. Ce procédé de récupération permet d'obtenir un pro duit cristallin de haute pureté aux deux points de vue en question.
Ce procédé implique essentiellement l'utilisation de sels d'ammonium quaternaire, qui pré cipitent sélectivement la tétracycline et la bromtétra- cycline dans le milieu de fermentation, à un pH alca lin (pH 8 à 11) sous forme de sels d'ammonium quaternaire de bromtétracycline et de tétracycline. Après filtration, un tel sel est empâté avec une faible quantité d'eau et une quantité relativement impor tante de chloroforme, en sorte que les sels d'ammo nium quaternaire de bromtétracycline et de tétracy cline sont dissous dans la phase chloroformique de la pâte.
Les phases aqueuse et chloroformique sont alors, de préférence, séparées de manière à éliminer les impuretés dissoutes dans l'eau. La bromtétracy- cline et la tétracycline sont alors extraites à l'aide d'une solution aqueuse acide à un pH d'environ 1 à 2,5, ce qui donne lieu à la formation des sels d'acide de bromtétracycline et de tétracycline, qui passent en solution dans la phase aqueuse, dans laquelle ces sels précipitent sous forme de produits cristallins, par augmentation du pH de 3 à 7, la précipitation com mençant à pH 3.
Les sels d'ammonium quaternaire, qui sont parti culièrement utiles dans ce procédé de récupération, sont les chlorures d'alcoyl-triméthylammonium et les chlorures de dialcoyl-diméthylammonium, dans les quels le groupe alcoyle contient 8 à 18 (inclusive ment) atomes de carbone. E,xemple <I>1</I> On prépare un hydrolysat de caséine par hydro lyse de 5 g de caséine avec 0,85 cm-3 d'acide sulfu rique dans 100 cm2 d'eau, en agitant à 50o C pen dant 60 minutes et en chauffant à 120,1 C pendant 120 minutes dans un autoclave.
On neutralise la caséine hydrolysée à pH 6,0 à l'aide d'ammoniaque, environ 2,5 cm8 de celui-ci étant requis. On prépare un milieu de base contenant, par litre, l'hydrolysat de caséine obtenu à partir de 5 g de caséine, et les ingrédients suivants lactate de magnésium . . 3,5 g carbonate de calcium . . 2,5 g NaH2P04 ' H20 . . . . . . 2,2 g saccharose . . . . . . . . . . 15;
0 g FeS04. 7H20 . . . . . . . . 40,0 mg CUS04 ' 5H20<B>......</B> 32,0 mg MnS04 - 4H20<B>......</B> 20,0 mg ZnSQt - 7140 <B>......</B> 20,0 mg acétate de cobalt<B>....</B> 5,0 mg C1 ................ < 5 parties par million de parties du milieu A ce milieu, on ajoute les quantités de bromure de potassium indiquées dans le tableau suivant. On obtient les activités indiquées dans le même tableau.
EMI0005.0011
Bromure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> Unités <SEP> d'activité
<tb> g/litre <SEP> antibiotique
<tb> 0,1 <SEP> 415
<tb> 0,2 <SEP> 450
<tb> 0,4 <SEP> 430 Les unités indiquées se rapportent à l'activité antibiotique sur Straphylococcus aureus correspon dant à l'activité de 1 microgramme de chlortétracy- cline par cm3. La fermentation est effectuée à 270 C pendant 72 heures avec agitation et aération. Le mi croorganisme utilisé pour la fermentation est le Strep tomyces aureofaciens B. C. 41.
Le rendement de la fermentation en antibiotiques se compose de '/a de tétracycline, '/9 de bromtétracycline et z/9 de chlor- tétracycline. <I>Exemple 2</I> On effectue une fermentation sous des conditions identiques à celles définies dans l'exemple 1, sauf que la durée de la fermentation est réduite à 48 heures.
On obtient les résultats suivants
EMI0005.0025
Bromure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> Unités <SEP> d'activité
<tb> g/litre <SEP> antibiotique
<tb> 0,1 <SEP> 330
<tb> 0,2 <SEP> 305
<tb> 0,4 <SEP> 290 Le rendement de la fermentation en antibiotiques se compose de 2 parties de tétracycline pour 1 par tie de bromtétracycline et d'une faible quantité de chlortétracycline. <I>Exemple 3</I> On prépare un milieu contenant moins de 50 parties d'ions halogénure par million de parties et ayant la composition suivante, exprimée en mgr/litre Saccharose .......... 30.000 D,L-alanine ..........
