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PROCEDE DE PREPARATION DE MATIERES THERAPEUTIQUES ET PIUS PARTICULIEREMENT
DE LA VITAMINE B.12.
La présente invention concerne un développement nouveau et un per- fectionnement du procédé décrit dans le brevet belge n 488.271.
Le brevet antérieur concerne un procédé de préparation de la vita- mine B12 à partir de préparations de foie actives à l'égard de L.L.D. et de produits d'élaboration de Streptomyces griseus.
On a découvert maintenant qu'on obtient des résultats supérieurs, particulièrement en ce qui concerne le rendement en vitamine B12 purelors- qué la matière de départ qu'on soumet à une extraction et qu'on purifie pour récupérer des concentrés de vitamine B12, est un concentré brut actif à l' égard du L.L.D., composé de façon prédominante d'un produit d'élboration de variétés de Streptomyes griseus produisant de la griséine ou de la Strep- tomycine.
On a également découvert qu'on peut obtenir la vitamine B12 comme sous- produit de la fabrication des antibiotiques streptomycine et griséine.
Une façon de procéder consiste à préparer le concentré brut-de départ en cultivant dans un milieu nutritif approprié une variété des micro- organismes Stroeptomyeces grisseus qui produise outre la griséine, des ingré- dients actifs à l'égard du L.L.D. dont on peut séparer la vitamine B12 com- me décrit dans cette spécification, en adsorbant la matière active du bouil- lon de culture à 1:1 aide d'un adsorbant approprié, du charbon de bois activé de préférence, en lessivant la fraction adsorbée au moyen d'un solvant ap- proprié tel qu'une solution aqueuse de pyridine ou un produit de substitu- tion alkylé de la pyridine et en concentrant la lessive brute, à siccité.
On a découvert que ces concentrés contiennent en plus de la griséine, des ingrédients actifs à l'égard du L.L.D. qui conviennent pour séparer la vi- tamine' B12 par le procédé revendiqué.
Par le traitement proposé, on élimine la griséine éventuellement présente dans le concentré de départ et les produits qu'on obtient en sont
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exempts.
On a également découvert qu'il est possible de récupérer la vi- tamine B12 des concentrés préparés en cultivant une variété de Streptomyces griseus qui produise en plus de streptomycine, des ingrédients actifs à l' égard du L.L.D. dont on peut séparer la -vitamine B12. Il est avantageux en pratique, de séparer et de récupérer la streptomycine avant d'effectuer le procédé relatif à la vitamine B12, en mettant le bouillon en contact avec une résine échangeuse d'ion dont la capacité d'échange provienne d'un grou- pe carboxylique grâce auquel ladite résine adsorbe la streptomycin,e On trai- te le bouillon dont on a éliminé la streptomycine à l'aide d'un adsorbant comme le carbone, on lessive la fraction adsorbée avec de la pyridine en so- lution aqueuse et on évapore la lessive jusqu'à un petit volume.
On précipi- te alors le concentré brut qu'on utilise comme matière de départ dans le procédé proposé, par dilution de la lessive.concentrée avec du méthanol et par addition d'éther.
Lorsqu'on utilise les concentrés contenant la vitamine B12 et la streptomycine sans éliminer d'abord la streptomycineon débarrasse le bouil- lon de l'organisme propagateur, on le traite par le carbone et on lessive la vitamine B12 de la fraction adsorbée par le carbone avec de la pyridine. Le procédé proposé élimine la streptomycine éventuellement présente dans le con- centré de départ utilisé et les produits obtenus en sont exempts.
Les pro- duits contenant la vitamine B12 décrits dans cette spécification sont par conséquent exempts de streptomycine aussi bien que de griséine. On peut ex- traire le concentré brut obtenu de cette façon, à l'eau ou au moyen d'un al- cool aliphatique inférieur soluble dans l'eau, l'alcool méthylique de pré- férence. Le choix du liquide d'extraction est déterminé par la manière adsor- bante à utiliser dans le fractionnement chromatographique.
Dans la pratique de cette invention, on peut utiliser divers ad- sorbants comprenant le carbone activé, l'alumine activée et les matières semblables. L'alumine est l'adsorbant préféré pour la ou les étapes chroma- tographiques. Lorsqu'on utilise des colonnes chromatographiques contenant du carbone, on emploie des extractions aqueuses et des extractions à l'aide d'alcool aliphatique inférieur soluble dans l'eau lorsque les colonnes sont constituées d'alumine activée. On charge de préférence la colonne à l'état humide par remplissage avec l'adsorbant et le solvant utilisé dans l'extrac- tion et par drainage subséquent du solvant jusqu'à ce que son niveau attei- gne le sommet de la matière adsorbante dans la colonne. Il est commode d'u- tiliser comme support de l'adsorbant une toile métallique recouverte d'une couche de sable.
Lorsqu'on utilise une colonne d'alumine pour la chromatographie, on verse l'extrait alcoolique, méthanolique de préférence, à la surface su- périeure de l'adsorbant dans la colonne et on le laisse s'écouler à travers l'adsorbant soit par gravité soit sous pression. On développe ensuite la colonne au moyen de quantités supplémentaires de solvant d'extractions pour développer dans la colonne des zônes de matière adsorbante contenant la vi- tamine B12 en quantités différentes et à différents degrés de pureté et on recueille les fractions convenables de la lessive au fur et à mesure que les zones sortent du fond de la colonne. On concentre séparément ou en mélange en mélange en un sirop épais les fractions présentant une activité suffisan- te révélées par un examen microbiologique ou en vertu de leur couleur rose.
On mélange ensuite ce concentré avec un alcool aliphatique inférieur et on ajoute un liquide non sissolvant miscible comme l'acétone dans lequel la substance active est insoluble. On recueille le précipité rouge floconneux qui se forme.
On peut purifier davantage le précipité rouge floconneux en le dissolvant dans un dissolvant de la vitamine B12 tel que l'alcool éthylique ou l'alcool méthylique ou l'eau, et en le précipitant au moyen d'un liquide miscible ne dissolvant pas la vitamine B12, tel que l'acétone, une ou plu- sieurs fois. Pendant ce traitement on peut filtrer la solution si elle n'est pas limpide avant d'ajouter le réactif de précipitation, pour en éliminer
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les impuretés insolubles; le nombre de ces précipitations et de ces traite- ments désirables varie avec les différents lots. L'absence de couleur bru- nâtre ou jaunâtre dans le liquide qui surnage après la précipitation four- nit une indication quant au nombre de précipitations utiles.
Dans quelques cas,, après plusieurs de ces traitements, on peut cristalliser la vitamine B12 d'une solution aqueuse en ajoutant de l'acétone jusqu'au point de tur- bidité commençante et en laissant se former des cristaux aciculaires rouges.
Cependant, lorsqu'on désire un produit cristallin d'une grande pureté, il est souvent désirable de soumettre le produit provenant du pre- . miel' fractionnement chromatographique (soit avant soit après une ou plusieurs étapes de précipitation mentionnées ci-dessus) à un second fractionnement
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l omatograph3quea On effectue ceci en dissolvant le produit amorphe dans un alcool aliphatique inférieure On peut alors introduire la solution dans une seconde colonne dalumine activée et on peut recueillir les fractions les plus actives de la lessive décelées comme'ci-dessus et les concentrer à sic- cité. On peut dissoudre le résidu ses dans de l'alcool méthylique et ajouter à la solution de 1?acétone qui provoque la séparation d'un précipité rouge de vitamine B12.
On peut dissoudre ce précipité dans de l'eau et ajouter à la solution de l'acétone qui provoque la séparation de cristaux rouges. On peut recristalliser de façon répétée la vitamine B12 d'une solution eau acé- tone pour éliminer toutes les impuretés qui subsistent encore.
