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"Nouvelles substances de croissance et leur procédé de pré- paration"
Par ferri-oxamines, on entend des substances de croissance renfermant du fer qui ont été isolées à partir d'organismes végétaux, notamment à partir de micro-organismes (cf. Bickel et ses Collaborateurs, "Experientia" 16, 129 [1960]; Bickel et ses Collaborateurs, "Helv. Chim. Act." 18, 2129 [1960]. Le fer peut être soutiré de ces substances,
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auquel cas on obtient 1rs desferri-oùDlp08" oorr..poD1antB, A am'Wft'M 7ase << a yT*#fnr T t<t J5 nnnnna6 ant A..."..'ft sont A !W'!!1?'y. Akmwat t!'9t"orm8 en les ferri# oxRaines par addition d'ions fer.
Sur la base de leur faculté de lier le fers les desferri-composés peuvent Stre utilisés en méde- cine, par exemple dans le cas d'un dépôt pathogène dame l'organisme de pigments ronfermant du fer, tels qu' ils se
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présentent dans l'hémochrcmatose et 1hmosidéroeeo On a maintenant trouvé de façon surprenante que Isa desferri-ooEamines sont formées par les organismes végétaux et peuvent, par suite, être directement isolées à partir de ceux-ci. En outre, il s'est avéré que
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la formation des ferri-oxamines et/ou des dsterri-ozsaines dépend à un degré élevé de la teneur en fer du milieu nutri- tif dans lequel les organismes végétaux sont cultivée.
Un très grand nombre de micro-organismes ne formant des ferri-
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oxamineig et/ou des desferri-oxamines, ou n'en forment que dans des quantités assez grandes, que lorsqu'ils sont culti- vés avec un manque de fer, c'est-à-dire dans des solutions nutritives renfermant moins de fer qu'on n'en utilise norma- lement lors de la culture des micro-organismes o Même lors d'une absence presque complète de fers il se forme une quan-
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tité notable de de.sterr1-oXli1l\ine o Par ailleurs, à partir d'une certaine teneur en fer,
on ne produit essentiellement
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plus de ferri-oxamines ou de desferri-oxamine. Le maximum de la formation de la ferri-oxamine et de la desferri-oxa- mine se présente pour une teneur en fer très minime du mi- lieu nutritif. S'il s'agit par suite, avec un micro-organis me déterminé, d'obtenir un rendement aussi élevé que possi- ble en desferri-oxamine, ledit micro-organisme est alors cultivé avantageusement sur des milieux pauvres en fer.
Le tableau 1 montre la dépendance existant entre la quantité de ferri-oxamine et/ou de desferri-oxamine et la teneur en fer du milieu nutritif dans le cas de la souche Hocardia brasi- liensie ETH 27413 formant de la desferri-oxamine E et respec- tivement de la ferri-oxamine E.
Tableau 1
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<tb> Teneur <SEP> en <SEP> fer <SEP> du <SEP> milieu <SEP> Quantité <SEP> de <SEP> ferri-oxamine
<tb>
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<tb> nutritif <SEP> en <SEP> moles <SEP> de <SEP> et/ou <SEP> de <SEP> desferri-oxamine
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<tb> sulfate <SEP> ferrique <SEP> par <SEP> litre <SEP> par <SEP> litre <SEP> après <SEP> culture
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<tb> pendant <SEP> 9 <SEP> jours
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<tb> traces <SEP> non-mesurables <SEP> 280 <SEP> mg
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<tb> 2.5 <SEP> 10-8 <SEP> 520 <SEP> mg
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<tb> 2,5.
<SEP> 10-7 <SEP> 170 <SEP> mg
<tb>
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<tb> 2,5 <SEP> 10-6 <SEP> inférieure <SEP> à <SEP> 5 <SEP> mg
<tb>
Le nouveau procédé d'obtention des d&sferri- oxamines est caractérisé par le fait que la oulture eet ef- fectuée dans une solution nutritive avec un manque de fer,
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jusqu'à ce qu'il'se soit formé une quantité notable de desfferri-oxamine, qu'on transforme la ferri-oxamineéven- tuellement présente en desferri-oxamine par addition de substances capables de lier le fer et qu'on isole la desferri-oxamine de la solution nutritive.,
On utilise comme substances de départ des micro-organismes convenant à l'obtention des ferri-oxamines
La solution nutritive renferme les sources usuelles de carbone et d'azote, par exemple dugLucose,
du saccharose, du lactose, de l'amidon, des alcools comme le mannitol et le glycérol, des acides aminés, par exemple l'ornitheine, des peptides, des protéines et leurs produits de dégradation comme la peptone ou la tryptone, dea ex= traits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le mais ou le froment, des rési- dus de distillation provenant de la préparation de l'alcool, des levures, des graines notamment de colza et de soja, des graines de coton, des sels d'ammonium, des nitrates Comme sels inorganiques, la solution nutritive renferme par exemple des chlorures, des carbonates, des sulfates, des nitrates de métaux aloalins et alcalino-terreux, du magné- sium, du zinc ou du manganèse, La teneur en sel de fer ne doit pas, en général,
dépasser 10-7 mole par litre, mais la teneur optimale doit être déterminée pour chaque organisa Lorsqu'on utilise l'eau du robinet pour préparer la. solu-
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tion nutritive, on doit tenir compte de sa teneur en fera
La culture a lieu de manière aérobie, c'est-à- dire par exemple en culture de surface au repos ou, de pré- férence, de manière immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans dos flacons agités ou dans les fermenteurs connus.
Comme température, convient une température comprise entre 18 et 40 C. de préférence une température de 27 Co Dans ce cas, la solution nutritive présente en général au bout de 4 à 10 jours un effet notable analogue à celui de la desferri-oxamine Mesuré en tant qu'activité ferri-oxaminique après transformation des desferri-oxamines en ferri-oxamines à l'aide d'un sel de fer- (III)7.
L'activité ferri-oxaminique peut être déterminée par voie miorobiologique à l'aide du test de Bonifas modifié (cfo Zähner et autres, "Arch Mikrobiolo" 36. page 325 et suivantes [1960], Comme solution-test, on utilise une solu- tion de ferrimycine d'une teneur de 0,01 mg par centimètre- cube, sous la forme d'une souche test de Staphylecoscue aureuso
On peut également déterminer par voie optique la concentration en ferri-oxamine de la solution de culture.