450 L-arginine <B>....</B> .<B>.......</B> 570 D,L-méthionine ...... 200 Acide L-glutamique <B>....</B> 260 L-histidine .......... 200 D,L-bêta-asparagine <B>....</B> 200 (NH4)2SO4 . . . . . . . . . . . .<B>2.000</B> Lactate de magnésium . . 5.000 NH4H2P04 . . . . . . . . . . 2.000 Lactate de potassium . . 2.000 Mg'-'l(P04)2 <B>....</B> .<B>.....</B> 1.000 Carbonate de calcium .. 5.000 FeS04. 7H20 . .
.<B>.....</B> 60 ZnS04-7H20 ........ 33 MnS04-H20 ........ 19 CUS04 ' 5H20 . . . . . . . . 5 Co(CH3C02)2 - 6H20 . . 5 La solution est portée au volume requis au moyen d'eau distillée sur de l'hydroxyde de sodium. Tous les constituants, à l'exception du carbonate de calcium, sont dissous, puis le pn est ajusté à 6,2-6,3 à l'aide d'une solution ammoniacale 3N (approxi mativement 3cc par litre) et le carbonate de calcium est ajouté. Le milieu ne donne pas de précipité avec l'acide nitrique et le nitrate d'argent.
Sa teneur en ions chlorure s'avère inférieure à 0,17 mgr/litre. Des fractions de 100 cc du milieu de base sont placées dans les flacons d'Erlenmeyer d'une capacité de 500 cc, que l'on bouche avec des tampons de coton et que l'on traite à l'autoclave pendant 15 mi nutes à 1200 C. 10 cc d'eau distillée stérile sont ajou tés à chaque tube d'une série de tubes à culture in clinée sur gélose, contenant du Streptomyces aureo-. faciens sous forme sporulée. Les spores sont douce ment détachées à l'aide d'un fil métallique stérile et -les suspensions de spores sont réunies l'une à l'autre.
Les flacons sont chacun inoculés à l'aide de 5 cc de cette suspension et agités pendant 24 heures à 27() C, en sorte qu'on obtient un inoculum. 6,3 litres du milieu et 35 cc d'huile minérale sont placés dans un fermentateur équipé d'un agitateur et d'un aérateur et le tout est stérilisé.
Le contenu de 7 flacons d'inoculum vieux de 24 heures et 50 cc d'une solution aqueuse stérile contenant 0,97 g de bromure de potassium sont introduits, dans des con ditions stériles, -dans le fermentateur. La fermentation est conduite à 27,40 C, en faisant tourner l'agitateur à 350 tours par minute et en faisant passer de l'air à un débit de 7 litres par minute. L'air est d'abord conduit à travers un laveur à acide nitrique et à ni trate d'argent, puis à travers un laveur à eau et en- suite à travers un filtre de stérilisation.
Au besoin, on ajoute un inhibiteur de mousse constitué, par exemple, par une polysiloxane <B>(e</B> Général Electric Silicone SS24 ).
Pendant la croissance du milieu, le pli diminue lentement et la fermentation est poursuivie jusqu'à ce que le pH cesse de diminuer et commence à aug menter. Ceci prend environ 51 heures et on obtient finalement une solution dont le pg est de 5,90. Le moût final titre 412 unités d'antibiotique.
Le moût de fermentation contient de la bromtétra- cycline ainsi que de la tétracycline. Pour séparer la bromtétracycline, le moût de fermentation est acidi fié à un pH de 1,5, en agitant et en employant de l'acide chlorhydrique concentré. Le moût est alors agité avec 95 g d'un adjuvant de filtration et le mé lange est filtré.
Le gâteau de filtration est empâté avec 1400 cc d'eau distillée à 500 C. La pâte obtenue est filtrée et le filtrat est ajouté au filtrat du moût. Dans les fil- trats, on retrouve 94,4 % de l'activité du moût. Le pH du filtrat est ajusté à 2,5 à l'aide d'hydroxyde de sodium à 50 % (32 cc)
et le mélange est concentré sous vide à une température comprise entre 25 et 30 OC, jusqu'à un volume final de 2070 cc. 83;6 % de l'activité du moût se retrouvent dans le mélange final. Le pH est ajusté à 1,5 à l'aide d'acide chlor hydrique concentré et 331 g de chlorure de sodium sont ajoutés.
La solution est extraite à deux repri ses avec des portions de 311 cc de n-butanol et en suite à trois reprises avec des portions de 207 cc de n-butanol. Les extraits sont combinés, leur pli est ajusté à 2,5 au moyen d'hydroxyde de sodium à 50 % et le mélange est distillé sous vide,
dans une atmosphère d'azote, en opérant des additions d'eau, jusqu'à ce que tout le n-butanol ait distillé azéotro- piquement. Le pli est ajusté à 1,5 à l'aide d'acide chlorhydrique concentré, 5 g d'un adjuvant de fil tration sont ajoutés et le mélange est filtré sur un entonnoir à verre fritté.
