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ELYMOCLAVINE ET FABRICATION D'ALCALOÏDES D'ERGOT PAR LA CULTURE.
La présente invention a trait à l'élymoclavine, un nouvel alca-
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loide' dwergotm et à une méthode qui consiste à cultiver le champignon ergot ayant une nature propre à produire une quantité extraordinairement grande d-9ergolmypti- nine en culture ¯et à séparer 1?érgokri#tmine, l9argoclavine et l'élymoclavine. de la culture.
En 1943, A. Stoll et Ao Hofmann ont expliqué que l'ergotoxine
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présentée par G. Barger et F oH. Carr (J'. Chem. o Soc Vol, a 91, p. 377 (1907)) et par'F-. Kraft''(Archo Pharm. Vol. 244. p 336 (1906)), eto. 0, n'était autre chose qu'un mélange de trois alcaloïdes, l9ergoeristine, 19ergokryptîne et lyergocornine, et que l'ergotinine présentée par C, Tanret (C.R. Acad. Scia Vol. 81. po 891 (1875)) était aussi un mélange consistant en ergocristinine;, ergokryptinine et ergocorninine qui sont des isomères des trois alcaloïdes ci-dessus.
Il s'ensuit qu'à présent, dix alcaloïdes d'ergot, dit du type pep-
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t3.de9 sont cânnuse à savoir les suivants: ergotamine, ergosine, ergocristine, er- gokryptinea ergoeôrnines ergotamininea ergôsinine,, ergocristinine, ergokryptinine et ergocorininee les cinq derniers alcaloïdes étant respectivement les isomères des cinq premiers. '
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Bien que tous ces 4alcaloidés soient largement employés. tels'quels ou sous la forme de leurs dérivés, dans des buts cliniques, leur production est très faible dans tous les pays par suite du fait qué l'agriculture de l'ergot de-
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mande de grands champs et une maind,9oeuvre nombreuses mais aussi du fait que cette agriculture est très sujette aux conditions climatériques.
Il s'ensuit que si la culture artificielle du champignon ergot était possible et si la prépara- tion d'alcaloïdes'd'ergot du type peptide à partir de la culture pouvait se fai- re, non seulement la culture pourrait être substituée à l'ergota mais aussi la production massive des. alcaloïdes serait en vue. sans parler de la conduite scientifique facile de' la production qui en résulterait.
Dans ce buts. bien des chercheurs ont étudié jusqu'ici la culture
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artificielle du champignon ergot et cela sans résultat. En fait, seule l'agrocla-
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vine, qui est un alcaloïde d'ergot, du type non-peptidé,. découvert par l'un des présents inventeurs (Annual Reports of Takeda Research Laboratory, Vol. 10, pp.
145, 162, 171 (1951). peut être préparée en grandes quantités par la culture ar- tificielle.
Comme le montrent la série de rapports de A. Mc Cre-a (Amer. Jour.
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Bot. Vol. 18, p. 50 (1931), H. Kreitmàir et W. Küssner(Biochem. Zeitschrift, Vol.
239. Po189 (1931)). R. Jaretsky(Archiv. d. Pharmazie, Vol. 273. p. 348 (19, ) ) , E. Baldacei (Farmaco. Sei. c. Toc. Lo. Vol. l,p. 187 (1941 . S.K. Sim et H.W.
Youngken. Fr. (Jour. Amer. Pharmac. Ass. Sci. Ed. Vol. 40, p.344 (1951)), etc..., aucun des alcaloïdes d'ergot du type peptide n'a été produit jusqu'ici en gran- des quantités par la culture.
Les présents demandeurs, qui ont étudié pendant bien des années
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la culture artificielle du champignon ergot ont découvert qu'en général, lélymsclavine,qsr.znnouvel alcaloïde d'ergot, existe dans l'ergot et dans la culture du champignon ergot et que certaines espèces de champignons ergots produisent dans la culture des quantités relativement grandes d'élymoclavine et d'agrocla-
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vine et, en même temps, des quantités extraordinairement grandes d'ergokrypt1nine.
En outre, ils ont découvert que la culture du champignon ergot susnommé contient peu d'espèces d'alcaloïdes et point d'impuretés qui soient difficiles à séparer d'où il suit que la concentration de l'élymoclavine et de l'ergokryptinine est extrêmement aisée.
Selon le procédé de la présente invention, le rendement en er- gokryptinine est anormalement excellent, par exemple, le rendement pour 100 g. de la substance desséchée obtenue en séchant la matière de culture produite par la méthode de culture liquide est d'environ 1 à 2 g. Les champignons parasites sur elymus mollis Trin. et les plantes apparentées et ses variantes produites artificiellement appartiennent à l'espèce susdite de champignons ergots.
Dans certaines conditions, le pouvoir de ces champignons à être des parasites sur l'hôte original dégénère et, parallèlement à cela, son pouvoir de produire les alcaloïdes d'ergot, spécialement l'ergokryptinine, dé- génère également. D'autre part, certaines parmi les variantes gardent tout de même le pouvoir de produire l'ergokryptinine en grandes quantités bien qu'elle n'aient plus le pouvoir d'être parasites sur l'hôte original.
Accessoirement, disons que la distinction morphologique de ces champignons par:rapport aux autres est difficile.
La culture du champignon ergot préconisée par le procédé selon la présente invention contient, en plus de l'ergokryptinine, l'argoclavine, 1'
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élymoclavine, l'ergokryptine, l'ergosinine,ltergométrine et des traces ou point d'autres alcaloïdes. Dans le cas d'une culture solide, le rapport des rendements en ergokryptànbw agroclavine et élymoclavine est généralement d'environ 100:35: 10 et le rapport est presque le même, grosso modo,dans la culture liquide.
Tou- tefois, dans ce dernier cas, si les rendements en alcaloïdes de la matière cel- lulaire et de la partie liquide ' sont mesurés séparément, le rapport des rende- ments en alcaloïdes de chaque partie varie avec les conditions de la culture et, spécialement, avec la quantité et l'espèce de source d'azote, et avec la durée de la culture. L'ergokryptine, l'ergosinine, l'ergométrine, etc... sont généra- lement produites en quantités très petites dans les deux cultures.
En ce qui concerne la méthode de culture, les deux cultures, :La liquide et la solide, peuvent être employées, mais la dernière est supérieure, en ce qui concerne le rendement en ergokryptinine, à la première pour la mise en oeuvre de laquelle on fait généralement usage de la bagasse ou d'autres aube- tances poreuses imbibées de liquide nutritif. La culture liquide est aussi ex-
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. .eellente en ce qu'elle peut être mise en oeuvre à grande échelle.
Dans le cas de la culture liquide, il est à conseiller d'obtenir le liquide de culture contenant l'ergokryptin1ne successivement par la méthode dite de culture par remplacement (Pilzdecke).
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La source nourricière du milieu est.choisie diaprés les condi- tions de la culture et l'état physiologique du champignon. Par exemple l'espè- ce du nourricier est limitée en nombre dans certains cas et, dans'd'autres cas, un grand choix est possible.
Dans le cas de la culture par remplacement,, des substances diffi-, cilement assimilables.. par exemple le mannitols conviennent en tant que source de carbone et des substances facilement assimilables. telles que l'acide asparti- que, l'acide glutamique,, l'aspargine, la glutamine ou les sels ammoniques de 1' acide aspartique, de l'acide glutamique. de l'acide succinique. de l'acide fuma- rique. de l'acide maléique., de l'acide malique et de l'acide tartique convien- nent en tant que source d'azote dans le premier milieu de culture. Toutefois, dans le second milieu de culture et dans les milieux de culture suivants, la constitution du nourricier ne doit pas nécessairement être la même que dans le premier milieu et l'espèce de nourricier peut être grandement variée.
Dans le procède selon la présente invention, un milieu de cul- ture de pH 3,2 à 8,4 convient pour la propagation du champignon ergot, l'inter- valle pH 6,6 à 6,8 convenant le mieux. A un pH supérieur ou inférieur à l'inter- valle 3.2 à 8,4, la propagation est difficile. La température de culture conve- nant pour la propagation du champignon est comprise entre 10 et 34 C, une tem- pérature voisine de 28 C convenant le mieux. Les conditions convenant à la pro- pagation du champignon ne coïncident toutefois pas avec celles qui conviennent à la formation des alcaloïdes d'ergot. Lorsqu'on réprime quelque peu la propa- gation du champignon,, on favorise le rendement en alcaloïdes. Cette répression se fait de préférence par les traitements suivants.
A) On augmente anormalement la quantité d'une ou de plusieurs sources de car- bone et d'azote et la quantité de sels inorganiques dans le milieu ou bien l'on ajoute au milieu d'autres substances réprimant la propagation du champignon, 1' addition se faisant avant l'inoculation du champignon ou pendant l'incubation.
B) La température de culture est maintenue à une valeur un peu plus basse que celle qui est la plus favorable pour la propagation du champignon.
C) On fait usage d'un milieu de pH un peu supérieur ou un peu inférieur à celui qui convient le mieux à la propagation du champignon. '.' : D) La quantité d'inoculation du champignon, la profondeur du milieu. la varia- tion de la constitution du nourricière le réglage de l'air ou 1'irradiation par la lumière visible et invisible etc... ont le même effet. Les méthodes ci-des- sus peuvent être employées séparément ou en combinaison.
Quant aux substances réprimant la propagation du champignon, elles sont si nombreuses que leur énumération est presque impossible et n'a pas de sens. Pour en nommer quelques unes, on peut citer les sels de métaux lourds tels que le manganèse., le cuivre et le zinc, les sels de l'acide fluorhydrique. de l'acide chlorhydrique, de l'acide cyanhydrique et de l'acide arsénique. les acides aromatiques et gras substitués, ou non, tels que l'acide formique, l'aci- de monochaloacétique. l'acide benzoïque, l'acide aminobenzoïque, l'acide phényl- acétique l'acide naphtylacétique, les substances ayant un groupe hydroxyle al- cool ou phénol. les composés aromatiques basiques tels que l'aniline, la diphé- nylamine, l'indole, la quinoline et leurs dérivés.
les hydrocarbures aromati- ques et les antibiotiques synthétiques ou obtenus à partir de microbes et d'au- tres sources. Ces substances sont généralement efficaces en petites quantités, par exemple des quantités moindres que 0,01% de l'une quelconque d'entre elles présentes dans le milieu constituent un moyen suffisant dans ce but. Les aube-. tances telles que le chlorure de sodium, qui réprime légèrement la propagation du champignon,, sont évidemment employées en quantités assez grandes.
