<Desc/Clms Page number 1>
L'invention est relative aux procédés pour obtenir certains anti- biotiques basiques; et elle concerne, plus particulièrement, l'obtention de certains antibiotiques contenant des groupements fortement basiques à l'ai- dé d'une série d'opérations faisant intervenir l'usage de résines échangeu- ses d'ions.
Diverses méthodes ont été utilisées pour obtenir des composés an- tibiotiques. Ces méthodes font intervenir généralement des procédés à opé- rations multiples en vue d'obtenir des matières fortement purifiées néces- saires pour permettre leur usage pour la thérapeutique de maladies infec- tieuses. La séparation de la matière active d'avec des impuretés de diffé- rents genres, tant organiques qu'inorganiques, qui a lieu dans les bouil- lons de fermentation nécessite souvent la préparation de dérivés ou de sels complexes, tels que des sels combinés avec certains colorants acides ou avec d'autres acides organiques. Plusieurs de ces procédés prévoient l'usage de solvants organiques pour l'extraction d'antibiotiques hors de la solution aqueuse.
Souvent les procédés d'extraction ont lieu dans des appareils très compliqués tels que les extracteurs de Podbielnak.
Des résines échangeuses d'ions ont été utilisées sur une grande échelle pour une opération faisant partie de procédés pour l'obtention d'an- tibiotiques basiques, plus particulièrement de composés tels que la strep- tomycine. Ces procédés sont décrits dans les brevets E.U.A. n 2.541.420 déposé le 8 janvier 1949, E.U.A. n 2.528.188 déposé le 12 avril 1949, E.U.A. n 2.528.022 déposé le 27 janvier 1945 et E.U.A, n 2.667.441 déposé le 2 août 1950.
Pour certaines de ces méthodes, on s'est servi de résines échan- geuses d'ions portant des groupements carboxyles comme groupements actifs principaux pour l'échange d'ions. Presque toujours, la préparation d'an- tibiotiques basiques purs, amorphes ou cristallisés ou de leurs sels, a né- cessité, toutefois, l'intervention d'opérations telles qu'une précipitation fractionnée sélective ou un fractionnement par extraction par des solvants ainsi que d'autres méthodes en plus de l'usage de résines échangeuses d'ions, en vue d'obtenir la formation de produits ayant une pureté élevée.
On a découvert maintenant que des antibiotiques basiques, y compris des composés tels que la streptomycine, la viomycine, la dihydrostreptomy- cine, l'hydroxystreptomycine, la streptothricine, la mannosidostreptomyoine et la néomycine, qui contiennent généralement des groupements fortement ba- siques tels que des groupements guanidino, peuvent être purifiés d'une ma- nière inattendue quand on a recours à une série d'opérations comprenant l'u- sage de plus d'une opération de purification à l'aide d'une résine acide échangeuse d'ions. Ces antibiotiques sont ceux qui forment, avec des aci- des minéraux, des sels simples, lesquels, en solution aqueuse, ont un pH voisin de la neutralité.
Ce procédé présente de nombreux avantages par rap- port aux procédés utilisés précédemment pour la purification des antibioti- ques basiques, En particulier, le procédé ne nécessite pas l'usage de sol- vants organiques, ni celui d'acides organiques complexes tels que certains colorants, l'acide picrique, l'acide de Reinecke et d'autres agents analo- gues, en vue d'obtenir un degré de purification élevé pour l'antibiotique.
Des appareils relativement simples, qui peuvent être utilisés pour plus d'un de ces antibiotiques, peuvent être utilisés pour la mise en oeuvre de l'in- vention. De plus, comme le même genre d'appareils est utilisé pour chacune des opérations envisagées, l'achat d'appareils de différents genres peut être supprimé et l'installation pour l'obtention de l'antibiotique peut avoir la forme la plus simple.
Un avantage très inattendu du procédé en question est que la for- mation de pyrogènes et de matières analogues à l'histamine, comme cela se
<Desc/Clms Page number 2>
produit souvent quand on veut obtenir des antibiotiques basiques, plus par- ticulièrement quand ces matières sont mises en contact avec des solvants et maintenues à des pH basiques pendant des périodes prolongées, semble être évitée d'une manière pratiquement complète par la méthode en question. Ce- ci constitue un avantage très utile du procédé car il est souvent nécessai- re de faire intervenir une opération séparée pour se débarrasser des pyro- gènes .
Pour la mise en oeuvre du procédé faisant l'objet de l'invention, on fait passer d'abord une solution antibiotique basique impure, telle qu'un bouillon d'antibiotique filtré, à un pH compris entre une valeur légè- rement acide et une valeur légèrement basique (par exemple entre 6,0 et 9,0), sur une résine échangeuse d'ions dont les groupements échangeurs prin- cipaux sont des groupements carboxyles, cette résine étant préparée par la polymérisation, sous forme de perles, d'acide méthacrylique ou , de préfé- rence, d'un méthacrylate et d'une quantité comprise entre environ 6% et en- viron 12% d'un composé aromatique divinylique, tel que le divinylbenzène, le divinyltoluène, le divinylnaphtalène, etc.., comme matière propre à for- mer des liaisons croisées.
Si l'on utilise un ester pour former la résine, les groupements esters dans la résine doivent évidemment être hydrolisés en groupements acides. Ces résines sont mises sur le marché par la Rohm & Haas Company sous la marque de fabrique "Amberlite IRC50". La résine est, tout au moins partiellement, à l'état de sel et son pH est, de préférence, réglé à une valeur d'équilibre comprise entre la valeur neutre et une valeur légèrement basique (environ 7 à 8) à l'aide d'un alcali, par exemple l'hydro- xyde de sodium ou de potassium, avant d'être mise en contact avec la solu- tion antibiotique. L'antibiotique adsorbé sur la résine est ensuite élue de la résine échangeuse d'ions à l'aide d'un acide dilué, de préférence un aci- de minéral tel que l'acide chlorhydrique ou sulfurique dilué.
Cette opéra- tion, ainsi que les opérations subséquentes du procédé, peuvent se faire au cours d'un traitement dit "à deux tours" décrit dans le brevet E.U.A.
2.528.188 dont question plus haut. Le pH de l'éluat de la résine est réglé, de préférence immédiatement, à une valeur légèrement basique, c'est-à-dire ' entre environ 6,0 et environ 9,0, de préférence entre 7,0 et 8,0. Ceci peut se faire en enlevant l'acide en excès, comme décrit plus loin, ou par l'ad-; dition d'un agent alcalin, par exemple de l'hydroxyde de sodium ou de potas- sium. La solution obtenue de cette manière, bien qu'elle soit beaucoup plus pure, à l'état sec, que ne l'est une solution non purifiée telle qu'un bouil- lon de fermentation, peut convenir à certains usages, par exemple pour la , médecine vétérinaire ou l'agriculture. La solution est ensuite mise en con- tact avec une deuxième résine échangeuse d'ions.
La deuxième résine échangeuse d'ions, utilisée pour effectuer l'o- pération de purification suivante du procédé selon l'invention , est égale- ment une résine échangeuse de cations synthétique. Elle est constituée par une résine ayant une porosité considérable, c'est-à-dire qu'elle est capa- ble d'adsorber une proportion élevée de bases organiques ayant un poids mo- léculaire élevé (supérieur à environ 150), Ces résines sont caractérisées par un accroissement relativement grand de leur volume quand la résine sè- che est mise en contact avec de l'eau ou quand on convertit la forme saline de la résine en la forme acide. Les résines ayant une porosité réduite ne subissent qu'un faible changement de volume.
Ces résines, à porosité éle- vée, peuvent être préparées par la copolymérisation d'un acrylate avec une quantité moindre (entre environ 1% et environ 15%) d'un composé aromatique divinylique, tel que le divinylbenzène. Suivant une variante, un copoly- mère d'un méthacrylate et d'une proport ion réduite (environ 1 à 4%) d'un composé aromatique divinylique peut être utilisé. La saponification des produits obtenus, qui sont préparés sous la forme de perles, procure des ré-
<Desc/Clms Page number 3>
sines échangeuses de cations poreuses d'acides carboxyliques. L'Amberlite
XE89, fabriquée par la Rohm & Haas Company, constitue une matière ayant une forme particulièrement avantageuse.
On a constaté que ces résines adsor- bent, après une période de contact relativement.courte, un antibiotique ba- sique, tel que la viomycine, la néomycine ou la streptomycine, suivant une proportion de 50% ou davantage de la capacité théorique de la résine. Il n'en est pas de même avec le genre de résine utilisée pour la première opé- ration du procédé en question, c'est-à-dire la résine du genre Amberlite
IRC50 qui adsorbe seulement ces composés pendant une période de contact suivant une proportion correspondant à environ 10 à 20 % de sa capacité to- tale.
Pour réaliser la deuxième opération du procédé en question, la ré- sine échangeuse d'ions est généralement convertie d'abord partiellement en un sel d'un cation d'un métal alcalin, tel que le sodium par exemple, en la lavant avec une solution aqueuse diluée d'hydroxyde de sodium jusqu'à ce que le pH d'équilibre soit compris entre une valeur neutre et une valeur lé- gèrement basique, c'est-à-dire entre 6 et 9. La solution antibiotique, obtenue à l'aide de la première colonne d'échange d'ions par élution avec un acide minéral dilué, est traitée par l'enlèvement des sels.
Elle peut, par exemple, être neutralisée et, en vue de réduire au minimum l'introduc- tion du sel, l'acide éluant peut être de l'acide sulfurique dilué et l'a- gent neutralisant de l'hydroxyde de baryum et, dans ce cas, le sulfate de baryum se sépare et est enlevé. Suivant une variante, l'acide en excès peut être enlevé avec une résine échangeuse d'anions ou l'eau peut "être en- levée par exemple par séchage à partir de l'état de cong élation après neu- tralisation avec une amine organique qui forme un sel soluble dans le sol- vant avec l'acide utilisé pour l'élution de la résine. Le remplacement de l'eau par un solvant approprié permet la séparation du sel antibiotique. Un procédé de ce genre est décrit dans le brevet E.U.A. n 2.560.891, déposé le 16 décembre 1948.