Un volume aqueux final de 1100 cc contenant 70,5 % de l'activité du moût ori- ginal est obtenu.
A ce filtrat, on ajoute 41,5 g de chlorure de ba ryum dihydraté dissous dans 119 cc d'eau distillée. Le mélange est agité pendant une demi-heure puis le pH est ajusté à 8,5 au moyen d'hydroxyde de sodium, après quoi le mélange est centrifugé. Le gâteau ré sultant est lavé à l'aide de 40 cc d'eau distillée.
Le gâteau lavé est empâté avec 249 cc d'eau distillée, le pli est ajusté à 2,5 au moyen d'acide sulfurique à 50 % et le mélange est agité vigoureusement pendant une heure. Après cela, le pH est ajusté à 1,5 à l'aide d'acide sulfurique à 50 0/0, agité à nouveau pendant une demi-heure, puis centrifugé.
Le précipité obtenu est lavé par centrifugation, avec deux fractions de 15 cc d'acide sulfurique N/10, la première fois en malaxant. Les liquides séparés dont le volume global atteint 260 cc, contiennent 62 % de l'activité du moût de départ.
Le mode opératoire décrit ci-dessus est répété et les deux liquides séparés sont combinés. Le pH du mélange est ajusté à 3,5 à l'aide d'hydroxyde de so dium à 10 0/0, après quoi le mélange est agité pendant 10 minutes et centrifugé. Le précipité obtenu est lavé avec 10 cc d'eau et l'eau de lavage est ajoutée au liquide surnageant.
Le pH des solutions combi nées est ajusté à 4,95 au moyen d'hydroxyde de so- dium à 10 %, et le précipité est recueilli et lavé. Le précipité est congelé et l'eau restante est chassée par sublimation.
On obtient 2,65 g d'un produit à 490 unités de produits actifs et contenant 5,43,% de brome.
Un appareil de répartition à contre-courant de Craig contenant 30 tubes est chargé au moyen d'un solvant constitué par des volumes égaux d'eau dis tillée et de n-butanol saturés l'un avec l'autre, le pH étant ajusté à 2,5 au moyen d'acide chlorhydrique concentré. 1,55 g du produit congelé et séché sont empâtés avec 160 cc de la phase aqueuse, le pH est réajusté à 2,5, 160 cc de la phase n-butanolique sont ajoutés et le pH est à nouveau ajusté à 2,5 en agitant.
Le mélange est filtré, on laisse les phases se séparer et 50 cc de chaque phase sont introduits dans chacun des trois premiers tubes de l'appareil de Craig. Les tubes restants sont chargés à l'aide de 50 cc de phase aqueuse saturée de n-butanol et la répartition est poursuivie jusqu'à ce que la phase supérieure initia lement dans le tube 2 soit équilibrée dans le tube 29. La répartition est effectuée jusqu'à ce que 18 phases supérieures soient extraites du tube 29. De cette ma nière, toute la matière active est amenée dans le tube 29.
Un examen spectrophotométrique montre qu'il y a deux crêtes, la première se concentrant autour du tube 12 avec un maximum optique à 355 - 365 milli- microns et la seconde se concentrant autour du tube 21 avec un maximum optique à 370 - 375 millimi- crons. Les solutions des tubes 18 à 29 contenant la matière présentant la seconde crête sont combinées et distillées sous vide, en atmosphère d'azote, avec addi tion d'eau à un pH de 2,5, jusqu'à obtention d'une solution aqueuse finale exempte de n-butanol de 50 cc. Le pH est ajusté à 1,5 à l'aide d'acide chlor hydrique, on ajoute un adjuvant de filtration et on filtre le mélange.
Le pH de la solution est alors ajusté lentement, en agitant, à 5,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium à 10,%. Le mélange est agité avec des per- les de verre et laissé au repos pendant une nuit à 40 C.
La solution est centrifugée et le liquide surna geant est congelé et séché en sorte qu'on obtient 200 mg de produit sec. 152 mg de ce produit sont dissous dans 1,4 cc de 2-éthoxy-éthanol sec et la so lution est filtrée, 0,14 cc d'eau sont ajoutés et le mé lange est placé dans un agitateur. La matière cris tallise et les cristaux sont filtrés, lavés et séchés. La première récolte donne 49 mg de bromtétracycline.
Process for the preparation of bromtetracycline The present invention relates to a process for the preparation of a novel broad spectrum antibiotic substance which can be used in therapy, bromtetracycline. In accordance with the process of the present invention, bromtetracycline is obtained by subjecting an aqueous nutrient medium containing at least 50 parts of bromide ions per 1 million parts of the medium and having a chloride ion content not exceeding 50 parts. for 1 million parts of the middle,
to aerobic fermentation using a strain of Streptomyces aureofaciens which produces bromtetracycline.