La vitamine B12 obtenue dans un état de pureté substantielle, con- formément à cette invention, est un composé rouge dont l'analyse suivante donne une composition type approximative déterminée sur deux échantillons
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séchés sous vide pendant deux heures à 100cor s 056.3556.116.726.72 N1lo511Lo75f2427; Colol.2408o On pense que la totalité de la différence entre la somme des pourcentages'donnés et 100% en substance est constituée par de l'oxygène. L'analyse spectrale n'indique pas la présence d'autres métaux.
La vitamine B12 possède à peu près la formule empirique
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approximative basée sur l'analyse précédente - ,,6l-54TT86-92.J-13rr, La vitamine B12 est substantiellement soluble dans l'eau, l'alcool méthy- lique, l'alcool éthylique, et le phénol et substantiellement insoluble dans
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!-'acétone, l'éther et le chloroforme'. La vitamine B12 possède un coeffi- oient de partage apparent d'environ l0%6 dans le système; 75% de toluène- 25% do thoorésol/eauo On a trouvé que la vitamine B12 a un coefficient de partage d'environ 1 2 dans le système eau/alcool b--nzylique.
La vitamine B12 cristallise à partir de solutions appropriées telles que l'acétone aqueux en cristaux rouges ayant les propriétés cris-
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tallographiques suivantes; indices de réfraction, Io 619; Io 6.9; Tp 659o Les cristaux de la vitamine B12 neont pas de point de fusion défini mais foncent à environ 2:020'C Le spectre cpadsorption de la vitamine B12 est caractérisé par des maxima a 27 80 (Elem 114.7) à 36Io ) (E = 203-5) et 5500 1 Iem Ism (EI = 62 7) Le spectre ne change pas de façon marquée par un changement ivom de pH; en solution acide, lintensité de la bande de 3610 diminue d9envi- ron 10% et en solution alcaline, il y a d'autres petits changements et la structure fine se marque moins.
Le spectre d'absorption infra-rouge a été déterminé avec un ré=-
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fractomètre PerI.nmElr 12A soigneusement calibré. On a observé les maxi- ma d'adsorption suivants
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<tb> Longueur <SEP> d'onde <SEP> en <SEP> Mu <SEP> (10-4cm)
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<SEP> 10.00 <SEP> S
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<tb> 12.35 <SEP> M
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S.M. et W signifient forte, moyenne et faible intensités d'absorption.
La vitamine B12 possède une grande valeur thérapeuthique dans le traitement de l'anémie pernicieuse d'Addison et d'autres anémies macrocyti- ques. Les doses requises varient selon le cas particulier et dépendent de la sévérité et de la durée de la condition pathologique et de la réponse thérapeuthique du patiento On estime que la dose effective minimum adminis- trée par voie intramusculaire sous la forme d'une solution aqueuse saline ou isotonique est approximativement I microgramme par jour ou des multi- ples de cette quantité à intervalles plus longs, par exemple approximative- ment 7 microgrammes par semaines.
Il existe dans la littérature des compte-rendus de recherches cliniques sur la thérapie de la vitamine B12 dans le traitement des anémies macrocytiques : Spies, T.D. Stone, R.H., Garcia Lopez.G., Milanes, F., Lopez Toca, R. et A- ramburu, T., "Thymine, Folie Acid, andVitamin B12 in nutritional Macrocytic Anemia, Tropical Sprue, and Pernicious Anemia," Lancet, 2.519-522, October 2919480
Hall, B.E., et Campbell, D.C., "Effect of Vitamin B12 On the Hema- topoietic and Nervous Systems in Addisoniam Pernicious Anemia", Journal of Laboratory and Clinical medicine, 33,:
1646, December 19480
La vitamine B12 pure possède une valeur thérapeutique tellement élevée dans le traitement des anémies macrocytiques que l'on peut employer un concentré de vitamine B12 provenant de sources microbiologiques en con- formité avec le procédé proposé et contenant une quantité aussi faible que 65.000 unités de L.L.D./mg. ou seulement environ 0,6% de vitamine B12, dans le traitement de l'anémie pernicieuse. Pour autant qu'on le sache ce concen- tré est beaucoup plus puissant que n'importe quel concentré contre l'anémie pernicieuse précédemment disponible L'administration par voie buccale d' une dose unique de concentré à 3% de vitamine B12 équivalent à 600 micro- grammes de vitamine B12 a produit une réaction hématologique maximum chez un patient.
Chez un autre, une quantité de concentré à 5% équivalent à 25 microgrammes s'est montrée active au point de vue hématopoiétique après injection par voie intramusculaire en une dose unique. On avait préparé cette matière pour injection en dissolvant le concentré de vitamine B12 dans une solution saline,, On a déterminé l'activité des produits mention- nés dans cette demande par une méthode d'essai de réaction de croissance microbiologique qui utilise le Lactobacillus lactis Dorner comme organisme de test, On donne ci-dessous une brève description de la méthode d'essai qui
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a été utilisée.
On a signale que le Lactobacillus lactis Dorner exige deux fac-
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teurs de croissance, T,J. et LL.D. Des modifications de milieu introduites dans la formule décrite ci-dessous ont éliminé la nécessité du facteur T.J. et l'essai tel qu'il est présenté est spécifique de L.L.D. Ce microorganis- me révèle la réaction du facteur L.L.D. à la vitamine B12. On utilise la vitamine B12 cristallisée comme standard de l'essai et on évalue toutes les inconnues en terme d'activité microbiologique favorisant la croissance, é- quivalent à l'activité microbiologique de la vitamine B12,
On peut se procurer l'organisme Lactobacillus lactis Dorner, A.
T.C.C. 10, 697, utilisé dans cette méthode d'essai dans la collection amé- ricaine de culture type. On maintient des cultures de réserve de l'organis- me dans un milieu de croissance qui consiste en :
I% d'extrait de ferment Difco 0.02% de sérum de jus de tomate
I% de dextrose anhydre
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1.5% d'agar.
Le milieu utilisé pour l'inoculation consiste dans le milieu de base ou milieu d'essai auquel on a ajouté I unité de vitamine B12 par ce.
On lave les cellules d'inoculation avec de l'eau distillée stérile et on les dilue pour former une suspension donnant, au photomètre d'Evelyn, une lectu- re comprise entre 90% et 95% de transmission lumineuse, avec un filtre de 520 mu.
La composition du milieu d'essai, de force double est énumérée ci-dessous. On peut sans inconvénient prélever les ingrédients de solutions de réserves
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<tb> DL <SEP> isoleucine <SEP> 200mg <SEP> Dextrose <SEP> 10 <SEP> gm
<tb>
<tb> DL <SEP> alpha-alanine <SEP> 200mg <SEP> acétate <SEP> sodique <SEP> 6 <SEP> gm
<tb>
<tb> DL <SEP> acide <SEP> aspartique <SEP> 200mg <SEP> acide <SEP> fumarique <SEP> 0.5 <SEP> gm
<tb>
<tb> DL <SEP> valine <SEP> 200mg <SEP> Ethyloxalacétate <SEP> sodique0o5 <SEP> gm
<tb>
<tb> riboflavine <SEP> 200mcg.
<tb>
<tb>
DL <SEP> methionine <SEP> 200mg <SEP> pantothenate <SEP> calcique <SEP> 200mcg.
<tb>
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Il acide glutamique 200mg thiamine HOl 200go DL threonine 200mg acide nicotinique 200mcg. DL serine 200mg P.1ridoxamin 400mcg.