D'autres combinaisons d'un acide et d'une base, qui forment un sel insoluble, peuvent être utilisées.
La solution antibiotique, partiellement purifiée, obtenue par l'é- lution de la première résine, est mise en contact avec la deuxième résine échangeuse d'ions, de préférence dans une colonne, et ceci est continu jus- qu'à ce que la résine choisie ait atteint l'équilibre avec l'antibiotique.
Il en résulte qu'une grande partie des cations, présents dans la solution admise dans la colonne passent dans cette colonne sans être adsorbés. Il est relativement aisé d'examiner des échantillons de la solution antibioti- que sortant de la colonne et de déterminer quand cette solution a une con- centration en antibiotique approximativement égale à celle qui pénètre dans la colonne. A ce moment on cesse d'alimenter la colonne et l'antibiotique est élue avec de l'acide minéral dilué. Si l'on utilise de l'acide sulfuri- que, l'acide en excès peut être enlevé par précipitation avec de l'hydroxy- de de baryum ou par les autres méthodes indiquées plus haut. La solution peut ensuite être utilisée pour divers usages.
Souvent, le produit obtenu à la suite du contact avec la deuxième résine a une pureté tellement élevée que la matière peut être séchée et uti- lisée directement pour des usages thérapeutiques, sans autre purification..
On peut remédier à la présence de quantités minimes de matières co- lorantes par leur adsorption sur du charbon de bois, si on le désire, mais ceci ne constitue pas une opération essentielle du procédé. Il est à noter que, si l'on utilise une résine du genre XE89 avant la résine du genre IRC50, de grandes quantités d'impuretés colorées et des matières à poids moléculai- re plus élevé sont adsorbées sur la résine en même temps que l'antibiotique au cours de la première opération.
L'utilisation de l'Amberlite IR50 pour la deuxième opération ne produit alors plus de purification appréciable. Par ailleurs, l'application
<Desc/Clms Page number 4>
du traitement répété avec un seul genre de ces résines ne permettrait pas d'obtenir le même degré élevé de purification d'une manière aussi simple.
En général, les impuretés inorganiques sont réduites plus aisément par le procédé en question qui.procure une sélectivité plus grande pour l'obten- tion des antibiotiques.
Les deux polymères, du genre de ceux utilisés pour la première et la deuxième opérations du procédé, sont, de préférence, préparés sous la - forme de perles et la polymérisation sous cette forme peut être obtenue par le traitement du mélange des monomères dans une suspension aqueuse avec un peroxyde. Les polymères résineux utilisés pour la deuxième opération ont des liaisons croisées lâches et sont poreux et on a constaté qu'ils sont extrémement efficaces pour adsorber une proportion très élevée des antibio- tiques basiques. Ceci donne lieu à l'adsorption d'une quantité de l'anti- biotique qui s'approche du pouvoir d'échange théorique de la résine dans des conditions d'équilibre.
Il n'en est pas de même pour le genre de rési- ne échangeuse d'ions, utilisé pour la première opération du procédé qui, dans les conditions normalement utilisées pour l'obtention des antibioti- ques, ne s'approche pas, en ce qui concerne son pouvoir adsorbant, de la va- leur d'équilibre.
Quand un bouillon de -streptomycine est utilisé comme matière ini- tiale pour les deux opérations décrites plus haut, la solution, obtenue par élution à partir du deuxième genre de résine échangeuse d'ions, peut avoir une activité aussi élevée que 20 à 30 mg de l'antibiotique (base) par ml, et elle peut, à l'état sec, avoir une pureté de 70% ou davantage en poids.
Si on le désire, on peut même atteindre un degré de pureté plus élevé en effectuant une opération de purification supplémentaire qui peut se faire avant ou après la deuxième purification à l'aide de la résine du genre acide carboxylique. Ceci implique le contact avec une résine échangeu- se d'ions du genre acide sulfonique, ayant une faible porosité et possédant une proportion élevée de constituants formateurs de liaisons croisées. Cet- te opération a lieu avec la résine échangeuse d'ions sous la forme acide, c'est-à-dire comme acide sulfonique libre. Des résines, qui sont copolymè- res de polystyrènes sulfonés et de composés aromatiques divinyliques, tels que le divinylbenzène sont particulièrement avantageuses. Ces résines se trouvent dans le commerce sous la marque de fabrique 'tDowex 50".
Elles contiennent des proportions variables de divinylbenzène comme constituant formateur de liaisons croisées. Une proportion d'environ 16% de divinyl- benzène est très avantageuse. Des proportions un peu plus élevées ou plus basses, c'est-à-dire comprises entre environ 10 et 25% peuvent être utili- sées à cet effet.
Une résine de ce genre, quand elle est utilisée sous sa forme aci-; de ou avec un pH réduit, ne retient que très peu ou pas d'antibiotique ba- - sique dans une solution mise en contact avec cette résine. Toutefois, elle retient des cations inorganiques et diverses impuretés organiques à un degré tel qu'une solution de ce genre, après un contact relativement court avec de la résine, à un faible pH, c'est-à-dire entre environ 1,0 et environ 2,5, a une très grande pureté. Cette opération du traitement a lieu, de préfé- rence, quand la résine se trouve dans une tour. L'acide libre, qui reste dans la solution effluente est ensuite neutralisé.
On utilise, de préféren- ce, de l'acide sulfurique au cours de l'opération précédente et, après le contact avec la résine, l'acide en excès, qui n'est pas nécessaire pour la combinaison avec l'antibiotique basique pour former un sel, est enlevé par précipitation avec un réactif tel que l'hydroxyde de baryum. La solution, qui reste après l'enlèvement du sel précipité, est une forme très fortement purifiée de l'antibiotique. Cette matière peut être filtrée pour former une solution qui peut être utilisée directement pour la thérapeutique, pour
<Desc/Clms Page number 5>
l'alimentation des animaux ou d'autres usages. Elle peut être séchée, par exemple par lyophilisation pour former un produit convenant très bien à l'incorporation dans des produits pharmaceutiques.
Elle est pratiquement exempte de pyrogènes et ne possède que peu ou pas de matières histaminiques.
La solution peut être stérilisée; elle peut être combinée avec des stabili- sateurs ou d'autres substances utiles
Quand ce procédé (à trois opérations) est utilisé pour la purifica- tion de la streptomycine, on constate que le produit a une pureté s'appro- chant de 95 %. Il est à noter que le procédé ne provoque pas de séparation de la streptomycine B qui n'est pas nuisible mais a une activité plus fai- ble que la streptomycine.Si l'on désire obtenir un produit contenant une proportion particulièrement faible de cette matière, un bouillon de fermen- tation approprié doit être choisi.Il est également à noter que le procédé en question enlève, d'une manière très efficace, un contaminant commun et indésirable des produits commerciaux à base de streptomycine,
c'est-à-dire la matière inactive qu'est la streptidine*
Dans de nombreux cas, il est possible de cristalliser l'antibioti- que basique sous une forme très purifiée en concentrant l'effluent aqueux provenant de la deuxième résine et en ajoutant un solvant organique miscible à l'eau, tel que le méthanol ou l'éthanol.
Dans certains cas, quand l'an- tibiotique impur, par exemple le bouillon de fermentation antibiotique, utilisé comme matière initiale, est de qualité particulièrement pauvre ou a des teneurs particulièrement élevées en impuretés inorganiques et organiques, il est désirable d'effectuer la purification d'une telle solution en mettant la matière brute en contact successivement avec trois genres différents de résines échangeuses d'ions. Dans ce cas, l' ordre préféré est la séquence susindiquée pour les opérations concernant l'échange d'ions, c'est-à-dire qu'on se sert d'abord de l'Amberlite IRd5O qui est la résine du genre acide méthacrylique-divinylbenzène à faible pouvoir adsorbant, cette résine étant utilisée sous une forme partiellement neutralisée.
Pour la deuxième opéra- tion, on utilise le produit de saponification acrylate-divinylbenzène plus poreux et, finalement, la solution partiellement purifiée est soumise à une purification supplémentaire par sa mise en contact avec la résine Dowex 50 qui est du genre acide sulfonique à liaisons fortement croisées en vue d'ob- tenir une solution ayant un degré de pureté très élevé. Si l'ordre des opé- rations deux et trois de ce procédé à trois opérations est inversé, le de- gré de purification obtenu est remarquablement élevé mais n'atteint pas ce- lui que l'on obtient quand on adopte la séquence préférée indiquée plus haut.
Il est à noter qu'avec chacune des résines carboxyliques les antibiotiques forment des sels définis, la résine agissant comme un acide polybasique ma- cromoléculaire. Les sels des antibiotiques avec des résines sont utilisés pour des usages tels que l'enrichissement de la nourriture..
On a découvert également que, même si l'une des opérations susdites pour la purification à l'acide carboxylique est supprimée, on obtient néan- moins un degré remarquable de purification des antibiotiques bruts, du mo- ment que la seule opération de purification à l'acide carboxylique est sui- vie d'une purification à l'acide sulfonique. La mise en contact d'une so- lution aqueuse impure d'un antibiotique basique avec une résine comprenant, comme groupements actifs principaux pour l'échange, des radicaux carboxyli- ques, l'élution de l'antibiotique d'avec la résine à l'aide d'un acide et la mise en contact de la solution de l'antibiotique avec une résine échan- geuse d'ions du genre acide sulfonique sous la forme acide,
procurent un de- gré de purification remarquable de l'antibiotique.
L'éluat obtenu par la séparation de l'antibiotique d'avec la rési- ne du premier genre, c'est-à-dire la résine du genre carboxylique, à l'aide
<Desc/Clms Page number 6>
d'une solution diluée d'un acide minéral, convient particulièrement bien à la purification supplémentaire par la mise en contact avec une résine échangeuse d'ions dont les groupements principaux pour l'échange sont for- més par le radical acide sulfonique. La première opération du procédé est efficace pour séparer l'antibiotique d'avec certaines des impuretés présen- tes dans les solutions initiales, plus particulièrement des impuretés orga- niques qui se trouvent généralement, à un degré très élevé, dans des bouil- lons de fermentation filtrés contenant des antibiotiques basiques.