The antibiotic substance thus obtained is different from those known hitherto and different, in particular, from the antibiotic called chlortetracycline produced hitherto from the same microorganisms.
The newly discovered antibiotic substance was named bromtetracycline because it was found that its structure is identical to that of chlortetracycline, except that the chlorine atom is replaced by a bromine atom. . Bromtetracycline therefore has the composition C, H2sN20sBr and the following structural formula
EMI0001.0017
Bromtetracycline, in free form, is bitter and forms salts with both acids and bases.
Thus, bromtetracychne forms addition salts with organic and inorganic acids and can be obtained in the form of hydrochloride, hydrobromide, sulphate, borate, nitrate, phosphate, ascorbate, citrate, succinate, acetate, sulphamate and other salts. addition with acids of a similar nature. Bromtetracycline also forms monobasic and bibasic salts with bases,
in particular with those of alkali metals or alkaline earth metals, with ammonium bases and amino bases. As specific examples, mention may be made of the salts of calcium, barium, strontium, magnesium, ethylenediamine, triethylamine, piperidine, potassium and lithium. Bromtetracycline also forms salts, or more exactly complex salts, with basic salts of boric acid, such as sodium borate.
Salts of the types described above are of value in isolation and purification processes because they can be transformed, by neutralization or metathesis, into free amphoteric material or one form into another. These salts also have antiseptic and therapeutic properties. The solubility of bromtetracycline in water varies with pH, this solubility being greater as the pH increases and less from a pH of around 6. The form which is less soluble in water at an intermediate pH is said to be isoelectric, or amphoteric or free material.
<I> in vitro </I> tests have shown that salts of acids and bases, as well as isoelectric or free matter, are active against a large number of bacteria, including Gram-positive and Gram-negative bacteria.
The acid salts of bromtetracycline can easily be prepared by dissolving the free antibiotic in water or another suitable solvent acidified with an organic or inorganic acid. Likewise, basic salts can be easily prepared by adding an organic or inorganic base to a solution of the free antibiotic.
The infrared absorption spectrum of free antibiotic dissolved in hydrocarbon oil exhibits characteristic absorption bands in the vicinity of 3460, 3320, 3050, 1645, 1610, 1575, 1525 and 830 cm-1. The infrared spectrum of this compound, although similar in many respects to that of free chlortetracycline, in particular as regards the absorption bands on either side of 950 cm - ', reveals differences;
thus, this spectrum does not show any triple absorption band corresponding to that exhibited by chlortetracycline in the vicinity of 800 cm 2, while differences are evident in the absorption intensity ratios, as can be seen. expect with small molecular differences.
The antibiotic spectrum of bromtetracycline is in many respects similar to that of chlortetracycline.
It has been found that during fermentation it is desirable to grow the aforementioned microorganisms under submerged aerobic conditions with adequate agitation and aeration of the cultures, for example in a flask on a shaker or in a stirred fermenter. , equipped with a device allowing the continuous introduction of a current of air. Temperature does not appear to be critical in the temperature range of 25 to. 350 C, although it is preferred to operate at a temperature between 30 and 350 C. The initial pH of.
The medium is preferably close to neutral, although some amount of antibiotic will also be produced in media with initial pH values as low as 5.0 or as high as 8.5. A fermentation medium suitable for the production of bromtetracycline contains a carbon source, such as an assimilable carbohydrate, an assimilable nitrogen source, inorganic salts, such as phosphates, magnesium salts, etc. ., and sources of the usual trace elements. Buffers are usually included in the fermentation medium.
A source of bromide ions is added such that at least 50 parts per million bromide ions are present, the maximum amount required for satisfactory operation not exceeding approximately 1500 parts per million. The content of the nutrient medium in chloride ions should not exceed 50 parts per million. It is preferably less than 10 parts per million.
The carbon source can be either a soluble carbohydrate, such as sucrose, or an insoluble carbohydrate, such as starch, such as corn starch. Dextrin can also be used. While sucrose, which is a soluble sugar, is very satisfactory, lactose and glucose, which are two other soluble sugars, are relatively poor.
The amount of carbon source can vary within wide limits, ie from 0.5 to 10.0% by weight approximately, relative to the total weight of the fermentation medium.
As the source of assimilable nitrogen, inorganic ammonium salts can be used. Among these salts, mention may be made of ammonium sulfate, ammonium phos phate, etc. It is also possible to use organic nitrogen sources such as amino acids and various natural protein materials.
Among the inorganic salts which have proved to be advantageous, mention may be made of phosphates, which may be present in the form of ammonium phosphate or of a metal phosphate, in particular in the form of potassium phosphate, and magnesium sulfate; it is desirable that potassium phosphate is present, if there is no other source of potassium.
