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PROCEDE DE RECUPERATION DE LA VITAMINE B 12
Cette invention se rapporte à la fabrication de vitamine B12 et spécialement à l'obtention de rendements accrus en vitamine B12 à partir de matières brutes contenant des substances étroitement apparentées à la vita- mine B12, mais possédant une activité physiologique sensiblement plus faible (c'est-à-dire activité contre l'anémie pernicieuse et activité de facteur de protéine animale) que celle de la vitamine B120 Cette invention se rap- porte plus particulièrement à des procédés nouveaux de transformation de tel- les substances semblables à la vitamine B12 en vitamine Bb12
Suivant la présente invention;
, on obtient la vitamine B12 à par- tir d'une matière de départ consistant en bouillons de fermentation obtenus par la propagation d'un micro-organisme produisant la vitamine B12 dans un milieu nutritif approprié, ou en concentrés de ceux-ci en traitant la matiè- re de départ par une substance fournissant des ions cyanure et en obtenant ainsi un mélange de réaction qui contient une quantité accrue de vitamine B12
Divers procédés d'obtention de la vitamine B12 à partir de foie et de bouillons de fermentation ont été exposés dans la littérature.
Par exemple,, Rickes et autres dans Science 108 634-35 (déco 3,1948) ont montré que 1 on peut obtenir la vitamine B12 à partir de bouillons de fermentation produits par le S treptomyces griseus Pierce et autres J.A.CS 71 :
2952, ont également montré que l'on peut 'obtenir la vitamine B12 à partir de bouillons de fermentation produits par le Streptomyces aureofaciens Tan- dis que les bouillons de fermentation obtenus par la propagation de micro- organismes produisant la vitamine B12 fournissent une source pratique pour la fabrication commerciale de la vitamine B12 on a trouvé que de tels bouil- lons contiennent également des produits de fermentation que l'on mentionne ici comme matières semblables à la vitamine B12 mais qui ne montrent qu'une fraction de Inactivité contre l'anémie pernicieuse et de l'activité de fac- teur de protéine animale présentée par la vitamine B12 elle-'même.
Dans la fabrication de vitamine B12 de pureté uniforme, l'élimination de ces matiè-
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res semblables à la vitamine B12 a suscité un problème difficile. Par suite de l'étroite parenté entre ces matières et la vitamine B12, il n'a été pos- sible de séparer la vitamine B12 pure., cristallisée,, qu'en utilisant des pro- cédés compliqués et coûteux.
On a découvert maintenant qu'il est possible de transformer pres- que quantitativement ces matières semblables à la vitamine B12 jusqu'ici in- désirables, en vitamine B12, ce qui simplifie matériellement le procédé d'ob- tention de vitamine B12 pure,, tout en augmentant en même temps considérable- ment le rendement en vitamine B12 que l'on peut'obtenir à partir de bouil- lons de fermentation.
Considéré sous certains de ces aspects les plus larges, le nou- veau procédé conforme à la présente invention consiste à faire réagir les matières semblables à la vitamine B12 avec une substance fournissant des ions cyanure et à transformer ainsi ces matières en vitamine B12 Ainsi, par exemple, en traitant des bouillons de fermentation ou des concentrés con- venables de ceux-ci, contenant les uns et les autres la vitamine B12 et les substances semblables à la vitamine B12, au moyen d'une source d'ions cyanu- re, on découvre qu'on obtient des rendements considérablement accrus en vi- tamine B12 pure. En outre, comme indiqué précédemment,la séparation de la vitamine B12 est considérablement facilitée.
Comme autre réalisation de cette invention, on a découvert que l'on peut effectuer cette transformation dans des conditions diverses en uti- lisant diverses sources d'ions cyanure. En général, on effectue la réaction en mettant les substances semblables à la vitamine B12 en contact intime avec les ions cyanure, et en transformant ainsi ces substances en vitamine B12., Par exemple, on peut traiter des solutions de substances semblables à la vi- tamine B12 au moyen de composés qui fournissent les ions cyanure (entre autres les cyanures métalliques, le cyanure ammonique ou l'acide cyanhydrique).
Parmi les milieux dissolvants appropriés, on compte l'eau, les mélanges dis- solvant organiques-aqueux ou des solvants organiques contenant des.ions cya- nure et dans lesquels les substances semblables à la vitamine B12 sont solu- bleso Pour des fins pratiques, on estime qu'il est très commode d'effectuer la réaction dans un milieu aqueux.
Bien qu'une étude de la réaction montrerait qu'il faut une môle d'ions cyanure par môle de substance semblable à la vitamine B12;, on préfère ordinairement utiliser un excès d'ions cyanure pour assurer Inachèvement de la transformation. Lorsqu'on traite une solution aqueuse de substances sem- blables à la vitamine B12 par un.
excès de cyanure métallique, comme le cya- nure sodique ou le cyanure ammonique, ce qui donne une sclution alcaline., on forme un complexe intermédiaire de couleur pourpre, qui apparaît être iden- tique à la substance qui se forme lorsqu'on ajoute du cyanure sodique à une solution aqueuse de vitamine B12 Lorsqu'on acidifie une solution contenant ce complexe pourpre, la solution reprend la couleur rouge qui est caractéris- tique de la vitamine B12 Cependant, en l'absence d'un excès de cyanure mé- tallique ou d'un pH alcalin, ce processus d'acidification n'est pas nécessai- re étant donné que le complexe pourpre ne se forme pas. Lorsqu'on utilise l'acide cyanhydrique comme source d'ions cyanure, le complexe pourpre ne se forme pas, même lorsqu'on utilise un excès considérable.
La vitamine B12 obtenue par cette réaction est en tous points identique à la vitamine B12 obtenue directement à partir de bouillons de fer- mentation. On a établi cette identité en comparant les spectres d'absorption ultra-violet., visible et infra-rouge, la rotation optique, les analyses élé- mentaires, la structure cristalline, les points de fusion ou de décomposi- tion;, la solubilité en phase, le comportement polarographique et le coeffi- cient de partage aussi bien que par l'activité microbiologique et l'activité clinique.
Lorsqu'on effectue le procédé de la présente invention, on peut faire réagir des matières semblables à la vitamines B12 à divers stades de récupération à partir de bouillions de fermentation., avec une substance four- nissant des ions cyanure. Ainsi par exemple,on peut traiter le bouillon
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de fermentation par une petite quantité dun cyanure approprié comme le cya- nure potassique ou sodique, ou bien on peut traiter en alternative,des con- centrés de matières semblables à la vitamine B12seuls ou en combinaison avec la vitamine B12 au moyen d'une substance fournissant des ions cyanure.,
Lorsque on traite un bouillon de fermentation contenant à la fois la vitamine B12 et des substances semblables à la vitamine B12 conformément à la présente invention,
on ajoute au bouillon une certaine quantité de sub- stance fournissant un excès dions cyanure pour effectuer la transformation des matières semblables à la vitamine B12 en vitamine B120 On enlève alors la vitamine B12 de cette solution par adsorption sur un adsorbant approprié comme la terre de Fuller, le charbon de bois, etc...
On peut utiliser ce pro- duit d'adsorption comme un supplément de vitamine B12 pour fortifier les nour- ritures animales ou alternative, comme matière de départ pour la séparation de la vitamine B12 pureo
Il est cependant préférable, lorsqu'on effectue la procédé de lâ présente invention, d'employer un concentré de substances semblables à la vitamine B12 car cela réduit le volume de matières à manier et diminue la difficulté et les dangers qu'il y a à se débarrasser du cyanure qui n'a pas réagi.
On préfère également traiter un concentré contenant à la fois la vitamine B12 et les matières semblables à la vitamine B12, car comme on l'a indiqué plus haut, l'un des avantages pratiques du nouveau procédé est d'é- liminer les procédés difficiles impliqués, nécessaires à la séparation de ces matières.
On traite la solution ou le concentré solide contenant les ma- tières semblables à la vitamine B12 au moyen d'une substance fournissant un excès d'ions cyanure, d'une façon qui assure un contact intime des réac- tifs et l'achèvement de la réaction. Il est préférable d'agiter soigneuse- ment le mélange et de le laisser alors reposer pendant un court laps de temps,c'est-à-dire 15 à 45 minutes environ. On peut employer toute sub- stance fournissant un excès d'ions cyanure,comme par exemplel'acide cyan- hydrique liquide ou gazeux, un sel métallique ou ammonique de l'acide cyan- hydrique, ou des mélanges d'un cyanure métallique et d'un acide., qui forme in situ de l'acide cyanhydrique.
Il faut seulement que le cyanure métalli- que utilisé, en milieu neutre ou alcalin, fournisse des ions cyanure dans les conditions de réaction utilisées. Les cyanures alcalins et alcalino- terreux remplissent cette condition. On a découvert, par exemplequ'on peut employer effectivement les cyanures sodique, potassique, de baryum, calcique et de strontium.
Lorsqu'on traite un concentré solide par de l'acide cyanhydrique liquide ou gazeux, il y a une ionisation suffisante de l'acide cyanhydrique pour que la réaction se fasse en l'absence d'un solvant quoique l'on puisse employer un solvant avantageusement. On effectue cependant de préférence la réaction entre les matières semblables à la vitamine B12 et les sels de l'acide cyanhydriqueen présence d'un solvant qui favorise l'ionisation du sel, comme par exemple l'eau, les alcools ayant un à trois carbone et des mélanges dissolvant organiques-aqueux, dans lesquels les matières semblables à la vitamine B12 et la substance fournissant les ions cyanuresoient solu- bles. Dans une opération à grande échelle il est très commode et économique d'effectuer la réaction en solution aqueuse.alcaline.