Toute- fois, il subsiste dans l'antibiotique brut, élue de la résine du premier genre, des quantités appréciables de diverses impuretés, plus particulière- ment des matières inorganiques, mais également certaines substances organi- ques. L'éluat acide, provenant de la résine échangeuse d'ions du genre acide carboxylique, peut être purifié, d'une manière des plus efficaces, par une mise en contact, à l'état acide, d'une résine du genre acide sulfo- nique.
Quand l'antibiotique, dans la solution acide, vient en contact avec la forme acide de la résine du genre acide sulfonique, il n'est pas 'adsorbé sur celle-ci à un degré appréciable. Toutefois, diverses impuretés, plus particulièrement des substances inorganiques mais également des matiè- res organiques, sont sélectivement enlevées de la solution acide par la ré- sine du genre acide sulfonique, de sorte qu'on obtient une solution très purifiée de l'antibiotique basique. Dans de nombreux cas, la pureté de la solution est tellement élevée que l'antibiotique peut être cristallisé di- rectement hors de la solution, en concentrant celle-ci soigneusement, par exemple sous vide à une basse température ou en concentrant celle-ci et en y ajoutant un solvant approprié, miscible à l'eau, mais qui ne dissout pas le sel antibiotique.
Dans certains cas, il est nécessaire de régler le pH de la solution avant la concentration car il peut y avoir une tendance à la décomposition d'une partie du produit si la concentration a lieu dans des conditions fortement acides. Pour la mise en oeuvre du procédé en question et comme indiqué plus haut, on peut se servir d'acide sulfurique pour l'élu- tion de l'antibiotique adsorbé d'avec la résine du premier genre, c'est-à- dire la résine du genre acide carboxylique, que l'on utilise. Suivant une variante, on peut se servir d'autres acides, tels que l'acide chlorhydrique, bromhydrique, etc... L'acide en excès peut être séparé d'avec la solution obtenue après sa mise en contact avec la deuxième échangeuse d'ions par la formation d'une substance légèrement soluble.
Par exemple, si l'acide sul- furique a été utilisé, de l'hydroxyde ou du carbonate de baryum peut être ajouté, à un pH approprié, et le sulfate de baryum précipité peut ensuite être séparé d'avec la solution avant de la concentrer et avant d'isoler le sel antibiotique purifié ou cristallisé. Si l'on utilise l'acide chlorhydri- que pour éluer la première résine, l'acide en excès peut être séparé par l'ad- dition d'un agent tel que le carbonate d'argent. Suivant une variante, cer- taines résines échangeuses d'anions peuvent être utilisées pour le réglage du pH de la solution aqueuse par enlèvement de l'acide en excès.
Après que la résine a été séparée d'avec la solution aqueuse, la solution antibiotique peut être concentrée pour obtenir l'antibiotique purifié ou cristallisé.En général, les sels acides des antibiotiques basiques ont un pH, en solution aqueuse, compris entre environ 4,0 à environ 6,5.
Pendant la mise en oeuvre du procédé en question, il est avantageux de maintenir les solutions des antibiotiques à des pH faibles, c'est-à-dire en dessous d'environ 2,5 pendant une durée minimum. Par conséquent, après l'élution de l'antibiotique d'avec la résine utilisée pour la première opé- ration, la mise en contact avec la deuxième résine doit se faire avec une rapidité raisonnable et l'effluent de la deuxième résine doit alors être ré- glé pour un pH approprié, c 'est-à-dire à au moins 4,5 environ, sans perte
<Desc/Clms Page number 7>
de temps excessive.
Comme dit plus haut, les solutions antibiotiques, ob- tenues par le procédé en question, ont un degré de pureté extraordinaire, et il est possible, dans de nombreux cas, d'utiliser directement l'effluent réglé, provenant de la deuxième résine, sans faire intervenir un traitement supplémentaire tel qu'une cristallisation. Des solutions de ce genre peu- vent être utilisées, par exemple, pour la médecine vétérinaire. Il peut être avantageux de concentrer ces solutions et d'ajouter des agents stabi- lisateurs avant que le produit soit utilisé. Souvent , la stérilisation peut se faire en filtrant la solution dans un appareil approprié.
Il est à noter que les produits, obtenus selon l'invention, sont exempts, d'une ma- nière remarquable, de pyrogènes et qu'ils ne contiennent que peu ou pas- de matières histaminiques qui souvent causent des difficultés dans le cas d'antibiotiques purifiés par d'autres procédés, à moins que des opérations détaillées, bien définies n'interviennent pour enlever ces matières.
On a découvert que le traitement de solutions aqueuses impures d'antibiotiques basiques par des résines à l'acide carboxylique, du genre décrit plus haut (c'est-à-dire une résine du genre Amberlite IRC50), peut être répété en vue d'obtenir une solution purifiée de l'antibiotique, cette solution ayant alors une pureté encore plus élevée et se prêtant d'elle-mê- me, d'une manière des plus aisées à une purification supplémentaire par sa mise en contact avec les résines du genre acide sulfonique, décrites plus haut.
Un traitement supplémentaire avec une résine du genre acide carboxy- lique ou avec une résine du genre acide sulfonique ne tend pas à augmenter la pureté de l'antibiotique à un degré appréciable et, comme dit plus haut, le produit obtenu par le traitement avec la résine du genre acide sulfoni- que peut souvent être cristallisé sans qu'on fasse intervenir des opérations de purification spécifiques supplémentaires. L'usage de la résine du gen- re Amberlite XE-89, suivi de l'usage d'une résine du genre acide sulfonique, ne procure pas un degré de purification aussi élevé.
Parmi les antibiotiques qui peuvent être purifiés par le procédé en question, on peut citer la streptomycine, la viomycine, la dihydrostrep- tomycine, l'hydroxystreptomycine, la streptothricine, la mannosidostrepto- mycine, la néomycine et d'autres de ce genre. Ils contiennent tous les groupements fortement basiques, tels que des groupements guanidino et ils peuvent être purifiés d'une manière particulièrement aisée par le procédé faisant l'objet de l'invention.
Les exemples ci-dessous sont donnés à titre illustratif et ne doi- vent pas être considérés comme les seuls modes de réalisation possibles de l'invention .
EXEMPLE I.
Une colonne est remplie d'une résine échangeuse de cations à l'aci- de carboxylique (genre Amberlite IRC50). Cette résine est équilibrée avec de l'hydroxyde de sodium dilué jusqu'à ce qu'on ait atteint un pH de 7,5.
Un bouillon de fermentation de streptomycine, filtré dans des conditions acides, est réglé, de manière à être approximativement neutre, à l'aide d'hydroxyde de sodium et la solution d'antibiotique traverse la colonne pour l'échange d'ions. Des échantillons de l'effluent de la colonne sont analy- sés périodiquement jusqu'à ce qu'on constate que la concentration de la strep- tomycine dans le bouillon, à la sortie de la colonne, est en substance la même que celle du bouillon admis dans la colonne. L'introduction de la so- lution est arrêtée et la résine est lavée avec plusieurs volumes d'eau.
L'antibiotique est ensuite élue ou séparé d'avec la résine à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique 0,35 N. Quand l'éluat quitte la colonne, 'il est neutralisé avec de l'hydroxyde de sodium. On constate, par l'analy- se de la quantité totale de la streptomycine dans l'éluat, qu'environ 15% '
<Desc/Clms Page number 8>
de la capacité totale de la résine ont été utilisés pour l'adsorption de l'antibiotique. Peu d'impuretés organiques du bouillon initial ont été re- tenues dans la colonne mais l'éluat, qui contenait 10 mg de streptomycine par ml, contenait également environ 20 mg de sels inorganiques par ml de solution; cette teneur en sels étant déterminée par évaporation d'un échan- tillon mesuré et par incinération en présence d'acide sulfurique.
La solu- tion contenait également environ 4 mg par ml, d'impuretés organiques colo- rées et non identifiées .
On prépare une deuxième colonne contenant 115 ml de résine échan- geuse de cations à l'acide carboxylique (genre Amberlite XE 89). La résine est équilibrée avec de l'hydroxyde de sodium pour un pH de 7,8. L'éluat neutralisé, provenant de la colonne précédente, est introduit dans la deu- xième colonne. A des intervalles périodiques, l'effluent de la deuxième co- lonne est analysé pour déterminer sa teneur en streptomycine. Après qu'au total 3 litres de la solution de streptomycine partiellement purifiée ont été introduits dans la colonne, on constate qu'on ne peut pas extraire da- vantage d'antibiotique hors de la solution, c'est-à-dire que la concentra- tion de l'antibiotique dans la solution à l'entrée est la même que celle de la solution de sortie.
On interrompt donc l'alimentation de la colonne et on lave la résine avec de l'eau. L'antibiotique est ensuite élué avec une solution d'acide sulfurique 0,36N. L'acide en excès dans l'éluat est neu- tralisé immédiatement avec une solution d'hydroxyde de baryum. Le sulfate de baryum précipité est enlevé par filtration et la solution aqueuse est analysée en ce qui concerne la streptomycine. On trouve qu'environ 50 % de la capacité totale de la résine a été utilisée pour l'adsorption de la strep- tomycine. L'éluat contient environ 30 mg d'antibiotique, en tant que base, par ml d'éluat et environ 6 mg, par ml, de sels inorganiques, déterminés sous la forme de cendres sulfatées. Environ un tiers des impuretés colorées, présentes dans l'éluat fourni à la deuxième colonne, est retenu dans l'é- luat.
On prépare une troisième colonne contenant 30 ml d'un copolymère sulfoné de polystyrène et d'environ 16% en poids de divinylbenzène (connu sous le nom de Dowex 50-X16). La résine est traitée avec de l'acide sul- furique dilué pour la convertir complètement à l'état acide et est ensuite lavée avec de l'eau pour enlever l'acide en excès. L'éluat neutralisé,pro- venant de la colonne précédente, est fourni à la colonne, contenant le Do- wex 50-X16, jusqu'à ce que le pH de l'effluent de la colonne manifeste une tendance..bien définie à monter. Environ 660 ml de l'effluent sont recueil- lis jusqu'à ce moment. Il est neutralisé immédiatement avec de l'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum précipité est séparé par filtration.