The addition of small amounts of heavy metals is desirable, unless such metals are present in the other ingredients. Among these elements, which may be present in the form of traces, for example as impurities, or be added, there may be mentioned copper, zinc, manganese, iron and chromium.
Among the buffering agents are calcium carbonate and salts of organic acids, such as citrates, acetates and lactates, which are useful in maintaining the pH within desired limits. In addition, organic acids can serve as sources of carbon in the metabolism of the microorganism. The use of a foam destroying agent is desirable in large capacity fermenters, although during fermentation the formation of foam is not a particularly difficult problem and is easily limited by the use of foam. a usual anti-foaming agent, such as octadecanol in bacon oil or other commercial foam suppressant or inhibitor.
Microorganisms of the species Streptomyces aureofaciens are divided into two general categories, one comprising the strains which exhibit a particular affinity for chloride ions and the other comprising the strains which do not exhibit a particular affinity for chloride ions. .
Strains in the first category tend to use any chloride ion present in the nutrient medium to produce chlortetracycline. In the absence of chloride ions, these strains tend to use bromide ions, provided the nutrient medium contains them, to produce bromtetracycline. A certain amount of tetracycline is invariably produced, even in the presence of an excess of chloride ions. The formation of one or the other of the anti-biotics depends on the conditions prevailing in the nutrient medium.
A strain of the first category, for example strain S-77, grown in a medium containing chloride ions but not containing bromide ions, will produce chlortetracycline and a small amount of tetracycline.
In a medium free of chloride ions but containing bromide ions, bromtetracycline and tetracycline will be formed, the latter in a notably higher quantity than in a fermentation medium containing chloride ions. The order of affinity of these organisms is such that chlortetracycline is preferably produced, with tetracycline and bromtetracycline taking second and third place, respectively.
In the presence of limited amounts of chloride ions and an excess of bromide ions, microorganisms in this category will first use up the chloride ions and then start to produce bromtetracycline. Tetracycline will also be synthesized. In the presence of an excess of chloride ions and bromide ions, organisms will not produce any appreciable amount of bromtetracycline. However, the bromide ions exert an inhibitory effect on the chloride ions, so that the ratio of tetra cyclin to chlortetracycline is changed in favor of tetracycline.
The strains of the second category behave very differently. They do not use bromide ions and therefore do not produce bromtetracycline under any culture conditions, in the presence or absence of chloride ions. Tetracycline is synthesized in moderate amounts and if chloride ions are present some chlortetracycline will also be produced. These microorganisms therefore cannot be used in the present process.
To obtain brom-tetracycline, it is therefore necessary to use a strain of organisms of the first species, having a particular affinity for chloride ions, and to eliminate the chloride ions or at least to limit the quantity thereof as indicated at the very beginning of the study. present presentation.
There are several ways to limit the content of chloride ions in the fermentation medium. One of these ways is to sequester the chloride ions in an inactive complex where the chlorine is not ionized. Satisfactory results have been obtained by using distilled water and by using constituents which do not contain chloride ions in the medium. Synthetic media, examples of which are given below, can be used for this purpose.
Many natural materials, often used in fermentation media, contain chloride ions. Their use is nevertheless possible, provided that they are previously deionized, by treatment with ion exchangers or other suitable agents to remove the chloride ions therefrom.
The licensee has developed a synthetic medium which is substantially free from chloride ions and which gives superior yields, while being easy to prepare, inexpensive and of constant composition. This medium contains, in general, sucrose as a carbohydrate, ammonium sulfate as a source of nitrogen, potassium phosphate as an inorganic salt, magnesium sulfate, calcium carbonate, sodium citrate and sodium. acetic acid as buffering agents, as well as copper sulfate, zinc sulfate and manganese sulfate in small amounts as sources of trace elements.
Substantially chloride-free grades of these materials are selected and distilled water is used so that the fermentation medium does not contain more than 1 part per million chloride ions. A source of bromide ions is then added in the desired amount.
An inoculum for fermentation can be prepared from a culture obtained on inclined culture media inoculated with Streptomyces aureofaciens. A suitable medium for inclined plane cultures is Waksman's agar of the following composition Glucose. _. . . . . . . . . . . . 10 g / 1 Peptone .......... 5 g / 1 KIH2P04 <B> ....... ...... </B> 1 g / 1 MgS04 .71-120 < B> ----- </B>. . . . . 0.5 g / 1 Agar. . . . . . . . . . . . . .
20 g / l The culture can be transferred to shake flasks which can be used as laboratory fermenters or for the production of inoculum for larger scale fermentation.
Depending on the dimensions of the fermenter, 0.5 to 1.5 volumes of free air can be used per volume of liquid medium. Foaming in the middle can. be limited by the sterile addition of an antifoam agent, such as bacon oil containing 2% octadecanol.