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<tb> DL <SEP> phenylalanine <SEP> 200mg <SEP> Acide <SEP> para-amino <SEP> benzoique <SEP> 40mcg
<tb>
<tb> DL <SEP> leucine <SEP> 200mg <SEP> Biotine <SEP> 0,4mcg
<tb>
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L histidine 200mg MgSOIo'7H20 200 mg.
Il tryptophane 400mg NaC 1 10 mg.
L arginine 200mg Fes04o7HZO 10 mg. lysine 100 mg MnSOl,H20 10 mgo
EMI5.7
<tb> acide <SEP> amino <SEP> acétique200 <SEP> mg <SEP> @
<tb>
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cystine 200 mg K2HP04 500 mga
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<tb> DL <SEP> norleucine <SEP> 200 <SEP> mg <SEP> KH <SEP> P04 <SEP> 500 <SEP> mg.
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<tb>
<tb>
.1 <SEP> tyrosine <SEP> 200 <SEP> mg <SEP> acide <SEP> folique <SEP> 2mcg.
<tb>
<tb>
<tb> caséine <SEP> hydrolysée <SEP> l.0gm.
<tb>
<tb>
<tb> eau <SEP> jusqu'à <SEP> 500 <SEP> cc.
<tb>
On prépare le milieu de base en combinant les acides aminés, en ajoutant ensuite le dextrose, l'acétate sodique et l'acide fumarique, en chauffant pour dissoudre et en réajustant immédiatement le pH à 7. On ajou-
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te alors l'éthyloxalacétate sodique et les vitamines, on les dissout et on réajuste les solutions au pH 70Finalement, on ajoute les sels, l'acide folique, la caséine hydrolisée, on dissout et on ajoute le pH à 6.6.
On dilue une solution ou suspension aqueuse de l'échantillon à essayer, de sorte que la solution contienne 0.2 unité type de L.L.D. par
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ce. qu'on ajoute alors aux tubes à essai en quantité de 0o5, 1.09 1.5y 200 et 205 CCo On ajuste alors tous les tubes au volume de 205 cc. avec
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de l'eau, on ajoute 2.5 ce. de milieu de base, on tamponne finalement les tubes et on les stérilise en les chauffant à 120 C. pendant 13 minutes
Après refroidissement à la température ambiante, on inocule les tubes au moyen d'une goutte de la suspension standardisée de L.Lactis et on soumet à incubation à 37 C pendant 40 heures. Après l'incubation,, on ti- tre les tubes directement avec de l'hydroxyde de sodium 0,05 N jusqu'à vi- rage au bleu vert du bleu de bromothymol.
On peut déterminer ensuite l'activité de l'échantillon à partir de la courbe standard au moyen de la quantitéd'hydroxyde de soude qui a été nécessaire.
On prépare la courbe standard avec de la vitamine B12 cristalli- sée. Un milligramme de vitamine B12 pure cristallisée contient 11 fois 106 unités. On dilue une solution de réserve et on ajoute 0.0. 0,05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 et 2.0 unités à une double série de tubes.
On ajoute de l'eau pour ajuster le volume à 2.5 ce. On suit pour le stan- dard la méthode décrite ci-dessus pour les échantillons soumis à l'essai.
Les valeurs de titration suivantes sont typiques pour les séries standard énumérées ci-dessus :1.5, 2.0, 2.7, 4.3, 5.7, 6.6, 7.5, 7.9, 8.0 et 8.4 respective- ment, exprimés en millilitres d'hydroxyde de soude 0.05 N nécessaire pour neutraliser l'acide produit par culture de L.Lactis.
Les exemples suivants illustrent les méthodes de réalisation de la présente invention mais on doit comprendre que ces exemples sont donnés principalement en guise d'illustration et non de limitation.
EXEMPLE I.
On a préparé un bouillon de culture en cultivant une variété produisant de la griséine du micro-organisme Streptomyces griseus dans un milieu de culture approprié. On a débarrassé le bouillon résultant de l' organisme propagateur et autre matière solide et on l'a traité au moyen d'un adsorbant comme le carbone. On a lessivé la matière active de l'alpha-picolice. sorbant avec un agent de lessivage tel que la pyridine en solution aqueu- se ou chromatographiquement On a évaporé la lessive jusqu'à un petit volume, on l'a dilué avec de l'alcool méthylique et on a précipité le concentré actif à l'éther. On a alors séché le concentré. Ce concentré séché possé- dait une activité microbiologique d'environ 1500 à 2000 unités de L.L.D. par mg.
On a ajouté 750 gr. de ce concentré séché à environ 2. 5 litres d'alcool méthylique anhydre: On a agité le mélange pendant à peu près 30 minutes et on l'a filtré ensuite. On a alors ajouté environ 2.5 litres d'alcool méthylique anhydre au résidu solide et on a agité et filtré le mélange. On a répété ce processus avec deux portions successives de 2.5 litres d'alcool méthylique anhydre. Les filtrats réunis possédaient une activité microbiologique totale d'environ 1.2 billion d'unités de L.L.D.
On a fractionné a réuni les filtrats réunis, par adsorption sur 7;5 kg d'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthy- lique. On a alors passer de l'alcool méthylique à travers la colonne et on a recueilli un certain nombre de fractions de la lessive. On les fractions possédant une activité élevée (généralement au moins 10.000 uni- tés de L.L.D./ml) déterminée microbiologiquement et indiquée habituellement par une coloration rose qu'on a concentrées à environ un dixième de leur volume initial ' une température inférieure à 30 C. et sous une pression moindre que la pression atmosphérique. On a éliminé par filtration une petite quantité de matière blanche insoluble qui s'est formée. On a alors concentré le filtrat sous vide en un sirop épais.
On a ajouté de l'alcool éthylique absolu au sirop et on a éliminé le précipité blanc insoluble qui s'est séparé de la solution . On a ajouté alors un volume égal d'acétone à la solution rouge limpide'dans l'alcool éthylique qui a provoqué la sépa- ration d'un, précipité rouge floconneux de la solution.
On a dissous la matière active précipitée de l'alcool éthylique
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par l'addition d'acétones dans approximativement 2 ml d'eau et on l'a pré- cipité à nouveau sous la forme d'une huile rouge par l, addition d'environ 12 volumes d'acétone. On a. séparé l'huile et on l'a dissoute dans environ 1 ml d'eau et on a traité la solution avec de l'acétone jusqu'à ce qu'on ob- serve un trouble. Après repos la vitamine B12 s'est séparée de la solution sous forme d'amas de petits cristaux rouges en aiguilles.
Exemple¯2.
On a purifié à nouveau un précipité floconneux formé par l'addi- tion d'acétone à la solution rouge limpide dans l'alcool éthylique obtenue comme dans l'exemple l selon le processus suivant. Après lavage du préci- pité avec de l'acétone et séchage, on a obtenu une substance possédant une activité microbiologique d'environ 4 millions d'unités de L.L.D. par mg. ou environ 36% de vitamine B12. On a récupéré une seconde portion possédant une activité analogue par addition à la liqueur mère d'un second volume d' acétone. La nouvelle addition d'acétone à la liqueur mère a entraîné la pré- cipitation d'une huile rouge qu'on a récupérée.
On a traité l'huile au moyen d'un mélange d'alcool éthylique et d'acétone qui a précipité un solide amor- phe rouge possédant une activité microbiologique d'environ 1.5 million d'u- nités de L.L.D. mg. ou environ 13.5% de vitamine B12 qu'on a récupée.