Contrairement à l'ergot qui a été employé jusqu'ici pour la préparation des alcaloïdes d'ergot du type peptide, la culture obtenue par le procédé de la présente invention contient une quantité extraordinairement élevée d'ergokryptinine comme il est dit ci-dessus. Toutefois.9 la culture ne contient
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pas d'ergacristinine ni d'ergocorninine dont la présence aurait rendu difficile la séparation de l'ergokryptinine, si bien que la séparation de chaque alcaloi- de est extrêmement aisée.
L'ensemble des alcaloïdes résultants sont séparés des impuretés selon la méthode ordinaire et les alcaloïdes individuels sont isolés de l'en- semble des alcaloïdes.
La solubilité dans l'eau de l'ergokryptinine, de l'agroclavine et de l'élymoclavine augmente de la première à la dernière et leurs coefficients de répartition entre les solvants aqueux et organiques sont évidemment nettement différents. Il s'ensuit qu'elles sont séparées entre elles ou des impuretés en tirant parti de leur différence de solubilité dans l'eau et un solvant organi- que. ou en utilisant leur comportement à leur séparation de leurs solutions.
La différence de leurs coefficients de répartition entre deux solvants non mis- cibles entre eux est aussi utilisée dans ce but. En outre, la dialyse, la dia- lyse électrique, l'électrophorèse. l'adsorption par la résine à échange de ca- tions, etc... sont employées dans le même but, mais sans grand profit.
Pour séparer les alcaloïdes de la matière solide, tels que la culture obtenue par la culture solide ou de la matière cellulaire obtenue par la culture liquide, ces matières sont soumises à l'extractions, telles quelles ou après dessiccation à basse température et pulvérisation, par un solvant orga- nique tel que l'éther, le benzène, le méthanol, l'éthanol, l'acétone, le chloro- forme et l'acétate éthylique dans des conditions acides, neutres ou alcalines après avoir éliminé, si c'est nécessaire, la graisse, par le pétrole ou la ben- zine. L'extrait obtenu par un solvant organique non miscible avec l'eau est se- coué avec de l'eau acidulée de pH inférieur à 4. Dans le cas de l'extrait obtenu par un solvant organique miscible avec l'eau,
il est d'abord desséché et ensui- te traité comme ci-dessus. En alcalinisant la solution acide par l'ammoniaque, le bicarbonate de soude ou analogue, l'ergokryptinine et la grande masse de 1' agroclavine s'en séparent, près de la totalité de l'élymoclavine restant en so- lution de laquelle la fraction élymoclavine est séparée par l'extraction par un solvant organique tel que l'éther ou le chloroforme et ensuite par la concentra- tion de l'extrait.
Lorsque le précipité ci-dessus est dissous dans un solvant or- ganique adéquat tel que le chloroforme et l'acétate éthylique et ensuite secoué avec de l'eau, acidulée, seule l'agroclavine passe dans l'eau acidulée, si bien que la fraction ergokryptinine est obtenue à partir de la solution dans le sol- vant organique et la fraction agroclavine se sépare en alcalinisant l'eau aci- dulée. La fraction agroclavine est aussi obtenue lorsque la solution acide sus- dite est rendue alcaline et est secouée avec un solvant organique pour dissou- dre l'alcaloïde y contenu et que la solution dans le solvant organique est soumi- se à l'extraction par contre-courant ou à la chromatographie de répartition. Dans ce cas, une petite quantité de la fraction élymoclavine est récupérée.
Lorsque la solution aqueuse acide de l'ensemble des alcaloïdes, nommée ci-dessus, est secouée avec un solvant organique tel que le chloroforme ou l'acétate éthylique, l'ergokryptinine passe dans les solvants organiques, tan- dis que l'agroclavine et l'élymoclavine restent dans la solution acide. Il s'en- suit que la fraction ergokryptinine est obtenue à partir de la solution dans le solvant organique par la concentration et la fraction agroclavine se sépare de la solution acide par l'alcalinisation et enfin la fraction élymoclavine est ré- cupérée de la liqueur mère de l'agroclavine.
La culture obtenue par la culture solide et la matière cellulai- re obtenue par la culture liquide sont aussi soumises à 1'extraction, telles quel- les ou après élimination de la graisse, directement par l'eau, acide et l'extrait, tel quel ou après concentration, est rendu alcalin. La solution alcaline est alors, soit soumise à l'extraction par un solvant organique non miscible avec 1' eau, soit traitée par un adsorbant tel que l'argile acide japonaise dans des con- ditions acides et ensuite lavée par un solvant organique. Chaque fraction, à sa- voir celles de l'ergokryptinine, de l'agroclavine et de l'élymoclavine, est alors séparée par les méthodes susmentionnées de ces solutions dans des solvants organi-
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ques.
Dans un autre casla culture ,obtenue par la culture solide ét la matière cellulaire obtenue par la culture liquide sont soumises à l'extrac- tion par l'eau acidulée et l'extrait acide est alors secoue tel quel avec un solvant organique tel que le chloroforme. l'acétate éthylique et d'autres, et la plus grande partie de l'ergokryptinine passe dans le solvant organique, tan- dis que la plus grande partie de l'agroclavine et d'élymoclavine reste dans l' eau acidulée.
Lorsque la substance solide de culture susmentionnée est soi- gneusement soumise à l'extraction par l'eau ou par un solvant aqueux pendant de nombreuses heures,,, une partie des alcaloïdes est extraite, partie qui consiste toutefois pour la majeure part en agroclavine et en élymoclavine, d'où chaque fraction d'alcaloïdes est séparée, par exemple, diaprés leur solubilité dans l' ,eau.
La partie liquide de la culture obtenue par la culture liquide est traitée comme suit.
Le liquide tel quel ou après concentration, est modifié pour l'amener à pH 4 et, après filtrage,, il est secoue avec un solvant organique tel que le chloroforme ou l'acétate éthylique, sur quoi l'ergokryptinine passe dans le solvant organique, tandis que 19agroclavine et l'élymoclavine restent dans le liquide acide. Lorsque le liquide est soumis à l'extraction par un solvant or- ganique dans des conditions presque neutres. l'ergokryptinine et l'agroclavine passent dans le solvant organique, l'élymoclavine restant seule dans le liquide.
Dans un autre cass le liquide est rendu alcalin, après concen- tration.. s'il est nécessaire,, et ensuite soumis à l'extraction par un solvant organique non miscible avec l'eau. Ou bien, le liquide est traité par un adsor- bant tel que l'argile acide japonaise dans des conditions acides et ensuite la- vé par un solvant organique. Chaque fraction, à savoir celles de l'ergokrypti- nine, de l'agroclavine et de l'élymoclavine, est séparée de ces solutions par les méthodes employées dans le cas de la matière solide.
Parmi les méthodes de séparation qui tirent profit de la diffé- rence de coefficient de répartition d'une substance entre deux solvants, l'extrac- tion par contre-courant et la chromatographie de répartition sont spécialement importantes dans le procédé de la présente invention. Pour des mises en oeuvre à grande échelle,, la chromatographie de répartition est employée sous la forme de chromatographie de répartition à colonne.
L'extraction par contre-courant est généralement mise en oeuvre en faisant usage d'eau acidulée et d'un solvant organique non miscible avec 1' eau. Une solution s'acides inorganiques ou organiques ou d'autres substances or- ganiques dans l'eau est employée en tant qu'eau acidulée.
Une solution tampon peut aussi être employée à cet effet.
L'éther. le chloroformée le butanol, l'acétate éthylique, etc... peuvent être employés en tant que solvant organique non miscible avec l'eau. Pour prendre 1' extrait de l'ensemble des alcaloïdes pour exemples l'extrait est distribué, par exemple entre 19eau et le butanol par l'extraction à contre-courant et chaque fraction d'alcaloïdes est séparée d'après sa réaction chromatique.
Dans le cas de la chromatographie de répartition à colonne, le papier à filtre ou d'autres fibres. l'alumine, le carbonate de calcium, le gel de silice. le goudron,,, etc.. sont employés en tant que support et l'eau ou la solution aqueuse d'acides organiques ou inorganiques en tant que solvant aqueux, et un solvant organiques tel que 1?éther le chloroforme.,, le butanol, 19amyl- alcool,, l'acétate éthylique saturé d'eau ou de la solution acide ci-dessus en tant que solvant organique développant. Les supports, les solvants aqueux ou les solvants organiques développants sont combinés convenablement et leurs es- pèces ne sont évidemment pas limitées aux substances ci-dessus.
Le solvant dé- veloppant peut être amené à s'écouler librement ou à l'aide de la succion.
Lorsque l'extrait de l'ensemble des alcaloïdes est développé par la chromatographie de répartition à colonne,. trois zones,, à savoir celles
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de l'ergokryptinine, de l'agroclavine et de l'élymocla- vinessont formées dans la colonne.
Les produits des zones sont enlevés séparément et soumis à l'extraction par un solvant organique ou par l'eau acidulée, ou.les alcaloïdes des zones sont enlevés: séparément par lavage.
Les distinctions entre les zones sont établies d'après les flu- orescences plutôt que d'après les réactions chromatiques.
Les fractipns de l'ergokryptinine, de l'agroclavine et de l' élymoclavine obtenues par les méthodes mentionnées ci-dessus contiennent encore certaines impuretés; il s'ensuit qu'une purification subséquente doit être pra: tiquée pour les obtenir à l'état pur.
Par exemple, la fraction ergokryptinine est dissoute dans un solvant organique tel que le benzène, l'acétate éthylique ou le chloroforme, et la solution est secouée avec de l'eau, alcaline telle que la solution de sou- de ou de potasse caustique et l'ergokryptinine reste dans le solvant organique, tandis que les impuretés telles que l'ergosinine, l'ergokryptine et d'autres pas- sent dans l'eau alcaline.
Lorsque la solution de solvant organique est évaporée jusqu'à la dessiccation et ensuite traitée par un solvant organique tel que le méthanol, l'ergokryptinine est obtenue sous forme cristalline.
Dans une variante, la fraction ergokryptinine est dissoute dans un solvant organique non miscible avec l'eau et la solution est secouée avec de l'eau acidulée pour dissoudre les alcaloïdes y contenus. La solution acide est rendue alcaline et le précipitat résultant est dissous, après dessiccation, dans un solvant organique tel que le méthanol, l'éthanol, l'acétate éthylique et la solution est concentrée, sur quoi l'ergokryptinine est obtenue sous forme cristalline.
La fraction agroclavine est dissoute dans un solvant organique, tel que l'éther ou l'acétate éthylique dans des conditions alcalines et la so- lution est concentrée, après dessiccation, et l'agroclavine se sépare après re- pos. Ou bien la fraction agroclavine est dissoute dans un solvant organique misci- ble avec l'eau, tel que le méthanol, l'éthanol ou l'acétone et la solution re- çoit de l'eau pour séparer l'agroclavine sous forme cristalline. La fraction agroclavine est aussi purifiée en transformant l'agroclavine en son sel et en- suite en la libérant de la solution du sel avec de l'alkali.