On obtient une récupération pratiquement quantitative de la strep- tomycine à la sortie de cette colonne. La solution a une concentration de 25 mg par ml en tant que streptomycine basique et seulement 0,62 mg, par ml, de sels inorganiques (comme cendres sulfatées).
La concentration de la solution sous vide, le traitement avec une petite quantité de carbone activé et l'addition de plusieur s volumes de mé- thanol, permettent d'obtenir un précipité de sulfate de streptomycine ayant' une grande pureté. Cette matière est filtrée et séchée 'sous vide. On cons- tate qu'elle contient 1,64% de cendres et que l'activité du produit, quand celui-ci a été débarrassé des matières volatiles, correspond à environ 790 . mcg/mg comparativement à l'activité théorique de 798 mcg/mg du sulfate de streptomycine.
EXEMPLE II.
Un bouillon de fermentation filtré est réglé à un pH de 7,5. L'ana- lyse montre qu'il contient 300 mcg de l'antibiotique -par ml de solution.-1
<Desc/Clms Page number 9>
Cette matière est introduite dans une colonne contenant de la résine Amber- lite IRC50 équilibrée pour un pH = 7, 5 à l'aide d'hydroxyde de sodium. La solution antibiotique est ajoutée à la colonne jusqu'à ce que la concentra- tion de l'antibiotique dans la- colonne soit- devenue' très voisine 'de celle de la solution admise dans l'effluent.
La colonne est ensuite lavée avec de l'eau et l'antibiotique est élue ou séparé d'avec la résine à l'aide d'une solution d'acide sulfurique 0,35N. L'éluat de la colonne est neutra- lisé immédiatement avec de l'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum précipité est séparé par filtration. L'éluat neutralisé contient environ
8 mg de viomycine par ml, en tant que base, et 7 mg, par ml, de cendres sulfatées. Environ 12% de la capacité totale de la résine ont été utilisés pour l'adsorption de l'antibiotique.
Une partie de l'éluat (190 litres), provenant de la colonne ci- dessus, est introduite à un pH de 7,5 dans une colonne contenant 3750 ml de résine du type Amberlite XE89 qui avait, au préalable, été équilibrée avec de l'hydroxyde de sodium dilué de manière à avoir un pH= 7,5. La ré- sine adsorbe la viomycine antibiotique à un degré correspondant à environ
80% de sa capacité d'échange totale. L'addition de la solution de viomyci- ne partiellement purifiée, est continuée jusqu'à ce que l'effluent de la co- lonne ait approximativement la même teneur en antibiotique que la solution que l'on a introduite dans la colonne. On interrompt alors l'addition de l'effluent et on lave la colonne avec de l'eau.
L'antibiotique est élué avec de l'acide sulfurique 0,35 N et l'éluat est neutralisé immédiatement avec de l'hydroxyde de baryum. Le sulfate de baryum précipité est enlevé par filtration et l'éluat est concentré sous vide, à une température modéré- ment élevée, jusqu'à avoir un volume de 11 litres. L'analyse d'un échan- tillon montre que le concentrât contient 102 mg de viomycine, en tant que base, par ml et seulement 5 mg de cendres (sulfatées) par ml. Le traitement de l'éluat avec du carbone activé enlève une petite partie de la couleur résiduelle. L'addition de 2 volumes de méthanol à la solution aqueuse don- ne lieu à la cristallisation du sulfate de viomyoine. Cette matière pèse 1275 g quand elle est séchée sous vide. Elle contient 1% de cendres et 9.3% de matières volatiles.
Quand elle est débarrassée des matières volatiles présentes, on trouve que l'activité est d'environ 805 mcg/mg. L'activité théorique du sulfate de viomycine pure est de 820 mcg/mg. On obtient donc une pureté extrêmement élevée par le procédé simple décrit.
EXEMPLE III.
Un bouillon de fermentation de néomycine est acidifié et filtré, après quoi il est neutralisé. Cette matière contient approximativement 730 mcg/ml de néomycine. 140 litres de la solution sont fournis à une colonne contenant 1 litre de la résine échangeuse d'ions à l'acide carboxylique (gen- re Amberlite IRC50) qui a été réglée de manière à peu près neutre à l'aide d'hydroxyde de sodium. On obtient presque une adsorption quantitative de l'antibiotique sur la résine. La résine est lavée avec de l'eau et est en- suite éluée avec une solution à 1% d'acide sulfurique. L'éluat est neutra- lisé immédiatement avec de l'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum pré- cipité est séparé par filtration.
La solution filtrée est analysée et on constate qu'elle contient 10 mg de néomycine (en tant que base) par ml et environ 8 mg de cendres sulfatées par ml.
Une partie de la solution de néomycine neutralisée et partiellement purifiées obtenue à l'aide de la colonne d'Amberlite IRC50, est fournie à une colonne d'Amberlite XE89 qui a été équilibrée avec de l'hydroxyde de so- dium dilué jusqu'à avoir un pH égal à environ 7,0. La solution est introdui- te dans la colonne jusqu'à ce que des quantités appréciables d'antibiotique soient détectées dans l'effluent. La colonne est lavée avec de l'eau et est
<Desc/Clms Page number 10>
ensuite éluée avec une solution à 1% d'acide sulfurique. L'acide en excès dans l'effluent est neutralisé avec de l'hydroxyde de baryum, après quoi le sulfate de baryum précipité est enlevé par filtration. L'éluat contient environ 20 mg de néomycine par ml et 5 mg de cendres sulfatées par ml.
On fait passer l'éluat dans une colonne contenant de la résine Dowex-50X16 sous la forme acide. Pratiquement, toutes les cendres sont enlevées de la matière avec une perte faible ou nulle en néomycine. L'effluent de la co- lonne est neutralisé avec de l'hydroxyde de baryum. Le précipité est sépa- ré par filtration et la couleur résiduelle est enlevée avec une quantité minime de carbone activé. La solution purifiée est versée dans plusieurs volumes de méthanol et la néomycine précipitée est séparée par filtration.
Le produit contient 1% de cendres sulfatées et 3,2% de matières volatiles.
Après la séparation des matières volatiles, l'analyse donne une activité d'environ 650 mcg/mg, comparativement à l'activité de 670 mcg/mg du sulfate de néomycine pure. On constate que ce produit, obtenue par ce procédé re- lativement simple, convient très bien à l'usage thérapeutique.
EXEMPLE IV.
On fait passer un bouillon de fermentation de streptomycine filtré, ayant une activité antibiotique de 800 mcg/ml, sur une colonne contenant une résine du genre Amberlite IRC50 à un pH de 7,5. L'antibiotique est élue de la résine à l'aide d'acide chlorhydrique 0,35 N et l'éluat est neu- tralisé avec de l'hydroxyde de sodium. Par l'adsorption de l'antibiotique, environ 15% de la capacité de la résine est utilisée. L'éluat contient en- viron 7 mg/ml de l'antibiotique. On fait passer une partie de cette matiè- re dans une colonne contenant 100 ml d'une résine du genre Amberlite XE 89 à un pH de 7,5.L'antibiotique est élue d'avec la résine à l'aide d'acide sulfurique dilué. L'éluat contient environ 18 g de streptomycine et envi- ron 2 g de cendres .
Environ 50% de la capacité totale de la résine genre Amberlite XE 89 ont été utilisés pour l'adsorption de l'antibiotique. L'é- luat est neutralisé avec de l'hydroxyde de sodium et traverse ensuite une colonne contenant 30 ml de résine du genre Dowex 50-X16 sous la forme acide.
L'effluent, sortant de la colonne, est neutralisé immédiatement avec une sc- lution d'hydroxyde de baryum. Le précipité de sulfate de baryum est enlevé, par filtration. Le filtrat est concentré sous vide et est décoloré à l'ai- de de carbone activé. La solution obtenue de cette manière est ajoutée à plusieurs volumes de méthanol pour précipiter le sulfate de streptomycine.
Le produit est filtré et séché. Il donne à l'essai une activité de 775 mcg/ ml et contient seulement 0,7 % de cendres. Une proportion élevée d'anti- biotique, contenu dans le bouillon initial est obtenue de cette manière.
EXEMPLE V.
Du bouillon de fermentation de néomycine filtré est fourni, à un pH de 7,5, à une colonne contenant 33 litres de résine Amberlite IRC50,préa- lablement équilibrée à un pH = 7,5 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium. Quand la résine cesse d'adsorber de la néomycine, l'alimentation est interrompue et la colonne est lavée avec de l'eau, puis éluée avec une solution à 1% d'acide sulfurique. On recueille la fraction de coeur de l'é- luat (c'est-à-dire la partie de celui-ci ayant une teneur maximum en anti- biotique); environ 170 litres avec un pH = 2,1. Elle contient la néomycine à une concentration de 12,0 mg/ml ainsi qu'un total de 31 mg/ml de matières solides et 7 mh/ml de cendres sulfatées.
Ceci représente une purification considérable quand on compare le produit au bouillon de fermentation. La solution antibiotique est neutralisée avec de l'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum est séparé par filtration. Le filtrat est fourni à une colonne contenant de la résine Amberlite XE89 qui a été préalablement équi-
<Desc/Clms Page number 11>
livrée avec de l'hydroxyde de sodium de manière à avoir un-pH = 7,5. Après que la colonne a été saturée avec de la néomycine, elle est éluée avec une solution à 1% d'acide sulfurique et l'acide en excès est neutralisé avec de l'hydroxyde de baryum. L'éluat contient 19,5 mg/ml de néomycine, 40 mg/ml de matières solides au total et 7 mg/ml de cendres sulfatées.
On fait passer cette solution sur une résine Dowex 50-X16 ayant un pH acide.