On a réuni les différentes fractions séchées, insolubles dans l' acétone qu'on a dissoutes dans approximativement 4 ml d'alcool méthylique et on a adsorbé la solution sur environ 10 gr. d'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique dans une colonne chromatographique. On a' ensui- te développé la colonne avec de l'alcool méthylique et une bande rouge fon- cé à traversé la colonne. Dès l'apparition de la couleur rouge dans la les- sive on a prélevé des fractions successives de 10 ml. jusqu'à ce que le li- quide sorte réellement incolore. On a réuni les trois premières fractions contenant la plus grande partie de la couleur rouge qu'on à évaporé à siccité à une pression inférieure à la pression atmosphérique et à une température inférieure à 25 C.
On a dissous le résidu sec dans environ 2 mlo d'alcool méthylique et on a traité la solution avec environ 8 volumes d'acétone provo- quant la séparation d'un précipité rouge amorphe de la solution. On a récu- péré ce précipité par centrifugation et on l'a reprécipité d'une façon simi- laire d'un mélange d'alcool méthylique et d'acétone. Le précipité rouge amor- phe consistait en vitamine B12 dans un état à 50% de pureté approximativement 5 millions d'unités de L.L.D. mg).On a dissous une portion de cette matiè- re (5 mgo sur un total de 21.8 mg.) dans approximativement 0.5 ml. d'eau et on a traité la solution avec environ 5 ml.
d'acétone. Après repos, la vitami- ne B12 s'est séparée de la solution sous forme d'amas de petits cristaux .-ou- ges en aiguilles possédant une activité mierobiologique d'environ 11 millions d'unités de L.L.D. mg. qu'on a récupérés.
.Exemple 3
On a ajouté environ 1388 grammes d'un concentré sec préparé comme la matière de départ de l'exemple l, à partir de produits délaboration d' une variété de Streptomyces griseus produisant de la griséine qui possède une activité microbiologique d'environ 2000 unités de L.L.D. mg., à environ 16 litres d'alcool méthylique anhydre. On a agité le mélange pendant 30 mi- nutes environ et on a filtré. On a adsorbé le filtrat sur environ 15 kg. d' alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique dans une colonne chromatographiue. On a ensuite développé la colonne avec de l'alcool méthy- lique et on recueilli un certain nombre de fractions de la lessive.
On a réuni les fractions chromatographiques possédant Inactivité microbiologique la plus prononcée qu'on a concentrée sous vide à environ un dixième de leur volume initial. On a filtré le concentré et on a concen- tré à nouveau le filtrat sous vide en un sirop épais. On a ajouté de l'al- cool éthylique à ce sirop et on a filtré le mélange. On a alors traité le filtrat avec une quantité suffisante d'acétone en agitant pour provoquer la
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précipitation complète de la matière rouge y contenue.
On a recueilli le précipité rouge qu'on a redissous dans environ 100 ml. d'alcool méthyli- que. On a alors versé lentement la solution dans environ un litre d'acé- tone, en agitant. Une matière rouge claire, floconneuse, a précipité dé la solution. On l'a recueillie. Après lavage et séchage du précipité, on a obtenu 7.8 gr. d'une poudre rouge possédant une activité microbiologi- que d'environ 65.000 unités de L.L.D. mg., ou environ 0.6% de vitamine B12.
On note que dans cet exemple la teneur en vitamine B12 du pro- duit obtenu en une étape chromatographique (0.6% de vitamine B12) était beaucoup plus faible que dans les autres exemples et beaucoup plus faible que ce doive être le cas. On a donné cet exemple pour illustrer le fait que le traitement proposé, même lorsqu'il n'est pas conduit pour retirer l'activité maximum du traitement chromatographique, donne un produit qui est beaucoup plus actif que tous les concentrés précédemment connus contre l'anémie pernicieuse, avec lesquels on est familiarisé, et qu'on peut uti- liser pour des fins cliniques sans nouvelle concentration si on le désire.
Les facteurs qui augmentent la teneur en vitamine L.L.D. du produit obtenu dans les étapes chromatographiques proposées, sont en générais (1) accroissement du rapport du poids de l'adsorbant à l'alumine, au poids des solides adsorbés; (2) le soin apporté à éliminer l'eau du concentré adsorbé et du solvant alcoolique utilisé; et (3) soin apporté à choisir le plus puissant facteur.
Exemple 1....
On a dissous dans de l'alcool méthylique 10.0 grammes de concen- tré du type décrit dans l'exemple précédente possédant une activité moyen- ne de 80.000 unités de mg., et on a adsorbé la solution sur environ 500 grammesd'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique dans une colonne chromatographique. On a ensuite développé la colonne avec de l'alcool méthylique et on a recueilli des fractions séparées de lessive.
On a sélectionné les fractions possédant une activité microbo- logique prononcée qu'on a réunies et évaporées à siccité sous une pression moindre que la pression atmosphérique. On a extrait le résidu à l'alcool éthylique absolu et on a éliminé la substance blanche qui ne s'est pas dis- soute. On a traité la solution rouge dans l'alcool éthylique avec un excès d'acétone qui a provoqué la séparation d'une huile rouge insoluble. On a récupéré cette huile qu'on a dissoute dans environ 10 ml. d'eau. On a pré- cipité à nouveau la matière active, avec un peu de matière inerte incluse, sous forme d'huile par addition d'un excès d'acétoneo On a redissous la matière rouge hautement active dans environ 3 ml. d'eau et on a traité la solution avec de l'acétone jusqu'à ce que l'on observe un léger trouble.
Après repos, des cristaux en aiguilles de vitamine B12 se sont séparés de la solution.
Exemple 5.
On a extrait à trois reprises 1305 kg. de concentré précipité à l'éther possédant une activité à l'égard de L.L.D. d'environ 2000 unités/ mg., préparé comme dans 1-'exemple l, en agitant pendant 30 minutes avec 13 gal. d'alcool méthylique. On a chromatographié les extraits réunis, dans 17 colonnes ayant chacune six pouces de diamètre et contenant 7,5 kg. d'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique. On a développé chaque colonne avec de l'alcool méthylique et on a recueilli une série de fractions.de 1,5 litre de lessive dès l'apparition de la couleur rouge ca- ractéristique de la vitamine B12 dans la lessive.
On a réuni les trois premières de ces fractions de lessive pro- venant de toutes les colonnes, qu'on a évaporé à environ 500 ml. sous pres- sion réduite et à une température inférieure à 30 C. On a débarrassé la so-
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lution par filtration, d'une matière blanche insoluble et on a traité avec de l'acétone jusquà précipitation-essentiellement complète de la couleur rouge sous forme d'une huile rougeOn a éliminé le liquide brun-jaunâtre surnageant.
On a redissous le résidu huileux rouge dans une quantité mini- mum d'alcool méthylique et on a traité à nouveau la solution avec de 1-lacé- tone jusqu 9a précipitation substantiellement complète de la substance acti- ve rougeo On a répété ce processus jusquà ce que le liquide surnageant cons- titué daloool et d'acétone soit substantiellement exempt de couleur brune- jaunâtre.
On a dissous alors le précipité rouge huileux dans une quantité minimum d'alcool méthylique et on a versé lentement la solution obtenue dans 10 volumes d'acétone.On a séparé par filtration le précipité rouge amorphe qui s'est formé, en l'a lavé à l'acétone et on l'a séché sous vide à la température ordinaireoSon activité à l'égard de L.L.D. correspond à environ 5% de vitamine Bl2. L'administration par voie- buccale en une seule dose d' un concentré à 5% en vitamine Bl2, équivalent à 600 microgrammes de vitamine Bl2, a produit une réaction hématologique maximum chez un patient. Chez un' autre, une quantité équivalente à 25 microgrammes injectée par voie intra- musculaire en une seule dose a été active au point de vue hématopodtique.
