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La préseme invention concerne la préparation de la tétracycline.
Plus particulièrement l'invention a pour objet un procédé pour obtenir la tétracycline par biosynthèse sans formation simultanée d'autres substances antibiotiques apparentées, procédé qui est caractérisé par l'utilisation d'un milieu de fermentation spécialement préparé, l'invention porte sur le procédé de préparation du nouveau milieu de fermentation, le milieu lui- même , etle nouveau procédé de fermentation par lequel on prépare la tétra- cycline.
La tétracycline est une substance antibiotique à laquelle on a donné le nom chimique de 4-diméthylamino-1,4,-4a,5,5a,6,11,12a-cotahydro-3,6,
10,12,12a-pentahydroxy-6-méthyl-1,11-dioxo-2-naphtacénecarbosamide On l'a tout d'abord préparé par déchloration de la chlorotétracycline par hydrogé- nation, en utilisant comme catalyseur du palladium sur charbon de bois.
On a trouvé récemment que certaines souches de micro-organiques qui produisent la chlorotétracycline par fermentation, produisent aussi de faibles quantités de tétracycline, particulièrement dans un milieu contenant des quantités minimes d'ions chlorure. Une sélection soignée de ces micro- organismes, y compris leurs mutants, a conduit aussi à isoler des souches qui produisent une quantité de tétracycline plus importante que la quantité de chlorotétracycline fabriquée simultanément. Mais en aucun cas il n'a été possible d'isoler un micro-organisme qui produise seulement de la té+ra- cycline, à l'exclusion de chlorotétracycline, en milieu de fermentation chloruré.
Bien que les propriétés thérapeutiques de la tétracycline et de la ohlorotétracycline soient étroitement apparentées, il y a pourtant des différences entre les deux substances antibiotiques, particulièrement en ce qui concerne la stabilité dans la circulation sanguine. Par suite de ces différences, et aussi pour plus de certitude dans le traitement de maladies justiciables de ces antibiotiques, il est désirable que la substance soit préparée et utilisée sous la forme d'une entité antibiotique unique, prati- quement pure. Il est très difficile de séparer la tétracycline de la chloro- tétracycline quand ces antibiotiques se présentent ensemble dans les mélan- ges de fermentation bruts à cause de leurs propriétés physiques et chimiques similaires.
Il est donc désirable de posséder une méthode pour préparer la tétracycline sans obtenir simultanément de quantités appréciables de chloro- tétracycline.
On a obtenu un certain succés dans la réalisation de ce but, en préparant un milieu de fermentation consitué par des substances nutritives essentielles qui sont exemptes de chlorures naturelso Mais cela a nécessité le choix d'hydrates de carbone assimilables pratiquement purs, tels que l'a- midon, le sucrose, le glucose, l'acide citrique, etc...; une source d'azote provenant de matières synthétiques, telles que nitrate d'ammonium, urée, sul- fate dammonium, ou des aminoacides purifiés et coûteux. Il a aussi fallu un choix soigné de sels minéraux exempts de chlorures , que l'on ajoute ha- bituellement dans des processus de fermentation pour donner des phosphates et autres cations et anions minéraux.
Non seulement ces milieux synthétiques sont coûteux à préparer, mais chose plus importante, on n'a pas obtenu une combinaison complète et exacte de toutes les conditions essentielles de nu- trition du micro-organisme pour la biosynthèse de la tétracycline. Par suite, la préparation de la tétracycline avec des milieux synthétiques exempts de chlorures reste coûteuse et antiécomomique.
L'expérience en matière de production des antibiotiques par des processus de fermentation montre qu'il y a dans des substances nutritives d'origine naturelle des substituants qui sont très importants pour obtenir des rendements élevés d'antibiotiques. C'est le cas en ce qui concerne la
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préparation de nombreux types et espèces différentes de substances antibio- tiques. Bien que l'on ait fait des efforts diligents pour déterminer la na- ture de ces substituants de substances nutritives d'origine naturelle, on a eu, très peu de succés lorsqu'il s'est agit de les identifier. La liqueur de macération de mais, par exemple, est considérée comme une substance nutri- tive presque indispensable pour obtenir un certain nombre d'antibiotiques avec des rendements maxima.
On trouve aussi ces matières nutritives désira bles,dans une mesure moindre, dans une variété d'autres substances d'ori- gine naturelle, telles que la farine de soja, la farine d'arachide, la fari- ne de poisson, et diverses autres substances d'origine naturelle communément employées, qui offrent une source d'azote, carbone et éléments minéraux biologiquement assimilables.
Les efforts faits pour éliminer les chlorures de ces substances nutritives naturelles désirables n'ont pas eu de succès. Quand on traite par des résines échangeuses d'ions les solutions nutritives . faites de liqueur de macération de mais, etc....dans le but d'éliminer les ions chlo- rures, on arrive à des rendements ridiculement faibles en tétracycline, lors- qu'on utilise ces milieux traités dans le processus de fermentation. Appa- remment, la résine échangeuse d'ions épuise le milieu, en un ou plusieurs des éléments essentiels inconue de la biosynthèse , ou bien elle fournit un corps indésirable. En tous cas, le rendement total en activité antibiotique que l'on obtient par fermentation d'un milieu nutritif adéquat après traite- ment par une résine échangeuse d'ions est notablement plus faible qu'on ne l'aurait pensé sans cela.
En sonséquence, il ne semble pas que la tétracy- cline puisse être préparée à bon marché à partir de matières nutritives d'o- rigine naturelle qui ont été soumises à un traitement d'échange d'ions..