<I> Recovery and purification </I> As indicated, the fermentation product contains in addition to the bromtetracycline a lower amount of tetracycline. For some applications, it is not necessary to isolate bromtetracycline from the fermentation medium. Thus, the fermented material can be added directly to animal feed, so that a product is obtained which is particularly suitable for stimulating growth and / or combating animal diseases.
When it is not desired to use the myceha and insoluble matter, the fermentation medium can be filtered with or without acidification and the clear liquor can be added to the drinking water or to animal feed. If desired, the liquor containing the bromtetracycline and tetracycline can be concentrated under reduced pressure or spray dried and the antibiotic can be used in crude form to stimulate growth or treat diseases in humans, animals and animals. Poultry.
When it is desired to isolate the bromtetracycline and optionally the tetracycline in pure form, they can be recovered from the fermentation medium by a certain number of processes comprising one or more operations, carried out in various orders, adsorption, elution, d extraction by soil with or without auxiliary agents, crystallization, precipitation in the form of insoluble salts, such as calcium, barium, strontium or magnesium salts at pH greater than about 6.5,
or in the form of insoluble salts with sulphates or sulphonic acids of the type wetting agent or azo dye. It is also possible to pass the bromtetracycline and the tetracycline in solution in an organic solvent, using, as solubilizing agents, sulfates or sulfonates of the wetting agent or azo coloring agent type.
Bromtetracycline and tetracycline can further be separated from the raw fermentation medium or wort by acidification to a pH of about 3 or less, the bromtetracychne and tetracycline passing or remaining in solution and insoluble solids then being able to be separated and disposed of. Bromtetracycline and tetra cycline can be precipitated as alkaline earth metal salts in aqueous solutions at a pH greater than about 6.5.
This precipitate can be extracted by means of acidified water or by means of organic solvents, such as alcohols, alkoxyalkanols or ketones. The extraction can be done in an acidic, neutral or basic medium. Similarly, an aqueous solution containing bromtetracycline and tetracycline can be extracted with organic solvents immiscible with the aqueous layer, such as lower alcohols, alkoxyalkanols, esters and ketones immiscible with the aqueous layer.
Among the known solvents such as butanol, chloroform and ethyl acetate, butanol is preferred for the extraction of bromtetracycline and tetracycline. Certain alcohols, such as isopropanol, which are miscible with water, but are not targeted to saline, are also useful. The addition of a substance soluble in water and insoluble in the organic layer, for example ammonia, amines, alkali metal halides and sulphates, facilitates the extraction process. .
Bromtetracycline and tetracycline can be precipitated from aqueous solutions by addition of water soluble substances, for example ammonia, amines, alkali metal halides and sulfates.
If the fermentation wort contains chlor-tetracycline, this is recovered with brom-tetracycline and tetracycline in the methods described above. The licensee has also developed a new recovery process that is highly efficient both from the point of view of recovering a product free from inactive impurities and from the point of view of recovering a product free from other substances. antibiotics formed at the same time in the medium. This recovery process results in a crystalline product of high purity from both points of view.
This process essentially involves the use of quaternary ammonium salts, which selectively precipitate tetracycline and bromtetracycline from the fermentation medium, at alkaline pH (pH 8 to 11) as quaternary ammonium salts. bromtetracycline and tetracycline. After filtration, such a salt is pasted with a small amount of water and a relatively large amount of chloroform, so that the quaternary ammonium salts of bromtetracycline and tetracycline are dissolved in the chloroform phase of the paste.
The aqueous and chloroform phases are then preferably separated so as to remove the impurities dissolved in the water. Bromtetracycline and tetracycline are then extracted with an acidic aqueous solution at a pH of about 1 to 2.5, which gives rise to the formation of the acid salts of bromtetracycline and tetracycline, which go into solution in the aqueous phase, in which these salts precipitate in the form of crystalline products, by increasing the pH from 3 to 7, the precipitation starting at pH 3.
Quaternary ammonium salts, which are particularly useful in this recovery process, are alkyl-trimethylammonium chlorides and dialkyl-dimethylammonium chlorides, in which the alkyl group contains 8 to 18 (inclusive) carbon atoms. carbon. E, xample <I> 1 </I> A casein hydrolyzate is prepared by hydrolysis of 5 g of casein with 0.85 cm-3 of sulfuric acid in 100 cm2 of water, with stirring at 50 ° C. for 60 minutes and heating at 120.1 C for 120 minutes in an autoclave.