L'effluent de la colonne est neutralisé avec de l'hydroxyde de sodium. On constate qu'il contient 15 mg/ml de néomycine, un total de 23 mg/ml de ma- tières solides et 0,1 mg/ml de cendres sulfatées. La solution aqueuse est soigneusement concentrée sous vide à basse température et le sulfate de néo- mycine est isolé par précipitation avec de l'éthanol. On constate que le produit séché a une activité de 660 mog/mg et une teneur de 1,0 % en cen- dres. On obtient donc un produit ayant une pureté élevée et convenant très bien à un usage pharmaceutique.
EXEMPLE VI.
Un bouillon de fermentation de streptomycine, ayant une activité d'environ 750 unités par millilitre, est filtré après un réglage du pH à environ 2,5. On fait passer la solution filtrée sur une colonne de résine Amberlite IRC50 à un pH = 7,5 environ, c'est-à-dire que le pH du bouillon de fermentation est réglé à 7,5 avec de l'hydroxyde de sodi um, la résine étant équilibrée à ce pH par contact avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium. Après adsorption de l'antibiotique par la résine, la colonne de résine est lavée avec un petit volume d'eau et cette eau est écartée.
L'an- tibiotique est alors élue à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique 0,35N. Après que tout l'antibiotique a été séparé de la colonne de résine, l'éluat est neutralisé avec une solution d'hydroxyde de sodium. L'éluat contient environ 7 mg d'antibiotique par millilitre de solution. On fait passer cette solution dans une deuxième colonne contenant de la résine Am- berlite IRC50, équilibrée à un pH = 7,5. Quand la résine n'adsorbe plus de streptomycine supplémentaire, l'alimentation est interrompue et la résine est éluée à l'aide d'acide sulfurique 0,35 N. L'acide sulfurique en excès est enlevé de la solution acide à l'aide d'hydroxyde de baryum. La solution impure contient environ 6% en poids d'impuretés basés sur le poids total du produit brut dans la solution.
On fait passer celle-ci sur une colonne con- tenant de la résine du genre Dowex 50-X16, à l'état acide. L'effluent est neutralisé avec de l'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum obtenu est séparé par filtration. Après avoir concentré soigneusement la solution aqueuse sous vide, on la traite avec une petite quantité de carbone décolo- rant, on la filtre et on la verse dans du méthanol. Le sulfate de strepto- mycine précipité est filtré et séché. Le produit séché contient, à l'essai, 745 mcg/mg de streptomycine et 0,6% de cendres.
EXEMPLE VII.
On règle le pH d'un bouillon de fermentation de néomycine filtré, contenant 500 mcg/ml de néomycine, à 7,5 et on fournit ce bouillon à une co- lonne contenant 33 litres d'Amberlite IRC50, équilibrée préalablement à un pH= 7e5 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium. On continue l'ali- mentation jusqu'à ce que la colonne cesse d'adsorber la néomycine. La co- lonne est lavée avec de l'eau pour enlever le bouillon résiduel et l'anti- biotique est ensuite élué à l'aide d'une solution à 1% d'acide sulfurique.
La première partie de l'éluat contenant peu d'antibiotique, est séparée.
La partie suivante de l'éluat, qui contient un proportion élevée d'antibioti- que , est recueillie. Elle a un volume de 170 litres et un pH=2,1. La so- lution contient 12,5 mg/ml de néomycine, 33 mg/ml au total de matières soli- des et 5 mg/ml de cendres (sous la forme de cendres sulfatées). La solution partiellement purifiée est ensuite fournie à une colonne contenant 35 litres
<Desc/Clms Page number 12>
de résine Dowex 50-X16 à l'état acide. L'effluent de la colonne, contenant l'antibiotique, est neutralisé avec une solution d'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum est séparé par filtration. La solution purifiée est trai- tée avec une petite quantité de carbone décolorant et est ensuite filtrée.
Cette solution contient seulement 0,04 mg/ml de cendres (sous la forme de cendres sulfatées). Un. produit solide est isolé par concentration de la so- lution à une température basse sous vide et en versant la solution concen- trée dans du méthanol. Les matières solides précipitées sont filtrées, la- vées avec un petit volume de méthanol et séchées. Le sulfate de néomycine ainsi obtenu a une activité, à l'essai, de 670 mcg/mg et contient seulement 0,55% de cendres.
EXEMPLE VIII.
On règle le pH d'un bouillon de fermentation de viomycine filtré à 7,5. Cette solution contient approximativement 300 mcg/ml de viomycineo Elle est fournie à une colonne contenant de la résine Amberlite IRC50 dont le pH a été préalablement équilibré à 7,5 à l'aide d'une solution d'hydro- xyde de sodium. La solution est fournie à la colonne jusqu'à ce qu'une quantité appréciable de l'antibiotique commence à apparaître dans l'effluent de la colonne. La colonne de résine avec l'antibiotique adsorbée est lavée avec un petit volume d'eau et l'antibiotique est ensuite élue avec une solu- tion d'acide sulfurique 0,35N. L'acide en excès dans l'éluat est neutrali- sé avec de l'hydroxyde de baryum. On fait passer 15,6 litres de cette so- lution sur une colonne contenant 1350 ml de résine Dowex-X16.
L'effluent acide de la colonne est neutralisé avec de l'hydroxyde de baryum et le sul- fate de baryum est enlevé par filtration. La solution aqueuse est ensuite soigneusement concentrée sous vide et la solution aqueuse concentrée est décolotée avec du carbone activé. Le sulfate de viomycine est cristallisé hors de la solution, par addition de 2 1/2 volumes de méthanol. On obtient 147 g de sulfate de viomycine cristallisé qui, à l'essai, a une activité de 790 mcg/mg. Ce produit contient 0,2% de cendres et 4% de matières vola- tiles. Quand il est débarrassé de ces impuretés, le produit a une activité de 824 mcg/mg ce qui est très voisin de l'activité théorique du sulfate de, viomycine pur.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de purification d'un antibiotique basique, caractérisé' en ce qu'on met une solution aqueuse impure de l'antibiotique en contact avec une résine échangeuse d'ions du genre acide carboxylique, qui est au moins partiellement neutralisée et à une porosité limitée, on sépare l'an- tibiotique par élution d'avec la résine à l'aide d'un acide dilué et on met ensuite l'éluat de ladite résine en contact, ou bien avec une résine échan- geuse d'ions du genre acide carboxylique, qui est au moins partiellement neutralisée et a une porosité élevée, ou bien avec une résine échangeuse d'ions du genre acide sulfonique.
<Desc / Clms Page number 1>
The invention relates to methods for obtaining certain basic antibiotics; and it relates, more particularly, to obtaining certain antibiotics containing strongly basic groups by means of a series of operations involving the use of ion exchange resins.
Various methods have been used to obtain antibiotic compounds. These methods generally involve multi-operation processes to obtain the highly purified materials necessary for their use in the therapy of infectious diseases. The separation of the active material from impurities of different kinds, both organic and inorganic, which takes place in fermentation broths often requires the preparation of derivatives or complex salts, such as salts combined with certain acid dyes or with other organic acids. Several of these methods provide for the use of organic solvents for the extraction of antibiotics from the aqueous solution.
Often the extraction processes take place in very complicated devices such as the Podbielnak extractors.
Ion exchange resins have been used on a large scale for an operation forming part of processes for obtaining basic antibiotics, more particularly compounds such as streptomycin. These methods are described in E.U.A. No. 2,541,420 filed January 8, 1949, E.U.A. No. 2,528,188 filed April 12, 1949, E.U.A. n 2,528,022 filed January 27, 1945 and E.U.A, n 2,667,441 filed August 2, 1950.
In some of these methods, ion exchange resins bearing carboxyl groups have been used as the main active groups for ion exchange. Almost always the preparation of pure basic antibiotics, amorphous or crystalline or their salts, has necessitated, however, the intervention of operations such as selective fractional precipitation or fractionation by extraction with solvents as well. as other methods in addition to the use of ion exchange resins, in order to obtain the formation of products having a high purity.
It has now been discovered that basic antibiotics, including compounds such as streptomycin, viomycin, dihydrostreptomycin, hydroxystreptomycin, streptothricin, mannosidostreptomyoine and neomycin, which generally contain strongly basic groups such as guanidino groups, can be purified in an unexpected way when a series of operations involving the use of more than one purification operation with an acid exchange resin are resorted to. ions. These antibiotics are those which form, with mineral acids, simple salts which, in aqueous solution, have a pH close to neutral.
This process has many advantages over the processes previously used for the purification of basic antibiotics. In particular, the process does not require the use of organic solvents, nor that of complex organic acids such as some. dyes, picric acid, Reinecke's acid and other similar agents, in order to obtain a high degree of purification for the antibiotic.
Relatively simple devices, which can be used for more than one of these antibiotics, can be used to practice the invention. In addition, as the same kind of apparatus is used for each of the envisaged operations, the purchase of apparatuses of different kinds can be omitted and the installation for obtaining the antibiotic can have the simplest form.
A very unexpected advantage of the process in question is that the formation of pyrogens and histamine-like materials, as occurs
<Desc / Clms Page number 2>
Often produced when it is desired to obtain basic antibiotics, more particularly when these materials are contacted with solvents and maintained at basic pHs for prolonged periods of time, appears to be almost completely avoided by the method in question. This is a very useful advantage of the process since it is often necessary to involve a separate operation to get rid of the pyrogens.
To carry out the process forming the subject of the invention, an impure basic antibiotic solution, such as a filtered antibiotic broth, is first passed to a pH between a slightly acidic value and a slightly basic value (for example between 6.0 and 9.0), on an ion exchange resin whose main exchange groups are carboxyl groups, this resin being prepared by polymerization, in the form of beads, d methacrylic acid or, preferably, a methacrylate and an amount of between about 6% and about 12% of a divinyl aromatic compound, such as divinylbenzene, divinyltoluene, divinylnaphthalene, and the like. ., as material suitable for forming cross-links.