11 y a lieu de noter que la croissance du micro-organisme produc- teur n'est pas nécessairement synonyme de production d'antibiotique. Des milieux nutritifs qui aménent une croissance luxuriante du cryptogame peuvent donner un rendement d'antibiotique faible ou nul Par contre, un milieu nutritif qui entretient une croissance de mycélium d'apparence ordinaire peut donner des rendements très élevés de substances antibiotique.
S'il est difficile d'obtenir un milieu de fermentation qui puisse servir de substrat pour la préparation de la tétracycline sans donner lieu aussi à la production de quantités appréciables de chlorotétracycline, la chose est devenue plus difficile encore par les récents progrés dans ce domaine, qui ont créé des milieux de fermentation améliorés et des souches de micro-organismes grosses productrices de chlorotétracycline, de sorte que maintenail est possible d'obtenir, sur une échelle commerciale, plu- sieurs milliers de microgrammes de chlorotétracycline- par cm3, contre quel- ques centaines de microgrammes de la matière il y a quelques années.
Le procédé de préparation de la tétracycline basé sur cette fermentation doit, pouvoir raisonnablement soutenir la concurrence avec lesprocédés similaires' de préparation de la chlorotétracycline. Les organismes qui produisent la chlorotértracycline particulièrement ceux du groupe Streptomyces aureofa- sont des utilisateurs extrêmement efficaces de chlorures, ils recher- chent et utilisent les chlorures qui existent dans les milieux de fermenta- tion, même à des concentrations inférieures à 1 mg/1.
L'élimination des chlo- rures pour permettre la production de la tétracycline est rendue plus diffi- cile par l'usage de souches à fort rendement, car elles sont très sensibles au milieu nutritif, et l'élimination de métabolites essentiels diminue sé- rieusement le rendement total en antibiotique que l'on peut obteniro
Chose inattendue, on a découvert que l'on peut enlever les ions dlo- rure de ces milieux de fermentation sans enlever sumutanément des quantités notables
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de corps nutritifs essentiels ou éléments de la biosynthèse de la tétracy- cline, et sans anone diminution appréciable du rendement total d'antibio.i- que que l'on pourrait obtenir autrement.
Conformément à la présente invention, l'élimination des ions chlo- rure par ce moyen se fait de préférence sous la forme de chlorure d'argent qui se forme dans les fractions chlorurées du milieu. Apparemment, on peut former le chlorure d'argent et l'éliminer du milieu nutritif sans pertur- ber l'équilibre délicat des autres métabolites qui sont nécessaires pour les rendements extrêmement élevés en tétracycline que l'on peut obtenir par le procédé de la présente invention.
On a trouvé aussi que pratiquement tous les ions chlorure présents dans le milieu, qui normalement serviraient à former la chlorotétracycline, peuvent être éliminés sous forme de chlorure mercureux, sans éliminer aussi simultanément d'autres constituants désirable- au milieu. Les résultats ex- cellents obtenus quand on utilise l'argent et-le mesure pour éliminer les ions chlorure du milieu de fermentation, sont inattendus aussi, étant donné la nature toxique de ces sels pour les micro-organismes.
Pour éliminer les ions chlorure du milieu de fermentatior ,on peut, suivant la présente invention , utiliser des moyens variés. Les sels d'argent ou les sels mercureux qui réagiront sur'-les ions chlorure présents dans tout le milieu, peuvent être ajoutés à celui-ci immédiatement avant le débit du processus de fermentation. On peut alors éliminer par filtration les sels d'argent et de mercure qui se forment. Une manière plus économique de préparer le milieu est de traiter seulement la partie du milieu qui con- tient les constituants naturels.
La source préférentielle d'éléments nutritifs pour la biosynthése de la tétracycline comprend des produits naturels tels que la liqueur de macération de mais, la farine de coton, la farine de soja, etc... Ceux-ci contiennent souvent les quantités appréciables d'ions chlorure, par exemple la liqueue de macération de mais peut contenir de 0,3 à 0,5 % d'ions chloru- re.Il-est généralement préféralbe d'éliminer les ions chlorure de ces consti- tuants naturels avant de passer aux étapes ultérieures de préparation des milieux par addition d'autres corps nutritifs comprenant les sels minéraux et oligo-éléments, et la stérilisation ultérieure. les matières nutritives ajoutées sont généralement exemptes de chlorures,ou on peut les rendre exemp- tes de chlorures par un traitement relativement simple.
La formation du chlorure d'argent ou du chlorure mercureux dans des solutions aqueuses contenant des ions chlorure est une chose bien connue aes chimistes, et n'a pas besoin d'être traitée plus en détail. La forme de réalisation préférentielle de l'invention consiste à diluer la liqueur de macération de mais jusqu'à une concentration appropriée, avec plusieurs vo- lumés d'eau exempte de chlorures, naturelle ou désionisée, puis à en prendre une partie aliquote. On ajuste celle-ci à un pH d'environ 3, et on ajoute lentement un sel soluble d'argent, tel que le nitrate d'argent, jusqu'à ce qu'on-n'obtienne plus de précipité de chlorure d'argent.
Le gros de la liqueur de macération de mais diluée peut alors être traité par des quanti- tés proportionnelles d'argent, et on peut alors éliminer le chlorure d'argent insoluble par filtration, centrifugation, ou par tout autre procédé désirable.