La fraction élymoclavine est dissoute dans une quantité adéqua- te d'un solvant organique qui dissout aisément l'élymoclavine, tel que l'acétone, le méthanol ou l'éthanol, et les impuretés insolubles sont éliminées par filtra- tion.
L'élymoclavine ainsi purifiée jusqu'à un certain point peut être cristallisée et recristallisée à partir d'un solvant organique tel que le benzène, l'éther, le chloroforme. l'acétate d'éthyle, l'acétone, le méthanol ou l'éthanol ou même de l'eau. Ou bien l'élymoclavine de sa fraction est d'abord transformée en son sel et ensuite elle est libérée de la solution du sel avec de l'alcali et fina- lement purifiée par le traitement par un solvant organique ou par cristallisa- tion d'un solvant organique.
Comme il est dit au début de la description, l'élymoclavine est un nouvel alcaloïde d'ergot et possède les propriétés suivantes.
Elle cristallise à partir du benzène, du chloroforme, de 1' éther, de l'acétate éthylique, de l'acétone, du méthanol. de l'éthanol ou de 1' eau en prismes incolores. Le cristal obtenu du méthanol est un prisme monocli- nique dont l'angle axial monoclinique /3 = 90 , et les indices de réfraction pour la raie D,Ó'= 1,62, ss = 1,75. Elle fond en se décomposant à 248 à 252 .
[Ó]20 = -59 .[Ó]20 = -98 (éthanol).[Ó]20D = -136 .[Ó]Hg = -166 (pyridine). Elle a un groupe H-CH3 dans sa molécule et son examen analytique indique la formule C16H18CN2. Tout comme l'agroclavine, l'élymoclavine présen-
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te le maximum de son spectre d'absorption aux environs de 282 mu et le minimum dans les environs de 246 mu. Elle se précipite avec l'acide tungstique, le ré- actif de Meyer et d'autres réactifs alcaloldaux et elle est aisément soluble dans divers acides organiques et inorganiques et les solutions donnent non seulement la réaction de Keller, mais aussi respectivement les réactions chromatiques rou-
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geâtre et bleue avec les solutions de vaniline et de pmd.iméthylau.3.nobenzaldéhyde dans l'acide sulfurique.
Elle est aisément soluble dans la pyridine, solubré dans 19acétone, le méthanol, l9éthanol et le butanol, modérement soluble dans 2e benzène le toluène, le chloroforme et l'éther et insoluble dans l'éther de pé- trole et la ligroineo Elle est bien soluble dans 19 eau froide et la solution donne une réaction alcaline.Elle est sensible à la lumière et ses solutions dans divers solvants brunissent et acquièrent la fluorescence. Tout comme l'agroclavi- ne, l'élymoclavine ne donne pas d'isomère lorsqu'on la traite par un acide ou un alcali.
Elle est hydrogénée en un composé dihydro, point de fus. (décomp.)
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239 â ,4p CD [e(] 24 = -143 [o<¯1,24 m -182 (pyridine). Lorsque l'élymocla-
D . Eg vine est développée par la méthode descendante sur le papier filtre Toyo N 131 à 24 C pendant une période de 13 à 15 heures par un solvant développant prépa-
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ré en secouant un mélange de 4 parties de n-butanol,, 5 parties d'eau et 1 partie d'acide acétique et qu9on retire la couche inférieure, il se forme un point à la valeur 0,67 de Rf. Parfois, un point fluorescent à la valeur 0,59 de Rf
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est dû aux produits de décomposition de 19élymoclavine.
A ce propos, les valeurs de Rf de l'acide lysergique, de l9ergomêtrine9 de l9agroelavine et de l'ergokryp- tine sont respectivement, dans les mêmes conditions, 0.50, 0,68, 0.82 et 0.92.
L'élymoclavine présente évidemment l'activité physiologique d'un alcaloïde d'er- got et produit un effet excitant sur l'utérus séparé de la lapine, même à une dilution de 1:10.000.000.
Exemple 1
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lJil2 - 1 d'un milieu de culture consistant en mannitol (5%), glu- tamate d1 ammonium (1%) sulfate de magnésium (01103%) et eau de canalisation, ré- glé à un pH de 5,2 par l'acide chlorhydrique, est placée dans un ballon à fond plat de 3-1.
Le milieu de culture est inoculé par une trace de champignon er- got parasite sur Elymus mollis Trin. et ensuite soumise à la culture de surface à 26 C. Après 40 jours, le liquide de culture est versé et acidifié par l'acide sulfurique et la matière cellulaire restante est soumise séparément à l'extrac- tion à plusieurs reprises par l'acide sulfurique dilué.
Les liquides acides combinés sont secoués avec de l'argile aci- de japonaise pour absorber les alcaloïdes y contenus et l'adsorbant est humecté
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d'ammoniaque et soumis à 19extraction par l'éther de manière répétée. Les extraits combinés sont concentrés'et ensuite secoués avec plusieurs parties d'un dixième de son volume d'une solution à 1 à 3% diacide succinique dans 1?eau. La solution acide est rendue alcaline à environ pH 8 par l'ammoniaque et le précipitât résul- tant est séparé de la liqueur mère (A) par filtration.
Le précipitat est dissous dans une quantité assez grande de chloroforme et la solution est secouée avec 3 parties d'un tiers de son volume diacide sulfurique n/10 pour éliminer les substances solubles dans la solution acide. La solution acide (B) est mise de côté et la solution dans le chloroforme est évaporée, après dessiccation par le chlorure de calcium l'évaporation étant menée jus- qu'à dessiccation et le résidu est dissous dans le benzène dans des conditions alcalines ammoniacales.
La solution dans le benzène., après qu'on l'a secouée avec une solution à 1% de soude caustique pour éliminer les substances solubles dans la solution d'alcali (la solution alcaline (G) est mise de côté), est
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évaporée jusqu?à dessiccation et au résidu est ajouté goutte' à goutte du métha nol et la solution. après élimination par filtrage des insolubles, est concen- trée, ce qui sépare l'argokryptin1ne sous forme cristalline pendant le repos.
Le rendement est d'environ 260 mg. La liqueur mère (A) est secouée à plusieurs
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reprises avec de l'éther et la solution dans 19éther est concentrée et secouée plusieurs fois avec une petite quantité d'acide sulfurique n/10. Les solutions acides combinées sont rendues alcalines par le bicarbonate de sodium et le pré - cipitat résultant (D) est éliminé par filtration. La liqueur mère est secouée à plusieurs reprises avec du benzène et la solution dans le benzène est concentrée à 20 cc.
La solution concentrée est laissée en repos pendant quelque temps dans un endroit frais et le précipitat résultant est éliminé par filtration et la liqueur mère est laissée en repos à la température ordinaire, sur quoi l'élymo- clavine se sépare sous forme cristalline. L'élymoclavine ainsi obtenue est dis- soute dans un peu d'acétone chaude et la solution est concentrée, après élimi- nation par filtrage des insolubles, et les cristaux séparés sont purifiés davan- tage par le lavage par un peu d'acétone froide et par recristallisation à partir de l'acétate éthylique. Le rendement est d'environ 6 mg.
La solution acide (B) est rendue alcaline par l'ammoniaque et le précipitat résultant est séparé de la liqueur mère (E). Le précipitat est dissous dans l'acétone et la solution., après filtrage, est concentrée et ensui- te l'eau distillée lui est ajoutée jusqu9à ce qu'elle se trouble, et est ensui laissée en repos à la température ordinaire, sur quoi l'agroclavine se sépare sous forme cristalline.
Les cristaux sont alors dissous dans l'acétate éthylique chaud et la solution est concentrée, après élimination par filtrage des insolubles, sur quoi l'agro- clavine pure est obtenue sous forme cristalline. Le rendement est d'environ 90 mg.
Sont récupérées en petite quantités: l'agroclavine du précipi- tat (D), l'élymoclavine de la liqueur mère (E) et l'ergokryptine, l'ergokryptine et l'ergosinine de la solution alcaline (C).
Exemple 2
1.3 - 1 d'un milieu de culture consistant en mannitol (5%), glu- tamate d'ammonium (0.8%). biphosphate de potassium (0.1%). sulfate de magnésium (0.03%) et eau de canalisation, réglée à pH 5,2 par l'acide chlorhydrique, est placée dans un ballon à fond plat de 3-1. Le milieu de culture est inoculé par le champignon ergot., cultivé et traité presque comme dans l'exemple 1. La solution dans l'éther de l'ensemble des alcaloïdes, obtenue en soumettant l'adsorbant à l'extraction!, est concentrée à 1-1. et secouée à plusieurs reprises avec 50 ce d' une solution à 1-3% d'acide citrique dans l'eau.
La solution acide est rendue alcaline et secouée de nouveau avec de l'éther et la solution dans l'éther est évaporée pour éliminer complètement l'éther. Le résidu est dissous dans l'acétone alcaline ammoniacale chaude et la solution est concentrée à un tiers de son volume et filtrée après un temps de repos dans un endroit frais. Le filtrat reçoit une grande quantité d'eau et le précipitat résultant (A) est éliminé par filtration et le filtrat est secoué à plusieurs reprises avec de l'éther pur. Les solutions dans l'éther combinés sont évapo- rées jusq'à dessiccation sous pression réduite et le résidu résineux est dissous dans le benzène bouillant et la solution est filtrée et concentrée.
La solu- tion concentrée est refroidie rapidement et le précipitât résultant est élimi- né par filtration et le filtrat est laissé en repos à la température ordinaire, sur quoi l'élymoclavine se sépare. Une petite quantité d'agroclavine est récu- pérée de la liqueur mère.
Le précipitat (A) est dissous dans l'alcool alcalin ammoniacal qhaud et la solution est filtrée et reçoit un grand volume d9eau distillée et le.précipitât (B) résultant est éliminé par filtration. Le filtrat est secoué à plusieurs reprises avec de l'éther pur et la solution dans l'éther combinée est évaporée jusqu'à dessiccation sous pression réduite et le résidu résineux est dissous dans le benzène bouillant et la solution dans le benzène, après fil- trage. est concentrée et laissée en repos, sur quoi l'élymoclavine se sépare.
On récupère un peu d'agroclavine, de la liqueur mère. L'élymocclavine réunie est lavée par une petite quantité d'acétone froide et recristallisée à partir de l'alcool pour donner le produit pur. Le rendement est de 6 mg.
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Le précipité (B) est dissous dans l'acétate éthylique et la so- lution après qu'on 19a secouée à plusieurs reprises avec de 19acide acétique di- lué, est évaporée jusqu9à dessiccation sous pression réduite (la solution diluée dans'19acide acétique (C) est mise de côté). Le résidu est dissôus dans le benzè- ne dans des conditions alcalines ammoniacales et la solutions après avoir été se- couée à plusieurs reprises avec un peu de solution de potasse caustique,, est éva- porée jusqu9à dessiccation (la solution alcaline (D) est mise de côté). Le résidu.