A cet effet!)on secoue pendant 5 minutes 5 car du liquide de culture avec 1,5 g de chlorure de sodium, un centimètre cube d'une solution à 0,1 % de sulfate ferrique et 5 car
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d'alcool benzylique, sépare par centrifugation, filtre la phase organique et détermine l'extinction de la phase orga- nique à 410 m . Comme échantillon de comparaison, on se sert d'un extrait préparé de la même manière à partir d'une solution nutritive non-ensemencée.
Pour l'isolement des desferri-oxamines, on peut se servir des méthodes connues. La ferri-oxamine présente dans le milieu de culture est transformée en desferri-oxa- mine par addition de substances formant des complexes ferri- fères, par exemple de 8-hydroxy-quinoléine.
Cela peut avoir lieu soit directement après la fin de la fermentation dans la bouillie de culture, soit cependant dans un stade ultérieur du traitement, pour éli- miner également des ions de fer-(III) éventuellement en- traînés par les agents utilisés.
Les méthodes suivantes conviennent particulière- ment pour l'isolement des desferri-oxamines.
1) On peut utiliser des agents d'adsorption, par exemple des charbons actifs comme la norite, des terres acti- vées comme la franconite, la terre à foulon ou la floridine, ou des adsorbants résineux comme l'asmite. L'élut ion des adsorbats a lieu avantageusement avec des mélanges aqueux de solvants organiques miscibles à l'eau, par exemple avec de des mélanges d'eau et méthanol, d'eau et de pyridine, d'acide acétique dilué et de méthanol, ou d'eau, de méthanol, d'acide
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acétique glacial et de butanol. Un mélange de 4 parties en volume d'eau et d'une partie en volume de pyridine s'est avéré particulièrement approprié pour l'élution d'un adsor- bat de franconite et de norite.
2) On peut de plus soutirer les desferri- oxamines d'une solution aqueuse à l'aide de solvants orga- niques. Pour ce procédé d'extraction, des alcools organi- ques supérieurs, par exemple l'alcool benzylique ou l'alcool isopropylique , se sont avérés particulièrement appropriés Dans ce cas, on ajoute avantageusement à la phase aqueuse des eels inorganiques, par exemple du sulfate d'ammonium ou du chlorure de sodium* A partir des extraits organiques obtenus, les desferri-oxamines peuvent être obtenues sous forme enrichie soit par évaporation du solvant, soit par précipitation à l'aide d'un solvant organique convenable, par exemple l'éther, l'éther de pétrole ou l'acétate d'éthyle.
3) Une autre méthode d'enrichissement des desferri-oxamines consiste à les répartir entre une solution aqueuse et une solution de phénol dans le chloroforme, la teneur en phénol de la solution chloroformique pouvant variero
4) Une autre méthode pour l'enrichissement et/ou la séparation des desferri-oxamines est constituée par la chromatographie, par exemple une chromatographie
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d'adsorption sur différentes matières, par exemple sur de la norite, de l'oxyde d'aluminium, des silicates de magné- sium, du gel de silice, du sulfate de calcium, ainsi qu'une chromatographie de répartition avec de la cellulose, de l'amidon, du gel de silice,
de la célite et analogues comme substances de support, ou toutefois une ohromatographie sur des résines échangeuses d'ions, par exemple sur du Dowex-50. de l'Amberlite IRC-50 et analogues.
5) Une méthode utilisable pour l'enrichissement et/ou la séparation des desferri-oxamines consiste également dans une extraction à l'aide d'échangeurs de cations liqui- des qui sont dissous dans des solvants organiques non misci- bles à l'eauo Comme échangeurs d'ions, on peut utiliser des acides carboxyliques d'un poids moléculaire de 200 à 1000, par exemple l'acide di-linoléique, ou des orthophos- phates de dialcoyles d'un poids moléculaire de 200 à 600 en- viron, par exemple l'orthophosphate de bis-2-éthylhexyle, qui peuvent être mis en oeuvre sous la forme H+ ou sous la forme saline, de préférence la forme Ne.+, ou dans un mélange des deux.
Comme solvants, conviennent des alcools non- miscibles à l'eau qui comportent de 4 à 8 atomes de carbone, de préférence l'alcool amylique normal et le 2-éthyl-n- butanol. L'extraction a lieu dans un domaine de pH de 5,0 à 8,5, de préférence entre 7)5 et 8,0. A partir des ex- traits, les desferri-oxamines peuvent à nouveau être trans-
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férées dans la phase aqueuse à l'aide d'alcalis ou d'acides ou de tampons alcalins ou acides, dans les zones de pH su- périeures à 8,5 ou inférieures à 3,0, de préférence à un pH de 10,5 à 11,0 ou de 1,5 à 2,0 , en obtenant à nouveau par là un enrichissement et une purification.
6) De plus, les desferri-oxamines peuvent être enrichies par une répartition à contre-courant suivant Oraig entre deux phases solvantes non-miscibles. Le système solvant suivant s'est avéré particulièrement avantageux n-butanol :alcool benzylique : acide chlorhydrique millinormal :solution aqueuse de chlorure de sodium saturée à 19 (9:9:15:5).
L'invention concerne également, à titre de produits industriels nouveaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non-limitatifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centigrades
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3 G *#.- 1 -.jtA .1. .<14-t<-. ####jt# -# uw.vwav la J-tMOJM cw vaâsvw.v t) M)00, vit üul- tive une souche de Streptomyces pilosus NRRL 2857 dans une solution nutritive renfermant, par litre d'cau du robinet, 20 g de farine de soja et 20 g de mannite. L'eau du robinet renferme de 20 à 30 de fer par litreo La solution nutri- tive est stérilisée dans les ballons d'ensemencement ou dans les fermenteurs pendant 20 à 30 minutes sous une pression d'une atmosphère effective. Elle présente alors un pH de 7,2 à 7,6.
On ensemence alors avec jusqu'à 20 % d'une cul- ture végétative, partiellement sporulante, de la souche ci- dessus Tout en secouant bien ou en agitant, on incube à
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24-30 , en faisant passer dans les cultures, dans les fer-aen- teurs, environ deux volumes d'air par volume de solution et par minute. Après 96 heures d'incubation environ, la solu- tion de culture a atteint la teneur maximale en desferri- oxamines. On détermine cette teneur à l'aida d'un test à
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1 lantisydéraiayoine.
A 3400 litres d'une bouillie de culture active
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de Streptomyces pilosus 1ffiRL 28j?7, on ajoute 8%) g de 8--hydroxy-quinoléine en solution dans 16 litres de méthanol.