The hydrolyzed casein is neutralized to pH 6.0 with ammonia, about 2.5 cm8 thereof being required. A base medium is prepared containing, per liter, the casein hydrolyzate obtained from 5 g of casein, and the following ingredients magnesium lactate. . 3.5 g calcium carbonate. . 2.5 g NaH2PO4 'H2O. . . . . . 2.2 g sucrose. . . . . . . . . . 15;
0 g FeS04. 7:20 am. . . . . . . . 40.0 mg CUS04 '5H20 <B> ...... </B> 32.0 mg MnS04 - 4H20 <B> ...... </B> 20.0 mg ZnSQt - 7140 <B> ...... </B> 20.0 mg cobalt acetate <B> .... </B> 5.0 mg C1 ................ < 5 parts per million parts of the medium To this medium is added the amounts of potassium bromide indicated in the following table. The activities indicated in the same table are obtained.
EMI0005.0011
Potassium <SEP> <SEP> <SEP> Bromide <SEP> Units of Activity
<tb> g / liter <SEP> antibiotic
<tb> 0.1 <SEP> 415
<tb> 0.2 <SEP> 450
<tb> 0.4 <SEP> 430 The units indicated relate to the antibiotic activity on Straphylococcus aureus corresponding to the activity of 1 microgram of chlortetracycline per cm3. Fermentation is carried out at 270 C for 72 hours with stirring and aeration. The microorganism used for fermentation is Strep tomyces aureofaciens B. C. 41.
The fermentation yield of antibiotics consists of de / tetracycline, / 9 of bromtetracycline and / 9 of chlortetracycline. <I> Example 2 </I> Fermentation is carried out under conditions identical to those defined in Example 1, except that the duration of the fermentation is reduced to 48 hours.
The following results are obtained
EMI0005.0025
Potassium <SEP> <SEP> <SEP> Bromide <SEP> Units of Activity
<tb> g / liter <SEP> antibiotic
<tb> 0.1 <SEP> 330
<tb> 0.2 <SEP> 305
<tb> 0.4 <SEP> 290 The fermentation yield of antibiotics consists of 2 parts of tetracycline to 1 part of bromtetracycline and a small amount of chlortetracycline. <I> Example 3 </I> A medium is prepared containing less than 50 parts of halide ions per million parts and having the following composition, expressed in mgr / liter Sucrose .......... 30,000 D , L-alanine ..........
450 L-arginine <B> .... </B>. <B> ....... </B> 570 D, L-methionine ...... 200 L-glutamic acid <B> .... </B> 260 L-histidine .......... 200 D, L-beta-asparagine <B> .... </B> 200 (NH4) 2SO4. . . . . . . . . . . . <B> 2.000 </B> Magnesium lactate. . 5,000 NH4H2PO4. . . . . . . . . . 2,000 Potassium lactate. . 2.000 Mg '-' l (P04) 2 <B> .... </B>. <B> ..... </B> 1.000 Calcium carbonate .. 5.000 FeS04. 7:20 am. .
. <B> ..... </B> 60 ZnS04-7H20 ........ 33 MnS04-H20 ........ 19 CUS04 '5H20. . . . . . . . 5 Co (CH3CO2) 2 - 6H20. . The solution is brought to the required volume by means of distilled water over sodium hydroxide. All the constituents, with the exception of the calcium carbonate, are dissolved, then the pn is adjusted to 6.2-6.3 using a 3N ammoniacal solution (approximately 3cc per liter) and the carbonate of calcium is added. The medium does not give a precipitate with nitric acid and silver nitrate.
Its chloride ion content is found to be less than 0.17 mgr / liter. 100 cc fractions of the base medium are placed in Erlenmeyer flasks with a capacity of 500 cc, which are stoppered with cotton swabs and autoclaved for 15 minutes at 1200 C. 10 cc of sterile distilled water are added to each tube of a series of agar-culture tubes containing Streptomyces aureo-. faciens in sporulated form. The spores are gently detached with sterile wire and the spore suspensions are joined together.
The vials are each inoculated with 5 cc of this suspension and stirred for 24 hours at 27 () C, so that an inoculum is obtained. 6.3 liters of the medium and 35 cc of mineral oil are placed in a fermenter equipped with a stirrer and an aerator and the whole is sterilized.
The contents of 7 vials of 24 hour old inoculum and 50 cc of a sterile aqueous solution containing 0.97 g of potassium bromide are introduced, in sterile conditions, into the fermenter. Fermentation is carried out at 27.40 C, rotating the agitator at 350 revolutions per minute and passing air at a flow rate of 7 liters per minute. The air is first passed through a nitric acid and silver nitrate washer, then through a water washer and then through a sterilization filter.
If necessary, a foam inhibitor consisting, for example, of a <B> (e </B> General Electric Silicone SS24) polysiloxane is added.
As the medium grows, the fold slowly decreases and fermentation is continued until the pH stops decreasing and begins to increase. This takes about 51 hours and finally a solution is obtained with a pg of 5.90. The final must contains 412 units of antibiotic.