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consistant en ergokcyptininea est traité par le méthanol et ensuite purifié par recristallisation comme dans l'exemple 1. Le rendement est de 180 mg.
La solution acide (C) est rendue alcaline par l'ammoniaque et le précipité résultant est dissous dans la moitié de son poids d'une solution concentrée diacide succinique. L9agroclavine se sépare de la solution sous for-
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me de succînate, de la solution duquel lyagroclavlne est précipités par une al- callnisation par .l'ammoniaque.
Le précipité est dissous dans un peu de méthanol et la solution reçoit de l'eau distillée pour donner des cristaux d9agroclavineoLe rendement est d'environ 45 mg.
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Une petite quantité doergokryptine et d'ergokryptinine est ré- cupérée de la solution alcaline (D).
Exemple 3.
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12 - 1 d'un milieu de culture consistant en mannitol (5), aspargine (1fl5)fl biphosphate de potassium (091%)9 sulfate de magnésium (0,05%) et eau de canalisation, réglé à pH 5,4 par l'acide sulfurique, est placé dans un ballon à fond plat de 3-la Le milieu de cultures après inoculation par une trace de champignon ergot parasite sur Elymus mollis Trin. est soumis à la cul- ture de surface à 26 à 28 Ce Après 36 jours,, le liquide de culture est séparé de la matière cellulaire et la matière cellulaire est lavée par de l'acide sulfurique n/10 jusqu9à ce que la lessive ne donne plus de réaction alcaloïde.
Le liquide de culture est réuni avec la lessive, rendu alcalin par l'ammoniaque et soumis deux fois à l'extrac- tion par l'éther en faisant usage d'un éjecteur. L'extrait à l'éther est con- centré et ensuite secoué à plusieurs reprises avec environ un dixième de son volume d'acide acétique dilué. La solution acide est secouée par deux parties
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d'environ la moitié de son volume de chloroforme et 1?ergokryptinme passe dans le chloroformée l9agroclavine et 1?élymoclavine restant dans la solution acide (A). La solution dans le chloroforme, après dessiccation par le chlorure de cal- cium, est évaporée jusqu9à dessiccation et le résidu est traité par l'éther dans des conditions alcalines ammoniacales.
La solution dans l'éther est secouée à plusieurs reprises avec une petite quantité d9acide acétique n/10 et la solu- tion acide est réglée à pH 8,0 par l'ammoniaque et le précipité résultant est filtré. Après dessiccation, le précipité est dissous dans une quantité assez grande de méthanol chaud et la solution est filtrées concentrée et laissée en re-
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pos à la température ordinaires sur quoi 1?ergokryptinine brute se sépare qui est purifiée par recristallisation à partir de l'acétate éthylique. Le rendement est d'environ 2f0 mg. Une petite quantité dergokryptinee fl d 9 ergokryptin3.ne et d'er- gosinine est récupérée de la liqueur mère.
La solution acide (A) est rendue alcaline par l'ammoniaque et,,, après élimination par filtrage du précipité résultant (B),elle est secouée à plusieurs reprises avec la benzène et la solution dans le benzène est concentrée et filtrée tant qu'elle est encore chaude. Lorsque le filtrat est laissé en repos
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à la température ordinaire, les cristaux d9élympelavine se séparent et adhèrent au fond du récipient,, tandis que les impuretés se déposent sous forme de précipi- té léger; on les sépare donc en décantant le liquide.
L9élymoclavine brute ainsi obtenue est lavée par le benzène froid et dissoute dans le chloroforme chaud et la solution est filtrée, concentrée et laissée en
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repos pour donner l'élymoclavine pure. Le rendement est d'environ fl0 mg4 Le pré- cipitat (B) est dissous dans 19éther dans des conditions alcalines ammoniacales et la solution, après dessiccation par le sulfate de sodium, est concentrée pour
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donner de l'agroclavine, qui est purifiée davantage par recristallisation a par- tir de L'éther. Le rendement est d'environ 80 mg.
Exemple la 2-1. d'un milieu de culture consistant en mannitol (5%), aci- de aspartique (0,8%), biphosphate de potassium (0,1%), sulfate de magnésium (0,05%) et eau de canalisation, réglé à pH 5,0 par 30% d'ammoniaque, est mis dans un ballon à fond plat de 3-1. Le milieu de culture, après inoculation par une 'va- riante obtenue à partir du champignon ergot parasite sur Elymus mollis Trin. par irradiation par le radium, est soumis à la culture de surface à 26 à 28 C.
Après 32 jours, le liquide de culture est versé et la face infé- rieure de la matière cellulaire est lavée par une solution (pH 5,0 env.) d'aci- de succinique dans l'eau jusq'à ce que la lessive ne donne plus de réaction alcaloïde. La matière cellulaire est soumise à la dite "culture de remplacement" à l'aide d'un nouveau milieu de culture adéquat.
Le liquide de culture est réuni à la lessive, rendu alcalin par l'ammoniaque et soumis par deux fois à l'extraction par le benzène en faisant usage d'un éjecteur. L'extrait est concentré et secoué à plusieurs reprises avec une petite quantité de solution à 3% diacide lactique. La solution acide est rendue alcaline par le bicarbonate de sodium et le précipité résultant est fil- tré (la liqueur mère (A) est mise de côté). Le précipité est dissous dans une quantité adéquate de n-butanol à la température ordinaire et la solution est versée dans une colonne de verre d'environ 45 cm. de haut et large d'environ 10 cm, qui contient un empilage de 1,6 kg de fécule de pomme de terre pure mala- xée avec 2-la d'eau distillée.
Lorsque la solution dans le butanol a imbibé la couche de fécule, un solvant développant, préparé en secouant soigneusement un mélange de 4 parties de n-butanol, 1 partie d'acide acétiques et 5 parties d'eaudistil- lée et en retirant la couche inférieure, est amenée à passer librement à partir du dessus de la couche de fécule. Après 18 heures, le solvant qui se trouve sur la couche de fécule est jeté et la colonne est laissée en repos pendant un cer- tain temps, jusqu'à ce que le solvant atteigne environ 20 cm. à partir du des- sus de la couche de fécule. Lorsqu'on observe la colonne sous les rayons ultra- violets, on trouve plusieurs zones de fluorescence.
La zone fluorescente bleue- purpurine inférieure, d'entre 10 et 15 cm. du dessus de la couche de fécule, est tranchée et soumise séparément à l'extraction à plusieurs reprises par le moins possible d'acide acétique à 10%. L'extrait est secoué avec l'éther pour éliminer le butanol et l'extrait est rendu alcalin par l'ammoniaque, et le pré- cipité résultant est filtré. Le précipité est séché, dissous dans une grande quantité d'acétate éthylique chaud et, après élimination des insolubres par filtrage, concentré,sur quoi l'ergokryptinine brute se sépare qui est puri-. fiée davantage par recristallisation à partir du méthanol. Le rendement est de 230 mg par 1-1. de liquide de culture.
La partie comprise entre 7 et 9 cm. en- viron à partir du dessus de la couche de fécule, qui comprend les zones fluo- rescentes vert jaunâtre et bleu purpurin est tranchée et soumise à plusieurs reprises à l'extraction par le moins possible d'acide sulfurique n/10 et 1' extrait est traité comme ci-dessus. Le précipité résultant est dissous dans l'éther dans des conditions alcalines ammoniacales et la solution dans l'éther, après dessiccation, est concentrée et secouée à plusieurs reprises avec une so- lution d'acide succinique à 1 à 3%.
L'éther de la solution acide est chassé et la solution acide est rendue alcali- ne par l'ammoniaque et le précipité résultant est filtré. Comma dans le cas de 1?exemple 1, le précipité est dissous dans l'acétone et la solution reçoit de l'eau pour précipiter l'agroclavine laquelle est purifiée davantage par recris- tallisation à partir de l'acétate éthylique. Le rendement est de 80 mg par 1-1. de liquide de culture.La liqueur mère (A) est traitée comme la liqueur mère (A) de l'exemple 1 pour donner l'élymoclavine.
Le rendement est d'environ 5 mg par 1-1. de liquide de culture. Dans ce cas, une petite quantité d'agroclavine est aussi récupérée comme dans l'exemple 1.
On récupère de la partie située entre 5 et 7 cm. environ à partir du-dessus
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de la couche de féculesune petite quantité d'élymoclavine si on la traite com- me dans l'exemple 5.
Exemple 5
La culture à végétation superficielle du champignon ergot est effectuée à 26 à 28 C en faisant usage du même milieu et de la même couche que dans le cas de l'exemple 1.
Après 35 jours, le liquide de culture est séparé de la matière cellulaire et l'extraction par l'acide sulfurique dilués l'adsorption par l'argile acide ja- ponaise et le lavage par l'éther sont réalisés comme dans l'exemple 1.
La solution dans l'éther est concentrée et secouée à plusieurs reprises avec un dixième de son volume d'acide sulfurique n/10 et le précipité résultant est séparé. La solution acide est réglée à pH 4,2 par l'ammoniaque et le précipi- té résultant est séparé de la liqueur mère. Le précipité réuni avec le précipi- té ci-dessus est dissous dans un peu d'acétone et la solution reçoit une grande quantité d'eau et le précipité résultant (A) est séparé de la liqueur mère.
La liqueur mère est réunie avec la liqueur mère ci-dessus,, rendue alcaline par l'ammoniaque et ensuite secouée à plusieurs reprises avec l'éther. La solution dans l'éther est évaporée pour éliminer l'éther complètement et le résidu est disso-us dans le n-butanol.
La solution dans le butanol est versée dans une colonne de verre d'environ 45 cm. de haut et large de 10 cm., contenant un empilage de le 6 kg de fécule de pomme de terre pure malaxée avec 2-1. d'aci- de acétique à 5%Lorsque la solution de butanol a pénétré dans la couche de fécule, le même solvant que dans 1?exemple 4 est amené à s'écouler pendant 16 heureso Au bout de ce temps, le solvant situé sur la couche de fécule est jeté et la colonne est laissée en repos jusqu9à ce que le solvant ne s'égoutte plus de l'extrémité inférieure de la colonne.
Comme dans l'exemple 4, on trouve cinq zones fluorescentes et la grande masse de l'élymoclavine est contenue entre la deuxième et la troisième zone, qui sont tranchées et secouées à plusieurs reprises avec une petite quantité d' acide sulfurique n/10 contenant un petit peu de n-butanol. Le butanol conte- nu dans la-solution acide est chassé et la solution acide est rendue alcaline par l'ammoniaque et secouée à plusieurs reprises avec l'éther. La solution dans l'éther est évaporée jusqu9à dessiccation et le résidu est dissous dans une grande quantité de benzène bouillant. Après élimination par filtrage des inso- lubles, la solution dans le benzène est évaporée jusqu'à dessiccation et le résidu cristallin reçoit de l'acétone.