Si l'on connait à l'avance la quantité d'ions'-chlorure dans la liqueur , un calcul chimique stoechiométrique simple révèle la quantité de sel d'argent soluble qu'il faudra pour obtenir la précipitation complète de l'ion chlorure. Les mêmes observations s'appliquent aussi à l'usage des sels mercureux
Les sels d'argent que l'on peut ajouter au milieu de fermentation
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aqueux pour obtenir la précipitation du chlorure d'argent comprennent un certain nombre . de sels d'argent communément connus , tels que l'acétate d'argent, le benzoate d'argent, le propionate d'argent, le chlorate d'ar- gent, le perchlorate d'argent le lactate d'argent, le sulfate d'argent, et divèrs autres sels d'argent que l'on peut ajouter à une solution aqueuse pour précipiter les ions chlorure sous forme de chlorure d'argent.
Il n'est pas nécessaire que ces sels d'argent soient solubles dans une mesure appré- ciable. , bien que ce soit généralement désirable. Des composés d'argent pratiquement insolubles , tels que l'oxyde d'argent , qui réagissent sur les ions chlorure en solution aqueuse, peuvent aussi servir, et présentent l'avantage que leur insolubilité relative empêche l'introduction de quanti- tés excessices d'argent soluble dans le milieu de fermentation. Mais ilsné cessitent un temps plus long pour la précipitation.
Le pH auquel on conduit la précipitation peut varier considérable- ment, mais il est généralement dans la gamme acide. Bien que le chlorure d' argent soit plus insoluble aux environs du PH 7 qu'aux pH inférieurs, il est avantageux de conduire la précipitation aux pH inférieurs parce que, dans ces conditions, le chlorure d'argent précipite plus vite, et il y a moins de risque d'enlever des phosphates au milieu. En conséquence, un pH infé- rieur à 4 environ est préférable. On peut ajuster le milieu,à ces pH avec n'importe quel acide courant, sauf l'acide chlorhydrique.
Les divers sels mercureux que l'on peut aussi utiliser du même point de vue comprennent l'acétate mercureux, le benzoate mercureux, le chlorate mercureux, le nitrate mercureux, le sulfate mercureux, etc...
Etant donné la nature toxique des sels d'argent et des sels mer- cureux, il est préférable d'enlever l'excès stoechiométrique par rapport à la quantité nécessaire pour précipiter l'ion chlorure, avant le débit de la fermentation. On peut y arriver facilement en traitant par l'hydrogène sul- furé ou par d'autres sulfures, ce qui -amène la formation de sulfure d'argent ou de sulfure mercurux insolubles. Ces sulfures en question comprennent le sulfure d'ammonium, le sulfure de sodium, le sulfure de potassium, etc...
La précipitation de l'argent et du mercure par es sulfures est une chose bien connue de l'homme de l'art, et n'a pas besoin d'être traitée en détail.
Mais on peut noter qu'aux pH inférieurs, il y a moins de chance de précipi- ier les métaux lourds désirables qui peuvent se trouver dans le milieu nu- tritif. Le pH de la préoi- itation doit donc être inférieur à 7,0 environ.
Quand on utilise les suliures alcalins, la solution doit êtrebien tamponnée ou avoir un pH initial suffisamment bas pour que le pH final ne soit pas supé- rieur à 7 environ. On recueille les sels insolubles par filtration ou autre- ment, et on peut conserver le métal utile, argent ou mercure, qu'ils contien- nent.
Quand la quasi-totalité des besoins en phosphates de la fermenta- tion sont contenus dans la solution aqueuse que l'on traite par le sel d'ar- gent, il peut y avoir élimination d'une partie de l'ion phosphate, comme noté plus haut, En pareil cas, il sera désirable de rétablir les concentra- tions nécessaires en phosphate, et on peut le faire à n'importe quel stade avant fermentation, en ajoutant de l'acide phosphorique , du phosphate d'am- monium , du phosphate de magnésium, ou des phosphates alcalins, à la liqueur de fermentation..
Il faut prendre une précaution similaire en ce qui concerne les métaux lourds essentiels qui sont généralement nécessaires à l'état de tra- ces. Si ces ions métalliques lourds sont compris dans la liqueur que l'on traite, et si l'on constate que des quantités appréciables de ces ions pré- cipitent en plus de l'ion chlorure dans les conditions appliquées, il peut être nécessaire d'ajouter au milieu nutritif des quantités supplémentaires
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d'oligo-éléments après le traitement d'élimination de chlorures. Il est relativement simple de déterminer dans quel cas il y a lieu de le faire, et cela rentre dans le savoir technique.
Le milieu nutritif utilisé dans le procédé de la présente inven- tion est par ailleurs le même que celui recommandé actuellement pour la pré- paration de la chlorotétracyclîne ou de la tétracycline, et contient une sour- ce assimilable de carbone qui peut venir en totalité ou en partie de matiè- res aussi diverses que la liqueur de macération de mais, la farine de soja la farine de poisson, la farine d'arachides le sucre, l'amidon, le glucose, le maltose, le dextrose, les alcools les sucres, l'acide citrique, 'et di- verses autres substances carbonéeso Les besoins en azote de la fermentation peuvent être satisfaits par la lique .r de macération de mais, la farine de soja, la farine de poisson, la farine de viande, la caséine hydrolysée, les am no-acides, les sels d'ammonium, les nitrates, l'urée,
et divers autres corps naturels ou sythétiques ou mélanges de ceux-ci. Les divers sels inor- ganiques qui sont souvent utilisés avantageusement comprennent les phospha- tes et carbonates alcalino-terreux et de divers métaux lourds à l'état de traces, omme on l'indiquera dans les exemples précis qui suivent.
Les micro-organismes qui sont envisagés pour servir dans le procé- dé de la présente invention comprennent tous les micro-organismes producteurs d tétracycline qui ont aussi la faculté de produire de la chlorotétracycl'- nE .Les sels organismes décrits jusqu'à présent sont du genre Streptomyces .