On a préparé cette substance pour injection en dissolvant le concentré de vitamine B12 dans une solution saline.
@ Exemple 6.
On a préparé un bouillon en cultivant une variété du micro-orga- nisme Etre produisant de la streptomycine, dans un milieu de culture approprié. On a débarrassé le bouillon obtenu de 1-'organisme propaga- teur et autre matière solide et on l'a mis en contact avec une résine échan- geuse dion dont la capacité de'change provienne de groupes carboxyliques grâ- ce auxquels la streptomycine s'est adsorbée sur ladite résine. On a alors trai- té le bouillon dont on a éliminé la streptomycine par du carbone. On a lessivé la matière active de la matière adsorbée par le carbone avec de la pyridine en solution aqueuse, on a évaporé la lessive à un petit volume et on a précipité le concentré actifavec de l'éther. On a séché le concentré.
On a broyé le concentré solide sec précipité à l'éther, qui pos- sédait une activité à 1-'égard de L.L.D. de 2500 unités/ mgo (l'628 grammes, comprenant 700 grammes de matière facilitant la filtration) en une poudre fi- ne qu'on a extraite quatre fois en agitant pendant 30 minutes avec 3500 ml. d'alcool méthylique, et qu'on a filtré. On a chromatographie les extraits dans l'alcool méthylique réunis, sur 15 kg. d'alumine activée et on a lavé la colon- ne avec de l'alcco. méthylique. On a recueilli une série de fractions de 3000 ml. dès l'apparition de la couleur rouge caractéristique de la vitamine B12 dans le liquide sortant.
On a réuni les 5 premières fractions contenant un total de 673 millions d'unités de L.L.D., qu'on a concentrées sous vide à une température inférieure à 40 C jusqu'au volume de 120 mlOn a récupéré la vi- tamine B12 impure en versant la solution dans 120 ml d'acétone; On a séparé par centrifugation le précipité rouge formé, qu'on a lavé avec de l'acétone et qu'on a séché à la température ambianteo On a obtenu une purification plus poussée en dissolvant le solide dans 5 ml. 0 d'alcool méthylique et en ajoutant 25 mo. d'acétone. On a recueilli par centrifugation le précipité formé;, on l' a lavé avec de 1-acétone et séché.Le rendement était de 89.8 mg.
On a dissous le solide rouge ci-dessus dans 3 ml. d'acool méthy- lique et on l'a chromatographie sur 4.5 grammes d'alumine activée.On a lavé la colonne avec de l'alcool méthylique.On a recueilli une série de fractions de trois à quatre ml.lorsque la couleur rouge caractéristique de la vitami- ne B12 est apparue dans la lessivée On a évaporé séparément à siccité les cinq premières d'entre elles, contenant substantiellement toute la couleur rouge, on les a dissous dans environ 3 ml.
d'eau, et on a traité la solution avec de 1-acétone jusqu'à ce qu'elle devienne légèrement trouble. Après un repos de 24 heures, des cristaux rouges en aiguilles se sont formés dans chacun des cinq tubeso On a recueilli les cristaux qu'on a réunis, lavés à 1,'acétone et séchés.Le rendement était de 14.l mgo de vitamine B12 cristal-
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Usée. On a essayé ce produit qu'on a trouvé actif au point de vue clinique.
Les divers produits décrits dans cette spécification, qui possè- dent une activité à l'égard de L.L.D.de 65.000 unités de L.L.D.à 11.000.000 d'unités de L.L.D.par milligramme, conviennent tous pour l'usage clinique.
Il est avantageux de les administrer sous la forme de solutions thérapeu- tiques dans l'eau., de solutions salines, de solutions isotoniques ou simi- laires. Les concentrations désirables de vitamine Bl2 dans ces solutions peu- vent varier dans de larges limites qui dépendent des exigences des cas in- dividuels.
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PROCESS FOR PREPARATION OF THERAPEUTIC MATERIALS AND PIUS IN PARTICULAR
OF VITAMIN B.12.
The present invention relates to a new development and improvement of the process described in Belgian Patent No. 488,271.
The prior patent relates to a process for the preparation of vitamin B12 from liver preparations active against L.L.D. and Streptomyces griseus constructs.
It has now been found that superior results are obtained, particularly with regard to the yield of pure vitamin B12 when the starting material which is subjected to extraction and purified to recover vitamin B12 concentrates is. a crude concentrate active against LLD, composed predominantly of a development product of strains of Streptomyes griseus producing grisein or Streptomycin.
It has also been found that vitamin B12 can be obtained as a by-product from the manufacture of the antibiotics streptomycin and grisein.
One way of doing this is to prepare the crude starting concentrate by culturing in a suitable nutrient medium a variety of the microorganisms Stroeptomyeces grisseus which, in addition to grisein, produce ingredients active against L.L.D. from which the vitamin B12 can be separated as described in this specification by adsorbing the active material from the culture broth 1: 1 using a suitable adsorbent, preferably activated charcoal, leaching the adsorbed fraction using a suitable solvent such as an aqueous solution of pyridine or an alkyl substituted product of pyridine and concentrating the crude lye to dryness.
It was discovered that these concentrates contain in addition to grisein, active ingredients with regard to L.L.D. which are suitable for separating vitamin B12 by the claimed process.
By the proposed treatment, the grisein possibly present in the starting concentrate is eliminated and the products obtained are
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exempt.
It has also been discovered that it is possible to recover vitamin B12 from the concentrates prepared by culturing a variety of Streptomyces griseus which in addition to producing streptomycin, active ingredients against L.L.D. which can be separated -vitamin B12. It is advantageous in practice to separate and recover the streptomycin before carrying out the process relating to vitamin B12, by bringing the broth into contact with an ion exchange resin, the exchange capacity of which comes from a group. e carboxylic acid by which said resin adsorbs streptomycin, e The broth from which streptomycin has been removed is treated with an adsorbent such as carbon, the adsorbed fraction is leached with pyridine in aqueous solution and the lye is evaporated to a small volume.
The crude concentrate, which is used as a starting material in the proposed process, is then precipitated by diluting the concentrated liquor with methanol and adding ether.
When concentrates containing vitamin B12 and streptomycin are used without removing streptomycin first, the broth is freed from the propagating organism, it is treated with carbon and the vitamin B12 is leached from the carbon adsorbed fraction. with pyridine. The proposed process eliminates streptomycin possibly present in the starting concentrate used and the products obtained are free thereof.
The products containing vitamin B12 described in this specification are therefore free from streptomycin as well as grisein. The crude concentrate obtained in this way can be extracted with water or with a water soluble lower aliphatic alcohol, preferably methyl alcohol. The choice of the extraction liquid is determined by the adsorbent manner to be used in the chromatographic fractionation.
In the practice of this invention, various adsorbents can be used including activated carbon, activated alumina and the like. Alumina is the preferred adsorbent for the chromatographic step (s). When using chromatographic columns containing carbon, aqueous extractions and water soluble lower aliphatic alcohol extractions are employed when the columns are made of activated alumina. The column is preferably loaded in the wet state by filling with the adsorbent and the solvent used in the extraction and subsequent draining the solvent until its level reaches the top of the adsorbent material in the column. the column. It is convenient to use as a support for the adsorbent a wire cloth covered with a layer of sand.
When an alumina column is used for chromatography, the alcoholic, preferably methanolic, extract is poured onto the upper surface of the adsorbent in the column and allowed to flow through the adsorbent either. by gravity or under pressure. The column is then developed with additional amounts of extraction solvent to develop in the column areas of adsorbent material containing vitamin B12 in varying amounts and varying degrees of purity, and the appropriate portions of the lye are collected in the column. as the zones emerge from the bottom of the column. The fractions showing sufficient activity revealed by microbiological examination or by virtue of their pink color are concentrated separately or mixed into a mixture into a thick syrup.