La solution dans 19acétone', après élimi nation par filtrage des insolubles est évaporée presque jusqu9à dessiccation, sur quoi quelques cristaux se séparent du résidu résineux. Les cristaux sont séparés par lavage par l'acétone et dissous dans l'acétate éthylique chaud et la solution est concentrée., sur quoi l'élymoclavine se sépare en cours de re- pos. Le rendement est d'environ 10 mg. La zone fluorescente de dessous est trai- tée comme dans 1?exemple 4 et environ 130 mg d'ergokryptinine et un peu d'ergo- kryptine sont obtenus sous forme cristalline.
De la partie située entre le des- sus de la zone de dessous et les zones fluorescentes suivantes vert jaunâtre -et bleu purpurin. on récupère environ 80 mg d'agroclavine par le traitement de 1' exemple 4. Du précipité (A) on obtient environ 100 mg d'ergokryptinine et un peu d'ergokryptine sous forme cristalline.
Exemple 6
La matière cellulaire obtenue dans l'exemple 3, lavée jusqu'à ascetptie, est mise à flotter sur 1.2-1. d'une solution stérilisée consistant en glucose (6%), succinate d'ammonium (0,8%), biphosphate de potassium (0,1%), sulfate de magnésium (0,03%) et eau de canalisation, réglée à pH 5,4 à l'ai- de d'acide succinique,,, et l'ensemble .est soumis à une culture. stationnaire à 24 à 26 C. Après 22 jours le liquide de culture est séparé de la matière cel- lulaire et la matière cellulaire est soumise à plusieurs reprises à l'extrac- tion par l'acide acétique n/10.
L'extrait acide est réuni avec le liquide de culture rendu alcalin par l'ammoniaque et soumis deux fois à l'extraction
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par l'éther en faisant usage d'un-éjecteur. La solution dans l'éther est éva- . porée pour éliminer l'éther complètement et le résidu est dissous dans le n- butanolo La solution dans le butanol est versée dans une colonne de verre d' environ 40 car. de hauteur et large d'environ 5 cm., contenant un empilage de 360 g de fécule de pomme de terre pure malaxée avec 420 cc d'acide acétique à 5%. Lorsque la solution dans le butanol a pénétré dans la couche de fécule, le solvant employé dans l'exemple 3 est amené à s'écouler du dessus de la couche de fécule pendant 16 heures.
Cinq zônes fluorescentes se forment dans¯ la cou- che de fécule. La zone fluorescente de dessous, bleu purpurin, comprise entre environ 10 cm. et 14 cm. à partir du dessus de la couche de fécule est tran- chée et soumise à plusieurs reprises à l'extraction par une petite quantité d'acide acétique à 10%. L'extrait acide est secoué avec l'éther pour éliminer le butanol et rendu alcalin par l'ammoniaque et le précipité résultant est fil- tré. Le précipité est dissous dans le benzène dans des conditions alcalines ammoniacales et la solution, après qu'elle a été secouée deux fois avec un di- xième de son volume d'une solution à 1% de soude caustique, est évaporée jusqu'à dessiccation.
Le résidu est dissous dans le moins d'éthanol possible et la solu- tion est filtrée et concentrée jusqu'à un très petit volume, sur quoi l'ergokryp- tinine se sépare après repos dans un endroit frais. L'ergokryptinine ainsi obte- nue est ensuite dissoute dans le méthanol et la solution, après concentration, est laissée au repos à la température ordinaire pour donner l'ergokryptinine pure.
Le rendement est de 210 mg. La zone comprise entre 4 et 7 cm. à partir du dessus de la couche de fécule est tranchée et soumise à plusieurs reprises à l'extrac- tion par une petite quantité d'acide sulfurique n/10. L'extrait acide est secoué avec de l'éther pour éliminer le butanol contenu dans l'extrait, rendu alcalin par l'ammoniaque et secoué à plusieurs reprises avec l'éther. La solution dans l'éther est évaporée jusqu'à la dessiccation et le résidu est dissous dans le benzène bouillant et la solution dans le benzène est filtrée et laissée au re- pos dans un endroit frais. Le précipité résultant est éliminé par filtration et le filtrat est concentré et laissé au repos à la température ordinaire, sur quoi l'élymoclavine se sépare. Le rendement est d'environ 10 mg.
La zone comprise entre environ 7 et 9 cm. à partir du dessus de la couche de fécule est soumise à l'extraction par l'acide sulfurique dilué, reprise par l'éther et secouée avec de l'eau acidulée comme dans l'exemple 4.
La solution acide est rendue alcaline par l'ammoniaque et le précipité résul- tant d'agroclavine est purifié davantage en la transformant en succinate aci- de, et ensuite des cristaux purs d'agroclavine sont obtenus comme dans l'exem- ple 2. Le rendement est d'environ 70 mg.
REVENDICATIONS.
1. Méthode de production de l'alcaloïde d'ergot, qui comprend la culture saprophytique du champignon ergot de nature à produire en culture des quantités extraordinairement grandes d'ergokryptinine, par suite de quoi les alcaloïdes d9Frgot contenant l'ergokryptinine, 1-9agroclavine et l'élymoclavine sont produite et la séparation de la culture d'un membre choisi dans le groupe consistant en ergokryptinine, agroclavine et élymoclavine.
2. Méthode de production de l'alcaloïde d'ergot selon la re- vendication 1, dans laquelle la culture saprophytique est mise en oeuvre sous forme de culture de surface.
3. Méthode de production de l'alcaloïde d'ergot selon la re- vendication 1, dans laquelle le champignon ergot, qui est choisi dans un groupe consistant en champignons ergots parasites sur Elymus mollis Trin.. les plan- tes y apparentées et leurs variantes, et qui est de nature à produire en cul- ture des quantités extraordinairement grandes d'ergokryptinine, est cultivé par la culture de surface.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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ELYMOCLAVINE AND MANUFACTURE OF ERGOT ALKALOIDS BY CULTURE.
The present invention relates to elymoclavin, a novel alka-
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law 'dwergotm and a method of cultivating ergot fungus having a nature to produce an extraordinarily large amount of ergolmyptin in culture ¯ and separating ergokri # tmine, argoclavin and elymoclavin. of the culture.
In 1943, A. Stoll and Ao Hofmann explained that ergotoxin
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presented by G. Barger and F oH. Carr (J '. Chem. O Soc Vol, a 91, p. 377 (1907)) and par'F-. Kraft '' (Archo Pharm. Vol. 244. p 336 (1906)), eto. 0, was nothing more than a mixture of three alkaloids, ergoeristine, 19ergokryptine and lyergocornine, and that ergotinine presented by C., Tanret (CR Acad. Scia Vol. 81. po 891 (1875)) was also a mixture. consisting of ergocristinine ;, ergokryptinine and ergocorninine which are isomers of the three alkaloids above.
It follows that at present, ten ergot alkaloids, said to be of the pep- type
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t3.de9 are the following: ergotamine, ergosine, ergocristine, ergokryptinea ergoeôrnines ergotamininea ergosinine, ergocristinine, ergokryptinine and ergocorininee the last five alkaloids being respectively the isomers of the first five. '
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Although all of these alkaloids are widely used. as such or in the form of their derivatives, for clinical purposes their production is very low in all countries owing to the fact that the agriculture of ergot de-
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requires large fields and a large workforce, but also due to the fact that this agriculture is very subject to climatic conditions.
It follows that if the artificial cultivation of ergot fungus was possible and if the preparation of ergot alkaloids of the peptide type from the culture could take place, not only the culture could be substituted for it. 'quibbled but also the massive production of. alkaloids would be in sight. not to mention the easy scientific conduct of the resulting production.
For this purposes. many researchers have so far studied the culture
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artificial ergot fungus and this without result. In fact, only the agrocla-
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vine, which is an ergot alkaloid, of the non-peptide type. discovered by one of the present inventors (Annual Reports of Takeda Research Laboratory, Vol. 10, pp.
145, 162, 171 (1951). can be prepared in large quantities by artificial culture.
As shown by the series of reports by A. Mc Cre-a (Amer. Jour.
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Bot. Flight. 18, p. 50 (1931), H. Kreitmàir and W. Küssner (Biochem. Zeitschrift, Vol.
239. Po189 (1931)). R. Jaretsky (Archiv. D. Pharmazie, Vol. 273. p. 348 (19,)), E. Baldacei (Farmaco. Sci. C. Toc. Lo. Vol. L, p. 187 (1941. SK Sim et HW
Youngken. Fr. (Jour. Amer. Pharmac. Ass. Sci. Ed. Vol. 40, p.344 (1951)), etc ..., none of the ergot alkaloids of the peptide type have so far been produced in large quantities per culture.
The present applicants, who have studied for many years
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the artificial culture of ergot fungus have found that in general, lelymsclavine, a new ergot alkaloid, exists in ergot and in the culture of the ergot fungus and that certain species of ergot fungi produce in culture relatively large quantities elymoclavin and agrocla-
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vine and, at the same time, extraordinarily large amounts of ergokryptinine.
In addition, they discovered that the culture of the aforementioned ergot fungus contains few alkaloid species and no impurities which are difficult to separate from where it follows that the concentration of elymoclavin and ergokryptinine is extremely easy.
According to the process of the present invention, the yield of er-gokryptinin is abnormally excellent, for example, the yield per 100 g. of the desiccated substance obtained by drying the culture material produced by the liquid culture method is about 1 to 2 g. Parasitic fungi on elymus mollis Trin. and related plants and its artificially produced variants belong to the above species of ergot fungi.
Under certain conditions, the power of these fungi to be parasites on the original host degenerates and, along with this, its power to produce ergot alkaloids, especially ergokryptinine, also degenerates. On the other hand, some of the variants still retain the power to produce ergokryptinine in large quantities although they no longer have the power to be parasitic on the original host.
Incidentally, let us say that the morphological distinction of these fungi from: others is difficult.
The culture of the ergot fungus recommended by the process according to the present invention contains, in addition to ergokryptinine, argoclavin, 1 '
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elymoclavine, ergokryptine, ergosinine, ltergometrine and traces or point of other alkaloids. In the case of a solid culture, the ratio of the yields of ergokryptànbw agroclavin and elymoclavin is generally about 100:35:10 and the ratio is almost the same, roughly, in the liquid culture.