Au bout d'une heure, on sépare le mycélium par filtration, en ajoutant 2 % d'Hyflo-uperael en tant qu'auxiliaire de filtration. En vue d'éliminer la 8-h1drox)'-qu1noléine en excès, on percole le filtrat à travers une colonne, avec
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45 litres d'Amberlite IR-45 sous la forme OR-. Le pH du produit de percolation est ajusté à 7,5 par addition d'acide chlorhydrique. La solution de culture active ainsi obtenue est ensuite envoyée de bas en haut à travers une série de quatre colonnes échangeuses d'ions montées en série, d'un diamètre de 15 cm.
Chaque colonne renferme 25 litres d'Amberlite IRC-50 soue la forme H Le contenu de chaque colonne est, avant l'adsorption, amené à 25 % environ sous la forme sadique, par traitement avec 780 g d'hydroxyde de sodium dans de l'eau. La vitesse de l'ad- sorption est de 150 litres par heure. Le contrôla biolo- gique des traversées des diverses colonnes à l'aide du test à l'antisidéramycine montre que la colonne N 1 est complètement chargée, la colonne N 2 partiellement char- gée et que les colonnes N 3 et 4 ne sont pratiquement pas chargées. Pour l'élution, la colonne ? 1 est soustraite à l'opération et l'on ajoute après la colonne ? 4 une colonne remplie d'une résine fraîchement régénérée et traitée avec de l'hydroxyde de sodium.
Après la fin de l'adsorption, la colonne N 1 est rincée à fond avec de l'eau désionisée. La substance active adsorbée est éluée avec de l'acide chlorhydrique 0;2'-normal, en percolant l'agent d'élution de haut en bas à une vitesse de 15 litres par heure On réunit les 200 litres d'éluats actifs, ajuste à un pH de 5,0 avec une
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solution d'hydroxyde de sodium, sature de chlorure de sodiur et extrait dans un rapport de 20 :
1 de l'alcool benzy- lique dans un extracteur à contre-courante L'extrait obte- nu à l'alcool benzylique est clarifié par essorage après avoir été agité avec un kilogramme d'Hyflo. Dans le fil- trat limpide, on détermine le fer lié de manière complexe, ajoute un excès de 100 % environ de la 8-hydroxy-quinoléine nécessaire pour l'élimination, puis agite pendant deux heu- res. A la solution maintenant de teinte noir verdâtre, on ajoute deux parties en volume de méthylisobutylcétone et extrait avec de l'eau dans un rapport de 5:1 sur un ex- tracteur à contre-courant.
En vue d'éliminer la 8-hydroxy- quinoléine en excès, on soumet alors les extraits aqueux à une extraction au chloroformée Cette solution aqueuse de teinte orange-jaune,d'un volume de 30 litres, renferme environ 500 g de substances solides. Pour isoler le chlor- hydrate de desferri-oxamine B, on concentre de façon ménagée la solution aqueuse sous vide jusqu'à un volume de 1,5 li- tre, le produit désiré commençant déjà à cristalliser- La cristallisation est complétée en laissant reposer à + 4 , après quoi on sépare le produit par essorage et le lave en- suite avec un mélange froid constitué par une partie en vo- lume de méthanol et par une partie en volume d'eau.
Le point de fusion du produit brut est de 162-165 . Par recristallisation dans un mélange d'eau et
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de méthanol dans le rapport le.9 et dans un mélange d'eau et d'acétone (1:4), le point de fusion passe à 169-171 .
Effectuée de la marne manière, l'élution de la colonne N 2 fournit un éluat renfermant 220 g de substan- ces solides o La cristallisation du concentrât aqueux four- nit 112 g d'un point de fusion de 168,5-171 . La cristal- lisation de la liqueur-mère fournit encore 40 mg d'un point de fusion de 164-165.5 . La recristallisation des deux cristallisais dans un mélange d'eau et de méthanol et dans un mélange d'eau et d'acétone fournit à l'état pur le chlorhydrate de desferri-oxamine B fondant à 170,5-172 .
EXEMPLE 2
Après addition de 90 kg d'Hyflo-Supercel, on filtre à travers un filtre-presse 3000 litres d'une bouillie de culture obtenue comme décrit dans l'exemple 1 et pompe le filtrat à un pH de 6,1, à une vitesse de 150 litres par heure, de bas en haut, à travers quatre colonnes montées en série, d'un diamètre de 15 cm et d'une hauteur de 3,5 m, qui sont chargées chacune de 25 litres d'Amberlite IHC-50 sous la forme H.
Le traitement des adsorbats a lieu comme décrit dans l'exemple lo Le contrôle biologique des raffi- nats fournit le même résultat que dans l'exemple lo
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EXEMPLE 3
A une vitesse de 150 litres par heure, on fait passer de bas en haut, à travers deux séries de quatre co- lonnes échangeuses d'ions, 3200 litres d'une bouillie de culture qui a été débarrassée du mycélium comme décrit dans l'exemple 2, les colonnes de la première série présentant un diamètre de 10 en et une hauteur de 2,5 m, et celles de la seconde série un diamètre de 15 cm et une hauteur de 3,5 m.
Les colonnes de la première série sont chargées cha- cune de 3 litres d'Amberlite IRC-50 sous la forme H. et celles de la seconde série sont chargées chacune de 25 li- tres d'Amberlite IRC-50 sous la forme H. Le traitement des adsorba ts a lieu comme décrit ddans l'exemple 1. Le contrôle biologique des raffinais montre que les colonnes N 1 à 4 de la première série n'ont absorbé que peu d'acti- vité, tandis que les colonnes N 1 à 4 de la seconde série se sont comportées d'une manière analogue à celle décrite dans les exemples 1 et 2.