Lorsqu'on déclare qu'on utilise un excès d'ions cyanure, il faut comprendre que cela signifie plus que la quantité en dessous de laquelle le rendement en vitamine B12 pure commence à diminuer. Le mieux est de déter- miner cette quantité expérimentalement pour chaque matière de départ brute, car on verra que la composition de divers bouillons ou concentrés varie con- sidérablement, On peut également déterminer approximativement la quantité d'ions cyanure nécessaire, en mesurant la densité optique d'un échantillon de la matière à traiter en utilisant la lumière de 55000A de longueur d'onde qui est l'un des maximums d'absorption caractéristiques de la vitamine Bl2o La valeur obtenue, qui représente la couleur due à la vitamine B12, lors
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qu'elle est présente,
plus celles qui sont dues aux substances semblables à la vitamine B12 est comptée comme vitamine B12 potentielle. Pour chaque milligramme de vitamine B12 potentielle ainsi calculé, on préfère utiliser environ 0,5 2 mg d'ions cyanure., ce qui apparaît comme un excès considé- rableo
On comprendra qu'il y a ordinairement en présence de nombreuses impuretés non identifiées avec les matières semblables à la vitamine B12 Pour autant que ces impuretés soient capables de réagir avec l'ion cyanure, il est nécessaire de fournir un excès suffisant de cet ion pour satis- faire leur demande ainsi que suffisamment pour assurer la complète trans- formation des matières semblables à la vitamine B12
Lorsqu'on effectue la réaction dans une solution aqueuse en uti- lisant un cyanure métallique à un pH alcalin,
la formation du complexe pour- pre mentionné ci-dessus, constitue une indication visuelle commode de l'ad- dition d'un excès de cyanure.
On transforme le complexe pourpre formé, en vitamine B12, en aci- difiant le mélange de réaction à un pH d'environ 5 ou plus faible. On peut employer pour l'acidification, des acides ordinaires comme l'acide chlorhydri- que, sulfurique ou acétique.
Il faut comprendre que l'utilisation d'un excès de cyanure n'est pas essentielle, car on peut obtenir un rendement en vitamine B12 considéra- ble ment accru en utilisant une quantité de cyanure qui ne réagit pas avec la totalité des matières semblables à la vitamine B12 Il est cependant pré- férable d'utiliser un excès, ce qui donne le rendement maximum en vitamine B12 et rend également inutile le processus difficile d'élimination des ma- tières semblables à la vitamine B12 lorsqu'on isole celle-ci à l'état pur.
Après achèvement de la réaction, on élimine le cyanure qui n'a pas réagi par évaporation partielle, à un pH acide. On peut effectuer cet- te évaporation à une température aussi élevée que 50 - 60 C et sous pres- sion réduite de préférence. On effectue l'évaporation jusqu'à ce que l'ex- cès acide cyanhydrique soit substantiellement entièrement éliminé. Lors- qu'on fait réagir un concentré solide avec de l'acide cyanhydrique liqui- de ou gazeux, on peut éliminer le cyanure qui n'a pas réagi par évapora- tion sous vide ou à la pression atmosphérique. D'autre part, lorsqu'on fait réagir une solution avec le cyanure., il est parfois judicieux d'utiliser un courant d'azote ou d'air pour accélérer l'élimination du cyanure qui n'a pas réagi.
Après le traitement au cyanure, l'acidification (lorsqu'elle est nécessaire) et l'élimination sous forme d'acide cyanhydrique., du cyanure n'ayant pas réagi, on poursuit le traitement du mélange de réaction pour en obtenir la vitamine B12 pure. On connaît diverses méthodes de traitement de mélanges contenant la vitamine B12 pour obtenir la vitamine B12 pure et la présente invention ne se limite pas à l'utilisation d'une méthode parti- culière de récupération.
L'un de ces procédés qu'on peut employer de façon pratique pour récupérer la vitamine B12 comprend la saturation d'une solu- tion de vitamine B12 au moyen d'un sel inorganique (entre autres le sulfate ammonique., le chlorure sodique, le sulfate sodique ou le sulfate d'aluminium) et l'extraction de la solution saturée par l'alcool benzylique, ensuite le séchage de l'extrait à l'alcool benzylique comme par exemple en chauffant dans le vide à une température d'environ 75-80 C et l'addition d'éther à la solution sèche dans l'alcool benzylique pour effectuer la précipitation de la vitamine B12 brute. On dissout alors le précité dans de l'eau satu- rée d'alcool benzylique et contenant environ 2-3% d'acide acétique glacial.
On introduit cette solution et un volume approximativement équivalent d'eau saturée d'alcool benzylique dans des récipients appropriés et on les ex- trait successivement au moyen de portions approximativement équivalentes d'alcool benzylique saturé d'eau. On peut effectuer ces extractions de fa- çon continue ou en extrayant successivement les deux premières solutions men- tionnées avec 6 à 8 portions d'alcool benzylique saturé d'eau. On sèche alors les extraits à l'alcool benzylique réunis et on les traite à l'éther pour
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précipiter la vitamine B12 purifiée. On peut dissoudre ce précipité dans' l'eau et le faire cristalliser pour obtenir de la vitamine B12 à 95% de pu= reté qui est préférable pour l'usage clinique.
On peut effectuer une pu- rification supplémentaire en faisant recristalliser dans l'eau.
Dans le cas où le précipité obtenu après l'extraction à l'alcool benzylique ne serait pas suffisamment purifié pour fournir de la vitamine
B12 à 95% de pureté ou plus par cristallisation, on peut purifier davanta- ge le précipité en dissolvant dans du méthanol, en enlevant la vitamine B12 de la solution par adsorption sur une colonne d'alumine activée et en dé- veloppant la colonne et en lessivant au méthanol. Le liquide sortant con- centré, traité à l'éther fournit un nouveau précipité de vitamine B12 puri- fiée. En alternative, on peut effectuer la précipitation supplémentaire en répétant le processus d'extraction à l'alcool benzylique.
Dans cette con- joncture, on comprendra qu'on peut traiter à nouveau les résidus aqueux de l'extraction à l'alcool benzylique et les fractions de lessive à faibles te- neurs en vitamine B12 de l'étape de purification chromatographique, par l'ion cyanure comme on l'expose ici et qu'on peut les réintroduire dans le pro- cessus pour produire des quantités additionnelles de vitamine B120
Pour s'assurer de la quantité de vitamine B12 présente dans di- vers concentrés intermédiaires et pour déterminer la quantité de vitamine
B12 présente avant et après le traitement au cyanure., il est nécessaire d'a- voir une méthode d5essai, On a trouvé avantageux d'utiliser une modifica- tion de l'extraction à contre courant à l'eau-alcool benzylique,
comme mé- thode d'essai. Cette méthode se base sur un coefficient de partage déter- miné expérimentalement de la vitamine B12 de 1,2 pour le système eau-alcool benzylique.
Dans l'exécution de la méthode de contrôle, on soumet la matière ayant une teneur inconnue en vitamine B12 à une distribution à contre-cou- rant à huit plateaux, entre des portions d'eau et d'alcool benzylique de vo- lumes égaux. On a découvert que les substances semblables à la vitamine B12 et d'autres produits interférant possèdent des coefficients de partage con- sidérablement plus élevés et qu'on les trouvera dans les trois premiers pal- teaux de la distribution. En outre, on décèle la présence dans certains cas., de substances à coefficients de partage plus faibles qu'on trouvera dans les trois derniers plateaux de la distribution. La courbe de partage de la vita- mine B12 atteint un maximum au,quatrième plateau.
On mesure la densité op- tique des contenus, du quatrième-(ou cinquième) plateau à 5500 , et la valeur obtenue représente la couleur due à la vitamine B120 En comparant avec la densité optique de la vitamine B12 pure Ltemine 63n on peut calculer la te- neur en vitamine B12 du plateau. Le quatrième plateau contient 29,1 % (24,2% dans le cinquième plateau) de ia totalité de vitamine B12 présente dans-la matière inconnue. De cette façon, on peut calculer la quantité totale de vitamine B12 présente. Cette méthode de contrôle fournit ordinairement une valeur absolue pour la vitamine B12 lorsque la matière inconnue possède une ! teneur élevée en vitamine Bl2, c'est-à-dire plus de 75% environ selon la na- ture des impuretés.
A pureté décroissante, la méthode est moins sûre pour déterminer des valeurs absolues à cause des impuretés supplémentaires qui interfèrent; la méthode d'essai indique alors la quantité maximum de vitami- ne B12 présente. On peut soumettre des matières brutes à très faibles te- neurs en vitamine B12 et contenant des couleurs qui interfèrent à une dis- tribution à contre-courant suivie d'un essai LLD du quatrième (ou cinquième) plateau, au lieu d'une détermination de couleur, et on calcule alors la quan- tité maximum de vitamine B12 présente sur la base de 11,000,000 d'unités LLD par mg de vitamine B12 La méthode suivante constitue une façon de réaliser la méthode d'essai qui précède%
On ajoute à chacun des huit tubes de centrifugation de 15 ml, 5 ml d'eau saturée d'alcool benzylique, Au premier tube,
on ajoute la matiè- re salide à essayer, en quantité qu'on estime contenir 1-10 mg de vitamine
B12 On ajoute alors au premier tube 5 ml d'alcool benzylique saturé d'eau, on agite le tube, et on sépare les phases par centrifugation. On transfère la phase inférieure (alcool benzylique) dans le second tube, où on répète
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le processus. On continue à procéder ainsi avec chaque tube successivement jusqu'à ce que la phase d'alcool benzylique soit en équilibre avec l'eau du huitième tube. On fait alors passer une seconde portion de 5 ml d'alcool benzylique saturé d'eau dans chaque tube successivement, de la même façon jusqu'à ce qu'elle soit en équilibre avec l'eau du septième tube.