However, in the latter case, if the alkaloid yields of the cellular material and the liquid part are measured separately, the ratio of the alkaloid yields of each part varies with the conditions of the culture and, especially, with the quantity and species of nitrogen source, and with the duration of cultivation. Ergokryptine, ergosinine, ergometrine, etc. are generally produced in very small amounts in both cultures.
As regards the culture method, the two cultures,: The liquid and the solid, can be used, but the latter is superior, as regards the yield of ergokryptinine, to the former for the implementation of which one generally uses bagasse or other porous blades soaked in nutrient liquid. Liquid culture is also ex-
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. .eellente in that it can be implemented on a large scale.
In the case of liquid culture, it is advisable to obtain the culture liquid containing ergokryptin successively by the so-called replacement culture method (Pilzdecke).
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The nourishing source of the medium is chosen according to the conditions of culture and the physiological state of the fungus. For example, the foster species is limited in number in some cases and in other cases a great choice is possible.
In the case of replacement cultivation, substances which are difficult to assimilate, for example mannitols are suitable as carbon source and substances which are readily assimilable. such as aspartic acid, glutamic acid, aspargine, glutamine or the ammonium salts of aspartic acid, glutamic acid. succinic acid. fumaric acid. maleic acid, malic acid and tartic acid are suitable as the nitrogen source in the first culture medium. However, in the second culture medium and in subsequent culture media, the constitution of the feeder need not necessarily be the same as in the first medium and the species of feeder can be greatly varied.
In the process according to the present invention, a culture medium of pH 3.2 to 8.4 is suitable for the propagation of ergot fungus, the pH range 6.6 to 6.8 being most suitable. At a pH above or below the 3.2 to 8.4 range, propagation is difficult. The cultivation temperature suitable for the propagation of the fungus is between 10 and 34 C, a temperature in the region of 28 C being the best. The conditions suitable for the spread of the fungus, however, do not coincide with those suitable for the formation of ergot alkaloids. If the spread of the fungus is suppressed somewhat, the yield of alkaloids is favored. This repression is preferably carried out by the following treatments.
A) The quantity of one or more carbon and nitrogen sources and the quantity of inorganic salts in the medium are abnormally increased or other substances which suppress the spread of the fungus are added to the medium, 1 addition being made before inoculation of the fungus or during incubation.
B) The cultivation temperature is kept at a value a little lower than that which is most favorable for the propagation of the fungus.
C) A medium with a pH a little higher or a little lower than that which is best suited to the propagation of the fungus is used. '.' : D) The amount of inoculation of the fungus, the depth of the medium. the variation of the constitution of the feeder the regulation of the air or the irradiation by visible and invisible light etc ... have the same effect. The above methods can be employed separately or in combination.
As for the substances that suppress the spread of the fungus, they are so numerous that their enumeration is almost impossible and does not make sense. To name a few, mention may be made of salts of heavy metals such as manganese, copper and zinc, salts of hydrofluoric acid. hydrochloric acid, hydrocyanic acid and arsenic acid. substituted or unsubstituted aromatic and fatty acids, such as formic acid, monochaloacetic acid. benzoic acid, aminobenzoic acid, phenylacetic acid naphthylacetic acid, substances having an alcohol or phenol hydroxyl group. basic aromatic compounds such as aniline, diphenylamine, indole, quinoline and their derivatives.
aromatic hydrocarbons and antibiotics synthetic or obtained from microbes and other sources. These substances are generally effective in small amounts, for example amounts less than 0.01% of any of them present in the medium are sufficient means for this purpose. The dawn-. Tances such as sodium chloride, which slightly suppresses the spread of the fungus, are obviously used in rather large quantities.
Unlike ergot which has heretofore been employed for the preparation of ergot peptide alkaloids, the culture obtained by the process of the present invention contains an extraordinarily high amount of ergokryptinine as stated above. However, 9 culture does not contain
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no ergacristinine or ergocorninine, the presence of which would have made the separation of ergokryptinine difficult, so that the separation of each alkaloid is extremely easy.
The resulting set of alkaloids are separated from the impurities by the ordinary method and the individual alkaloids are isolated from the set of alkaloids.
The water solubility of ergokryptinine, agroclavin and elymoclavin increases from the first to the last and their partition coefficients between aqueous and organic solvents are obviously markedly different. It follows that they are separated from each other or from impurities by taking advantage of their difference in solubility in water and an organic solvent. or by using their behavior to separate them from their solutions.
The difference in their distribution coefficients between two non-target solvents is also used for this purpose. In addition, dialysis, electrical dialysis, electrophoresis. adsorption by cation exchange resin, etc., are employed for the same purpose, but without much benefit.
To separate alkaloids from solid matter, such as culture obtained by solid culture or from cellular matter obtained by liquid culture, these materials are subjected to extractions, as they are or after low temperature drying and pulverization, by an organic solvent such as ether, benzene, methanol, ethanol, acetone, chloroform and ethyl acetate under acidic, neutral or alkaline conditions after removing, if it is necessary, grease, petroleum or benzine. The extract obtained with an organic solvent immiscible with water is mixed with acidulated water with a pH of less than 4. In the case of the extract obtained with an organic solvent miscible with water,
it is first dried and then treated as above. By alkalizing the acidic solution with ammonia, baking soda or the like, ergokryptinine and the bulk of the agroclavin are separated from it, nearly all of the elymoclavin remaining in solution of which the fraction Elymoclavin is separated by extraction with an organic solvent such as ether or chloroform and then by concentrating the extract.
When the above precipitate is dissolved in a suitable organic solvent such as chloroform and ethyl acetate and then shaken with water, acidulated, only the agroclavin passes into the acidulated water, so that the ergokryptinine fraction is obtained from the solution in organic solvent and the agroclavin fraction separates out alkalizing the acidic water. The agroclavin fraction is also obtained when the aforesaid acidic solution is made alkaline and is shaken with an organic solvent to dissolve the alkaloid contained therein and the solution in the organic solvent is subjected to extraction on the other hand. -current or distribution chromatography. In this case, a small amount of the elymoclavin fraction is recovered.
When the acidic aqueous solution of all the alkaloids, named above, is shaken with an organic solvent such as chloroform or ethyl acetate, ergokryptinine passes into organic solvents, while agroclavin and Elymoclavin remain in the acidic solution. It follows that the ergokryptinine fraction is obtained from the solution in the organic solvent by the concentration and the agroclavin fraction separates from the acidic solution by alkalization and finally the elymoclavine fraction is recovered from the liquor. mother of agroclavin.
The culture obtained by the solid culture and the cell material obtained by the liquid culture are also subjected to the extraction, as is or after removal of the fat, directly by water, acid and the extract, such as. which or after concentration, is made alkaline. The alkaline solution is then either subjected to extraction with an organic solvent immiscible with water or treated with an adsorbent such as Japanese acid clay under acidic conditions and then washed with an organic solvent. Each fraction, namely those of ergokryptinine, agroclavin and elymoclavin, is then separated by the aforementioned methods from these solutions in organic solvents.
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ques.
In another case, the culture obtained by the solid culture and the cell material obtained by the liquid culture are subjected to the extraction with acidulated water and the acid extract is then shaken as it is with an organic solvent such as chloroform. ethyl acetate and others, and most of the ergokryptinine passes into the organic solvent, while most of the agroclavin and elymoclavin remain in the acidulated water.
When the above-mentioned cultured solid substance is carefully subjected to the extraction with water or with an aqueous solvent for many hours, a part of the alkaloids is extracted, which part, however, consists mainly of agroclavin and to elymoclavin, from which each alkaloid fraction is separated, for example, according to their solubility in water.
The liquid part of the culture obtained by the liquid culture is treated as follows.
The liquid as it is or after concentration, is modified to bring it to pH 4 and, after filtering, it is shaken with an organic solvent such as chloroform or ethyl acetate, whereupon the ergokryptinine passes into the organic solvent , while 19agroclavin and elymoclavin remain in the acidic liquid. When the liquid is subjected to extraction with an organic solvent under almost neutral conditions. ergokryptinine and agroclavin pass into the organic solvent, the elymoclavin remaining alone in the liquid.
In another case the liquid is made alkaline, after concentration, if necessary, and then subjected to extraction with an organic solvent immiscible with water. Or, the liquid is treated with an adsorbent such as Japanese acid clay under acidic conditions and then washed with an organic solvent. Each fraction, namely those of ergokryptinine, agroclavin and elymoclavin, is separated from these solutions by the methods employed in the case of solid matter.
Among the separation methods which take advantage of the difference in partition coefficient of a substance between two solvents, countercurrent extraction and partition chromatography are especially important in the process of the present invention. For large scale applications, distribution chromatography is employed in the form of column distribution chromatography.
Countercurrent extraction is generally carried out using acidulated water and an organic solvent immiscible with water. A solution of inorganic or organic acids or other organic substances in water is used as acidulated water.
A buffer solution can also be used for this purpose.
Ether. chloroform, butanol, ethyl acetate, etc., can be used as an organic solvent immiscible with water. To take the extract of all the alkaloids as an example the extract is distributed, for example between water and butanol by the countercurrent extraction and each alkaloid fraction is separated according to its color reaction.
In the case of distribution column chromatography, filter paper or other fibers. alumina, calcium carbonate, silica gel. tar ,,, etc. are employed as a carrier and water or the aqueous solution of organic or inorganic acids as an aqueous solvent, and an organic solvent such as ether, chloroform. ,, butanol , 19 amyl alcohol, water-saturated ethyl acetate or the above acidic solution as an organic developing solvent. Carriers, aqueous solvents or organic developing solvents are suitably combined and their species are of course not limited to the above substances.
The developing solvent can be made to flow freely or with the aid of suction.
When the extract of all the alkaloids is developed by column distribution chromatography ,. three zones, namely those
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ergokryptinine, agroclavin and elymoclavin are formed in the column.
The products from the zones are removed separately and subjected to extraction with an organic solvent or acidulated water, or the alkaloids from the zones are removed: separately by washing.
Distinctions between zones are made on the basis of fluorescence rather than color reactions.
The fractions of ergokryptinine, agroclavin and elymoclavin obtained by the methods mentioned above still contain certain impurities; it follows that a subsequent purification must be carried out to obtain them in their pure state.
For example, the ergokryptinine fraction is dissolved in an organic solvent such as benzene, ethyl acetate or chloroform, and the solution is shaken with water, alkaline such as sodium or caustic potash solution and ergokryptinine remains in the organic solvent, while impurities such as ergosinine, ergokryptine and others pass through alkaline water.
When the organic solvent solution is evaporated to drying and then treated with an organic solvent such as methanol, ergokryptinine is obtained in crystalline form.
Alternatively, the ergokryptinine fraction is dissolved in an organic solvent immiscible with water and the solution is shaken with acidulated water to dissolve the alkaloids contained therein. The acidic solution is made alkaline and the resulting precipitate is dissolved, after drying, in an organic solvent such as methanol, ethanol, ethyl acetate and the solution is concentrated, whereupon ergokryptinine is obtained in crystalline form.