If an ester is used to form the resin, the ester groups in the resin must obviously be hydrolyzed to acidic groups. These resins are marketed by the Rohm & Haas Company under the trademark "Amberlite IRC50". The resin is, at least partially, in the salt state and its pH is preferably adjusted to an equilibrium value between the neutral value and a slightly basic value (approximately 7 to 8) using an alkali, for example sodium or potassium hydroxide, before being contacted with the antibiotic solution. The antibiotic adsorbed on the resin is then eluted from the ion exchange resin using a dilute acid, preferably a mineral acid such as dilute hydrochloric or sulfuric acid.
This operation, as well as the subsequent operations of the process, can be carried out during a so-called "two-round" treatment described in the E.U.A.
2,528,188 of which question above. The pH of the resin eluate is adjusted, preferably immediately, to a slightly basic value, i.e. between about 6.0 and about 9.0, preferably between 7.0 and 8, 0. This can be done by removing the excess acid, as described later, or by the ad-; addition of an alkaline agent, for example sodium or potassium hydroxide. The solution obtained in this way, although it is much purer in a dry state than an unpurified solution such as a fermentation broth, may be suitable for certain uses, for example for veterinary medicine or agriculture. The solution is then contacted with a second ion exchange resin.
The second ion exchange resin, used to carry out the next purification step of the process according to the invention, is also a synthetic cation exchange resin. It consists of a resin having a considerable porosity, that is to say that it is capable of adsorbing a high proportion of organic bases having a high molecular weight (greater than about 150). These resins are characterized by a relatively large increase in their volume when the dry resin is contacted with water or when the salt form of the resin is converted to the acid form. Resins with reduced porosity undergo only a small change in volume.
These high porosity resins can be prepared by the copolymerization of an acrylate with a lesser amount (between about 1% and about 15%) of a divinyl aromatic compound, such as divinylbenzene. Alternatively, a copolymer of a methacrylate and a reduced proportion (about 1-4%) of a divinyl aromatic compound can be used. The saponification of the products obtained, which are prepared in the form of beads, provides
<Desc / Clms Page number 3>
Porous cation exchange sines of carboxylic acids. Amberlite
XE89, manufactured by the Rohm & Haas Company, is a material having a particularly advantageous shape.
These resins have been found to adsorb, after a relatively short contact period, a basic antibiotic, such as viomycin, neomycin or streptomycin, in an amount of 50% or more of the theoretical capacity of the drug. resin. This is not the case with the type of resin used for the first operation of the process in question, that is to say the resin of the Amberlite genus.
IRC50 which adsorbs only these compounds during a contact period in an amount corresponding to about 10 to 20% of its total capacity.
To carry out the second step of the process in question, the ion exchange resin is generally first partially converted into a salt of a cation of an alkali metal, such as sodium for example, by washing it with a dilute aqueous solution of sodium hydroxide until the equilibrium pH is between a neutral value and a slightly basic value, that is to say between 6 and 9. The antibiotic solution, obtained at Using the first ion exchange column by elution with dilute mineral acid, is treated by the removal of salts.
It can, for example, be neutralized and, in order to minimize the introduction of salt, the eluting acid can be dilute sulfuric acid and the neutralizing agent barium hydroxide and , in this case, the barium sulfate separates and is removed. Alternatively, the excess acid can be removed with an anion exchange resin or the water can be removed, for example, by drying from the frozen state after neutralization with an organic amine. which forms a soluble salt in the solvent with the acid used for eluting the resin. Replacement of water with a suitable solvent enables the separation of the antibiotic salt. A process of this kind is described in the patent. EUA no 2,560,891, filed December 16, 1948.
Other combinations of an acid and a base, which form an insoluble salt, can be used.
The partially purified antibiotic solution obtained by the elution of the first resin is contacted with the second ion exchange resin, preferably in a column, and this is continued until the first resin is released. resin chosen has reached equilibrium with the antibiotic.
As a result, a large part of the cations present in the solution admitted into the column pass through this column without being adsorbed. It is relatively easy to examine samples of the antibiotic solution exiting the column and to determine when this solution has an antibiotic concentration approximately equal to that which enters the column. At this time, the column is stopped and the antibiotic is eluted with dilute mineral acid. If sulfuric acid is used, the excess acid can be removed by precipitation with barium hydroxide or by the other methods given above. The solution can then be used for various purposes.
Often the product obtained as a result of contact with the second resin has such a high purity that the material can be dried and used directly for therapeutic purposes without further purification.
The presence of minimal amounts of coloring material can be remedied by adsorbing them onto charcoal, if desired, but this is not an essential part of the process. Note that if an XE89 genus resin is used before the IRC50 genus resin, large amounts of colored impurities and higher molecular weight materials are adsorbed onto the resin along with the resin. antibiotic during the first operation.
The use of Amberlite IR50 for the second operation then no longer produces any appreciable purification. In addition, the application
<Desc / Clms Page number 4>
repeated treatment with only one kind of these resins would not achieve the same high degree of purification in such a simple manner.
In general, inorganic impurities are more easily reduced by the process in question which provides greater selectivity for obtaining antibiotics.
The two polymers, of the kind used for the first and second steps of the process, are preferably prepared in the form of beads and the polymerization in this form can be obtained by treating the mixture of monomers in a suspension. aqueous with a peroxide. The resinous polymers used for the second step are loosely cross-linked and porous and have been found to be extremely effective at adsorbing a very high proportion of the basic antibiotics. This results in the adsorption of an amount of the antibiotic which approaches the theoretical exchange power of the resin under equilibrium conditions.
The same is not true for the kind of ion exchange resin used for the first operation of the process which, under the conditions normally used for obtaining antibiotics, does not approach, in fact. with regard to its adsorbing power, the equilibrium value.
When a -streptomycin broth is used as the starting material for the two operations described above, the solution, obtained by elution from the second kind of ion exchange resin, can have an activity as high as 20 to 30 mg. of the antibiotic (base) per ml, and it may, when dry, have a purity of 70% or more by weight.
If desired, even a higher degree of purity can be achieved by carrying out an additional purification operation which can be done before or after the second purification using the carboxylic acid type resin. This involves contact with an ion exchange resin of the sulfonic acid type, having a low porosity and having a high proportion of cross-bonding constituents. This operation takes place with the ion exchange resin in the acid form, ie as free sulfonic acid. Resins, which are copolymers of sulfonated polystyrenes and aromatic divinyl compounds, such as divinylbenzene are particularly advantageous. These resins are commercially available under the trademark 'tDowex 50'.
They contain varying proportions of divinylbenzene as a component which forms cross-links. A proportion of about 16% of divinylbenzene is very advantageous. Slightly higher or lower proportions, that is to say between about 10 and 25%, can be used for this purpose.
Such a resin, when used in its acid form; of or with a reduced pH, retains very little or no basic antibiotic in a solution brought into contact with this resin. However, it retains inorganic cations and various organic impurities to such an extent as such a solution, after relatively short contact with resin, at low pH, i.e. between about 1.0 and about 2.5, has a very high purity. This processing step preferably takes place when the resin is in a tower. The free acid, which remains in the effluent solution is then neutralized.
Sulfuric acid is preferably used in the previous operation and, after contact with the resin, excess acid, which is not necessary for the combination with the basic antibiotic for to form a salt, is removed by precipitation with a reagent such as barium hydroxide. The solution, which remains after removing the precipitated salt, is a very highly purified form of the antibiotic. This material can be filtered to form a solution which can be used directly for therapy, to
<Desc / Clms Page number 5>
animal feed or other uses. It can be dried, for example by lyophilization to form a product very suitable for incorporation into pharmaceutical products.
It is practically free from pyrogens and has little or no histamine material.
The solution can be sterilized; it can be combined with stabilizers or other useful substances
When this (three-step) process is used for the purification of streptomycin, the product is found to have a purity approaching 95%. It should be noted that the process does not cause the separation of streptomycin B which is not harmful but has a lower activity than streptomycin. If it is desired to obtain a product containing a particularly low proportion of this material , an appropriate fermentation broth should be chosen. It should also be noted that the process in question very effectively removes a common and unwanted contaminant from commercial streptomycin products,
i.e. the inactive substance streptidin *
In many cases, it is possible to crystallize the basic antibiotic in a highly purified form by concentrating the aqueous effluent from the second resin and adding a water-miscible organic solvent, such as methanol or l. ethanol.
In some cases, when the impure antibiotic, for example the antibiotic fermentation broth, used as the starting material, is of particularly poor quality or has particularly high contents of inorganic and organic impurities, it is desirable to carry out the purification. of such a solution by bringing the raw material into contact successively with three different kinds of ion exchange resins. In this case, the preferred order is the above-mentioned sequence for the operations concerning the ion exchange, that is to say that we first use the Amberlite IRd5O which is the resin of the acid type. low adsorbent methacrylic-divinylbenzene, this resin being used in a partially neutralized form.
For the second step, the more porous acrylate-divinylbenzene saponification product is used and, finally, the partially purified solution is subjected to further purification by contacting it with the Dowex 50 resin which is of the bonded sulfonic acid type. strongly crossed in order to obtain a solution having a very high degree of purity. If the order of steps two and three of this three-step process is reversed, the degree of purification obtained is remarkably high, but does not reach what is obtained when the preferred sequence shown is adopted. upper.
It should be noted that with each of the carboxylic resins the antibiotics form defined salts, the resin acting as a macromolecular polybasic acid. Salts of antibiotics with resins are used for such uses as food fortification.
It has also been found that even if one of the above operations for the carboxylic acid purification is omitted, a remarkable degree of purification of the crude antibiotics is still obtained, as long as the single operation of purification at the carboxylic acid is followed by purification with sulfonic acid. Contacting an impure aqueous solution of a basic antibiotic with a resin comprising, as main active groups for the exchange, carboxylic groups, elution of the antibiotic from the resin to using an acid and bringing the solution of the antibiotic into contact with an ion exchange resin of the sulfonic acid type in the acid form,
provide a remarkable degree of purification of the antibiotic.
The eluate obtained by the separation of the antibiotic from the resin of the first kind, that is to say the resin of the carboxylic type, using
<Desc / Clms Page number 6>
of a dilute solution of a mineral acid, is particularly suitable for further purification by contacting with an ion exchange resin, the main groups for the exchange of which are formed by the sulphonic acid radical. The first step of the process is effective in separating the antibiotic from some of the impurities present in the initial solutions, more particularly the organic impurities which are generally found, to a very high degree, in broths. filtered fermentation containing basic antibiotics.