On conti- nue à procéder ainsi avec six portions supplémentaires d'alcool benzylique, après quoi, les huit tubes contiennent tous deux phases en équilibre. On ajoute au contenu du quatrième tube (ou cinquième)., 10 ml de chloroforme pour transférer la vitamine B12 dans la couche aqueuse. On détermine alors la densité optique de la couche aqueuse à 550 dans une cellule de I cm On calcule alors la quantité totale de vitamine B12 présente, à partir de cette valeur, comme décrit ci-dessus.
Les exemples suivants montrent diverses méthodes pour traiter les matières semblables à la vitamine B12 par l'ion cyanure pour les trans- former en vitamine B12,en même temps qu'ils indiquent le rendement accru en vitamine B12 obtenu en faisant réagir avec l'ion cyanure des mélanges contenant à la fois la vitamine B12 et des matières semblables à la vitami- ne B12 Il faut comprendre, toutefois, que ces exemples sont donnés comme illustration et non comme limitation.
EXEMPLE 1. = Préparation préliminaire d'un concentré de vitamine B12
On a acidifié au pH 2,5 environ 2200 gal de bouillon de fermen- tation obtenu par l'élaboration d'une souche de S griseus et titrant 4630 unités par ml d'acivité LLD, au moyen d'acide phosphorique et on a effectua une clarification préliminaire par filtration au moyen de terre de diato- méeso On a neutralisé au pH 7-8 avec l'hydroxyde de sodium et on a filtré à nouveau au moyen de terre de diatomées. On a alors traité le filtrat par 88 livres de charbon de bois activé pour adsorber les facteurs actifs. A- près l'avoir éliminé par filtration, on a agité le charbon de bois avec 45 gala de n-butanol pendant 15 minutes.
On a ajouté au mélange 35 gal, d'eau et 25 livres d'aide filtrant et on a agité le mélange pendant 45 minutes.
On a éliminé la matière solide par filtration dans une centrifugeuse à bol et on a alors lavé plusieurs fois dans la centrifugeuse avec une quantité totale d'environ 40 gal d'eau préalablement saturée de butanol. On a réu- ni le filtrat et les eaux de lavage et on a séparé les couches de butanol e t d'eau. On a filtré la couche d'eau qui contenait pratiquement toute la ma- tière possédant l'activité LLd pour éliminer les fines de carbone.
On a ajouté aux 85 gal de couche d'eau filtrée obtenus, 13 gal d'alcool benzylique et 425 livres de sulfate ammoniqueo On a agité le mé- lange pendant 15 minutes et on l'a alors laissé reposer pendant une heure.
On a séparé la couche aqueuse et on l'a extraite à nouveau au moyen de 8,5 gal d'alcool benzylique, On a réuni les extraits à l'alcool benzylique et on les a séchés,sur du sulfate sodique anhydre. Le volume des extraits secs était d'environ 28 gala (l'augmentation de volume était due à la présence de butanol)
On a alors chromatographié la solution dans l'alcool benzylique, sur 20 kg d'alumine activée. La solution entière ayant été incorporée à la colonne, on a lavé celle-ci avec un mélange de méthanol et d'acétone dans le rapport 1 2 jusqu'à ce que le liquide sortant soit clair comme l'eau.
On a alors développé la colonne au moyen de méthanol et on a recueilli com- me fraction riche tout le liquide sortant contenant une coloration rouge.
On a obtenu cinquante deux litres de fraction riche.
On a concentré sous vide le liquide sortant, riche, en dessous de 35 C jusqu'à deux litres environ et on l'a fait précipiter en ajoutant un volume d'acétone et 4 volumes d'éther.
On a extrait le précipité par portions au moyen de méthanol jus- qu'à ce qu'il reste un résidu blanc. La mesure de la densité optique de la solution de méthanol à 5500 indiquait un maximum de 416 mg de vitamine B12 et de matières semblables à la vitamine B12 On a traité une partie a- liquote de la solution dans le méthanol, au moyen d'éther pour effectuer la
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précipitation et on a soumis le précipité à une distribution à contre-cou- rant à huit tubes dans le système alcool benzylique-eau.
La quantité maximum de vitamine B12 présente déterminée par la méthode d'essai à contre-courant, était de 187 mg.
Transformation des matières semblables à la vitamine B12 au moyen de cyanure.
On a divisé en deux le restant de la solution et on a traité une moitié à l'éther pour effectuer la précipitation. On a dissous le précipité dans environ 100 ml d'eau. On a ajouté huit ml d'une solution aqueuse à 1% de cyanure de potassium en agitant, et on a laissé reposer la solution pen- dant environ 15 minutes. On a alors traité la solution par l'acide chlorhy- drique jusqu'au pH 4 On a ajouté septante grammes de sulfate ammonique et on a extrait le mélange au moyen de portions de 20 ml, 10 ml et 10 ml d'al- cool benzylique. On a séché les extraits à l'alcool benzylique en chauffant sous vide à 75-80 C on a filtré la solution résultante et on l'a traitée par l'éther pour effectuer la précipitation.
On a dissous le précipité dans 20 ml d'eau préalablement saturée à l'alcool benzylique et à laquelle on avait ajouté 0.5 ml d'acide acétique. glacial. On a introduit la solution dans un tube à centrifugation de 40 ml On a ajouté dans un second tube à centrifugation de 40 ml, 20 ml d'eau satu- rée d'alcool benzylique, On a alors fait passer sept portions de 20 ml d'al- cool benzylique saturé d'eau à contre-courant dans les deux tubes, chaque portion d'alcool benzylique étant utilisée pour extraire en premier lieu le,
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tube 1:-Jo 1 etT en.suite' le tube- 2a Les- solut,i<1>:i1s dans l'alcool benzylique ont alors été réunies, on les a séchées par chauffage'"'sous vide et traitées à l'éther pour effectuer la précipi,'-U-a.-tion.
On notera que cetterméthode d'ex- traction à contre-courant est réellement équivalente à la distribution à con- tre-courant pour la séparation de la vitamine B12 de toutes matières résiduel- les semblables à la-vitamine B12 Il n'est pas nécessaire de conserver à part
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les derniers tubes de la distribution à contre-courant étant donné quà av;.; point ils contiennent tous essentiellement la vitamine B12 pure.
On a dissous le précipite obtenu dans 1,1 ml d'eau et on l'a lais- sé cristalliser. On a enlevé les cristaux par centrifugation et on les a fait recristalliser en les dissolvant dans 10 ml d'eau, en ajoutant de l'a- cétone (environ 120 ml) jusqu'à formation d'un trouble et en laissant repo- ser la solution. On a obtenu 127 mg de cristaux (séchés à 100 sous vide) à 95% de pureté déterminée par l'essai de distribution à contre-courant.
On a contrôlé l'identité de ces cristaux avec la vitamine B12 authentique en comparant les propriétés physiques et chimiques. Les résultats figurent dans le tableau suivant
Comparaison du produit du procédé au cyanure avec la vitamine
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------------- =------- B12 authentique, --------------------- ==============
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<tb> Produit <SEP> du <SEP> procédé <SEP> au <SEP> Vitamine <SEP> B12
<tb>
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=.=#= cyanure. '"'" ='" mmom=mmmm
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<tb> Coefficient <SEP> de <SEP> partage <SEP> 1,2 <SEP> 1,2
<tb>
<tb> eau/alcool <SEP> benzylique
<tb>
<tb> Spectre <SEP> d'absorption
<tb>
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A max.
(î) 27899 3615, 5500 2780, 3610, 5500
EMI7.8
<tb> Absorption <SEP> infra-rouge <SEP> Les <SEP> deux <SEP> substances <SEP> correspondent <SEP> en <SEP> détail
<tb>
EMI7.9
Indices de réfraction 10618 00002 10616 + + 0,002 10650 + 00002 10652 0,002 1.650 - 0.002 1.652 0002 10668 = 00002 1.664 - 00002 Rotation optique M 23 61 + 9 59 + 9
EMI7.10
<tb> 6563A
<tb>
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uomparaison des Soub1es : La aenennina-cion ae la so1ua11lte absolue en solution aqueuse aussi bien que de la solubi-
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lité en mélange dans une solution saturée de vitami- ne B12 authentique ont indiqué que les deux matières étaient identiques.
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On a traité à nouveau la solution aqueuse restante;, provenant de la distribution à contre-courant modifiée décrite ci-dessus, par le cyanure potassique en solution aqueuse. On a acidifié à nouveau la solution et on l'a alors extraite avec une solution de tétra chlorure de carbone et de cré- sol dans le rapport 2 1 et on a traité les extraits à l'éther pour effec- tuer la précipitation. On a dissous lé précipité dans une petite quantité de méthanol et on a traité à nouveau à l'éther pour effectuer la précipita- tion. On a alors dissous le précipité dans 0,13 ml d'eau et on l'a laissé cristalliser. On a obtenu 47 mg de cristaux (séchés à 100 C. sous vide).