The agroclavin fraction is dissolved in an organic solvent, such as ether or ethyl acetate under alkaline conditions and the solution is concentrated, after drying, and the agroclavin separates after standing. Or the agroclavin fraction is dissolved in an organic solvent miscible with water, such as methanol, ethanol or acetone, and the solution receives water to separate the agroclavin in crystalline form. The agroclavin fraction is also purified by converting the agroclavin to its salt and then releasing it from the solution of the salt with alkali.
The elymoclavin moiety is dissolved in a suitable amount of an organic solvent which readily dissolves the elymoclavin, such as acetone, methanol or ethanol, and insoluble impurities are removed by filtration.
Elymoclavin thus purified to a certain extent can be crystallized and recrystallized from an organic solvent such as benzene, ether, chloroform. ethyl acetate, acetone, methanol or ethanol or even water. Or the elymoclavin of its fraction is first converted to its salt and then it is liberated from the solution of the salt with alkali and finally purified by treatment with an organic solvent or by crystallization of. an organic solvent.
As said at the start of the description, Elymoclavine is a novel ergot alkaloid and has the following properties.
It crystallizes from benzene, chloroform, ether, ethyl acetate, acetone, methanol. ethanol or water in colorless prisms. The crystal obtained from methanol is a monoclinal prism whose monoclinic axial angle / 3 = 90, and the refractive indices for the D line, Ó '= 1.62, ss = 1.75. It melts by decomposing at 248 to 252.
[Ó] 20 = -59. [Ó] 20 = -98 (ethanol). [Ó] 20D = -136. [Ó] Hg = -166 (pyridine). It has an H-CH3 group in its molecule and its analytical examination indicates the formula C16H18CN2. Like agroclavin, elymoclavin presents
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te the maximum of its absorption spectrum around 282 mu and the minimum around 246 mu. It precipitates with tungstic acid, Meyer's reagent and other alkaloidal reagents and it is readily soluble in various organic and inorganic acids and the solutions give not only the Keller reaction but also the red color reactions respectively. -
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geish and blue with the solutions of vanilin and pmd.imethylau.3.nobenzaldehyde in sulfuric acid.
It is readily soluble in pyridine, dissolved in acetone, methanol, ethanol and butanol, moderately soluble in 2 benzene, toluene, chloroform and ether and insoluble in petroleum ether and ligroineo It is well soluble in cold water and the solution gives an alkaline reaction. It is sensitive to light and its solutions in various solvents turn brown and acquire fluorescence. Like agroclavin, elymoclavin does not give an isomer when treated with an acid or an alkali.
It is hydrogenated to a dihydro compound, point of fus. (decomp.)
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239 â, 4p CD [e (] 24 = -143 [o <¯1.24 m -182 (pyridine). When elymocla-
D. Eg vine is developed by the top-down method on Toyo N 131 filter paper at 24 C for a period of 13 to 15 hours by a developing solvent prepa-
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When shaking a mixture of 4 parts of n-butanol, 5 parts of water and 1 part of acetic acid and removing the lower layer, a dot is formed at the value 0.67 of Rf. Sometimes a fluorescent spot at the Rf value 0.59
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is due to the decomposition products of 19elymoclavin.
Incidentally, the Rf values of lysergic acid, agroelavine ergomerin9 and ergokryptine are respectively, under the same conditions, 0.50, 0.68, 0.82 and 0.92.
Elymoclavin evidently exhibits the physiological activity of a taste alkaloid and produces an exciting effect on the separated uterus of the rabbit, even at a dilution of 1: 10,000,000.
Example 1
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lJil2 - 1 of a culture medium consisting of mannitol (5%), ammonium glucamate (1%) magnesium sulfate (01103%) and piped water, adjusted to a pH of 5.2 per liter. hydrochloric acid, is placed in a 3-1 flat-bottomed flask.
The culture medium is inoculated with a trace of the er-got parasitic fungus on Elymus mollis Trin. and then subjected to the surface culture at 26 C. After 40 days, the culture liquid is poured out and acidified with sulfuric acid and the remaining cellular material is separately subjected to extraction several times with acid. diluted sulfuric acid.
The combined acidic liquids are shaken with Japanese acid clay to absorb the alkaloids contained therein and the adsorbent is moistened.
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ammonia and repeatedly extracted with ether. The combined extracts are concentrated and then shaken with several parts of one tenth of its volume of a 1 to 3% solution of succinic acid in water. The acidic solution is made alkaline to about pH 8 by ammonia and the resulting precipitate is separated from the mother liquor (A) by filtration.
The precipitate is dissolved in a fairly large amount of chloroform, and the solution is shaken with 3 parts of one third of its volume n / 10 di-sulfuric acid to remove substances soluble in the acid solution. The acidic solution (B) is set aside and the solution in chloroform is evaporated, after drying with calcium chloride, the evaporation being carried out until drying and the residue is dissolved in benzene under ammoniacal alkaline conditions. .
The solution in benzene., After shaking it with a 1% solution of caustic soda to remove the substances soluble in the alkali solution (the alkaline solution (G) is set aside), is
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evaporated to dryness and to the residue is added methanol and solution dropwise. after filtering off the insolubles, is concentrated, which separates the argokryptin in crystalline form on standing.
The yield is about 260 mg. The mother liquor (A) is shaken together
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taken up with ether and the ether solution is concentrated and shaken several times with a small amount of n / 10 sulfuric acid. The combined acid solutions are made alkaline by sodium bicarbonate and the resulting precipitate (D) is removed by filtration. The mother liquor is repeatedly shaken with benzene, and the solution in benzene is concentrated to 20 cc.
The concentrated solution is left to stand for some time in a cool place and the resulting precipitate is removed by filtration and the mother liquor is left to stand at room temperature, whereupon the elymoclavine separates out in crystalline form. The elymoclavin thus obtained is dissolved in a little hot acetone and the solution is concentrated, after filtering off the insolubles, and the separated crystals are further purified by washing with a little cold acetone. and by recrystallization from ethyl acetate. The yield is about 6 mg.
The acidic solution (B) is made alkaline by ammonia and the resulting precipitate is separated from the mother liquor (E). The precipitate is dissolved in acetone and the solution, after filtering, is concentrated and then distilled water is added to it until it becomes cloudy, and is then left to stand at room temperature, whereupon agroclavin separates in crystalline form.
The crystals are then dissolved in hot ethyl acetate and the solution is concentrated, after filtering off the insoluble matter, whereby pure agro-clavin is obtained in crystalline form. The yield is about 90 mg.
The following are recovered in small quantities: agroclavin from the precipitate (D), elymoclavin from the mother liquor (E) and ergokryptine, ergokryptine and ergosinine from the alkaline solution (C).
Example 2
1.3 - 1 of a culture medium consisting of mannitol (5%), ammonium glucamate (0.8%). potassium biphosphate (0.1%). magnesium sulfate (0.03%) and piped water, adjusted to pH 5.2 with hydrochloric acid, is placed in a 3-1 flat-bottomed flask. The culture medium is inoculated with the ergot fungus, cultivated and treated almost as in Example 1. The solution in ether of all the alkaloids, obtained by subjecting the adsorbent to extraction !, is concentrated to 1-1. and shaken several times with 50 cc of a 1-3% solution of citric acid in water.
The acidic solution is made alkaline and shaken again with ether and the ether solution is evaporated to remove the ether completely. The residue is dissolved in hot alkaline ammoniacal acetone, and the solution is concentrated to one third of its volume and filtered after standing in a cool place. The filtrate receives a large amount of water, and the resulting precipitate (A) is filtered off and the filtrate is repeatedly shaken with pure ether. The combined ether solutions are evaporated to dryness under reduced pressure and the resinous residue is dissolved in boiling benzene and the solution is filtered and concentrated.
The concentrated solution is cooled rapidly and the resulting precipitate is filtered off and the filtrate is allowed to stand at room temperature, whereupon the elymoclavin separates out. A small amount of agroclavin is recovered from the mother liquor.
The precipitate (A) is dissolved in hot alkaline ammoniacal alcohol and the solution is filtered and receives a large volume of distilled water and the resulting precipitate (B) is removed by filtration. The filtrate is shaken several times with pure ether and the combined ether solution is evaporated to dryness under reduced pressure and the resinous residue is dissolved in boiling benzene and the solution in benzene, after fil- trage. is concentrated and allowed to stand, whereupon the elymoclavin separates.
We recover a little agroclavin, from the mother liquor. The combined elymocclavine is washed with a small amount of cold acetone and recrystallized from alcohol to give the pure product. The yield is 6 mg.
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The precipitate (B) is dissolved in ethyl acetate and the solution, after shaking several times with diluted acetic acid, is evaporated to dryness under reduced pressure (the solution diluted in acetic acid ( C) is set aside). The residue is dissolved in benzene under ammoniacal alkaline conditions and the solution, after being shaken several times with a little caustic potash solution, is evaporated to dryness (the alkaline solution (D) is set apart). The residue.
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consisting of ergokcyptininea is treated with methanol and then purified by recrystallization as in Example 1. The yield is 180 mg.
The acidic solution (C) is made alkaline by ammonia and the resulting precipitate is dissolved in half its weight of a concentrated solution of succinic acid. Agroclavin separates from solution under
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me of succinate, from the solution of which lyagroclavlne is precipitated by alkallnization with ammonia.
The precipitate is dissolved in a little methanol and the solution receives distilled water to give agroclavino crystals. The yield is about 45 mg.
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A small amount of ergokryptine and ergokryptinine is recovered from the alkaline solution (D).
Example 3.
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12 - 1 of a culture medium consisting of mannitol (5), aspargine (1fl5) fl potassium biphosphate (091%) 9 magnesium sulfate (0.05%) and piped water, adjusted to pH 5.4 by sulfuric acid, is placed in a flat-bottomed flask of 3-la culture medium after inoculation with a trace of parasitic ergot fungus on Elymus mollis Trin. is subjected to the surface culture at 26-28 Ce After 36 days, the culture liquid is separated from the cellular material and the cellular material is washed with 10 n / 10 sulfuric acid until the lye does not gives more alkaloid reaction.
The culture liquid is combined with the lye, made alkaline with ammonia, and subjected to extraction twice with ether, using an ejector. The ether extract is concentrated and then shaken several times with about one tenth of its volume of dilute acetic acid. The acidic solution is shaken by two parts
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about half of its volume of chloroform and ergokryptinm passes into the chloroform agroclavin and the remaining elymoclavin in the acid solution (A). The chloroform solution, after drying with calcium chloride, is evaporated to drying and the residue is treated with ether under ammoniacal alkaline conditions.