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H!'l1i!UPT .1i! ZL Sur 25 couches différentes d'aotlncmy côtes ohoi- sies de façon quelconque, deux souches seulement (à savoir les souches de Streptomyces ETH 21748 et ETH 21798) forment des ferri-oxamines qui sont décelables dans le test antago- niste, lorsqu'on utilise la solution nutritive suivante :
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<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 20 <SEP> g <SEP> Solution <SEP> saline <SEP> :
<SEP>
<tb>
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Itn nn it e 20 g (1fH4) 4 100 g
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<tb> Eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> 1000 <SEP> cm3 <SEP> KNO3 <SEP> 50 <SEP> g
<tb>
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Solution saline 110 cm3 ueo4- Il 7 0 25 g
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<tb> Citrate <SEP> ferrique <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb> ZnSO <SEP> . <SEP> 7 <SEP> H2O <SEP> 5
<tb>
<tb> MnC2 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb>
<tb> CoC12 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb>
<tb> CuSO <SEP> . <SEP> 5 <SEP> H2O <SEP> 0,25 <SEP> g
<tb>
<tb> H3BO3 <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb>
dans 5 litres d'eau
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Sur 73 souches différentes d'aotinamyoètes choisies de façon quelconque, toutes forment des ferri- oxamines lorsqu'on utilise la solution nutritive ci-dessus sans addition de sel ferrique.
Les souches examinées sont : 22.794. streptomyces glaucescens, 240457, Streptomyces albus,
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27=001, analogue au Streptomyces vïolageoniger, 27o002, analogue au Streptomyces fradiae.
27.005. Streptomyces sp., 27.007, Streptomyoes spo 27.009,Streptomyces galilaeua, 27.010, Streptomyces antibiatieus, 27.013, Nocardia bras-4.14 et 27.015, Nocardia spo,
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27o025 et 27o028, analogues au Streptomycea gal1la:f)US, 27.033.
Streptomyces viridochromogenes, 27.053, Streptomyces polychromogenes.
EMI16.2
270054, Streptomyces antibioticus, 270059, 8trepta,yces griseoflavusp 27?067t Streptoayees antibioticus, 27.068, Streptomyces olivaceus, 27o070, Streptomyces venezuelae, 27.074, Streptomyces olivaceus,
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27'6077, Streptomyces antibioticus, 2?au83., Streptomyces griseoflavus, 27oOE3) Streptomyces antibioticua, 2?e090 9 Streptomycea viridochromogenes, 27.093, Streptomyces grisous, 27o094, Nocardia brasiliensis, 27.106, Streptomyces olivaceus, 27.113.
Streptomyoes aureofaoiens, 27.116, Streptomyces olivaceus,
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27ol22, Nocardia bxasiliensi$9 27ol32, Streptomyces gr1seus, 27.140, Streptomyces antibioticus, 27cl50, Streptomyces olivaceus, 27.151, Streptomyces grisous, 27.152, Streptomyces lavendulae, 270164" Nocardia brasiliensis,
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2701?5, Streptomyces noursel, 27ol88, Streptomyoes eohiuatua, 27.216, streptO!D1ces hirsutus, 27o217, Streptomyces hlrsutua, 27.2209 Streptomycea gris eus ,
EMI17.2
27o232, Streptomyces sp.
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27o269< Streptomyoes epo, 27o273t B aptomcaa veeur3ae, 270299, analogue au Streptomyces fradiae, 27o303, Nooardia brasilienais, 27o507 Streptomyoea aureofpriens, 27.362, atreptomyaes fravieslmus,
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27o364, Streptomyces griseus,
EMI17.5
27-377, Streptomyoes rotiouli, 27o380, Streptomyces ep., 27-3829 Streptomyces grieeus, 2?fol390, Nooardia brasilisnsie, 27o413, Nocardia brasiliensis, 27o440, Nocardia astéroïdes, 2? a 4l.2 , 8 trept ormya e a aureofaciena, 27bzz Streptomyoes vir3dochromogsncje, 270465, Streptomyoea polyohromogenea, 2?04?2, lfooardla asteroides, 270479, Btreptomyoee antibiotioue, 2? 0 490 , 8 treptomrces ep
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27.499, Nocardia astéroïdes,
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27o509f Streptc#yces ech1Da:
tuB 2/o5iû, S zrept omo se à.ivaaeu8 , 27,5169 Nocardia astéroïdes, 27o525, 8*,reptosparangium roaeum, 27<>5<taô, Streptomyces griseus, 270549 Streptomroes aureofaciens, 2'7.556 Mioromonospore. fusca, 27o559, StreptoBqrces spo+, 27o590, Streptomyces gris eus + , 27.596, Streptomyoes galilaeus.
+Ces souches étalant négatives dans le premier essai,mais le contrôle ultérieur montre qu'elles sont
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toutes appropriées à la formation de sidéram)"aine
Les souches ont été déposées sous les numéros indiqués à l'Ecole Polytechnique Fédérale à Zurich.
EXEMPLE 5
On cultive en culture immergée, à 27 , la sou-
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che ETH 2?0413 Nocardia brasiliensis, dans la solution sui- vante :
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<tb> glucose <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb> asparagine <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
EMI18.5
MgSO4 - 7 H20 1,0 g
EMI18.6
<tb> CaC12 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> K2HPO4 <SEP> 1,0 <SEP> g <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> eau <SEP> distillée <SEP> 1000 <SEP> car,
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
et en plus quantités variables de sulfate ferrique.
Après 9 jours d'incubation à 27 , on détermine
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la quantité de ferri-oxamim E (resp. de desferri-oD';J1e) qui s'est formée (test antagoniste et détermination optique à 440 m ). On sépare la culture par filtration, ajoute un milligramme de FeC13 par centimètre-cube et extrait la même quantité d'un mélange de chloroforme et de phénol (une par- tie en volume a une partie en poids), puis mesure l'extinc- tion dans la phase organique filtrée.
EMI19.2
Teneur en terri-oaamine B au bout de 9 jours (ou de desf erri-oxawi ne E)
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<tb> sans <SEP> sulfate <SEP> ferrique <SEP> 280 <SEP> mg <SEP> par <SEP> litre
<tb>
<tb> 2,5 <SEP> . <SEP> 10-8 <SEP> moles <SEP> de <SEP> sulfate <SEP> ferrique <SEP> 520 <SEP> mg <SEP> par <SEP> litre
<tb>
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2,5 1.0-7 moles " " 1?J mg par litre 295 - 10 moles" " " moins de
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<tb> 5 <SEP> mg <SEP> par <SEP> litre
<tb>
EXEMPLE 6
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la souche de Streptomyoea piloous ETE 210748 (NRRL 2857) est cultivée de manière immergée pendant 10 jours dans la solution nutritive suivante : marmite 2 % farine de soja 2% eau du robinet et quantités variants de chlorure ferrique.
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L'eau du robinet renferme de 20 à 30 de fer par litre
La détermination de la formation de ferri- examine (il se forme principalement de la ferri-oxamine B) a lieu dans le test antagoniste.