On a déterminé par un essai de distribution à contre-courant que les cris- taux étaient de la vitamine B12 à 73% de pureté.
On a obtenu ainsi l'équivalent de 153.3 mg de vitamine B12 pure à partir de 1100 gal de bouillon de fermentation en utilisant le nouveau procédé.
On a obtenu de la seconde moitié de la solution méthanolique ini- tiale, un rendement de 50 mg de vitamine B12 après l'avoir traitée substan- tiellement de la même façon que la première moitié, en exceptant l'omission du cyanure. Ceci indique que le traitement au cyanure a pour effet de tri- pler la quantité de vitamine B12 isolée,
Lorsqu'on répète le procédé précédent en utilisant les cyanures ammonique, de barium et calcique au lieu du cyanure potassique, les résultats montrent dans chaque cas une augmentation approximativement triple de la quan- tité de vitamine B12 recueillie, grâce au traitement au cyanure.
EXEMPLE 2
On a purifié un concentré intermédiaire obtenu par la propagation de S griseus, contenant de la vitamine B12 et des substances semblables à la vitamine B12 par une distribution à contre-courant entre de l'eau et de l'alcool benzylique, en utilisant deux tubes d'eau et en faisant passer dans chacun successivement un total de sept portions d'alcool benzylique, de la façon décrite dans l'exemple 1 Le concentré n'avait pas été traité aupa- ravant par du cyanure. On a continué à traiter la matière purifiée se trou- vant dans les extraits à l'alcool benzylique,.pour.obtenir la vitamine B12 pure. On a réuni les couches aqueuses contenant des matières semblables à la vitamine B12 une petite quantité de vitamine B12 et des impuretés incon- nues et on les a traitées à l'éther.
Il s'est formé un précipité amorphe qu'on a séparé et séché. En opérant conformément aux méthodes antérieures, on a retraité ce précipité normalement avec d'autres fractions de rebut pour obtenir une petite récupération supplémentaire de vitamine B12 après de nombreuses étapes de purification. Cependant, il y avait encore une perte considérable des substances actives présentes.
On a traité une partie du précité amorphe à des fins de compa- raison et on a traité plusieurs portions par le cyanure de la façon sui- vante a) On a dissous dans l'eau une portion du précipité et on en a fait une analyse spectrographique. On a observé des maxima d'absorption à 3610 et 5200 On a alors soumis la solution à une distribution à contre-courant entre l'eau et l'alcool benzylique de la façon décrite dans la méthode d'essai. Les mesures de densité optique du cinquième tu- be de la distribution à contre-courant ont indiqué que 51% au maximum de l'ensemble de la vitamine B12 et des matières semblables à la vitami- ne B12 présentes, étaient effectivement de la vitamine B12, représentant 09112 mg de vitamine par mg de matière solide' initiale.
b) On a dissous dix et cinq dixièmes de mg du précipité amor- phe dans 3 ml d'eau et on a ajouté 0.2 ml d'acide cyanhydrique liquide On a laissé reposer la solution pendant une courte période et on l'a chauffée
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à 50-60 C pour éliminer l'excès d'acide cyanhydrique.
Des analyses spec- tographiques de la solution résultante ont montré des maxima d'absorption- à 3610 A, 5200 A, et 5500 , ce qui indique un déplacement vers le spectre de la vitamine B12 On a soumis la solution à une distribution à contre- courant entre l'eau et l'alcool benzylique, Une mesure de la densité opti- que de la solution du cinquième tube a montré que 88.3 % de l'ensemble de la vitamine B12 et des matières semblables à la vitamine B12 présentes, étaient de la-vitamine B12 représentant 0,220 mg de vitamine B12 par mg de matière de départ, soit une augmentation de 96% c) On a dissous neuf et six dixièmes de mg de précipité amorphe dans 2 ml de méthanol et on a ajouté 0,2 ml d'acide cyanhydrique liquide.
On a laissé reposer la solution pendant une période de 15 minutes dans un bain glacé et on l'a chauffée à 50 - 60 jusqu'à siccité. On a dissous le résidu dans de l'eau, Des analyses spectrographiaues de.la solution résultante ont montré des maxima d'absorption à 3610 5200 A 5500 Ä indi- quant un déplacement vers le spectre de la vitamine B12
On a soumis la solution aqueuse à une distribution à contre-cou- rant entre l'eau et L'alcool benzylique, La mesure de la densité optique de la matière du cinquième tube a montré que 81% de l'ensemble de la vitami- ne B12 et des matières semblables à la vitamine B12 représentant 0.219 mg de vitamine B12 par mg de matière de départ étaient de la vitamine B12,
soit une augmentation de 95.5%
On a traité trois fraction supplémentaires du précipité amorphe par l'acide cyanhydrique anhydre liquide, en solution dans l'éthanol, l'al- cool benzylique et le crésol respectivement, au lieu de la solution métha- noliqueo On a obtenu des augmentations de teneur en vitamine B12 dans tous les cas, ces augmentations étant du même ordre de grandeur que celles qu'on obtient en utilisant le méthanol. d) On a mélange soigneusement dix et huit dixièmes de mg de pré- cipité amorphe avec 2,2 ml d'acide cyanhydrique liquide anhydre et on a lais- sé reposer jusqu'à ce que l'acide cyanhydrique se soit évaporé. On a dissous le résidu dans l'eau.
Des analyses spectrographiques de la solution résultante ont montré des maxima d'absorption à 3610 A 5200 et 5500 A indi- quant un déplacement vers le spectre de la vitamine B12. On a soumis la so- lution aqueuse à une distribution à contre-courant entre l'eau et l'alcool benzylique. Des mesures de la densité optique du cinqième tube ont montré que 81% de l'ensemble de la vitamine B12 et des matières semblables à la vi- tamine B12, représentant 0.198 mg de vitamine B12 par mg de matière de dé- part étaient de la vitamine B12 soit une augmentation de 77%.
EXEMPLE 3
On -9 soumis trois mille gal de bouillon de fermentation prove- nant de plusieurs lots, obtenus par la propagation d'une souche de S.gri seus à une adsorption sur du charbon de bois, à une désorption au moyen de butanol et d'eau, à une extraction à l'alcool benzylique, à une analyse chromatographique et à une précipitation comme décrite dans l'exemple 1 On a extrait les matières solides précipitées au méthanol jusqu'à ce qu'il reste un résidu blanc.
La mesure de la densité optique de la solution ma- thanolique obtenue, mesurée à 5500 et comparée à la valeur relative à la vitamine B12 pure a montré la présence de 540 mg de vitamine B12 et de matières semblables à la vitamine B12a0n a ajouté de l'acétone et de 1'é- ther à la solution méthanolique pour effectuer la précipitation;, jusqu'à ce que les liqueurs ne contiennent plus de coloration rosé.
On a dissous le précipité dans 300 ml d'eau et on a ajusté le pH à 8 au moyen d'une solution aqueuse d'hydroxyde sodique. On a ajouté à cet- te solution 2,7 gr de cyanure sodique et on a laissé reposer la solution en agitant un peu, pendant 45 minutes. (La solution possédait une couleur pourpre indiquant qu'on avait ajouté un excès marqué de cyanure). On a a- lors acidifié la solution au pH 3 avec de l'acide chlorhydrique et on a fait passer de l'azote dans la solution pour éliminer l'acide cyanhydrique.
On a ajouté 210 gr de sulfate ammonique à la solution et on l'a extraite avec
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des portions de 50 ml, 25 ml, 25ml 25 ml et 10 ml d'alcool benzylique. On a séché les extraits par chauffage à 75-80 C sous vide, et on a filtré les extraits secs sur un entonnoir en verre fritte., On a ajouté de l'éther au filtrat pour effectuer la précipitation,
On a dissous le précipité dans 100 ml d'eau additionnée de 2 ml d'acide acétique glacial et on a introduit 100 ml d'alcool benzylique satu- ré d'eau dans un second tube. On a effectué une opération de distribution à contre-courant modifiée en faisant passer sept portions de 100 ml d'alcool benzylique saturé d'eau dans chaque tube successivement, comme décrit dans l'exemple I, et on a réuni les extraits à l'alcool benzylique après les avoir retirés du second tube.
On a séché les extraits réunis par chauffage à 75- 80 C, sous vide,. On a ajouté de l'éther aux extraits séchés pour effectuer la précipitation.
On a dissous le précipité dans du méthanol, et on l'a chromatogra- phié sur de l'alumine activée, en développant la colonne avec du méthanol.
On a traité le liquide sortant riche par l'éther pour effectuer la précipi- tation On a mis les queues de la chromatographie en réserve pour être re- traitées. Elles contenaient à 5500 à une couleur qui, calculée en vita- mine B12 était équivalente à environ 90 mg de vitamine B12 On a dissous le précipité dans.1.9 ml d'eau et on l'a laissé cristalliser. On a dissous les cristaux rouges dans 20 ml d'eau et on a filtré la solution. On a uti- lisé 20 ml supplémentaire d'eau pour laver l'appareillage et on les a ajou- tés à la solution. On a ajouté 520 ml d'acétone et la cristallisation s'est produite. On a séparé les cristaux par centrifugation, on les a lavés à l'a- cétone et on les a séchés à 560 C sous vide, On a obtenu 324.7 mg de cris- taux rouges.