The ether solution is repeatedly shaken with a small amount of n / 10 acetic acid and the acidic solution is adjusted to pH 8.0 with ammonia and the resulting precipitate is filtered off. After drying, the precipitate is dissolved in a fairly large quantity of hot methanol and the solution is filtered, concentrated and left to stand.
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pos at room temperature whereupon the crude ergokryptinin separates which is purified by recrystallization from ethyl acetate. The yield is about 20 mg. A small amount of ergokryptine fl 9 ergokryptin3ne and ergosinin is recovered from the mother liquor.
The acidic solution (A) is made alkaline by ammonia and, after filtering off the resulting precipitate (B), it is repeatedly shaken with benzene, and the benzene solution is concentrated and filtered while it is still hot. When the filtrate is left to stand
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at room temperature the crystals of Olympelavin separate and adhere to the bottom of the vessel, while the impurities settle as a light precipitate; they are therefore separated by decanting the liquid.
The crude elymoclavin thus obtained is washed with cold benzene and dissolved in hot chloroform and the solution is filtered, concentrated and left to stand.
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rest to give pure elymoclavin. The yield is about fl0 mg4 The precipitate (B) is dissolved in ether under ammoniacal alkaline conditions and the solution, after drying with sodium sulfate, is concentrated to
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give agroclavin, which is further purified by recrystallization from ether. The yield is about 80 mg.
Example 2-1. of a culture medium consisting of mannitol (5%), aspartic acid (0.8%), potassium biphosphate (0.1%), magnesium sulphate (0.05%) and piped water, regulated at pH 5.0 with 30% ammonia, is placed in a 3-1 flat-bottomed flask. The culture medium, after inoculation with a variant obtained from the parasitic ergot fungus on Elymus mollis Trin. by irradiation with radium, is subjected to surface culture at 26-28 C.
After 32 days, the culture liquid is poured out and the underside of the cellular material is washed with a solution (pH 5.0 approx.) Of succinic acid in water until the lye no longer gives an alkaloid reaction. Cellular material is subjected to the so-called "replacement culture" using a new suitable culture medium.
The culture liquid is combined with the lye, rendered alkaline by ammonia and subjected twice to extraction with benzene, using an ejector. The extract is concentrated and repeatedly shaken with a small amount of 3% diacid lactic acid solution. The acidic solution is made alkaline by sodium bicarbonate and the resulting precipitate is filtered (mother liquor (A) is set aside). The precipitate is dissolved in an adequate amount of n-butanol at room temperature and the solution is poured into a glass column of about 45 cm. about 10 cm high and wide, which contains a stack of 1.6 kg of pure potato starch mixed with 2 ml of distilled water.
When the butanol solution has soaked into the layer of starch, a developing solvent, prepared by carefully shaking a mixture of 4 parts n-butanol, 1 part acetic acid and 5 parts water distillate and removing the layer. lower, is allowed to pass freely from the top of the starch layer. After 18 hours the solvent which is on the starch layer is discarded and the column is left standing for some time, until the solvent reaches about 20 cm. from above the starch layer. When the column is observed under ultraviolet rays, there are several areas of fluorescence.
The lower fluorescent blue-purpurine zone, between 10 and 15 cm. from the top of the starch layer, is sliced and separately subjected to extraction several times with the least possible 10% acetic acid. The extract is shaken with ether to remove butanol and the extract is made alkaline with ammonia, and the resulting precipitate is filtered. The precipitate is dried, dissolved in a large amount of hot ethyl acetate and, after removing insolubbles by filtration, concentrated, whereupon the crude ergokryptinine separates which is purified. further relied upon by recrystallization from methanol. The yield is 230 mg per 1-1. culture fluid.
The part between 7 and 9 cm. approximately from the top of the starch layer, which includes the yellowish green and purpurine blue fluorescent areas is cut and repeatedly extracted with as little sulfuric acid as possible n / 10 and 1 ' extract is processed as above. The resulting precipitate is dissolved in ether under ammoniacal alkaline conditions and the ether solution, after drying, is concentrated and shaken several times with a solution of 1 to 3% succinic acid.
The ether of the acid solution is removed and the acid solution is made alkaline with ammonia and the resulting precipitate is filtered off. As in the case of Example 1, the precipitate is dissolved in acetone and the solution is given water to precipitate the agroclavin which is further purified by recrystallization from ethyl acetate. The yield is 80 mg per 1-1. culture liquid. The mother liquor (A) is treated like the mother liquor (A) of Example 1 to give the elymoclavin.
The yield is about 5 mg per 1-1. culture fluid. In this case, a small amount of agroclavin is also recovered as in Example 1.
We recover from the part between 5 and 7 cm. approx from above
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from the starch layer a small amount of elymoclavin if treated as in Example 5.
Example 5
The superficial vegetation culture of the ergot fungus is carried out at 26 to 28 ° C. using the same medium and the same layer as in the case of Example 1.
After 35 days, the culture liquid is separated from the cellular material and extraction with dilute sulfuric acid, adsorption with Japanese acid clay and washing with ether are carried out as in Example 1. .
The ether solution is concentrated and repeatedly shaken with one tenth of its volume of n / 10 sulfuric acid, and the resulting precipitate is separated. The acidic solution is adjusted to pH 4.2 with ammonia and the resulting precipitate is separated from the mother liquor. The precipitate combined with the above precipitate is dissolved in a little acetone and the solution receives a large amount of water and the resulting precipitate (A) is separated from the mother liquor.
The mother liquor is combined with the above mother liquor, made alkaline by ammonia and then shaken several times with ether. The ether solution is evaporated to remove the ether completely and the residue is dissolved in n-butanol.
The solution in butanol is poured into a glass column of about 45 cm. high and wide 10 cm., containing a stack of the 6 kg of pure potato starch kneaded with 2-1. 5% acetic acid When the butanol solution has penetrated the starch layer, the same solvent as in Example 4 is allowed to flow for 16 hours. At the end of this time, the solvent on the starch layer is discarded and the column is left standing until the solvent no longer drains from the lower end of the column.
As in Example 4, five fluorescent zones are found and the large mass of elymoclavin is contained between the second and third zone, which are sliced and shaken several times with a small amount of n / 10 sulfuric acid containing a little bit of n-butanol. The butanol contained in the acid solution is removed and the acid solution is made alkaline with ammonia and shaken several times with ether. The ether solution is evaporated to dryness and the residue is dissolved in a large quantity of boiling benzene. After filtering off the insoluble matter, the benzene solution is evaporated to dryness and the crystalline residue receives acetone.
The acetone solution, after filtering off the insolubles, evaporated almost to dryness, whereupon a few crystals separated from the resinous residue. The crystals are washed off with acetone and dissolved in hot ethyl acetate and the solution is concentrated, whereupon the elymoclavin separates on standing. The yield is about 10 mg. The fluorescent area below is treated as in Example 4 and about 130 mg of ergokryptinin and some ergokryptine are obtained in crystalline form.
From the part between the top of the bottom area and the following fluorescent areas yellowish green -and purpurine blue. approximately 80 mg of agroclavin is recovered by the treatment of Example 4. From the precipitate (A) approximately 100 mg of ergokryptinine and a little ergokryptine are obtained in crystalline form.
Example 6
The cellular material obtained in Example 3, washed until asceticism, is floated on 1.2-1. a sterilized solution consisting of glucose (6%), ammonium succinate (0.8%), potassium biphosphate (0.1%), magnesium sulphate (0.03%) and tap water, set at pH 5.4 with succinic acid ,,, and the whole is subjected to culture. stationary at 24-26 C. After 22 days the culture fluid is separated from the cellular material and the cellular material is repeatedly extracted with n / 10 acetic acid.
The acid extract is combined with the culture liquid made alkaline by ammonia and subjected to extraction twice.
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by the ether by making use of an ejector. The ether solution is evacuated. porée to remove the ether completely and the residue is dissolved in n-butanol. The butanol solution is poured into a glass column of about 40 cm. height and width of about 5 cm., containing a stack of 360 g of pure potato starch mixed with 420 cc of 5% acetic acid. When the butanol solution has penetrated the starch layer, the solvent used in Example 3 is allowed to flow from the top of the starch layer for 16 hours.
Five fluorescent zones form in the starch layer. The fluorescent zone below, purpurine blue, between about 10 cm. and 14 cm. from the top of the starch layer is cut off and repeatedly subjected to extraction with a small amount of 10% acetic acid. The acidic extract is shaken with ether to remove the butanol and made alkaline with ammonia and the resulting precipitate is filtered. The precipitate is dissolved in benzene under ammoniacal alkaline conditions and the solution, after it has been shaken twice with one tenth of its volume of a 1% solution of caustic soda, is evaporated to dryness. .
The residue is dissolved in as little ethanol as possible and the solution is filtered and concentrated to a very small volume, whereupon the ergokryptinin separates after standing in a cool place. The ergokryptinine thus obtained is then dissolved in methanol and the solution, after concentration, is left to stand at room temperature to give pure ergokryptinine.
The yield is 210 mg. The area between 4 and 7 cm. from the top of the starch layer is sliced and repeatedly subjected to extraction with a small amount of n / 10 sulfuric acid. The acidic extract is shaken with ether to remove the butanol contained in the extract, made alkaline with ammonia and repeatedly shaken with ether. The ether solution is evaporated to drying and the residue is dissolved in boiling benzene and the benzene solution is filtered and left to stand in a cool place. The resulting precipitate is removed by filtration and the filtrate is concentrated and allowed to stand at room temperature, whereupon the elymoclavin separates. The yield is about 10 mg.
The area between about 7 and 9 cm. from the top of the starch layer is subjected to extraction with dilute sulfuric acid, taken up in ether and shaken with acidulated water as in Example 4.
The acidic solution is made alkaline by ammonia and the resulting agroclavin precipitate is further purified by converting it to acid succinate, and then pure agroclavin crystals are obtained as in Example 2. The yield is about 70 mg.
CLAIMS.
1. A method of producing ergot alkaloid, which comprises the saprophytic cultivation of ergot fungus so as to produce in culture extraordinarily large quantities of ergokryptinine, as a result of which d9Frgot alkaloids containing ergokryptinine, 1-9agroclavin and elymoclavin are produced and culture separation from a member selected from the group consisting of ergokryptinin, agroclavin and elymoclavin.
2. A method of producing the ergot alkaloid according to claim 1, wherein the saprophytic culture is carried out as a surface culture.
3. A method of producing the ergot alkaloid according to claim 1, wherein the ergot fungus, which is selected from a group consisting of parasitic ergot fungi on Elymus mollis Trin .. related plants and their related plants. variants, and which is such as to produce extraordinarily large amounts of ergokryptinin in cultivation, is cultivated by surface culture.
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