En fait, tous les Streptomyces connus qui produisent de la chlorotétracycl-.- ne et de la tétracycline peuvent être classés comme Streptomyces aureofaciens.
On a obtenu de nombreuses souches et de nombreuses mutants, tant naturels que provoqués, de cette espèce, et bien que chaque souche ou chaque mutant puisse varier quelque peu par l'apparence grossière, les besoins nutritifs et à d'autres poirts de vue, pourtant tous les organismes de cette espèce qui produisent de la chlorotéracycline et de la tétracycline doivent selon toute vraisemblance être classés comme Streptomyces aureofacines ll est re- connu que certains taxonomistes peuvent préférer pour des raisons jugées per- tinantes par eux, attribuer à une ou plusieurs de ces variétés une classifi- cation autre que celle de Streptomyces aureofaciens, mais les connaissances que l'on possède actuellement sur l'espèce ne justifient pas cette classifi- cation.
C'est pourquoi aux fini de la présente invention, l'expression Streptom ces aureofaciens" comprend tous les cryptogames du genre Strepto- myces qui produisent à la fois de la chlorotétracycline et de la tétraycli- ne dans des milieux favorables à la fabrication de ces antibiotiques. L'in- vention , sous ses aspects larges, ne concerne pas particulièrement l'espè- ce de micro-org-nisme dont il s'agit, mais bien plutôt la conception nouvel- le qui tend à éliminer les ions chlorure dans les matières nutritives dont on dispose, sans influer aussi de façon nuisible sur la faculté que présen- te la solution nutritive de supporter une croissance adéquate des cryptoga- mes, et sans aucune perte de sa capacité de production d'antibiotique.
L'élimination absolue de tous les ions chlorure dans le milieu de fermenta ion n'est pas nécessaire, et bie entendu, elle est probablement impossible à réaliser. Toutefois, il est désirable d'avoir un produit aussi exempt de chlorotétracycline que possible, et à cet effet, il faut éliminer le plus possible de l'ion chlorure, Giossièrement la présence de 1 micro- gramme par cm3 d'ions chlorure dans le milieu de fermentation peut donner environ quatorze microgrammes par cm3 de chlorotétracycline dans la liqueur de fermentation.
Si le milieu de fermentation et la souche particulière de S aureofaciens choisie amène la formation de seulement 500 microgrammes par cm3 d'antibiotique total, et si le milieu contient 1 mg/1. d'ions chlo- rure, on peut s'attendre à ce que la liqueur de fermentation contiennet 14 microgrammes par cm3 de chlorotétracycline, soit environ 3% du total.
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Par contre ,si le milieu de fermentation et la souche de S.aureo- faciens sont tels qu'il y ait production de 5000 microgrammes par cm3 d'an- tibiotique, et ce résultat est possible si l'on utilise la présente invention, le produit final contiendra moins de 0,3% de chlorotétracycline dans la li- queur de fermentationo Etant donné que, pour la pratique, il n'y a pas d'in- convénient à ce q'un produit antibiotique de ce genre contienne environ 5 -il 6 % de chlorotétracycline, et étant donné que la présente invention est particulièrement applicable à la production de la tétracycline avec des ren- dements de 2000 microgrammes par cm3 et plus,
en voit que le milieu de fer- mentation peut contenir jusqu'à 20 mg/1 d'ion chlorure quand le rendement de fermentation est supérieur à 5000 microgrammes par cm3, mais que, lorsqu' on obtient des renements de seulement 2000 microgrammes environ par cm3 d'antibiotique total, le milieu ne doit pas contenir plus de 8 mg/1 environ d'ic- chlorure. Bien que les souches de s.aurcofaciens à rendement élevé per- mettent l'élimination totale de l'ion chlorure, les grandes quantités d'ions chlorure contenues dans la plupart des matières nutritives d'origine naturelle nécessitent l'élimination des chlorures par le procédé de la présente inven- tion, si l'on veut obtenir les nouveaux résultats envisagés par le procédé de la présente invention.
On illustrera maintenant 1 invention plus en détail au moyen des exemples suivants, dans lesquels on expose en détail les conditions et cons- tituànts précis. On comprendra que l'invention n'est pas limitée à ces for- mes de réalination particulières. Les exemples illustrent la portée de l'in- vention plutôt qu'ils ne la définissent
EXEMPLE 1
On mélange 200 parties en poids de liqueur de macération de mais avec 600 parûtes en volume d'eau, on agite avec un adjuvant, de filtration au silicate de magnésium, et on filtre. On ajuste à 2,3 le p de la solution, d'une valeur initiale de 4,0 à l'aide d'acide sulfurique 6N, dont il faut 60 parties.
On ajoute 60 parties d'une solution aqueuse à 10% de nitrate d'argent, on agite le mélange et on sépare par centrifugation le précipité obtenu, qui contient du chlorure d'argent, et on le met de côté pour en ré- cupérer l'argent. On sature l'hydrogène sulfuré le liquide surnageant, et on sépare par filtration le sulfure d'argent résultant. On élimine sous vi- de l'hydrogène sulfuré en excès, à l'aide d'azote. Après l'élimination de l'hydrogène sulfuré, on ajuste le pH à 4,0 avec de l'ammoniaque aqueux con- centré,et n porte le volume à 1000 volumes par addition d'eau, On utilise cette liqueur de macération de mais déshalogénée comme matière nutritive or- ganique d'origine naturelle pour un milieu de fermentation.