Teneur en ferri-oxamine au bout de 10 jours (activité correspondant à mg de ferri-oxamine B par litre
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<tb> sans <SEP> chlorure <SEP> ferrique <SEP> 480 <SEP> mg
<tb>
<tb> 10 <SEP> mg <SEP> de <SEP> chlorure <SEP> ferrique <SEP> par <SEP> litre <SEP> 150 <SEP> mg
<tb>
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lOOmg" il nn 5 mg 1000 m;
moins de 1 mg/litre|
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<tb>
<tb>
EXEMPLE 7
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Après addition de 60 kg d'Eyflo-qSupercel et 1 ajustement du pH à une valeur de 4,5 avec 2 litres environ d'acide sulfurique, on filtre sur un filtre rotatif 3400 litres d'une bouillie de culture obtenue comme décrit dans l'exemple lo A l'aide d'un extracteur à contre-courant, on extrait les 3000 litres de filtrat limpide avec une solution
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à 5 % d'orthophosphate de bis-2-éthylhezyle (sous la forme sodique) dans du 2-éthyl-n-butanol (dans le rapport 4:1), en ajustant constamment le pH avec une solution 0,4-normale d'hydroxyde de sodium à une valeur de 7,6 à 7,8.
Après l'extraction, la phase aqueuse présente un pH de 8,0 et ne renferme plus que de l'ordre de 2 % de l'aotivité de départ, L'extrait formé (750 litres) est lavé dans le rapport de
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5:1 à contre-courant avec une solution à 0,75 % de chlorure de sodium et est ensuite agité avec de l'acide chlorhydri- que demi-normal, de sorte que la valeur de pH de l'extrait aqueux obtenu en retour est de 1,7 à 1,9. Le rapport d'extraction est de l'ordre de 3:1. L'ajustement de l'équi- libre exige de l'ordre de 15 à 30 minutes.
A partir des 250 litres de l'extrait aqueux obtenu en retour renfer- mant de 80 à 90 % de l'activité de départ, on peut obtenir quantitativement la desferri-oxamine B avec une grande pureté, par exemple par extraction avec de l'alcool benzy- lique, comme décrit dans l'exemple 1, ou par extraction avec un mélange de chloroforme et de phénol (1:1).
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"New growth substances and their preparation process"
By ferri-oxamines is meant iron-containing growth substances which have been isolated from plant organisms, in particular from micro-organisms (cf. Bickel et al., "Experientia" 16, 129 [1960]; Bickel et al., "Helv. Chim. Act." 18, 2129 [1960]. Iron can be withdrawn from these substances,
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in which case we get 1rs desferri-whereDlp08 "oorr..poD1antB, A am'Wft'M 7ase << a yT * # fnr T t <t J5 nnnnna6 ant A ..." .. 'ft are A! W'! ! 1? 'Y. Akmwat t! '9t "orm8 in ferri # oxRaines by addition of iron ions.
On the basis of their iron-binding ability, the desferri-compounds can be used in medicine, for example in the case of a pathogenic deposit in the organism of iron-ringing pigments, such as they are
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present in hemochrcmatosis and hmosideroeeo It has now surprisingly been found that Isa desferri-ooEamines are formed by plant organisms and can therefore be directly isolated from them. In addition, it turned out that
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the formation of ferri-oxamines and / or dsterri-ozsaines depends to a high degree on the iron content of the nutrient medium in which plant organisms are cultivated.
A very large number of microorganisms which do not form ferri-
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oxamineig and / or desferri-oxamines, or only form in sufficiently large quantities when cultivated with a lack of iron, that is to say in nutrient solutions containing less iron that one normally does not use during the culture of micro-organisms o Even in the almost complete absence of irons, a quantity is formed.
EMI2.5
notable tity of de.sterr1-oXli1l \ ine o Furthermore, from a certain iron content,
we do not mainly produce
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more ferri-oxamines or desferri-oxamine. The maximum formation of ferri-oxamine and desferri-oxamine occurs at a very minimal iron content of the nutrient medium. If it is therefore a question, with a given microorganism, of obtaining as high a yield as possible of desferri-oxamine, said microorganism is then advantageously cultivated on media poor in iron.
Table 1 shows the dependence between the amount of ferri-oxamine and / or desferri-oxamine and the iron content of the nutrient medium in the case of the strain Hocardia brasilia ETH 27413 forming desferri-oxamine E and respec - tively ferri-oxamine E.
Table 1
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<tb> Content <SEP> in <SEP> iron <SEP> of the <SEP> medium <SEP> Quantity <SEP> of <SEP> ferri-oxamine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> nutrient <SEP> in <SEP> moles <SEP> of <SEP> and / or <SEP> of <SEP> desferri-oxamine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sulphate <SEP> ferric <SEP> by <SEP> liter <SEP> by <SEP> liter <SEP> after <SEP> culture
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> for <SEP> 9 <SEP> days
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> non-measurable <SEP> traces <SEP> 280 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2.5 <SEP> 10-8 <SEP> 520 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2.5.
<SEP> 10-7 <SEP> 170 <SEP> mg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2.5 <SEP> 10-6 <SEP> lower <SEP> to <SEP> 5 <SEP> mg
<tb>
The new process for obtaining deferrioxamines is characterized by the fact that the opening is carried out in a nutrient solution with a lack of iron,
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until a significant amount of desferri-oxamine has been formed, the ferri-oxamine possibly present is converted into desferri-oxamine by adding substances capable of binding iron and the desferri is isolated -oxamine from the nutrient solution.,
Microorganisms suitable for obtaining ferri-oxamines are used as starting substances.
The nutrient solution contains the usual sources of carbon and nitrogen, for example dugLucose,
sucrose, lactose, starch, alcohols such as mannitol and glycerol, amino acids, eg ornitheine, peptides, proteins and their degradation products such as peptone or tryptone, dea ex = dashes of meat, water-soluble fractions of cereal seeds such as corn or wheat, distillation residues from the preparation of alcohol, yeasts, seeds in particular of rapeseed and soya beans, cottonseeds, ammonium salts, nitrates As inorganic salts, the nutrient solution contains, for example, chlorides, carbonates, sulphates, nitrates of aloaline and alkaline earth metals, magnesium, zinc or manganese, The iron salt content should not, in general,
exceed 10-7 moles per liter, but the optimum content must be determined for each organism. When using tap water to prepare the. solu-
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nutrient content, we must take into account its will
The culture takes place aerobically, that is to say for example in surface culture at rest or, preferably, in an immersed manner with shaking or agitation with air or oxygen in the flasks. stirred or in known fermenters.