Un échantillon des cristaux a perdu 5 % de son poids par sé- chage à 100 C L'échantillon sec s'est montré être de la vitamine B12 à 94% de pureté par un essai de distribution à contre-courant, indiquant la récu- pération de 290 mg de vitamine B12 pure.
On a trouvé qu'on obtenait substantiellement les mêmes résultats en effectuant le traitement au cyanure dans une solution aqueuse méthanoli- que et dans une solution aqueuse éthanoliqueo EXEMPLE 1......
On a appliqué le traitement au cyanure pour la transformation de matières semblables à la vitamine B12, à un bouillon de fermentation et on a évalué la transformation en utilisant la méthode d'essai à contre-courant.
On a traité 3 litres de bouillon de fermentation obtenu par l'élaboration d'une souche de S.griseus par 201 gr de cyanure sodique dissous dans une petite quantité d'eau. On a agité la solution pendant deux heures et on l'a portée au pH 4 avec de l'acide chlorhydrique concentré. On y a appli- qué le vide de sorte que de l'air a barbotté toute une nuit à travers la so- lutiono On a.ajouté à la solution 2150 gr de sulfate ammonique et 30 ml d'al- cool benzylique On a agité le mélange, on l'a laissé déposer et on en a re- tiré la couche,,-d'alcool benzylique. On a extrait alors à-nouveau la couche aqueuse avec-une portion de 20 ml et trois portions de dix ml d'alcool ben- zylique. La couche d'eau consommée qui ne contenait aucune activité LLD a été écartée.
On a dilué les extraits à l'alcool benzylique réunis,avec deux volumes de chloroforme et on les a extrait avec trois portions de 5 ml d'eau.
On a soumis dix ml de la solution aqueuse contenant environ 300.000 unités LLD par ml à une distribution à contre-courant à huit plateaux avec de 1'al- cool benzylique en utilisant des phases de 10 mlo Les résultats de la dis- tribution à contre-courant sont indiqués dans le tableau ci-joint.
On a effectué le même traitement sur trois litres du même bouil- lon à l'exception de l'addition de cyanure sodique. On a soumis encore la solution aqueuse initiale obtenue par extraction à l'alcool benzylique à une distribution à contre-courant d'alcool benzylique. Les résultats supplé- mentaires sont indiqués dans le tableau.
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Effet du cyanure sodique sur la transformation de 1'ac- tivité LLD dans un bouillon en vitamine B12
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-------------------------------------------------- (Résultats d'essai de distribution à contre-courant dans le système alcool benzylique=eau}0 Pourcentage de répartition
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--------------------------------------
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<tb> Tube <SEP> N <SEP> Il <SEP> Bouillon <SEP> non <SEP> traité <SEP> " <SEP> Bouillon <SEP> traité <SEP> Il <SEP> Vitamine <SEP> B12 <SEP> pure
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<tb> --------------------------------------------------------------------------
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<tb> 1 <SEP> 28,7 <SEP> 1 <SEP> 1.4
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<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 19.1 <SEP> 6.1 <SEP> 8.3
<tb>
EMI11.4
3 23.4 29.0 20'09
EMI11.5
<tb> 4 <SEP> 15,
5 <SEP> 29.2 <SEP> 29.1
<tb>
EMI11.6
5 5.4 20.9 24.2
EMI11.7
<tb> 6 <SEP> 3.9 <SEP> 11.2 <SEP> 12.1
<tb>
EMI11.8
7 2.6 2.6. 3.3 8 0.7 0.9 O4
Le tableau ci=dessus montre un déplacement marqué dans le com- portement dans la distribution à contre-courant, de Inactivité LLD par rapport au comportement typique de la vitamine B12 après le traitement du bouillon par le cyanure sodique. A partir des données ci-dessus, il est impossible de calculer exactement les quantités de vitamines B12 contenues dans les bouillons traité et non traité. On peut voir cependant que la répartition du bouillon traité est différente de celle du bouillon non trai- té et très semblable à celle de la vitamine B12 pure.
En outre, il est évident que lacivité du bouillon traité dans le quatrième tube (tube qui montre une teneur maximum en vitamine B12) est presque le double de celle du bouillon non traité.
EXEMPLE 50
On a obtenu un bouillon de fermentation par la propagation d'une
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souche de S. sriseus# On a acidifié 100 litres de bouillon au pH 2.5 avec de l'acide chlorhydrique. On a alors traité le bouillon par 220'mg de cya- nure sodique et on a agité le lot pendant 10 minutes. On a àjouté 100 gr de terre de Fuller et 100 gr de terre de diatomées, on a agité la bouillie résultante pendant 30 minutes, on a séparé le produit d'adsorption par fil- tration et on l'a séché à 50 C Le produit d'adsorption a montré une ac-
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tivité de 8430000 unités par gr mesurée sur le Lnlactis Dorner dans le Ileup essay" et a montré une action favorable à la croissance des poulets.
Essentiellement toute la matière active du bouillon s'adsorbe par traitement à la terre de Fuller dans les conditions décrites, La teneur en vitamine B12 du bouillon étant augmentée de façon marquée par le traitement au cyanure;, comme le montre l'exemple 4., la teneur en vitamine B12 du produit d'adsorption ainsi préparé à partir du bouillon traité, s'accroît proportion- nellement,
Divers changements ou modifications dans les méthodes précédentes viendront à l'espirt des experts en cette matière et pour autant que ces chan- gements ou modifications soient compris dans les revendications ci-après, on doit comprendre qu'ils sont parties intégrantes de l'invention.
REVENDICATIONS.
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VITAMIN B 12 RECOVERY PROCESS
This invention relates to the manufacture of vitamin B12 and especially to obtaining increased yields of vitamin B12 from raw materials containing substances closely related to vitamin B12, but having significantly lower physiological activity (ie. (i.e. activity against pernicious anemia and animal protein factor activity) than that of vitamin B120. This invention relates more particularly to novel methods of converting such substances similar to vitamin B12 into vitamin Bb12
According to the present invention;
Vitamin B12 is obtained from a starting material consisting of fermentation broths obtained by propagating a microorganism producing vitamin B12 in a suitable nutrient medium, or concentrates thereof by processing the starting material with a substance supplying cyanide ions and thereby obtaining a reaction mixture which contains an increased amount of vitamin B12
Various methods of obtaining vitamin B12 from liver and fermentation broths have been disclosed in the literature.
For example, Rickes et al. In Science 108 634-35 (deco 3,1948) have shown that vitamin B12 can be obtained from fermentation broths produced by S. treptomyces griseus Pierce et al. J.A.CS 71:
2952, have also shown that vitamin B12 can be obtained from fermentation broths produced by Streptomyces aureofaciens, whereas fermentation broths obtained by the propagation of microorganisms producing vitamin B12 provide a practical source for the commercial manufacture of vitamin B12 it has been found that such broths also contain fermentation products which are mentioned here as materials similar to vitamin B12 but which show only a fraction of inactivity against anemia pernicious and animal protein factor activity exhibited by vitamin B12 itself.
In the manufacture of vitamin B12 of uniform purity, the removal of these materials
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Res similar to vitamin B12 created a difficult problem. Due to the close relationship between these materials and vitamin B12, it has only been possible to separate pure, crystallized vitamin B12 by using complicated and expensive methods.
It has now been discovered that it is possible to convert these heretofore undesirable vitamin B12-like materials almost quantitatively into vitamin B12, thereby materially simplifying the process of obtaining pure vitamin B12. while at the same time considerably increasing the yield of vitamin B12 which can be obtained from fermentation broths.
Considered in some of these broadest aspects, the novel process according to the present invention consists of reacting the vitamin B12-like materials with a substance providing cyanide ions and thereby converting these materials into vitamin B12. For example, by treating fermentation broths or suitable concentrates thereof, both containing vitamin B12 and substances similar to vitamin B12, with a source of cyanide ions, it was found that considerably increased yields of pure vitamin B12 were obtained. In addition, as previously stated, the separation of vitamin B12 is greatly facilitated.
As a further embodiment of this invention, it has been found that this transformation can be carried out under various conditions using various sources of cyanide ions. Usually, the reaction is carried out by bringing the substances similar to vitamin B12 into intimate contact with the cyanide ions, and thereby converting these substances into vitamin B12., For example, solutions of substances similar to the vitamin can be processed. tamine B12 by means of compounds which provide the cyanide ions (among others metal cyanides, ammonic cyanide or hydrocyanic acid).
Suitable dissolving media include water, organic-aqueous solvent mixtures or organic solvents containing cyanide ions and in which substances similar to vitamin B12 are soluble. For practical purposes, it is believed to be very convenient to carry out the reaction in an aqueous medium.
Although a study of the reaction would show that one mole of cyanide ions per mole of vitamin B12-like substance is required, it is usually preferred to use an excess of cyanide ions to ensure completion of the transformation. When treating an aqueous solution of substances similar to vitamin B12 with a.
excess metallic cyanide, such as sodium cyanide or ammonium cyanide, which results in alkaline sclution., a purple colored intermediate complex is formed, which appears to be identical to the substance which forms when added sodium cyanide to an aqueous solution of vitamin B12 When a solution containing this purple complex is acidified, the solution regains the red color which is characteristic of vitamin B12 However, in the absence of an excess of metallic cyanide or alkaline pH, this acidification process is not necessary since the purple complex does not form. When hydrocyanic acid is used as the source of cyanide ions, the purple complex does not form, even when a considerable excess is used.