On prépare un milieu de fermentation contenant :
55 g d'amidon
5 g de sulfate d'ammonium
1,2g de sulfate de magnésium
60 mg de sulfate ferreux heptahydraté
50 mg de sulfate de manganèse tétrahydraté
100 mg de sulfate de zinc heptahydraté 6,lm de nitrate cobalteux hexahydraté
20 cm3 d'huile de saindoux g de carbonate de calcium exempt de chlorures
80 mg d'acide phosphorique
1000 g de solution de liqueur de macération de mais déchlorurée, préparée comme décrit plus haut, eau distillée:q.s.)our
1 litre.
On cuit le milieu de fermentation à 120 C pendant 15 min.,on refroi-
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dit et on inocule avec une souche à grand rendement de S.aureofaciens S-77 et on fait fermenter avec agitation et aération. Au bout de 120 h, le milieu fermenté contient plus de 5000 microgrammes par cm3 de tétracycline, teneur déterminée par titrage spetrophotométrique. L'analyse chromatographique indique la présence de 5 % au maximum de chlorotétracycline par rapport à l'antibiotique total présent.
EXEMPLE II
Quand on repète le procédé de l'exemple I en utilisant de la liqueur de macération de mais non traitée au lieu de la liqueur de macéra- tion de mais déchlorurée décrite dans cet exemple, et en utilisant la même souche de S aureofacens on obtient à peu près le même rendement total d' antibiotique par cm3 de substances , dont 1300-1600 microgrammes par cm3 sont de la chlorotétracycline.
EXEMPLE III
Quand on utilise, dans le procédé de l'exemple I, une liqueur de macération de mais qui a été déchlorurée par traitement avec des résines échangeuses d'ions, le rendement total d'antibiotique est inférieur à envi- ron 2000 microgrammes par cm3, ce qui indique que des métabolites essentiels ont été enlevés à la liqueur de macération de mais traitée, par le traite- ment au moyen des échangeurs d'ions.
EXEMPLE IV
On mélange 200 parties en poids de liqueur de macération de mais avec 600 parties en volume d'eau, on agite avec un adjuvant de filtration au silicate de magnésium et on filtre. On ajuste le pH de la solution à 2,5 avec de l'acide nitrique, et on ajoute 60 parties d'une composition à 10% de nitrate mercureux dans l'acide nitrique aqueux à 3% On agite le mélange , et on sépare par filtration le précipité résultant, qui contient du chlorure mercureux. On sature la solution clarifiée avec de l'hydrogène sulfuré, et on sépare par filtration le sulfure mercureux résultant . On élimine l'excès sous vide en utilisant de l'air pour l'agitation. Après élimination de l'hy- drogène sulfuré, on ajuste le pH à 4,0 avec de l'ammoniaque concentré, et on porte le volume à 1000 volumes par addition -d'eau.
On utilise la liqueur de macération de mais ainsi déchlorée dans une fermentation conduite par ailleurs comme dans l'exemple I, et on obtient un rendement d'environ 5000 microgrammes par cm3 de tétracycline. La produc- tion de chlorotétracycline obtenue dans ce procédé est de même inférieur 5% environ de l'antibiotique total obtenu.
La récupération de la tétracycline dans les solutions de fermenta- tion décrites plus haut peut être réalisée par des moyens variés qui toute- fois ne font pas partie de la présente invention . Pour servir dans l'alimen- tation animale, la liqueur de fermentation peut être simplement incorporée aux aliments pour animaux, et on obtient un effet de stimulation de crois- sance REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un milieu nutritif pratiquement exempt de chlorures pour la production de la tétracyoline par biosynthèse, caracté- risé en ce qu'on traite la solution aqueuse de matière nutritive chlorurée par des ions argent et/ou des ions mercureux , à un pH inférieur à 7 environ, et en ce qu'on sépare de la solution aqueuse le chlorure d'argent et/ou le chlorure mercureux ainsi formés.
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The present invention relates to the preparation of tetracycline.
More particularly the invention relates to a process for obtaining tetracycline by biosynthesis without simultaneous formation of other related antibiotic substances, which process is characterized by the use of a specially prepared fermentation medium, the invention relates to the process preparation of the new fermentation medium, the medium itself, and the new fermentation process by which tetracyclin is prepared.
Tetracycline is an antibiotic substance which has been given the chemical name of 4-dimethylamino-1,4, -4a, 5,5a, 6,11,12a-cotahydro-3,6,
10,12,12a-pentahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-2-naphtacenecarbosamide It was first prepared by dechlorination of chlorotetracycline by hydrogenation, using as catalyst palladium on charcoal .
It has recently been found that certain strains of microorganisms which produce chlorotetracycline by fermentation also produce small amounts of tetracycline, particularly in a medium containing minimal amounts of chloride ions. Careful selection of these microorganisms, including their mutants, has also led to the isolation of strains which produce a greater quantity of tetracycline than the quantity of chlorotetracycline produced simultaneously. But in no case has it been possible to isolate a microorganism which produces only te + racyclin, to the exclusion of chlorotetracycline, in a chlorinated fermentation medium.
Although the therapeutic properties of tetracycline and ohlorotetracycline are closely related, yet there are differences between the two antibiotic substances, particularly with regard to stability in the bloodstream. As a result of these differences, and also for greater certainty in the treatment of diseases justiciable by these antibiotics, it is desirable that the substance be prepared and used as a single, substantially pure antibiotic entity. It is very difficult to separate tetracycline from chlorotetracycline when these antibiotics occur together in crude fermentation mixtures because of their similar physical and chemical properties.
It is therefore desirable to have a method for preparing tetracycline without simultaneously obtaining appreciable amounts of chlorotetracycline.