As the temperature, a temperature between 18 and 40 ° C. is suitable, preferably a temperature of 27 Co In this case, the nutrient solution generally exhibits after 4 to 10 days a notable effect similar to that of desferri-oxamine Measured in as ferri-oxaminic activity after conversion of desferri-oxamines to ferri-oxamines using an iron (III) salt 7.
The ferri-oxaminic activity can be determined miorobiologically using the modified Bonifas test (cfo Zähner et al., "Arch Mikrobiolo" 36. page 325 et seq. [1960]. As test solution, a solution is used. - tion of ferrimycin with a content of 0.01 mg per cubic centimeter, in the form of a test strain of Staphylecoscue aureuso
The ferrioxamine concentration in the culture solution can also be determined optically.
For this purpose!) Shake for 5 minutes 5 because of culture liquid with 1.5 g of sodium chloride, one cubic centimeter of a 0.1% solution of ferric sulphate and 5 because
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of benzyl alcohol, separates by centrifugation, filters the organic phase and determines the extinction of the organic phase at 410 m. As a comparison sample, an extract prepared in the same way from an unseeded nutrient solution is used.
For the isolation of desferri-oxamines, known methods can be used. The ferri-oxamine present in the culture medium is converted into desferri-oxamine by the addition of substances which form ferriferous complexes, for example 8-hydroxy-quinoline.
This can take place either directly after the end of the fermentation in the culture slurry or, however, at a later stage of the processing, in order also to remove any fer- (III) ions which may be entrained by the agents used.
The following methods are particularly suitable for the isolation of desferri-oxamines.
1) Adsorption agents, for example activated carbons such as norite, activated earths such as franconite, fuller's earth or floridin, or resinous adsorbents such as asmite, can be used. Elution of the adsorbates advantageously takes place with aqueous mixtures of organic solvents miscible with water, for example with mixtures of water and methanol, water and pyridine, dilute acetic acid and methanol, or water, methanol, acid
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glacial acetic and butanol. A mixture of 4 parts by volume of water and 1 part by volume of pyridine has been found to be particularly suitable for the elution of an adsorbent of franconite and norite.
2) In addition, the desferrioxamines can be withdrawn from an aqueous solution using organic solvents. For this extraction process higher organic alcohols, for example benzyl alcohol or isopropyl alcohol, have been found to be particularly suitable. In this case, inorganic salts, for example sulphate, are advantageously added to the aqueous phase. ammonium or sodium chloride * From the organic extracts obtained, the desferri-oxamines can be obtained in enriched form either by evaporation of the solvent or by precipitation using a suitable organic solvent, for example ether, petroleum ether or ethyl acetate.
3) Another method of enriching desferri-oxamines consists in dividing them between an aqueous solution and a solution of phenol in chloroform, the phenol content of the chloroform solution being able to vary.
4) Another method for the enrichment and / or separation of desferri-oxamines is constituted by chromatography, for example chromatography
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adsorption on different materials, for example on norite, aluminum oxide, magnesium silicates, silica gel, calcium sulphate, as well as distribution chromatography with cellulose , starch, silica gel,
celite and the like as carrier substances, or alternatively ohromatography on ion exchange resins, for example on Dowex-50. Amberlite IRC-50 and the like.
5) A method which can be used for the enrichment and / or separation of desferri-oxamines also consists in extraction using liquid cation exchangers which are dissolved in organic solvents which are immiscible with water. As ion exchangers, carboxylic acids with a molecular weight of 200 to 1000, for example di-linoleic acid, or dialkyl orthophosphates with a molecular weight of about 200 to 600 can be used. , for example bis-2-ethylhexyl orthophosphate, which can be used in the H + form or in the salt form, preferably the Ne. + form, or in a mixture of the two.
Suitable solvents are water-immiscible alcohols which have 4 to 8 carbon atoms, preferably normal amyl alcohol and 2-ethyl-n-butanol. The extraction takes place in a pH range of 5.0 to 8.5, preferably between 7) 5 and 8.0. From the extracts, the desferri-oxamines can again be trans-
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fired in the aqueous phase using alkalis or acids or alkaline or acidic buffers, in the pH zones above 8.5 or below 3.0, preferably at a pH of 10, 5 to 11.0 or 1.5 to 2.0, thereby again obtaining enrichment and purification.
6) In addition, the desferri-oxamines can be enriched by a countercurrent distribution along Oraig between two immiscible solvent phases. The following solvent system has been found to be particularly advantageous n-butanol: benzyl alcohol: millinormal hydrochloric acid: 19 (9: 9: 15: 5) saturated aqueous sodium chloride solution.
The invention also relates, as new industrial products, to the compounds obtained by carrying out the process defined above.
The invention is described in more detail in the non-limiting examples which follow, in which the temperatures are indicated in degrees centigrade.
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3 G * # .- 1 -.jtA .1. . <14-t <-. #### jt # - # uw.vwav J-tMOJM cw vaâsvw.vt) M) 00, lives üultive a strain of Streptomyces pilosus NRRL 2857 in a nutrient solution containing, per liter of tap water, 20 g of soy flour and 20 g of mannite. Tap water contains 20 to 30 iron per liter. The nutrient solution is sterilized in seed flasks or fermenters for 20 to 30 minutes under pressure of an effective atmosphere. It then has a pH of 7.2 to 7.6.
It is then inoculated with up to 20% of a vegetative, partially sporulating culture of the above strain. While shaking well or stirring, incubate at
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24-30, passing through the cultures, through the iron, about two volumes of air per volume of solution per minute. After about 96 hours of incubation, the culture solution has reached the maximum content of desferrioxamines. This content is determined with the aid of a
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1 lantisydéraiayoine.
At 3400 liters of an active culture porridge
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of Streptomyces pilosus 1ffiRL 28j? 7, 8%) g of 8 - hydroxyquinoline dissolved in 16 liters of methanol are added.
After one hour, the mycelium is separated by filtration, adding 2% Hyflo-uperael as filter aid. In order to remove the excess 8-hydroxy-quinoline, the filtrate is percolated through a column with
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45 liters of Amberlite IR-45 in the OR- form. The pH of the percolation product is adjusted to 7.5 by adding hydrochloric acid. The active culture solution thus obtained is then sent from bottom to top through a series of four ion exchange columns mounted in series, with a diameter of 15 cm.