Vitamin B12 obtained by this reaction is in all points identical to vitamin B12 obtained directly from fermentation broths. This identity was established by comparing ultraviolet, visible and infra-red absorption spectra, optical rotation, elementary analyzes, crystal structure, melting or decomposition points, solubility. in phase, polarographic behavior and partition coefficient as well as by microbiological and clinical activity.
In carrying out the process of the present invention, vitamin B12-like materials at various stages of recovery from fermentation slurries can be reacted with a substance providing cyanide ions. So for example, we can treat the broth
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of fermentation with a small amount of a suitable cyanide such as potassium or sodium cyanide, or alternatively, concentrates of materials similar to vitamin B12 alone or in combination with vitamin B12 by means of a substance providing cyanide ions.,
When processing a fermentation broth containing both vitamin B12 and substances similar to vitamin B12 in accordance with the present invention,
a certain quantity of substance providing an excess of cyanide ions is added to the broth to effect the transformation of materials similar to vitamin B12 into vitamin B120. The vitamin B12 is then removed from this solution by adsorption on a suitable adsorbent such as Fuller's earth , charcoal, etc ...
This adsorption product can be used as a vitamin B12 supplement to fortify animal foods or as an alternative, as a starting material for the separation of pure vitamin B12.
It is, however, preferable when carrying out the process of the present invention to employ a concentrate of substances similar to vitamin B12 as this reduces the volume of material to be handled and decreases the difficulty and the dangers of get rid of unreacted cyanide.
It is also preferred to process a concentrate containing both vitamin B12 and vitamin B12-like materials, since as noted above one of the practical advantages of the new process is to eliminate difficult processes. involved, necessary for the separation of these materials.
The solution or solid concentrate containing the vitamin B12-like material is treated with a substance providing an excess of cyanide ions, in a manner which assures intimate contact of the reagents and the completion of the reaction. the reaction. It is preferable to stir the mixture thoroughly and then allow it to stand for a short time, ie about 15 to 45 minutes. Any substance providing an excess of cyanide ions can be used, such as, for example, liquid or gaseous cyanhydric acid, a metal or ammonium salt of cyanhydric acid, or mixtures of a metal cyanide and 'an acid, which forms hydrocyanic acid in situ.
It is only necessary that the metallic cyanide used, in a neutral or alkaline medium, provide cyanide ions under the reaction conditions used. Alkaline and alkaline earth cyanides meet this condition. It has been discovered, for example, that sodium, potassium, barium, calcium and strontium cyanides can be used effectively.
When a solid concentrate is treated with liquid or gaseous hydrocyanic acid, there is sufficient ionization of the hydrocyanic acid for the reaction to proceed in the absence of a solvent although a solvent can be used. advantageously. However, the reaction between vitamin B12-like materials and salts of hydrocyanic acid is preferably carried out in the presence of a solvent which promotes ionization of the salt, such as, for example, water, alcohols having one to three carbon. and organic-aqueous solvent mixtures, in which the vitamin B12-like materials and the substance providing the cyanide ions are soluble. In a large-scale operation it is very convenient and economical to carry out the reaction in aqueous alkaline solution.
When declaring that an excess of cyanide ions is used, it should be understood that this means more than the amount below which the yield of pure vitamin B12 begins to decrease. It is best to determine this quantity experimentally for each crude starting material, as it will be seen that the composition of various broths or concentrates varies considerably. The quantity of cyanide ions required can also be determined approximately by measuring the density. optics of a sample of the material to be treated using light of wavelength 55000A which is one of the characteristic absorption maxima of vitamin Bl2o The value obtained, which represents the color due to vitamin B12, then
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that she is present,
plus those due to substances similar to vitamin B12 are counted as potential vitamin B12. For each milligram of potential vitamin B12 thus calculated, it is preferred to use about 0.5 2 mg of cyanide ions, which appears to be a considerable excess.
It will be understood that there are ordinarily in the presence many impurities not identified with the vitamin B12-like materials. In so far as these impurities are capable of reacting with the cyanide ion, it is necessary to provide a sufficient excess of this ion to satisfy their demand as well as enough to ensure the complete transformation of vitamin B12-like materials
When the reaction is carried out in an aqueous solution using a metal cyanide at alkaline pH,
the formation of the above-mentioned purple complex is a convenient visual indication of the addition of excess cyanide.
The purple complex formed is converted to vitamin B12 by acidifying the reaction mixture to a pH of about 5 or lower. Ordinary acids such as hydrochloric, sulfuric or acetic acid can be used for acidification.
It should be understood that the use of an excess of cyanide is not essential, since a considerably increased yield of vitamin B12 can be obtained by using an amount of cyanide which does not react with all of the similar materials. vitamin B12 However, it is preferable to use an excess, which gives the maximum yield of vitamin B12 and also eliminates the difficult process of eliminating materials similar to vitamin B12 when it is isolated. in its purest form.
After completion of the reaction, unreacted cyanide is removed by partial evaporation at acidic pH. This evaporation can be carried out at a temperature as high as 50-60 C and preferably under reduced pressure. Evaporation is carried out until the excess hydrocyanic acid is substantially completely removed. When a solid concentrate is reacted with liquid or gaseous hydrocyanic acid, unreacted cyanide can be removed by evaporation in vacuo or at atmospheric pressure. On the other hand, when reacting a solution with cyanide, it is sometimes advisable to use a stream of nitrogen or air to accelerate the removal of unreacted cyanide.
After cyanide treatment, acidification (when necessary) and removal as hydrocyanic acid, unreacted cyanide, further processing of the reaction mixture to obtain vitamin B12. pure. Various methods of processing mixtures containing vitamin B12 to obtain pure vitamin B12 are known, and the present invention is not limited to the use of a particular method of recovery.
One of these methods which can be conveniently employed to recover vitamin B12 comprises saturating a solution of vitamin B12 with an inorganic salt (inter alia ammonium sulfate, sodium chloride, sodium sulphate or aluminum sulphate) and extracting the saturated solution with benzyl alcohol, then drying the extract with benzyl alcohol such as for example by heating in vacuum to a temperature of about 75-80 C and the addition of ether to the dry solution in benzyl alcohol to effect precipitation of crude vitamin B12. The above is then dissolved in water saturated with benzyl alcohol and containing about 2-3% glacial acetic acid.
This solution and an approximately equivalent volume of water saturated with benzyl alcohol are placed in suitable containers and are successively extracted with approximately equivalent portions of benzyl alcohol saturated with water. These extractions can be carried out continuously or by extracting successively the first two solutions mentioned with 6 to 8 portions of benzyl alcohol saturated with water. The combined benzyl alcohol extracts are then dried and treated with ether to obtain
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precipitate purified vitamin B12. This precipitate can be dissolved in water and crystallized to obtain vitamin B12 at 95% purity which is preferable for clinical use.
Further purification can be carried out by recrystallizing from water.
In the event that the precipitate obtained after the extraction with benzyl alcohol is not sufficiently purified to provide vitamin
B12 at 95% purity or more by crystallization, the precipitate can be further purified by dissolving in methanol, removing vitamin B12 from the solution by adsorption on an activated alumina column and developing the column and by leaching with methanol. The concentrated exiting liquid treated with ether provides a new precipitate of purified vitamin B12. Alternatively, the further precipitation can be carried out by repeating the benzyl alcohol extraction process.
In this circumstance, it will be understood that the aqueous residues of the benzyl alcohol extraction and the low vitamin B12 lye fractions from the chromatographic purification step can be treated again by cyanide ion as discussed here and can be reintroduced into the process to produce additional amounts of vitamin B120
To ensure the amount of vitamin B12 present in various intermediate concentrates and to determine the amount of vitamin
B12 present before and after the cyanide treatment, it is necessary to have a test method. It has been found advantageous to use a modification of the countercurrent extraction with water-benzyl alcohol,
as a test method. This method is based on an experimentally determined partition coefficient for vitamin B12 of 1.2 for the water-benzyl alcohol system.
In carrying out the control method, the material having an unknown vitamin B12 content is subjected to an eight-plate countercurrent distribution between water and benzyl alcohol portions of equal volumes. . It has been found that substances similar to vitamin B12 and other interfering products have considerably higher partition coefficients and will be found in the first three layers of the distribution. In addition, the presence in certain cases is detected of substances with lower partition coefficients than will be found in the last three plateaus of the distribution. The partition curve for vitamin B12 peaks at the fourth plateau.
We measure the optical density of the contents, from the fourth- (or fifth) plateau to 5500, and the value obtained represents the color due to vitamin B120 By comparing with the optical density of pure vitamin B12 Ltemine 63n we can calculate the plateau vitamin B12 content. The fourth tray contains 29.1% (24.2% in the fifth tray) of the total vitamin B12 present in the unknown material. In this way, one can calculate the total amount of vitamin B12 present. This control method usually provides an absolute value for vitamin B12 when the unknown material has an! high vitamin B1 content, that is to say more than approximately 75% depending on the nature of the impurities.