Some success in achieving this goal has been obtained by preparing a fermentation medium consisting of essential nutrients which are free from natural chlorides. But this has necessitated the selection of practically pure assimilable carbohydrates, such as starch, sucrose, glucose, citric acid, etc ...; a source of nitrogen from synthetic materials, such as ammonium nitrate, urea, ammonium sulfate, or purified and expensive amino acids. It also required a careful selection of mineral salts free from chlorides, which are usually added in fermentation processes to give phosphates and other mineral cations and anions.
Not only are these synthetic media expensive to prepare, but more importantly, a complete and exact combination of all the essential nutrient conditions of the microorganism for tetracycline biosynthesis has not been obtained. As a result, the preparation of tetracycline with synthetic media free of chlorides remains costly and uneconomical.
Experience with the production of antibiotics by fermentation processes shows that there are substituents in naturally occurring nutrients which are very important for obtaining high yields of antibiotics. This is the case with regard to
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preparation of many different types and species of antibiotic substances. Although diligent efforts have been made to determine the nature of these naturally occurring nutrient substituents, very little success has been achieved in identifying them. Maize maceration liquor, for example, is considered to be an almost essential nutrient for obtaining a number of antibiotics with maximum yields.
These desirable nutrients are also found, to a lesser extent, in a variety of other naturally occurring substances, such as soybean meal, peanut meal, fish meal, and various other substances. other commonly used substances of natural origin, which provide a source of nitrogen, carbon and biologically assimilable mineral elements.
Efforts to remove chlorides from these desirable natural nutrients have not been successful. When treating nutrient solutions with ion exchange resins. maceration liquor, etc ... for the purpose of removing chloride ions, ridiculously low yields of tetracycline are achieved when these treated media are used in the fermentation process. Apparently, the ion exchange resin either depletes the medium in one or more of the essential elements unknown to biosynthesis, or it provides an unwanted body. In any event, the total yield of antibiotic activity obtained by fermentation of a suitable nutrient medium after treatment with an ion exchange resin is notably lower than would otherwise have been thought.
Accordingly, it does not appear that tetracycline can be inexpensively prepared from naturally occurring nutrients which have been subjected to ion exchange treatment.
It should be noted that the growth of the producing microorganism is not necessarily synonymous with the production of antibiotic. Nutrient media which induce lush fungal growth may give little or no antibiotic yield. In contrast, a nutrient medium which sustains ordinary appearing mycelial growth can give very high antibiotic yields.
While it is difficult to obtain a fermentation medium which can serve as a substrate for the preparation of tetracycline without also giving rise to the production of appreciable quantities of chlorotetracycline, the matter has become even more difficult by recent advances in this field. , which created improved fermentation media and strains of large chlorotetracycline-producing microorganisms, so that maintenail is possible to obtain, on a commercial scale, several thousand micrograms of chlorotetracycline- per cm3, against which - only hundreds of micrograms of the material a few years ago.
The process for preparing tetracycline based on this fermentation should reasonably be able to compete with similar processes for preparing chlorotetracycline. The organisms which produce chlorotertracycline, particularly those of the Streptomyces aureofa- group, are extremely efficient users of chlorides, they seek out and use the chlorides which exist in fermentation media, even at concentrations below 1 mg / l.
The elimination of chlorides to allow the production of tetracycline is made more difficult by the use of high yielding strains, because they are very sensitive to the nutrient medium, and the elimination of essential metabolites is seriously reduced. the total yield of antibiotic that can be obtained o
Unexpectedly, it has been found that one can remove chloride ions from these fermentation media without suddenly removing significant amounts.
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of essential nutrients or elements of tetracycline biosynthesis, and without an appreciable decrease in the total yield of antibiotic which might otherwise be obtained.
According to the present invention, the removal of chloride ions by this means is preferably in the form of silver chloride which forms in the chloride fractions of the medium. Apparently, silver chloride can be formed and removed from the nutrient medium without disturbing the delicate balance of other metabolites which are necessary for the extremely high yields of tetracycline obtainable by the process herein. invention.
It has also been found that virtually all of the chloride ions present in the medium which would normally serve to form chlorotetracycline can be removed as mercurous chloride, without also simultaneously removing other desirable constituents from the medium. The excellent results obtained when using silver and measuring it to remove chloride ions from the fermentation medium, are also unexpected, given the toxic nature of these salts to microorganisms.
To remove the chloride ions from the fermentation medium, it is possible, according to the present invention, to use various means. Silver salts or mercury salts which will react with the chloride ions present throughout the medium, can be added to it immediately before the flow of the fermentation process. The silver and mercury salts which form can then be filtered off. A more economical way of preparing the medium is to treat only the part of the medium which contains the natural constituents.
The preferred source of nutrients for the biosynthesis of tetracycline includes natural products such as corn maceration liquor, cottonseed meal, soybean meal, etc. These often contain appreciable amounts of Chloride ions, for example corn maceration liquor may contain 0.3 to 0.5% chloride ions. It is generally preferred to remove chloride ions from these natural constituents before proceeding to the subsequent stages of preparation of the media by addition of other nutrients including mineral salts and trace elements, and subsequent sterilization. the added nutrients are generally free of chlorides, or they can be rendered free of chlorides by relatively simple processing.
The formation of silver chloride or mercury chloride in aqueous solutions containing chloride ions is well known to chemists, and does not need to be discussed in more detail. The preferred embodiment of the invention consists in diluting the corn maceration liquor to an appropriate concentration, with several volumes of water free from chlorides, natural or deionized, then in taking an aliquot thereof. This is adjusted to a pH of about 3, and a soluble silver salt, such as silver nitrate, is slowly added until no more chloride precipitate is obtained. silver.