Each column contains 25 liters of Amberlite IRC-50 in the form H The content of each column is, before adsorption, brought to about 25% in the sadistic form, by treatment with 780 g of sodium hydroxide in sodium hydroxide. 'water. The rate of adsorption is 150 liters per hour. The biological control of the crossings of the various columns using the antisideramycin test shows that the N 1 column is completely loaded, the N 2 column partially loaded and that the N 3 and 4 columns are practically not loaded. For elution, the column? 1 is subtracted from the operation and we add after the column? 4 a column filled with a freshly regenerated resin and treated with sodium hydroxide.
After the end of the adsorption, the N 1 column is rinsed thoroughly with deionized water. The adsorbed active substance is eluted with 0; 2'-normal hydrochloric acid, percolating the eluting agent from top to bottom at a rate of 15 liters per hour. The 200 liters of active eluate are combined, adjusted at pH 5.0 with
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sodium hydroxide solution, saturated with sodiur chloride and extracted in a ratio of 20:
1 of benzyl alcohol in a counter-current extractor The extract obtained from the benzyl alcohol is clarified by draining after having been stirred with one kilogram of Hyflo. In the clear filtrate, the complex bound iron is determined, about 100% excess of the 8-hydroxyquinoline required for removal is added, then stirred for two hours. To the now greenish-black tinted solution, two parts by volume of methyl isobutyl ketone was added and extracted with water in a 5: 1 ratio on a countercurrent extractor.
In order to remove the excess 8-hydroxyquinoline, the aqueous extracts are then subjected to extraction with chloroform. This aqueous solution of orange-yellow tint, with a volume of 30 liters, contains approximately 500 g of solid substances. To isolate the desferri-oxamine B hydrochloride, the aqueous solution is carefully concentrated in vacuo to a volume of 1.5 liters, the desired product already starting to crystallize. Crystallization is completed by allowing to stand. at + 4, after which the product is separated by suction and then washed with a cold mixture consisting of one part by volume of methanol and one part by volume of water.
The melting point of the crude product is 162-165. By recrystallization from a mixture of water and
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of methanol in the ratio le.9 and in a mixture of water and acetone (1: 4), the melting point increases to 169-171.
Carried out in the marl manner, elution from column N 2 gives an eluate containing 220 g of solids. Crystallization of the aqueous concentrate gives 112 g of a melting point of 168.5-171. Crystallization of the mother liquor provided a further 40 mg of melting point 164-165.5. Recrystallization of the two crystallized from a mixture of water and methanol and from a mixture of water and acetone provides in the pure state the hydrochloride of desferri-oxamine B, melting at 170.5-172.
EXAMPLE 2
After addition of 90 kg of Hyflo-Supercel, 3000 liters of a culture slurry obtained as described in Example 1 are filtered through a filter press and the filtrate is pumped to a pH of 6.1, at a speed 150 liters per hour, from bottom to top, through four columns mounted in series, with a diameter of 15 cm and a height of 3.5 m, which are each loaded with 25 liters of Amberlite IHC-50 in the form H.
The treatment of the adsorbates takes place as described in example lo. Biological control of the raffinates gives the same result as in example lo
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EXAMPLE 3
At a rate of 150 liters per hour, 3200 liters of a culture slurry which has been freed of mycelium is passed from the bottom upwards through two sets of four ion exchange columns. example 2, the columns of the first series having a diameter of 10 in and a height of 2.5 m, and those of the second series having a diameter of 15 cm and a height of 3.5 m.
The columns of the first series are each loaded with 3 liters of Amberlite IRC-50 in the H form and those of the second series are each loaded with 25 liters of Amberlite IRC-50 in the H form. The treatment of the adsorbs takes place as described in example 1. The biological control of the raffinates shows that the columns N 1 to 4 of the first series have absorbed only little activity, while the columns N 1 to 4 of the second series behaved in a manner similar to that described in Examples 1 and 2.
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H! 'L1i! UPT .1i! ZL Out of 25 different layers of unaffected ribs, only two strains (i.e. Streptomyces strains ETH 21748 and ETH 21798) form ferri-oxamines which are detectable in the antagonist test when uses the following nutrient solution:
<Desc / Clms Page number 15>
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<tb> Soy <SEP> <SEP> flour <SEP> 20 <SEP> g <SEP> Saline <SEP> solution <SEP>:
<SEP>
<tb>
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Itn nn it e 20 g (1fH4) 4 100 g
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<tb> Water <SEP> from <SEP> tap <SEP> 1000 <SEP> cm3 <SEP> KNO3 <SEP> 50 <SEP> g
<tb>
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Saline solution 110 cm3 ueo4- Il 7 0 25 g
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<tb> Citrate <SEP> ferric <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
<tb> ZnSO <SEP>. <SEP> 7 <SEP> H2O <SEP> 5
<tb>
<tb> MnC2 <SEP> 0.5 <SEP> g
<tb>
<tb> CoC12 <SEP> 0.5 <SEP> g
<tb>
<tb> CuSO <SEP>. <SEP> 5 <SEP> H2O <SEP> 0.25 <SEP> g
<tb>
<tb> H3BO3 <SEP> 0.01 <SEP> g
<tb>
in 5 liters of water
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Out of 73 different strains of aotinamyoetes chosen in any way, all formed ferrioxamines when the above nutrient solution was used without the addition of ferric salt.
The strains examined are: 22,794. streptomyces glaucescens, 240457, Streptomyces albus,
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27 = 001, similar to Streptomyces violageoniger, 27o002, similar to Streptomyces fradiae.
27.005. Streptomyces sp., 27.007, Streptomyoes spo 27.009, Streptomyces galilaeua, 27.010, Streptomyces antibiatieus, 27.013, Nocardia bras-4.14 and 27.015, Nocardia spo,
<Desc / Clms Page number 16>
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27o025 and 27o028, analogs to Streptomycea gal1la: f) US, 27,033.
Streptomyces viridochromogenes, 27,053, Streptomyces polychromogenes.