This concentrate is then mixed with a lower aliphatic alcohol and a miscible non-dissolving liquid such as acetone in which the active substance is insoluble is added. The fluffy red precipitate which forms is collected.
The red fluffy precipitate can be further purified by dissolving it in a vitamin B12 dissolver such as ethyl alcohol or methyl alcohol or water, and precipitating it with a miscible liquid which does not dissolve the vitamin. B12, such as acetone, once or more. During this treatment, the solution can be filtered if it is not clear before adding the precipitation reagent, to remove it.
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insoluble impurities; the number of such precipitations and desirable treatments varies with different lots. The absence of a brownish or yellowish color in the liquid which floats after precipitation provides an indication of the number of useful precipitations.
In some cases, after several of these treatments, vitamin B12 can be crystallized from an aqueous solution by adding acetone to the point of beginning turbidity and allowing red needle crystals to form.
However, when a crystalline product of high purity is desired, it is often desirable to submit the product from the pre-. honey 'chromatographic fractionation (either before or after one or more precipitation steps mentioned above) to a second fractionation
EMI3.1
l omatograph3quea This is done by dissolving the amorphous product in a lower aliphatic alcohol. The solution can then be introduced into a second activated alumina column and the most active fractions of the lye detected as above can be collected and concentrated to sic - cited. The residue can be dissolved in methyl alcohol and added to the solution with acetone which causes separation of a red precipitate of vitamin B12.
This precipitate can be dissolved in water and acetone can be added to the solution which causes the separation of red crystals. Vitamin B12 can be repeatedly recrystallized from water acetone solution to remove any remaining impurities.
Vitamin B12 obtained in a state of substantial purity, in accordance with this invention, is a red compound, the following analysis of which gives an approximate typical composition determined on two samples.
EMI3.2
dried under vacuum for two hours at 100cor s 056.3556.116.726.72 N1lo511Lo75f2427; Colol. 2408o The entire difference between the sum of the percentages given and 100% substance is believed to be oxygen. Spectral analysis does not indicate the presence of other metals.
Vitamin B12 has roughly the empirical formula
EMI3.3
approximate based on previous analysis - ,, 6l-54TT86-92.J-13rr, Vitamin B12 is substantially soluble in water, methyl alcohol, ethyl alcohol, and phenol and substantially insoluble in
EMI3.4
! - 'acetone, ether and chloroform'. Vitamin B12 has an apparent partition coefficient of about 10% 6 in the system; 75% toluene- 25% thoresol / watero Vitamin B12 has been found to have a partition coefficient of about 1 2 in the water / b-nzyl alcohol system.
Vitamin B12 crystallizes from suitable solutions such as aqueous acetone to red crystals with crystalline properties.
EMI3.5
following tallographic; refractive indices, Io 619; Io 6.9; Tp 659o The crystals of vitamin B12 do not have a defined melting point but darken at around 2: 020 ° C. The absorption spectrum of vitamin B12 is characterized by maxima of 27 80 (Elem 114.7) at 36 Io) (E = 203 -5) and 5500 1 Iem Ism (EI = 62 7) The spectrum does not change markedly by a change in pH; in acidic solution the intensity of the 3610 band decreases by about 10% and in alkaline solution there are other small changes and the fine structure is less marked.
The infrared absorption spectrum was determined with a re = -
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Carefully calibrated PerI.nmElr 12A fractometer. The following adsorption maxima were observed
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<tb> Wave length <SEP> <SEP> in <SEP> Mu <SEP> (10-4cm)
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<tb> 3.05 <SEP> S <SEP> (large)
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<tb> 4.62 <SEP> W
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<tb> 5.98 <SEP> S
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<tb> 6.13 <SEP> M
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<tb> 6.70 <SEP> S
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<tb> 7.14 <SEP> S
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<tb> 7.35 <SEP> S
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<tb> 7060 <SEP> W
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<tb> 8.15 <SEP> S
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<tb> 6.67 <SEP> S
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<tb> 9.35 <SEP> S
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<SEP> 10.00 <SEP> S
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<tb> 10.80 <SEP> W
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<tb> 11.10 <SEP> W
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<tb> II.81 <SEP> M
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<tb> 12.35 <SEP> M
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S.M. and W stand for high, medium and low absorption intensities.
Vitamin B12 has great therapeutic value in the treatment of pernicious Addison's anemia and other macrocytic anemias. The doses required vary according to the particular case and depend on the severity and duration of the pathological condition and the patient's response to therapy o The minimum effective dose administered intramuscularly in the form of an aqueous saline solution is estimated to be or isotonic is approximately 1 microgram per day or multiples thereof at longer intervals, eg, approximately 7 micrograms per week.
There are reviews of clinical research on vitamin B12 therapy in the treatment of macrocytic anemia in the literature: Spies, TD Stone, RH, Garcia Lopez.G., Milanes, F., Lopez Toca, R. and A- ramburu, T., "Thymine, Folie Acid, andVitamin B12 in nutritional Macrocytic Anemia, Tropical Sprue, and Pernicious Anemia," Lancet, 2.519-522, October 2919480
Hall, B.E., and Campbell, D.C., "Effect of Vitamin B12 On the Hema- topoietic and Nervous Systems in Addisoniam Pernicious Anemia", Journal of Laboratory and Clinical medicine, 33 ,:
1646, December 19480
Pure vitamin B12 has such a high therapeutic value in the treatment of macrocytic anemias that a concentrate of vitamin B12 from microbiological sources can be used in accordance with the proposed process and containing as little as 65,000 units of LLD. / mg. or only about 0.6% vitamin B12, in the treatment of pernicious anemia. As far as is known this concentrate is much more potent than any previously available pernicious anemia concentrate Oral administration of a single dose of 3% vitamin B12 concentrate equivalent to 600 micrograms of vitamin B12 produced maximum hematologic response in one patient.
In another, an amount of 5% concentrate equivalent to 25 micrograms was shown to be haematopoietic active after intramuscular injection in a single dose. This material for injection was prepared by dissolving the vitamin B12 concentrate in saline solution. The activity of the products mentioned in this application was determined by a microbiological growth reaction assay method which utilizes Lactobacillus lactis. Dorner as the test organism, Below is a brief description of the test method which
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has been used.
Lactobacillus lactis Dorner has been reported to require two fac-
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growth promoters, T, J. and LL.D. Media modifications introduced into the formula described below eliminated the need for factor T.J. and the assay as presented is specific for L.L.D. This microorganism reveals the reaction of the L.L.D. with vitamin B12. Crystallized vitamin B12 is used as the test standard and all unknowns are evaluated in terms of microbiological activity promoting growth, equivalent to the microbiological activity of vitamin B12,
The organism Lactobacillus lactis Dorner, A.
T.C.C. 10, 697, used in this test method in the American type culture collection. Reserve cultures of the organism are maintained in a growth medium consisting of:
I% Difco ferment extract 0.02% tomato juice serum
I% anhydrous dextrose
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1.5% agar.
The medium used for inoculation consists of the base medium or test medium to which 1 unit of vitamin B12 has been added thereto.
The inoculation cells are washed with sterile distilled water and diluted to form a suspension giving, on the Evelyn photometer, a reading between 90% and 95% light transmittance, with a 520 filter. mu.