However, in the crude antibiotic, eluted from the resin of the first kind, there remain appreciable amounts of various impurities, more particularly inorganic materials, but also some organic substances. The acidic eluate from the carboxylic acid-type ion exchange resin can most efficiently be purified by contacting, in the acid state, a sulfo acid-type resin. - picnic.
When the antibiotic in the acidic solution comes in contact with the acid form of the sulfonic acid-type resin, it is not adsorbed thereon to an appreciable degree. However, various impurities, more particularly inorganic substances but also organic matters, are selectively removed from the acidic solution by the sulfonic acid-like resin, so that a highly purified solution of the basic antibiotic is obtained. . In many cases, the purity of the solution is so high that the antibiotic can be crystallized directly out of the solution, by concentrating it carefully, for example under vacuum at a low temperature or by concentrating it and by adding a suitable solvent, miscible with water, but which does not dissolve the antibiotic salt.
In some cases, it is necessary to adjust the pH of the solution prior to concentration as there may be a tendency for some of the product to decompose if concentration takes place under strongly acidic conditions. For carrying out the process in question and as indicated above, sulfuric acid can be used for the elution of the antibiotic adsorbed from the resin of the first kind, that is to say the resin of the carboxylic acid type, which is used. According to a variant, other acids can be used, such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, etc. The excess acid can be separated from the solution obtained after it has been brought into contact with the second heat exchanger. ions by the formation of a slightly soluble substance.
For example, if sulfuric acid has been used, barium hydroxide or carbonate can be added, at an appropriate pH, and the precipitated barium sulfate can then be separated from the solution before washing. concentrate and before isolating the purified or crystallized antibiotic salt. If hydrochloric acid is used to elute the first resin, the excess acid can be separated by the addition of an agent such as silver carbonate. Alternatively, certain anion exchange resins can be used for adjusting the pH of the aqueous solution by removing excess acid.
After the resin has been separated from the aqueous solution, the antibiotic solution can be concentrated to obtain the purified or crystallized antibiotic. In general, the acidic salts of basic antibiotics have a pH, in aqueous solution, of between about 4 , 0 to about 6.5.
While carrying out the process in question, it is advantageous to maintain the solutions of the antibiotics at low pHs, that is to say below about 2.5 for a minimum period of time. Consequently, after the antibiotic has eluted from the resin used for the first operation, the contact with the second resin must be done with a reasonable speed and the effluent of the second resin must then be. set for an appropriate pH, i.e. at least about 4.5, lossless
<Desc / Clms Page number 7>
excessive time.
As said above, the antibiotic solutions obtained by the process in question have an extraordinary degree of purity, and it is possible, in many cases, to directly use the regulated effluent, originating from the second resin, without involving any additional treatment such as crystallization. Solutions of this kind can be used, for example, in veterinary medicine. It may be advantageous to concentrate these solutions and add stabilizing agents before the product is used. Often sterilization can be done by filtering the solution through a suitable device.
It should be noted that the products obtained according to the invention are remarkably free from pyrogens and that they contain little or no histamines which often cause difficulties in the case of Antibiotics purified by other methods, unless detailed, well-defined operations are involved to remove these materials.
It has been found that the treatment of impure aqueous solutions of basic antibiotics with carboxylic acid resins, of the kind described above (i.e. a resin of the Amberlite IRC50 genus), can be repeated with a view to '' to obtain a purified solution of the antibiotic, this solution then having an even higher purity and lending itself, in a most easy way, to an additional purification by bringing it into contact with the resins of kind of sulfonic acid, described above.
Further treatment with a carboxylic acid-type resin or with a sulfonic acid-type resin does not tend to increase the purity of the antibiotic to any appreciable degree and, as said above, the product obtained by the treatment with the antibiotic. Resin of the sulfonic acid type can often be crystallized without the involvement of additional specific purification steps. The use of resin of the Amberlite XE-89 type, followed by the use of a resin of the sulfonic acid type, does not provide such a high degree of purification.
Among the antibiotics which can be purified by the method in question, there may be mentioned streptomycin, viomycin, dihydrostreptomycin, hydroxystreptomycin, streptothricin, mannosidostreptomycin, neomycin and the like. They contain all the strongly basic groups, such as guanidino groups and they can be purified in a particularly easy manner by the process forming the subject of the invention.
The examples below are given by way of illustration and should not be considered as the only possible embodiments of the invention.
EXAMPLE I.
A column is packed with a carboxylic acid cation exchange resin (genus Amberlite IRC50). This resin is equilibrated with dilute sodium hydroxide until a pH of 7.5 has been reached.
Streptomycin fermentation broth, filtered under acidic conditions, is adjusted so as to be approximately neutral with sodium hydroxide and the antibiotic solution is passed through the column for ion exchange. Samples of the column effluent are analyzed periodically until it is found that the concentration of streptomycin in the broth, leaving the column, is substantially the same as that in the broth. admitted in the column. The introduction of the solution is stopped and the resin is washed with several volumes of water.
The antibiotic is then eluted or separated from the resin using 0.35 N hydrochloric acid solution. When the eluate leaves the column, it is neutralized with sodium hydroxide. From the analysis of the total amount of streptomycin in the eluate, it can be seen that about 15%
<Desc / Clms Page number 8>
of the total capacity of the resin were used for the adsorption of the antibiotic. Few organic impurities from the initial broth were retained in the column but the eluate, which contained 10 mg of streptomycin per ml, also contained about 20 mg of inorganic salts per ml of solution; this salt content being determined by evaporation of a measured sample and by incineration in the presence of sulfuric acid.
The solution also contained about 4 mg per ml, colored and unidentified organic impurities.
A second column is prepared containing 115 ml of carboxylic acid cation exchange resin (genus Amberlite XE 89). The resin is equilibrated with sodium hydroxide for a pH of 7.8. The neutralized eluate from the previous column is introduced into the second column. At periodic intervals, the effluent from the second column is analyzed to determine its streptomycin content. After a total of 3 liters of the partially purified streptomycin solution has been added to the column, it is found that no more antibiotic can be extracted out of the solution, that is, the Concentration of the antibiotic in the inlet solution is the same as that of the outlet solution.
The supply to the column is therefore interrupted and the resin is washed with water. The antibiotic is then eluted with a 0.36N sulfuric acid solution. The excess acid in the eluate is immediately neutralized with a solution of barium hydroxide. The precipitated barium sulfate is removed by filtration and the aqueous solution is analyzed for streptomycin. About 50% of the total resin capacity was found to have been used for streptomycin adsorption. The eluate contains approximately 30 mg of antibiotic, as a base, per ml of eluate and approximately 6 mg, per ml, of inorganic salts, determined as sulphated ash. About one third of the colored impurities present in the eluate supplied to the second column is retained in the eluate.
A third column is prepared containing 30 ml of a sulfonated copolymer of polystyrene and about 16% by weight of divinylbenzene (known as Dowex 50-X16). The resin is treated with dilute sulfuric acid to convert it completely to the acid state and is then washed with water to remove excess acid. The neutralized eluate, from the previous column, is fed to the column, containing the DoWex 50-X16, until the pH of the column effluent shows a well-defined trend of. ascend. About 660 ml of the effluent is collected up to this point. It is immediately neutralized with barium hydroxide and the precipitated barium sulfate is filtered off.
A practically quantitative recovery of streptomycin is obtained at the outlet of this column. The solution has a concentration of 25 mg per ml as basic streptomycin and only 0.62 mg, per ml, of inorganic salts (as sulphated ash).
Concentration of the solution in vacuo, treatment with a small amount of activated carbon and the addition of several volumes of methanol yields a precipitate of streptomycin sulfate having high purity. This material is filtered and dried in vacuo. It was found that it contained 1.64% ash and that the activity of the product, when the latter had been freed from volatiles, corresponded to about 790. mcg / mg compared to the theoretical activity of 798 mcg / mg of streptomycin sulfate.
EXAMPLE II.
A filtered fermentation broth is adjusted to a pH of 7.5. Analysis shows that it contains 300 mcg of the antibiotic -per ml of solution.-1
<Desc / Clms Page number 9>
This material is introduced into a column containing Amberlite IRC50 resin equilibrated to pH = 7.5 with sodium hydroxide. The antibiotic solution is added to the column until the concentration of the antibiotic in the column has become 'very close' to that of the solution entering the effluent.
The column is then washed with water and the antibiotic is eluted or separated from the resin using a 0.35N sulfuric acid solution. The eluate from the column is immediately neutralized with barium hydroxide and the precipitated barium sulfate is filtered off. The neutralized eluate contains approximately
8 mg of viomycin per ml, as a base, and 7 mg, per ml, of sulphated ash. About 12% of the total resin capacity was used for the adsorption of the antibiotic.
A part of the eluate (190 liters), from the above column, is introduced at a pH of 7.5 into a column containing 3750 ml of resin of the Amberlite XE89 type which had previously been equilibrated with sodium hydroxide diluted so as to have a pH = 7.5. The resin adsorbs the antibiotic viomycin to a degree corresponding to approximately
80% of its total exchange capacity. The addition of the partially purified viomycin solution is continued until the column effluent has approximately the same antibiotic content as the solution which has been introduced into the column. The addition of the effluent is then stopped and the column is washed with water.
The antibiotic is eluted with 0.35 N sulfuric acid and the eluate is immediately neutralized with barium hydroxide. The precipitated barium sulphate is removed by filtration and the eluate is concentrated in vacuo, at a moderately elevated temperature, to a volume of 11 liters. Analysis of a sample shows that the concentrate contains 102 mg of viomycin as base per ml and only 5 mg of ash (sulphated) per ml. Treatment of the eluate with activated carbon removes a small portion of the residual color. Addition of 2 volumes of methanol to the aqueous solution results in crystallization of viomyoine sulfate. This material weighs 1275 g when dried under vacuum. It contains 1% ash and 9.3% volatile matter.