EMI16.2
270054, Streptomyces antibioticus, 270059, 8trepta, yces griseoflavusp 27? 067t Streptoayees antibioticus, 27.068, Streptomyces olivaceus, 27o070, Streptomyces venezuelae, 27.074, Streptomyces olivaceus,
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27'6077, Streptomyces antibioticus, 2? Au83., Streptomyces griseoflavus, 27oOE3) Streptomyces antibioticua, 2? E090 9 Streptomycea viridochromogenes, 27,093, Streptomyces grisous, 27o094, Nocardia brasiliensis, 27,106, Streptomyces olivaceusis, 27,106, Streptomyces olivaceusis, 27,106
Streptomyoes aureofaoiens, 27.116, Streptomyces olivaceus,
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27ol22, Nocardia bxasiliensi $ 9 27ol32, Streptomyces gr1seus, 27.140, Streptomyces antibioticus, 27cl50, Streptomyces olivaceus, 27.151, Streptomyces grisous, 27.152, Streptomyces lavendulae, 270164 "Nocardia brasiliensis,
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2701? 5, Streptomyces noursel, 27ol88, Streptomyoes eohiuatua, 27.216, streptO! D1ces hirsutus, 27o217, Streptomyces hlrsutua, 27.2209 Streptomycea gris eus,
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27o232, Streptomyces sp.
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27o269 <Streptomyoes epo, 27o273t B aptomcaa veeur3ae, 270299, similar to Streptomyces fradiae, 27o303, Nooardia brasilienais, 27o507 Streptomyoea aureofpriens, 27.362, atreptomyaes fravieslmus,
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27o364, Streptomyces griseus,
EMI17.5
27-377, Streptomyoes rotiouli, 27o380, Streptomyces ep., 27-3829 Streptomyces grieeus, 2? Fol390, Nooardia brasilisnsie, 27o413, Nocardia brasiliensis, 27o440, Nocardia asteroids, 2? a 4l.2, 8 trept ormya e aureofaciena, 27bzz Streptomyoes vir3dochromogsncje, 270465, Streptomyoea polyohromogenea, 2? 04? 2, lfooardla asteroides, 270479, Btreptomyoee antibiotioue, 2? 0 490.8 ep treptomrces
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27.499, Nocardia asteroids,
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27o509f Streptc # yces ech1Da:
tuB 2 / o5iû, S zrept omo se à.ivaaeu8, 27.5169 Nocardia asteroids, 27o525, 8 *, reptosparangium roaeum, 27 <> 5 <taô, Streptomyces griseus, 270549 Streptomroes aureofaciens, 2'7.556 Mioromonospore. fusca, 27o559, StreptoBqrces spo +, 27o590, Streptomyces gris eus +, 27.596, Streptomyoes galilaeus.
+ These strains showing negative in the first test, but the subsequent control shows that they are
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all suitable for the formation of sideram) "groin
The strains were deposited under the numbers indicated at the Federal Polytechnic School in Zurich.
EXAMPLE 5
We cultivate in submerged culture, at 27, the
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che ETH 2? 0413 Nocardia brasiliensis, in the following solution:
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<tb> glucose <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb> asparagine <SEP> 5 <SEP> g
<tb>
EMI18.5
MgSO4 - 7 H2O 1.0 g
EMI18.6
<tb> CaC12 <SEP> 0.5 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> K2HPO4 <SEP> 1.0 <SEP> g <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> distilled water <SEP> 1000 <SEP> because,
<tb>
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and in addition varying amounts of ferric sulfate.
After 9 days of incubation at 27, we determine
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the quantity of ferri-oxamim E (resp. of desferri-oD '; J1e) which has formed (antagonist test and optical determination at 440 m). The culture is separated by filtration, one milligram of FeCl3 per cubic centimeter is added and the same amount is extracted from a mixture of chloroform and phenol (one part by volume has one part by weight), then the extinction is measured. tion in the filtered organic phase.
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Terri-oaamine B content after 9 days (or desf erri-oxawi ne E)
EMI19.3
<tb> without <SEP> sulfate <SEP> ferric <SEP> 280 <SEP> mg <SEP> per <SEP> liter
<tb>
<tb> 2.5 <SEP>. <SEP> 10-8 <SEP> moles <SEP> of <SEP> sulphate <SEP> ferric <SEP> 520 <SEP> mg <SEP> per <SEP> liter
<tb>
EMI19.4
2.5 1.0-7 moles "" 1? J mg per liter 295 - 10 moles "" "less than
EMI19.5
<tb> 5 <SEP> mg <SEP> per <SEP> liter
<tb>
EXAMPLE 6
EMI19.6
the strain of Streptomyoea piloous ETE 210748 (NRRL 2857) is cultured immersed for 10 days in the following nutrient solution: pot 2% soybean flour 2% tap water and varying amounts of ferric chloride.
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Tap water contains 20 to 30 iron per liter
The determination of the formation of ferri-examine (mainly ferri-oxamine B is formed) takes place in the antagonist test.
Ferri-oxamine content after 10 days (activity corresponding to mg of ferri-oxamine B per liter
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<tb> without <SEP> ferric <SEP> chloride <SEP> 480 <SEP> mg
<tb>
<tb> 10 <SEP> mg <SEP> of <SEP> ferric chloride <SEP> <SEP> per <SEP> liter <SEP> 150 <SEP> mg
<tb>
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100mg - 11n 5mg 1000m;
less than 1 mg / liter |
EMI20.3
<tb>
<tb>
EXAMPLE 7
EMI20.4
After addition of 60 kg of Eyflo-qSupercel and 1 adjustment of the pH to a value of 4.5 with approximately 2 liters of sulfuric acid, 3400 liters of a culture slurry obtained as described in 1 are filtered through a rotary filter. example lo Using a counter-current extractor, the 3000 liters of clear filtrate are extracted with a solution
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at 5% bis-2-ethylhezyl orthophosphate (in sodium form) in 2-ethyl-n-butanol (in the ratio 4: 1), constantly adjusting the pH with a 0.4-normal solution d sodium hydroxide has a value of 7.6 to 7.8.
After the extraction, the aqueous phase has a pH of 8.0 and only contains around 2% of the starting activity. The extract formed (750 liters) is washed in the ratio of
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5: 1 countercurrently with 0.75% sodium chloride solution and then stirred with semi-normal hydrochloric acid, so that the pH value of the resulting aqueous extract in return is 1.7 to 1.9. The extraction ratio is of the order of 3: 1. Adjusting the balance requires about 15 to 30 minutes.
From the 250 liters of the aqueous extract obtained in return, containing 80 to 90% of the starting activity, desferri-oxamine B can be obtained quantitatively in high purity, for example by extraction with benzyl alcohol, as described in Example 1, or by extraction with a mixture of chloroform and phenol (1: 1).