The composition of the double strength test medium is listed below. You can easily take the ingredients of stock solutions
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<tb> DL <SEP> isoleucine <SEP> 200mg <SEP> Dextrose <SEP> 10 <SEP> gm
<tb>
<tb> DL <SEP> alpha-alanine <SEP> 200mg <SEP> acetate <SEP> sodium <SEP> 6 <SEP> gm
<tb>
<tb> DL <SEP> aspartic acid <SEP> <SEP> 200mg <SEP> <SEP> fumaric acid <SEP> 0.5 <SEP> gm
<tb>
<tb> DL <SEP> valine <SEP> 200mg <SEP> Ethyloxalacetate <SEP> sodium0o5 <SEP> gm
<tb>
<tb> riboflavin <SEP> 200mcg.
<tb>
<tb>
DL <SEP> methionine <SEP> 200mg <SEP> pantothenate <SEP> calcium <SEP> 200mcg.
<tb>
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There glutamic acid 200mg thiamine HOl 200go DL threonine 200mg nicotinic acid 200mcg. DL serine 200mg P.1ridoxamin 400mcg.
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<tb> DL <SEP> phenylalanine <SEP> 200mg <SEP> <SEP> para-amino <SEP> benzoic acid <SEP> 40mcg
<tb>
<tb> DL <SEP> leucine <SEP> 200mg <SEP> Biotin <SEP> 0.4mcg
<tb>
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L histidine 200mg MgSOIo'7H20 200 mg.
There tryptophan 400mg NaC 1 10 mg.
L arginine 200mg Fes04o7HZO 10 mg. lysine 100 mg MnSOl, H20 10 mgo
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<tb> <SEP> amino acid <SEP> acetic200 <SEP> mg <SEP> @
<tb>
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cystine 200 mg K2HP04 500 mga
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<tb> DL <SEP> norleucine <SEP> 200 <SEP> mg <SEP> KH <SEP> P04 <SEP> 500 <SEP> mg.
<tb>
<tb>
<tb>
.1 <SEP> tyrosine <SEP> 200 <SEP> mg <SEP> folic acid <SEP> <SEP> 2mcg.
<tb>
<tb>
<tb> casein <SEP> hydrolyzed <SEP> l.0gm.
<tb>
<tb>
<tb> water <SEP> up to <SEP> 500 <SEP> cc.
<tb>
The base medium is prepared by combining the amino acids, then adding dextrose, sodium acetate and fumaric acid, heating to dissolve and immediately readjusting the pH to 7. The pH is added.
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Then, the sodium ethyloxalacetate and the vitamins are dissolved and the solutions are readjusted to pH 70. Finally, the salts, folic acid, hydrolyzed casein are added, dissolved and the pH is added to 6.6.
An aqueous solution or suspension of the sample to be tested is diluted so that the solution contains 0.2 standard units of L.L.D. through
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this. which is then added to the test tubes in quantities of 0o5, 1.09 1.5y 200 and 205 cc. All the tubes are then adjusted to the volume of 205 cc. with
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of water, we add 2.5 cc. of base medium, the tubes are finally buffered and sterilized by heating them to 120 ° C. for 13 minutes
After cooling to room temperature, the tubes are inoculated with a drop of the standardized suspension of L. Lactis and incubated at 37 ° C. for 40 hours. After the incubation, the tubes are titrated directly with 0.05 N sodium hydroxide until the bromothymol blue turns blue green.
The activity of the sample can then be determined from the standard curve using the amount of sodium hydroxide that was required.
The standard curve is prepared with crystallized vitamin B12. One milligram of pure crystallized vitamin B12 contains 11 times 106 units. A stock solution is diluted and 0.0 is added. 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 and 2.0 units to a double series of tubes.
Water is added to adjust the volume to 2.5 cc. The method described above for the samples tested is followed for the standard.
The following titration values are typical for the standard series listed above: 1.5, 2.0, 2.7, 4.3, 5.7, 6.6, 7.5, 7.9, 8.0 and 8.4 respectively, expressed in milliliters of 0.05 N sodium hydroxide required to neutralize the acid produced by culturing L.Lactis.
The following examples illustrate methods of carrying out the present invention, but it should be understood that these examples are given primarily by way of illustration and not by way of limitation.
EXAMPLE I.
A culture broth was prepared by growing a grisein-producing variety of the microorganism Streptomyces griseus in an appropriate culture medium. The resulting broth was freed from propagating organism and other solid matter and treated with an adsorbent such as carbon. The active ingredient was leached from alpha-picolice. sorbent with a leaching agent such as pyridine in aqueous solution or chromatographically. The lye was evaporated to a small volume, diluted with methyl alcohol and the active concentrate was precipitated with water. ether. The concentrate was then dried. This dried concentrate had a microbiological activity of about 1,500 to 2,000 L.L.D. per mg.
750 gr were added. of this concentrate dried to about 2.5 liters of anhydrous methyl alcohol: The mixture was stirred for about 30 minutes and then filtered. About 2.5 liters of anhydrous methyl alcohol was then added to the solid residue and the mixture was stirred and filtered. This process was repeated with two successive 2.5 liter portions of anhydrous methyl alcohol. The combined filtrates had a total microbiological activity of approximately 1.2 trillion units of L.L.D.
The combined filtrates were fractionated by adsorption on 7.5 kg of activated alumina moistened with methyl alcohol. Methyl alcohol was then passed through the column and a number of lye fractions were collected. Fractions with high activity (usually at least 10,000 LLD units / ml) determined microbiologically and usually indicated by a pink color were concentrated to about one tenth of their original volume at a temperature below 30 ° C. and at a pressure less than atmospheric pressure. A small amount of insoluble white material which formed was removed by filtration. The filtrate was then concentrated in vacuo to a thick syrup.
Absolute ethyl alcohol was added to the syrup and the insoluble white precipitate which separated from the solution was removed. An equal volume of acetone was then added to the clear red solution in ethyl alcohol which caused a red, flaky precipitate to separate from the solution.
The active ingredient precipitated from ethyl alcohol was dissolved
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by the addition of acetones in approximately 2 ml of water and again precipitated as a red oil by the addition of about 12 volumes of acetone. We have. The oil was separated and dissolved in about 1 ml of water and the solution was treated with acetone until cloudiness was observed. After standing, vitamin B12 separated from the solution in the form of a cluster of small red crystals in needles.
Example 2.
A fluffy precipitate formed by the addition of acetone to the clear red solution in ethyl alcohol obtained as in Example 1 was again purified by the following procedure. After washing the precipitate with acetone and drying, a substance having a microbiological activity of about 4 million units of L.L.D. per mg. or about 36% vitamin B12. A second portion having similar activity was recovered by adding to the mother liquor a second volume of acetone. The further addition of acetone to the mother liquor caused the precipitation of a red oil which was recovered.
The oil was treated with a mixture of ethyl alcohol and acetone which precipitated a red amorphous solid having a microbiological activity of about 1.5 million units of L.L.D. mg. or about 13.5% of vitamin B12 that we recovered.
The various dried fractions, insoluble in acetone, were combined and dissolved in approximately 4 ml of methyl alcohol and the solution was adsorbed on approximately 10 g. activated alumina moistened with methyl alcohol in a chromatographic column. The column was then developed with methyl alcohol and a dark red band passed through the column. As soon as the red color appeared in the waste, successive 10 ml fractions were taken. until the liquid comes out really colorless. The first three fractions containing most of the red color were combined and evaporated to dryness at a pressure below atmospheric pressure and at a temperature below 25 ° C.
The dry residue was dissolved in about 2 ml of methyl alcohol and the solution was treated with about 8 volumes of acetone causing an amorphous red precipitate to separate from the solution. This precipitate was collected by centrifugation and reprecipitated in a similar fashion with a mixture of methyl alcohol and acetone. The amorphous red precipitate consisted of vitamin B12 at 50% purity of approximately 5 million units of L.L.D. mg). A portion of this material (5 mg out of a total of 21.8 mg) was dissolved in approximately 0.5 ml. of water and the solution was treated with about 5 ml.
acetone. After standing, the vitamin B12 separated from solution in the form of clusters of small needle-shaped crystals with a microbiological activity of about 11 million units of L.L.D. mg. that we have recovered.