The fermentation wort contains bromtetracycline as well as tetracycline. To separate the bromtetracycline, the fermentation wort is acidified to a pH of 1.5, with stirring and the use of concentrated hydrochloric acid. The wort is then stirred with 95 g of a filter aid and the mixture is filtered.
The filter cake is pasted with 1400 cc of distilled water at 500 C. The paste obtained is filtered and the filtrate is added to the filtrate of the wort. In the filters, we find 94.4% of the activity of the must. The pH of the filtrate is adjusted to 2.5 using 50% sodium hydroxide (32 cc)
and the mixture is concentrated in vacuo at a temperature between 25 and 30 ° C., to a final volume of 2070 cc. 83; 6% of the activity of the must is found in the final mixture. The pH is adjusted to 1.5 using concentrated hydrochloric acid and 331 g of sodium chloride are added.
The solution is extracted twice with 311 cc portions of n-butanol and then three times extracted with 207 cc portions of n-butanol. The extracts are combined, their fold is adjusted to 2.5 by means of 50% sodium hydroxide and the mixture is distilled in vacuo,
in a nitrogen atmosphere, making additions of water, until all the n-butanol has azeotroped off. The ply is adjusted to 1.5 using concentrated hydrochloric acid, 5 g of a filter aid is added and the mixture is filtered through a sintered glass funnel.
A final aqueous volume of 1100 cc containing 70.5% of the activity of the original wort is obtained.
To this filtrate was added 41.5 g of ba ryum chloride dihydrate dissolved in 119 cc of distilled water. The mixture is stirred for half an hour and then the pH is adjusted to 8.5 using sodium hydroxide, after which the mixture is centrifuged. The resulting cake is washed with 40 cc of distilled water.
The washed cake is pasted with 249 cc of distilled water, the fold is adjusted to 2.5 using 50% sulfuric acid and the mixture is stirred vigorously for one hour. After that, the pH is adjusted to 1.5 with 50% sulfuric acid, stirred again for half an hour, and then centrifuged.
The precipitate obtained is washed by centrifugation with two 15 cc fractions of N / 10 sulfuric acid, the first time while mixing. The separated liquids, the total volume of which reaches 260 cc, contain 62% of the activity of the starting wort.
The procedure described above is repeated and the two separated liquids are combined. The pH of the mixture is adjusted to 3.5 using 10% sodium hydroxide, after which the mixture is stirred for 10 minutes and centrifuged. The precipitate obtained is washed with 10 cc of water and the washing water is added to the supernatant liquid.
The pH of the combined solutions is adjusted to 4.95 using 10% sodium hydroxide, and the precipitate is collected and washed. The precipitate is frozen and the remaining water is removed by sublimation.
2.65 g of a product containing 490 units of active products and containing 5.43% of bromine are obtained.
A Craig countercurrent distribution apparatus containing 30 tubes is charged with a solvent consisting of equal volumes of distilled water and n-butanol saturated with each other, the pH being adjusted to 2.5 using concentrated hydrochloric acid. 1.55 g of the frozen and dried product are pasted with 160 cc of the aqueous phase, the pH is readjusted to 2.5, 160 cc of the n-butanol phase are added and the pH is again adjusted to 2.5 by waving.
The mixture is filtered, the phases are allowed to separate and 50 cc of each phase are introduced into each of the first three tubes of the Craig apparatus. The remaining tubes are loaded with 50 cc of n-butanol saturated aqueous phase and the distribution is continued until the upper phase initially in tube 2 is equilibrated in tube 29. The distribution is effected. until 18 upper phases are extracted from tube 29. In this way, all the active material is fed into tube 29.
A spectrophotometric examination shows that there are two peaks, the first concentrating around tube 12 with an optical maximum at 355 - 365 milli- microns and the second concentrating around tube 21 with an optical maximum at 370 - 375 mm. crons. The solutions of tubes 18 to 29 containing the material exhibiting the second peak are combined and distilled under vacuum, in a nitrogen atmosphere, with the addition of water at a pH of 2.5, until an aqueous solution is obtained. 50 cc n-butanol-free finish. The pH is adjusted to 1.5 using hydrochloric acid, a filter aid is added and the mixture is filtered.
The pH of the solution is then slowly adjusted, with stirring, to 5.0 using 10% sodium hydroxide. The mixture is stirred with glass beads and left to stand overnight at 40 ° C.
The solution is centrifuged and the superfluous liquid is frozen and dried so that 200 mg of dry product are obtained. 152 mg of this product are dissolved in 1.4 cc of dry 2-ethoxy-ethanol and the solution is filtered, 0.14 cc of water are added and the mixture is placed in a stirrer. The material crystallizes and the crystals are filtered, washed and dried. The first harvest gives 49 mg of bromtetracycline.