With decreasing purity, the method is less reliable in determining absolute values because of the additional impurities which interfere; the test method then indicates the maximum amount of vitamin B12 present. Raw materials with very low levels of vitamin B12 and containing colors that interfere can be subjected to countercurrent distribution followed by a fourth (or fifth) plateau LLD test, instead of a determination. of color, and the maximum amount of vitamin B12 present is then calculated on the basis of 11,000,000 LLD units per mg of vitamin B12 The following method is one way of carrying out the above test method%
To each of the eight 15 ml centrifuge tubes, 5 ml of water saturated with benzyl alcohol are added, to the first tube,
add the salty material to be tested, in an amount estimated to contain 1-10 mg of vitamin
B12 5 ml of benzyl alcohol saturated with water are then added to the first tube, the tube is shaken, and the phases are separated by centrifugation. We transfer the lower phase (benzyl alcohol) to the second tube, where we repeat
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the process. This is continued with each tube successively until the benzyl alcohol phase is in equilibrium with the water in the eighth tube. A second 5 ml portion of benzyl alcohol saturated with water is then passed through each tube successively, in the same manner until it is in equilibrium with the water in the seventh tube.
This is continued with six more portions of benzyl alcohol, after which the eight tubes all contain two phases in equilibrium. To the contents of the fourth (or fifth) tube, 10 ml of chloroform is added to transfer vitamin B12 to the aqueous layer. The optical density of the aqueous layer is then determined at 550 in a 1 cm cell. The total amount of vitamin B12 present is then calculated from this value as described above.
The following examples show various methods of treating vitamin B12-like materials with the cyanide ion to convert them to vitamin B12, along with showing the increased yield of vitamin B12 obtained by reacting with the ion. cyanide mixtures containing both vitamin B12 and vitamin B12-like materials It should be understood, however, that these examples are given by way of illustration and not by way of limitation.
EXAMPLE 1. = Preliminary preparation of a vitamin B12 concentrate
About 2200 gal of fermentation broth obtained by the preparation of a strain of S griseus and assaying 4630 units per ml of LLD activity were acidified to pH 2.5 by means of phosphoric acid and carried out. preliminary clarification by filtration with diatomaceous earth. Neutralized to pH 7-8 with sodium hydroxide and filtered again with diatomaceous earth. The filtrate was then treated with 88 pounds of activated charcoal to adsorb the active factors. After removing it by filtration, the charcoal was stirred with 45 gala of n-butanol for 15 minutes.
To the mixture were added 35 gal of water and 25 lbs of filter aid and the mixture was stirred for 45 minutes.
Solid material was removed by filtration in a bowl centrifuge and then washed several times in the centrifuge with a total amount of about 40 gal of water previously saturated with butanol. The filtrate and the washings were combined and the layers of butanol and water were separated. The water layer which contained virtually all of the material having LLd activity was filtered to remove carbon fines.
To the resulting 85 gal of filtered water layer, 13 gal of benzyl alcohol and 425 lbs of ammonium sulfate were added. The mixture was stirred for 15 minutes and then allowed to stand for one hour.
The aqueous layer was separated and extracted again with 8.5 gal of benzyl alcohol. The benzyl alcohol extracts were combined and dried, over anhydrous sodium sulfate. The volume of the solids was about 28 gala (the increase in volume was due to the presence of butanol)
The solution was then chromatographed in benzyl alcohol on 20 kg of activated alumina. The entire solution having been incorporated into the column, it was washed with a mixture of methanol and acetone in the ratio 1 2 until the liquid leaving was clear as water.
The column was then developed with methanol and all of the outgoing liquid containing a red color was collected as a rich fraction.
Fifty two liters of rich fraction were obtained.
The exiting rich liquid was concentrated in vacuo below 35 ° C to about two liters and precipitated by adding one volume of acetone and 4 volumes of ether.
The precipitate was extracted in portions with methanol until a white residue remained. Measurement of the optical density of the 5500 methanol solution indicated a maximum of 416 mg of vitamin B12 and vitamin B12-like material. An alcoholic portion of the solution was treated in methanol with ether. to perform the
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precipitation and the precipitate was countercurrently distributed to eight tubes in the benzyl alcohol-water system.
The maximum amount of vitamin B12 present, determined by the countercurrent test method, was 187 mg.
Transformation of vitamin B12-like materials using cyanide.
The remainder of the solution was halved and one half treated with ether to effect precipitation. The precipitate was dissolved in about 100 ml of water. Eight ml of a 1% aqueous solution of potassium cyanide was added with stirring, and the solution was allowed to stand for about 15 minutes. The solution was then treated with hydrochloric acid until pH 4. Seventy grams of ammonium sulfate were added and the mixture was extracted with 20 ml, 10 ml and 10 ml portions of alcohol. benzyl. The benzyl alcohol extracts were dried with heating in vacuo at 75-80 ° C., the resulting solution was filtered and treated with ether to effect precipitation.
The precipitate was dissolved in 20 ml of water previously saturated with benzyl alcohol and to which 0.5 ml of acetic acid had been added. glacial. The solution was introduced into a 40 ml centrifuge tube. 20 ml of water saturated with benzyl alcohol were added to a second 40 ml centrifuge tube. Seven 20 ml portions were then passed through. 'benzyl alcohol saturated with water countercurrently in the two tubes, each portion of benzyl alcohol being used to first extract the,
EMI7.1
tube 1: -Jo 1 and T followed by tube 2a The solut, i <1>: i1s in benzyl alcohol were then combined, dried by heating in vacuo and treated with 'ether to effect the precipitate,' - Ua.-tion.
Note that this countercurrent extraction method is actually equivalent to the countercurrent distribution for the separation of vitamin B12 from any residual matter similar to vitamin B12. to keep apart
EMI7.2
the last tubes of the counter-current distribution given that in front;.; point they all essentially contain pure vitamin B12.
The resulting precipitate was dissolved in 1.1 ml of water and allowed to crystallize. The crystals were removed by centrifugation and recrystallized by dissolving them in 10 ml of water, adding acetone (about 120 ml) until cloudy and allowing to stand. the solution. This gave 127 mg of crystals (dried at 100 in vacuo) at 95% purity as determined by the countercurrent distribution test.
These crystals were checked for identity with genuine vitamin B12 by comparing physical and chemical properties. The results are shown in the following table
Comparison of the product of the cyanide process with the vitamin
EMI7.3
------------- = ------- Genuine B12, --------------------- ===== =========
EMI7.4
<tb> Product <SEP> from <SEP> process <SEP> to <SEP> Vitamin <SEP> B12
<tb>
EMI7.5
=. = # = cyanide. '"'" = '"mmom = mmmm
EMI7.6
<tb> Coefficient <SEP> of <SEP> sharing <SEP> 1.2 <SEP> 1.2
<tb>
<tb> water / alcohol <SEP> benzyl
<tb>
<tb> Absorption <SEP> spectrum
<tb>
EMI7.7
A max.
(î) 27899 3615, 5500 2780, 3610, 5500
EMI7.8
<tb> Absorption <SEP> infra-red <SEP> The <SEP> two <SEP> substances <SEP> correspond <SEP> in <SEP> detail
<tb>
EMI7.9
Refractive indices 10618 00002 10616 + + 0.002 10650 + 00002 10652 0.002 1.650 - 0.002 1.652 0002 10668 = 00002 1.664 - 00002 Optical rotation M 23 61 + 9 59 + 9
EMI7.10
<tb> 6563A
<tb>
EMI7.11
uomparison of Soub1es: The aenennina-cion has the absolute solute in aqueous solution as well as the solubi-
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Mixed in a saturated solution of genuine vitamin B12 indicated that the two materials were identical.
@
The remaining aqueous solution from the modified countercurrent distribution described above was treated again with potassium cyanide in aqueous solution. The solution was again acidified and then extracted with a 2 L solution of carbon tetrachloride and creol and the extracts treated with ether to effect precipitation. The precipitate was dissolved in a small amount of methanol and again treated with ether to effect the precipitation. The precipitate was then dissolved in 0.13 ml of water and allowed to crystallize. 47 mg of crystals were obtained (dried at 100 ° C. under vacuum).
The crystals were determined by a countercurrent distribution test to be 73% purity vitamin B12.
The equivalent of 153.3 mg of pure vitamin B12 was thus obtained from 1100 gal of fermentation broth using the new process.
From the second half of the initial methanolic solution, a yield of 50 mg of vitamin B12 was obtained after treating it substantially the same as the first half, except for the omission of cyanide. This indicates that the cyanide treatment has the effect of tripling the amount of vitamin B12 isolated,
When the above procedure is repeated using ammonium, barium and calcium cyanides instead of potassium cyanide, the results show in each case an approximately threefold increase in the amount of vitamin B12 collected, due to the cyanide treatment.
EXAMPLE 2
An intermediate concentrate obtained by propagation of S. griseus, containing vitamin B12 and substances similar to vitamin B12 was purified by countercurrent distribution between water and benzyl alcohol, using two tubes. of water and passing a total of seven portions of benzyl alcohol through each in turn, as described in Example 1. The concentrate had not previously been treated with cyanide. The purified material in the extracts was continued to be processed with benzyl alcohol, to obtain pure vitamin B12. The aqueous layers containing vitamin B12-like materials, a small amount of vitamin B12 and unknown impurities were combined and treated with ether.
An amorphous precipitate formed which was separated and dried. Operating according to the previous methods, this precipitate was reprocessed normally with other waste fractions to obtain a small additional recovery of vitamin B12 after numerous purification steps. However, there was still a considerable loss of the active substances present.
A portion of the above amorphous was treated for comparison and several portions were treated with cyanide as follows a) A portion of the precipitate was dissolved in water and analyzed. spectrographic. Absorbance maxima were observed at 3610 and 5200. The solution was then countercurrently distributed between water and benzyl alcohol as described in the test method. Optical density measurements of the fifth tube of the countercurrent distribution indicated that at most 51% of all vitamin B12 and vitamin B12-like material present was indeed vitamin B12. , representing 09112 mg of vitamin per mg of starting solid.
b) Ten and five tenths of a mg of the amorphous precipitate was dissolved in 3 ml of water and 0.2 ml of liquid hydrocyanic acid was added The solution was allowed to stand for a short time and heated.