Example 3
About 1388 grams of a dry concentrate prepared as the starting material of Example 1 was added from the development products of a variety of Streptomyces griseus producing grisein which has a microbiological activity of about 2000 units of. LLD mg., to about 16 liters of anhydrous methyl alcohol. The mixture was stirred for about 30 minutes and filtered. The filtrate was adsorbed on about 15 kg. of activated alumina moistened with methyl alcohol in a chromatographic column. The column was then developed with methyl alcohol and a number of lye fractions collected.
The chromatographic fractions possessing the most pronounced microbiological inactivity were pooled and concentrated in vacuo to about one tenth of their original volume. The concentrate was filtered and the filtrate was again concentrated in vacuo to a thick syrup. Ethyl alcohol was added to this syrup and the mixture filtered. The filtrate was then treated with a sufficient amount of acetone with stirring to cause
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complete precipitation of the red matter contained therein.
The red precipitate was collected which was redissolved in about 100 ml. methyl alcohol. The solution was then poured slowly into about a liter of acetone with stirring. A clear red, fluffy material precipitated from the solution. We picked it up. After washing and drying the precipitate, 7.8 g were obtained. of a red powder having a microbiological activity of approximately 65,000 units of L.L.D. mg., or about 0.6% vitamin B12.
It is noted that in this example the vitamin B12 content of the product obtained in a chromatographic step (0.6% of vitamin B12) was much lower than in the other examples and much lower than it should be the case. This example has been given to illustrate that the proposed treatment, even when not carried out to remove the maximum activity of the chromatographic treatment, gives a product which is much more active than any previously known concentrates against pernicious anemia, with which one is familiar, and which can be used for clinical purposes without further concentration if desired.
The factors that increase the content of vitamin L.L.D. of the product obtained in the chromatographic steps proposed, are in general (1) increase in the ratio of the weight of the adsorbent to the alumina, to the weight of the solids adsorbed; (2) the care taken in removing water from the adsorbed concentrate and the alcoholic solvent used; and (3) care taken in choosing the most powerful factor.
Example 1 ....
10.0 grams of concentrate of the type described in the previous example having an average activity of 80,000 mg units were dissolved in methyl alcohol, and the solution was adsorbed onto about 500 grams of humidified activated alumina. with methyl alcohol in a chromatographic column. The column was then developed with methyl alcohol and separate lye fractions collected.
Fractions having a pronounced microbiological activity were selected and combined and evaporated to dryness under a pressure less than atmospheric pressure. The residue was extracted with absolute ethyl alcohol and the white matter which did not dissolve was removed. The red solution in ethyl alcohol was treated with excess acetone which caused separation of an insoluble red oil. This oil was recovered which was dissolved in about 10 ml. of water. The active material was again precipitated, with some inert material included, as an oil by addition of excess acetone. The highly active red material was redissolved in about 3 ml. of water and the solution was treated with acetone until a slight cloudiness was observed.
After standing, needle crystals of vitamin B12 separated from the solution.
Example 5.
1305 kg were extracted three times. of ether-precipitated concentrate having activity towards L.L.D. of about 2000 units / mg., prepared as in Example 1, stirring for 30 minutes with 13 gal. methyl alcohol. The combined extracts were chromatographed in 17 columns each six inches in diameter and containing 7.5 kg. activated alumina moistened with methyl alcohol. Each column was developed with methyl alcohol and a series of 1.5 liter lye fractions were collected as soon as the characteristic red color of vitamin B12 appeared in the lye.
The first three of these lye fractions from all the columns were combined, which were evaporated to about 500 ml. under reduced pressure and at a temperature below 30 ° C. The sol-
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Filtration of an insoluble white material and treated with acetone until essentially complete precipitation of the red color as a red oil. The supernatant yellowish-brown liquid was removed.
The red oily residue was redissolved in a minimum amount of methyl alcohol and the solution was again treated with 1-acetone until substantially complete precipitation of the red active substance. This process was repeated until that the supernatant liquid consisting of aloool and acetone is substantially free of yellowish-brown color.
The oily red precipitate was then dissolved in a minimum amount of methyl alcohol, and the resulting solution was slowly poured into 10 volumes of acetone. The amorphous red precipitate which formed was filtered off, leaving it behind. washed with acetone and vacuum dried at room temperature o Its activity against LLD corresponds to approximately 5% of vitamin Bl2. Single dose oral administration of 5% vitamin B12 concentrate, equivalent to 600 micrograms of vitamin B12, produced maximum hematologic response in one patient. In another, an amount equivalent to 25 micrograms injected intramuscularly in a single dose was haematopodtically active.
This material for injection was prepared by dissolving the vitamin B12 concentrate in saline solution.
@ Example 6.
A broth was prepared by growing a variety of the streptomycin-producing Etre microorganism in an appropriate culture medium. The resulting broth was freed from the propagating organism and other solid matter and contacted with an ion-exchange resin, the exchange capacity of which arises from carboxylic groups due to which streptomycin s. 'is adsorbed on said resin. The broth from which the streptomycin had been removed was then treated with carbon. The active material was leached from the carbon adsorbed material with pyridine in aqueous solution, the lye was evaporated to a small volume and the active concentrate was precipitated with ether. The concentrate was dried.
The dry solid concentrate precipitated with ether, which had activity against L.L.D., was ground. of 2500 units / mgo (628 grams, comprising 700 grams of filter material) to a fine powder which was extracted four times by stirring for 30 minutes with 3500 ml. of methyl alcohol, and filtered. The combined methyl alcohol extracts were chromatographed on 15 kg. of activated alumina and the column was washed with alcohol. methyl. A series of 3000 ml fractions were collected. as soon as the characteristic red color of vitamin B12 appears in the outgoing liquid.
The first 5 fractions containing a total of 673 million units of LLD were combined, which were concentrated in vacuo at a temperature below 40 ° C. to the volume of 120 ml. The impure vitamin B12 was recovered by pouring the solution in 120 ml of acetone; The red precipitate formed was separated by centrifugation, which was washed with acetone and dried at room temperature. Further purification was obtained by dissolving the solid in 5 ml. 0 methyl alcohol and adding 25 mo. acetone. The formed precipitate was collected by centrifugation, washed with 1-acetone and dried. The yield was 89.8 mg.
The above red solid was dissolved in 3 ml. Methyl alcohol and chromatographed on 4.5 grams of activated alumina. The column was washed with methyl alcohol. A series of three to four ml fractions was collected. when the characteristic red color vitamin B12 appeared in the lye. The first five of them, containing substantially all of the red color, were separately evaporated to dryness, dissolved in about 3 ml.
of water, and the solution was treated with 1-acetone until it became slightly cloudy. After standing for 24 hours, red needle crystals formed in each of the five tubes. The crystals were collected, pooled, washed with 1.1 acetone and dried. The yield was 14.1 mg of vitamin. B12 crystal-
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Worn out. We tried this product and found it to be clinically active.
The various products described in this specification, which have activity against L.L.D. from 65,000 units of L.L.D. to 11,000,000 units of L.L.D. per milligram, are all suitable for clinical use.
It is advantageous to administer them in the form of therapeutic solutions in water, saline solutions, isotonic solutions or the like. The desirable concentrations of vitamin B1 2 in these solutions can vary within wide limits which depend on the requirements of the individual cases.