The bulk of the diluted corn maceration liquor can then be treated with proportional amounts of silver, and the insoluble silver chloride can then be removed by filtration, centrifugation, or any other desirable method.
If one knows in advance the quantity of chloride ions in the liquor, a simple stoichiometric chemical calculation reveals the quantity of soluble silver salt which it will take to obtain complete precipitation of the chloride ion. The same observations also apply to the use of mercury salts.
Silver salts that can be added to the fermentation medium
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aqueous to obtain the precipitation of silver chloride include a number. commonly known silver salts, such as silver acetate, silver benzoate, silver propionate, silver chlorate, silver perchlorate, silver lactate, sulfate silver, and various other silver salts which can be added to an aqueous solution to precipitate chloride ions as silver chloride.
These silver salts need not be soluble to any appreciable extent. , although this is generally desirable. Substantially insoluble silver compounds, such as silver oxide, which react with chloride ions in aqueous solution, can also be used, and have the advantage that their relative insolubility prevents the introduction of excessive amounts of salt. silver soluble in the fermentation medium. But they did not cease a longer time for the rush.
The pH at which precipitation is carried out can vary widely, but is generally in the acidic range. Although silver chloride is more insoluble at around pH 7 than at lower pH, it is advantageous to conduct precipitation at lower pHs because, under these conditions, silver chloride precipitates faster, and there is has less risk of removing phosphates in the middle. Therefore, a pH of less than about 4 is preferable. The medium can be adjusted to these pHs with any common acid except hydrochloric acid.
The various mercury salts which can also be used from the same point of view include mercury acetate, mercury benzoate, mercury chlorate, mercury nitrate, mercury sulfate, etc.
Due to the toxic nature of silver and mercury salts, it is preferable to remove the stoichiometric excess over the amount needed to precipitate the chloride ion, before the fermentation begins. This can be easily accomplished by treating with hydrogen sulphide or other sulphides, which results in the formation of insoluble silver sulphide or mercurux sulphide. These sulphides in question include ammonium sulphide, sodium sulphide, potassium sulphide, etc.
The precipitation of silver and mercury by sulfides is well known to those skilled in the art, and does not need to be discussed in detail.
However, it can be noted that at lower pHs there is less chance of precipitating desirable heavy metals which may be in the nutrient medium. The pH of the mixture should therefore be less than about 7.0.
When using alkaline sulides, the solution should be well buffered or have an initial pH low enough that the final pH does not exceed about 7. Insoluble salts are collected by filtration or otherwise, and the useful metal, silver or mercury, which they contain can be retained.
When almost all of the phosphate requirements of the fermentation are contained in the aqueous solution which is treated with the silver salt, there may be elimination of part of the phosphate ion, as noted above, In such a case it will be desirable to restore the necessary phosphate concentrations, and this can be done at any stage before fermentation, by adding phosphoric acid, ammonium phosphate. , magnesium phosphate, or alkaline phosphates, to the fermentation liquor.
A similar precaution should be taken with regard to essential heavy metals which are generally required for tracing. If these heavy metal ions are included in the liquor being treated, and appreciable amounts of these ions are found to precipitate in addition to the chloride ion under the conditions applied, it may be necessary to add additional amounts to the nutrient medium
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trace elements after the chloride removal treatment. It is relatively straightforward to determine when to do so, and that comes within technical knowledge.
The nutrient medium used in the process of the present invention is otherwise the same as that currently recommended for the preparation of chlorotetracycline or tetracycline, and contains an assimilable source of carbon which may come wholly or partly of materials as diverse as corn maceration liquor, soybean meal fish meal, peanut meal sugar, starch, glucose, maltose, dextrose, alcohols sugars , citric acid, and various other carbonaceous substances The nitrogen requirements of fermentation can be met by maceration liquor of maize, soybean meal, fishmeal, meat meal, hydrolyzed casein, amino acids, ammonium salts, nitrates, urea,
and various other natural or synthetic substances or mixtures thereof. The various inorganic salts which are often used to advantage include alkaline earth phosphates and carbonates and various heavy metals in trace amounts, as will be indicated in the specific examples which follow.
Microorganisms which are contemplated for use in the process of the present invention include all tetracycline producing microorganisms which also have the ability to produce chlorotetracycl'-nE. The organism salts described heretofore are of the genus Streptomyces.
In fact, all of the known Streptomyces which produce chlorotetracycline and tetracycline can be classified as Streptomyces aureofaciens.
Many strains and mutants, both natural and induced, have been obtained from this species, and although each strain or mutant may vary somewhat in gross appearance, nutrient requirements and other considerations, yet all organisms of this species which produce chloroteracycline and tetracycline are in all likelihood to be classified as Streptomyces aureofacins It is recognized that some taxonomists may prefer for reasons considered relevant by them, ascribed to one or more of these varieties a classification other than that of Streptomyces aureofaciens, but the current knowledge of the species does not justify this classification.
This is why for the purposes of the present invention, the expression Streptom ces aureofaciens "includes all cryptogams of the genus Streptomyces which produce both chlorotetracycline and tetraycline in media favorable for the manufacture of these. The invention, in its broad aspects, does not particularly relate to the species of microorganism in question, but rather to the novel design which tends to eliminate chloride ions in the nutrients available without also adversely affecting the ability of the nutrient solution to support adequate fungal growth, and without any loss of its antibiotic production capacity.
Absolute removal of all chloride ions from the fermentation medium is not necessary, and of course it is probably impossible to achieve. However, it is desirable to have a product as free from chlorotetracycline as possible, and for this purpose, as much of the chloride ion as possible should be removed, especially the presence of 1 microgram per cm 3 of chloride ions in the chloride. fermentation medium can yield approximately fourteen micrograms per cm3 of chlorotetracycline in the fermentation liquor.