When stripped of the volatiles present, the activity was found to be about 805 mcg / mg. The theoretical activity of pure viomycin sulfate is 820 mcg / mg. An extremely high purity is therefore obtained by the simple process described.
EXAMPLE III.
A neomycin fermentation broth is acidified and filtered, after which it is neutralized. This material contains approximately 730 mcg / ml of neomycin. 140 liters of the solution are supplied to a column containing 1 liter of the carboxylic acid ion exchange resin (type Amberlite IRC50) which has been adjusted to approximately neutral using sodium hydroxide. sodium. Almost quantitative adsorption of the antibiotic onto the resin is obtained. The resin is washed with water and then eluted with a 1% sulfuric acid solution. The eluate is immediately neutralized with barium hydroxide and the precipitated barium sulfate is filtered off.
The filtered solution is analyzed and it is found that it contains 10 mg of neomycin (as base) per ml and approximately 8 mg of sulphated ash per ml.
Part of the neutralized and partially purified neomycin solution obtained using the Amberlite IRC50 column is supplied to an Amberlite XE89 column which has been equilibrated with dilute sodium hydroxide to. have a pH equal to approximately 7.0. The solution is added to the column until appreciable amounts of antibiotic are detected in the effluent. The column is washed with water and is
<Desc / Clms Page number 10>
then eluted with a 1% sulfuric acid solution. The excess acid in the effluent is neutralized with barium hydroxide, after which the precipitated barium sulfate is removed by filtration. The eluate contains approximately 20 mg of neomycin per ml and 5 mg of sulphated ash per ml.
The eluate is passed through a column containing Dowex-50X16 resin in the acid form. Virtually all of the ash is removed from the material with little or no loss of neomycin. The effluent from the column is neutralized with barium hydroxide. The precipitate is filtered off and the residual color is removed with a minimal amount of activated carbon. The purified solution is poured into several volumes of methanol and the precipitated neomycin is separated by filtration.
The product contains 1% sulphated ash and 3.2% volatile matter.
After separation of the volatiles, analysis gives an activity of about 650 mcg / mg, compared to the activity of 670 mcg / mg of pure neomycin sulfate. It is found that this product, obtained by this relatively simple process, is very suitable for therapeutic use.
EXAMPLE IV.
A filtered streptomycin fermentation broth, having an antibiotic activity of 800 mcg / ml, is passed through a column containing a resin of the Amberlite IRC50 genus at a pH of 7.5. The antibiotic is eluted from the resin using 0.35 N hydrochloric acid and the eluate is neutralized with sodium hydroxide. By adsorption of the antibiotic, about 15% of the capacity of the resin is used. The eluate contains about 7 mg / ml of the antibiotic. Part of this material is passed through a column containing 100 ml of a resin of the genus Amberlite XE 89 at a pH of 7.5. The antibiotic is eluted from the resin with acid. diluted sulfuric acid. The eluate contains about 18 g of streptomycin and about 2 g of ash.
About 50% of the total capacity of the Amberlite XE 89 genus resin was used for the adsorption of the antibiotic. The eluate is neutralized with sodium hydroxide and then passes through a column containing 30 ml of Dowex 50-X16 type resin in the acid form.
The effluent leaving the column is immediately neutralized with a barium hydroxide solution. The barium sulfate precipitate is removed by filtration. The filtrate is concentrated in vacuo and decolorized with activated carbon. The solution obtained in this way is added to several volumes of methanol to precipitate streptomycin sulfate.
The product is filtered and dried. It gives the test an activity of 775 mcg / ml and contains only 0.7% ash. A high proportion of antibiotic contained in the initial broth is obtained in this way.
EXAMPLE V.
Filtered neomycin fermentation broth is supplied, at pH 7.5, to a column containing 33 liters of Amberlite IRC50 resin, previously equilibrated to pH = 7.5 with a solution of. sodium hydroxide. When the resin stops adsorbing neomycin, the feed is discontinued and the column is washed with water, then eluted with a 1% sulfuric acid solution. The core fraction of the eluate is collected (ie the part thereof having the maximum antibiotic content); about 170 liters with a pH = 2.1. It contains neomycin at a concentration of 12.0 mg / ml as well as a total of 31 mg / ml of solids and 7 mh / ml of sulphated ash.
This represents a considerable purification when comparing the product to the fermentation broth. The antibiotic solution is neutralized with barium hydroxide and the barium sulfate is separated by filtration. The filtrate is supplied to a column containing Amberlite XE89 resin which has been previously equilibrated.
<Desc / Clms Page number 11>
supplied with sodium hydroxide so as to have a-pH = 7.5. After the column has been saturated with neomycin, it is eluted with 1% sulfuric acid solution and the excess acid is neutralized with barium hydroxide. The eluate contains 19.5 mg / ml neomycin, 40 mg / ml total solids and 7 mg / ml sulphated ash.
This solution is passed through a Dowex 50-X16 resin having an acidic pH.
The column effluent is neutralized with sodium hydroxide. It was found to contain 15 mg / ml of neomycin, a total of 23 mg / ml of solids and 0.1 mg / ml of sulphated ash. The aqueous solution is carefully concentrated in vacuo at low temperature and the neomycin sulfate is isolated by precipitation with ethanol. The dried product was found to have an activity of 660 mog / mg and a content of 1.0% ash. A product is therefore obtained having a high purity and very suitable for pharmaceutical use.
EXAMPLE VI.
A streptomycin fermentation broth, having an activity of about 750 units per milliliter, is filtered after adjusting the pH to about 2.5. The filtered solution is passed through a column of Amberlite IRC50 resin to a pH = approximately 7.5, i.e. the pH of the fermentation broth is adjusted to 7.5 with sodium hydroxide. , the resin being equilibrated to this pH by contact with a dilute solution of sodium hydroxide. After adsorption of the antibiotic by the resin, the resin column is washed with a small volume of water and this water is discarded.
The antibiotic is then eluted using a 0.35N hydrochloric acid solution. After all the antibiotic has been separated from the resin column, the eluate is neutralized with sodium hydroxide solution. The eluate contains approximately 7 mg of antibiotic per milliliter of solution. This solution is passed through a second column containing Amberlite IRC50 resin, equilibrated to pH = 7.5. When the resin no longer adsorbs additional streptomycin, the feed is interrupted and the resin is eluted with 0.35 N sulfuric acid. Excess sulfuric acid is removed from the acid solution using of barium hydroxide. The impure solution contains about 6% by weight of impurities based on the total weight of the crude product in the solution.
This is passed through a column containing resin of the type Dowex 50-X16 in the acid state. The effluent is neutralized with barium hydroxide and the barium sulphate obtained is separated by filtration. After carefully concentrating the aqueous solution in vacuo, it is treated with a small amount of decolouring carbon, filtered and poured into methanol. The precipitated streptomycin sulfate is filtered off and dried. The dried product contains, in the test, 745 mcg / mg streptomycin and 0.6% ash.
EXAMPLE VII.
The pH of a filtered neomycin fermentation broth, containing 500 mcg / ml of neomycin, is adjusted to 7.5 and this broth is supplied to a column containing 33 liters of Amberlite IRC50, previously equilibrated to pH = 7e5 using sodium hydroxide solution. Feeding is continued until the column stops adsorbing neomycin. The column is washed with water to remove residual broth and the antibiotic is then eluted using a 1% sulfuric acid solution.
The first part of the eluate, containing little antibiotic, is separated.
The next part of the eluate, which contains a high proportion of antibiotic, is collected. It has a volume of 170 liters and a pH = 2.1. The solution contains 12.5 mg / ml neomycin, 33 mg / ml total solids and 5 mg / ml ash (as sulphated ash). The partially purified solution is then supplied to a column containing 35 liters.
<Desc / Clms Page number 12>
of Dowex 50-X16 resin in the acid state. The column effluent, containing the antibiotic, is neutralized with a solution of barium hydroxide and the barium sulfate is filtered off. The purified solution is treated with a small amount of decolorizing carbon and is then filtered.
This solution contains only 0.04 mg / ml of ash (in the form of sulphated ash). A solid product is isolated by concentrating the solution at low temperature in vacuo and pouring the concentrated solution into methanol. The precipitated solids are filtered, washed with a small volume of methanol and dried. The neomycin sulfate thus obtained has an activity, in the test, of 670 mcg / mg and contains only 0.55% ash.
EXAMPLE VIII.
The pH of a filtered viomycin fermentation broth is adjusted to 7.5. This solution contains approximately 300 mcg / ml of viomycin. It is supplied to a column containing Amberlite IRC50 resin whose pH has been previously equilibrated to 7.5 with sodium hydroxide solution. The solution is supplied to the column until an appreciable amount of the antibiotic begins to appear in the column effluent. The resin column with the adsorbed antibiotic is washed with a small volume of water and the antibiotic is then eluted with 0.35N sulfuric acid solution. The excess acid in the eluate is neutralized with barium hydroxide. 15.6 liters of this solution are passed through a column containing 1350 ml of Dowex-X16 resin.
The acidic column effluent is neutralized with barium hydroxide and the barium sulphate is removed by filtration. The aqueous solution is then carefully concentrated in vacuo and the concentrated aqueous solution is decolotated with activated carbon. Viomycin sulfate is crystallized out of solution by adding 2 1/2 volumes of methanol. 147 g of crystallized viomycin sulfate are obtained which, in the test, has an activity of 790 mcg / mg. This product contains 0.2% ash and 4% volatiles. When freed from these impurities, the product has an activity of 824 mcg / mg which is very close to the theoretical activity of pure viomycin sulfate.
CLAIMS.
1. A method of purifying a basic antibiotic, characterized in that an impure aqueous solution of the antibiotic is brought into contact with an ion exchange resin of the carboxylic acid type, which is at least partially neutralized and at a limited porosity, the antibiotic is separated by elution from the resin using a dilute acid and the eluate of said resin is then brought into contact, or else with an ion-exchange resin. of the carboxylic acid type, which is at least partially neutralized and has a high porosity, or with an ion exchange resin of the sulfonic acid type.