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at 50-60 C to remove excess hydrocyanic acid.
Spectrum analyzes of the resulting solution showed absorption maxima at 3610 A, 5200 A, and 5500, indicating a shift to the vitamin B12 spectrum. The solution was counterdistributed. current between water and benzyl alcohol, A measurement of the optical density of the solution in the fifth tube showed that 88.3% of all vitamin B12 and vitamin B12-like matter present was the-vitamin B12 representing 0.220 mg of vitamin B12 per mg of starting material, an increase of 96% c) Nine and six tenths of mg of amorphous precipitate were dissolved in 2 ml of methanol and 0.2 ml was added liquid hydrocyanic acid.
The solution was allowed to stand for a period of 15 minutes in an ice bath and heated at 50-60 until dry. The residue was dissolved in water. Spectrographic analyzes of the resulting solution showed absorption maxima at 3610 5200 to 5500 Ä indicating a shift towards the vitamin B12 spectrum.
The aqueous solution was subjected to a countercurrent distribution between water and benzyl alcohol. Measurement of the optical density of the material in the fifth tube showed that 81% of the whole vitamin ne B12 and vitamin B12-like materials representing 0.219 mg of vitamin B12 per mg of starting material were vitamin B12,
an increase of 95.5%
Three additional fractions of the amorphous precipitate were treated with liquid anhydrous hydrocyanic acid, dissolved in ethanol, benzyl alcohol and cresol, respectively, instead of the methanol solution. Increases in content were obtained. in vitamin B12 in all cases, these increases being of the same order of magnitude as those obtained by using methanol. d) Ten and eight tenths of mg of amorphous precipitate were mixed thoroughly with 2.2 ml of anhydrous liquid hydrocyanic acid and allowed to stand until the hydrocyanic acid had evaporated. The residue was dissolved in water.
Spectrographic analyzes of the resulting solution showed absorption maxima at 3610 A 5200 and 5500 A indicating a shift towards the vitamin B12 spectrum. The aqueous solution was subjected to countercurrent distribution between water and benzyl alcohol. Optical density measurements of the fifth tube showed that 81% of all vitamin B12 and vitamin B12-like material, representing 0.198 mg of vitamin B12 per mg of starting material was from the vitamin B12 is an increase of 77%.
EXAMPLE 3
Three thousand gal of fermentation broth from several batches obtained by propagating a strain of S.gri seus were subjected to adsorption on charcoal, desorption with butanol and water, benzyl alcohol extraction, chromatographic analysis and precipitation as described in Example 1 The precipitated solids were extracted with methanol until a white residue remained.
Measurement of the optical density of the obtained methanol solution, measured at 5500 and compared to the relative value for pure vitamin B12, showed the presence of 540 mg of vitamin B12 and vitamin B12-like matter, added l acetone and ether to methanolic solution to effect precipitation, until the liquors no longer contain a pink color.
The precipitate was dissolved in 300 ml of water and the pH was adjusted to 8 using an aqueous solution of sodium hydroxide. 2.7 g of sodium cyanide were added to this solution and the solution was allowed to stand with a little stirring for 45 minutes. (The solution had a purple color indicating that a marked excess of cyanide had been added). The solution was then acidified to pH 3 with hydrochloric acid and nitrogen was passed through the solution to remove the hydrocyanic acid.
210 g of ammonium sulfate was added to the solution and extracted with
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portions of 50ml, 25ml, 25ml 25ml and 10ml benzyl alcohol. The extracts were dried by heating at 75-80 C under vacuum, and the dry extracts were filtered through a sintered glass funnel. Ether was added to the filtrate to effect precipitation,
The precipitate was dissolved in 100 ml of water supplemented with 2 ml of glacial acetic acid, and 100 ml of benzyl alcohol saturated with water was introduced into a second tube. A modified countercurrent dispensing operation was performed by passing seven 100 ml portions of water-saturated benzyl alcohol through each tube successively, as described in Example I, and the extracts were combined. benzyl alcohol after removing them from the second tube.
The combined extracts were dried by heating at 75-80 ° C in vacuo. Ether was added to the dried extracts to effect precipitation.
The precipitate was dissolved in methanol, and chromatographed on activated alumina, developing the column with methanol.
The rich exiting liquid was treated with ether to effect precipitation. The chromatography bottoms were stored for reprocessing. They contained 5500 at a color which calculated as vitamin B12 was equivalent to about 90 mg of vitamin B12. The precipitate was dissolved in 1.9 ml of water and allowed to crystallize. The red crystals were dissolved in 20 ml of water and the solution was filtered. An additional 20 ml of water was used to wash the apparatus and added to the solution. 520 ml of acetone was added and crystallization occurred. The crystals were separated by centrifugation, washed with ketone and dried at 560 ° C. in vacuo. 324.7 mg of red crystals were obtained.
A sample of the crystals lost 5% of its weight upon drying at 100 ° C. The dry sample was shown to be vitamin B12 at 94% purity by a countercurrent distribution test, indicating recovery. peration of 290 mg of pure vitamin B12.
It was found that substantially the same results were obtained by carrying out the cyanide treatment in an aqueous methanolic solution and in an aqueous ethanolic solution. EXAMPLE 1 ......
The cyanide treatment for transformation of vitamin B12-like materials was applied to a fermentation broth and the transformation was evaluated using the countercurrent test method.
3 liters of fermentation broth obtained by the preparation of a strain of S. griseus were treated with 201 g of sodium cyanide dissolved in a small quantity of water. The solution was stirred for two hours and brought to pH 4 with concentrated hydrochloric acid. Vacuum was applied to it so that air bubbled through the solution overnight. 2150 g of ammonium sulfate and 30 ml of benzyl alcohol were added to the solution. The mixture was allowed to settle and the layer of benzyl alcohol removed. The aqueous layer was then extracted again with one 20 ml portion and three ten ml portions of benzyl alcohol. The layer of water consumed which contained no LLD activity was discarded.
The combined benzyl alcohol extracts were diluted with two volumes of chloroform and extracted with three 5 ml portions of water.
Ten ml of the aqueous solution containing about 300,000 LLD units per ml was subjected to an eight-plate countercurrent distribution with benzyl alcohol using 10 ml phases. -current are shown in the attached table.
The same treatment was carried out on three liters of the same broth except for the addition of sodium cyanide. The initial aqueous solution obtained by extraction with benzyl alcohol was further subjected to countercurrent distribution of benzyl alcohol. The additional results are shown in the table.
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Effect of sodium cyanide on the transformation of LLD activity in vitamin B12 broth
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-------------------------------------------------- (Test results for countercurrent distribution in the benzyl alcohol system = water} 0 Percent distribution
EMI11.2
--------------------------------------
EMI11.3
<tb> Tube <SEP> N <SEP> It <SEP> Broth <SEP> not <SEP> treated <SEP> "<SEP> Broth <SEP> treated <SEP> It <SEP> Vitamin <SEP> B12 <SEP > pure
<tb>
<tb>
<tb> ----------------------------------------------- ---------------------------
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> 28.7 <SEP> 1 <SEP> 1.4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 19.1 <SEP> 6.1 <SEP> 8.3
<tb>
EMI11.4
3 23.4 29.0 20'09
EMI11.5
<tb> 4 <SEP> 15,
5 <SEP> 29.2 <SEP> 29.1
<tb>
EMI11.6
5 5.4 20.9 24.2
EMI11.7
<tb> 6 <SEP> 3.9 <SEP> 11.2 <SEP> 12.1
<tb>
EMI11.8
7 2.6 2.6. 3.3 8 0.7 0.9 O4
The above table shows a marked shift in the behavior in the countercurrent distribution of LLD inactivity from the typical behavior of vitamin B12 after treatment of the broth with sodium cyanide. From the above data, it is impossible to calculate exactly how much vitamin B12 is contained in treated and untreated broths. It can be seen, however, that the distribution of the treated broth is different from that of the untreated broth and very similar to that of pure vitamin B12.
In addition, it is evident that the activity of the processed broth in the fourth tube (tube which shows maximum vitamin B12 content) is almost double that of the untreated broth.
EXAMPLE 50
A fermentation broth was obtained by the propagation of a
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S. sriseus strain # 100 liters of broth to pH 2.5 were acidified with hydrochloric acid. The broth was then treated with 220 mg of sodium cyanide and the batch was stirred for 10 minutes. 100 g of Fuller's earth and 100 g of diatomaceous earth were added, the resulting slurry was stirred for 30 minutes, the adsorption product was filtered off and dried at 50 ° C. adsorption showed an ac-
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activity of 8,430,000 units per gr measured on Lnlactis Dorner in the Ileup test "and showed a favorable action to the growth of chickens.
Essentially all of the active material in the broth is adsorbed by treatment with Fuller's earth under the conditions described, the vitamin B12 content of the broth being markedly increased by the cyanide treatment, as shown in Example 4, the vitamin B12 content of the adsorption product thus prepared from the treated broth increases proportionally,
Various changes or modifications in the foregoing methods will come to the mind of those skilled in the art and so far as such changes or modifications are understood within the following claims, it should be understood that they form an integral part of the invention. .
CLAIMS.