If the fermentation medium and the particular strain of S. aureofaciens chosen results in the formation of only 500 micrograms per cm3 of total antibiotic, and if the medium contains 1 mg / l. of chloride ions, the fermentation liquor can be expected to contain 14 micrograms per cm3 of chlorotetracycline, or about 3% of the total.
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On the other hand, if the fermentation medium and the strain of S. aureofaciens are such that there is production of 5000 micrograms per cm3 of antibiotic, and this result is possible if the present invention is used, the final product will contain less than 0.3% of chlorotetracycline in the fermentation liquor Since, in practice, there is no disadvantage that an antibiotic product of this kind contains approximately 5 -11 6% chlorotetracycline, and since the present invention is particularly applicable to the production of tetracycline with yields of 2000 micrograms per cm3 and more,
It can be seen that the fermentation medium can contain up to 20 mg / l of chloride ion when the fermentation yield is greater than 5000 micrograms per cm3, but that when yields of only about 2000 micrograms per cm3 are obtained. cm3 of total antibiotic, the medium should not contain more than about 8 mg / l of chloride. Although the high yielding strains of s.aurcofaciens allow complete removal of the chloride ion, the large amounts of chloride ions contained in most naturally occurring nutrients require the removal of chlorides by the chloride. process of the present invention, if the new results contemplated by the process of the present invention are to be obtained.
The invention will now be illustrated in more detail by means of the following examples, in which the precise conditions and components are set forth in detail. It will be understood that the invention is not limited to these particular embodiments. The examples illustrate the scope of the invention rather than defining it.
EXAMPLE 1
200 parts by weight of corn maceration liquor are mixed with 600 parts by volume of water, stirred with a magnesium silicate filter aid, and filtered. The p of the solution, from an initial value of 4.0, is adjusted to 2.3 with 6N sulfuric acid, of which 60 parts are required.
60 parts of a 10% aqueous solution of silver nitrate are added, the mixture is stirred and the resulting precipitate, which contains silver chloride, is separated by centrifugation and set aside for recovery. the money. The supernatant liquid is saturated with hydrogen sulfide, and the resulting silver sulfide is filtered off. Excess hydrogen sulfide is removed under vacuum with nitrogen. After removing the hydrogen sulfide, the pH is adjusted to 4.0 with concentrated aqueous ammonia, and the volume is increased to 1000 volumes by addition of water. This corn maceration liquor is used. dehalogenated as a naturally occurring organic nutrient for a fermentation medium.
A fermentation medium is prepared containing:
55 g of starch
5 g of ammonium sulfate
1.2g of magnesium sulfate
60 mg of ferrous sulfate heptahydrate
50 mg of manganese sulfate tetrahydrate
100 mg of zinc sulphate heptahydrate 6, lm of cobaltous nitrate hexahydrate
20 cm3 of lard oil g calcium carbonate free from chlorides
80 mg of phosphoric acid
1000 g of dechlorinated corn maceration liquor solution, prepared as described above, distilled water: q.s.) Or
1 litre.
The fermentation medium is cooked at 120 ° C. for 15 min., Then cooled.
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Said and inoculated with a high yield strain of S. aureofaciens S-77 and fermented with agitation and aeration. After 120 h, the fermented medium contains more than 5000 micrograms per cm3 of tetracycline, content determined by spetrophotometric titration. Chromatographic analysis indicates the presence of up to 5% chlorotetracycline relative to the total antibiotic present.
EXAMPLE II
When the process of Example I is repeated using untreated corn maceration liquor instead of the dechlorinated corn maceration liquor described in this example, and using the same strain of S aureofacens the result is roughly the same total antibiotic yield per cm3 of substance, of which 1300-1600 micrograms per cm3 are chlorotetracycline.
EXAMPLE III
When a corn maceration liquor which has been dechlorinated by treatment with ion exchange resins is used in the process of Example I, the total yield of antibiotic is less than about 2000 micrograms per cm3. indicating that essential metabolites have been removed from the treated corn maceration liquor by treatment with ion exchangers.
EXAMPLE IV
200 parts by weight of corn maceration liquor are mixed with 600 parts by volume of water, stirred with magnesium silicate filter aid and filtered. The pH of the solution is adjusted to 2.5 with nitric acid, and 60 parts of a composition of 10% mercurous nitrate in 3% aqueous nitric acid are added. The mixture is stirred, and separated. by filtration the resulting precipitate, which contains mercurous chloride. The clarified solution is saturated with hydrogen sulfide, and the resulting mercurous sulfide is filtered off. The excess is removed in vacuo using air for agitation. After removing the hydrogen sulfide, the pH is adjusted to 4.0 with concentrated ammonia, and the volume is brought up to 1000 volumes by addition of water.
The corn maceration liquor thus dechlorinated is used in a fermentation carried out elsewhere as in Example I, and a yield of about 5000 micrograms per cm 3 of tetracycline is obtained. The production of chlorotetracycline obtained in this process is likewise less than about 5% of the total antibiotic obtained.
Recovery of tetracycline from the fermentation solutions described above can be accomplished by various means which, however, do not form part of the present invention. For use in animal feed, the fermentation liquor can be simply incorporated into animal feed, and a growth stimulating effect is obtained.
1. Process for the preparation of a nutrient medium practically free of chlorides for the production of tetracyoline by biosynthesis, characterized in that the aqueous solution of chlorinated nutrient material is treated with silver ions and / or mercury ions, at a pH below approximately 7, and in that the silver chloride and / or the mercury chloride thus formed is separated from the aqueous solution.