PROCEDE DE PURIFICATION D'ACIDES AMINES AROMATIQUES PROCESS FOR PURIFYING AROMATIC AMINO ACIDS
DOMAINE DE L'INVENTION FIELD OF THE INVENTION
La présente invention concerne un procédé de purification d'acides aminés aromatiques, c'est-à-dire d'acides aminés comportant un cycle aromatique, et en premier lieu le tryptophane, la phénylalanine, la tyrosine, et l'histidine. ARRIERE-PLAN TECHNIQUE The present invention relates to a method for purifying aromatic amino acids, that is to say amino acids having an aromatic ring, and firstly tryptophan, phenylalanine, tyrosine, and histidine. TECHNICAL BACKGROUND
Les acides aminés aromatiques peuvent être produits par fermentation, par enzymation ou par voie synthétique. The aromatic amino acids can be produced by fermentation, enzymation or synthetic route.
Le tryptophane, la phénylalanine et l'histidine (pour les nourrissons) font partie de la famille des acides aminés essentiels : à ce titre, ils sont utilisés en tant que compléments nutritifs. Tryptophan, phenylalanine and histidine (for infants) are part of the family of essential amino acids and as such are used as nutritional supplements.
Le moût d'acide aminé produit par voie fermentaire, synthétique ou enzymatique contient des impuretés parmi lesquelles des sucres et substrats résiduels, des minéraux, des pigments. Ces impuretés doivent être éliminées pour atteindre le degré de pureté requis pour son utilisation commerciale. The fermentative, synthetic or enzymatic amino acid wort contains impurities including residual sugars and substrates, minerals, pigments. These impurities must be removed to achieve the purity required for commercial use.
Diverses méthodes de purification ont été développées pour purifier les acides aminés aromatiques. Elles sont basées sur les technologies dominantes suivantes : cristallisation, extraction liquide / liquide et fixation sur résine. Various purification methods have been developed for purifying aromatic amino acids. They are based on the following dominant technologies: crystallization, liquid / liquid extraction and resin fixation.
La purification par cristallisation est mise en œuvre en voie aqueuse ou solvant. Des étapes de de prétraitement avant cristallisation sont parfois prévues, de manière à augmenter la pureté des cristaux. Il peut s'agir d'une étape de purification sur charbon actif (documents CN 101245047 et CN 102146052) ; d'une étape de filtration membranaire sur filtre inox (document CN 101376646) ; d'une étape d'ultrafiltration (document CN 101691349) ; ou d'une combinaison de plusieurs filtrations successives pour éliminer plusieurs familles d'impuretés, par exemple un enchaînement microfiltration / ultrafiltration / nanofiltration (document CN 101812009).
Des solvants sont parfois ajoutés lors de la cristallisation pour atteindre de meilleurs degrés de pureté, tels que de l'acide acétique (documents JP 2097801 et EP 1756055), ou un alcool aliphatique (document EP 0274728). L'utilisation de ces solvants entraîne une augmentation des coûts de production, et des coûts de traitement ou de recyclage des liqueurs mères. The purification by crystallization is carried out in aqueous route or solvent. Pre-treatment steps before crystallization are sometimes provided, so as to increase the purity of the crystals. This may be a purification step on activated carbon (documents CN 101245047 and CN 102146052); a membrane filtration step on a stainless steel filter (CN 101376646); an ultrafiltration step (CN 101691349); or a combination of several successive filtrations to remove several families of impurities, for example a microfiltration / ultrafiltration / nanofiltration sequence (CN 101812009). Solvents are sometimes added during crystallization to achieve higher levels of purity, such as acetic acid (JP 2097801 and EP 1756055), or an aliphatic alcohol (EP 0274728). The use of these solvents leads to an increase in production costs, and costs of treatment or recycling of mother liquors.
Une deuxième voie de purification consiste à procéder à une extraction liquide / liquide de l'acide aminé. Ainsi, il a été proposé une purification du tryptophane utilisant des tensioactifs pour former une phase micellaire inverse (document CN 102382030), ou encore du toluène (document EP 0299715). Ces techniques ne sont jamais suffisantes en tant que telles pour atteindre de hauts degrés de pureté. Des étapes de pré- et de post-traitement sont nécessaires. De plus, la mise en œuvre de volumes importants de solvants est économiquement peu intéressante pour traiter des volumes industriels d'acides aminés à l'échelle de plusieurs kilotonnes / an / unité. A second purification route consists in carrying out a liquid / liquid extraction of the amino acid. Thus, it has been proposed a purification of tryptophan using surfactants to form a reverse micellar phase (CN 102382030), or else toluene (EP 0299715). These techniques are never sufficient as such to achieve high levels of purity. Pre- and post-treatment steps are required. In addition, the implementation of large volumes of solvents is economically unattractive to treat industrial volumes of amino acids at the scale of several kilotonnes / year / unit.
Enfin, une troisième voie propose un traitement sur résine polymérique. Finally, a third route proposes a treatment on polymeric resin.
Dans les documents CN 101812488, CN 101948420 et US 2013/0079527, la purification repose sur une capture et fixation de l'acide aminé sur une résine adsorbante (donc neutre), puis une élution à l'éthanol (dans les deux premiers documents) ou avec un sel (dans le troisième document). In the documents CN 101812488, CN 101948420 and US 2013/0079527, the purification is based on a capture and fixation of the amino acid on an adsorbent resin (thus neutral), then elution with ethanol (in the first two documents) or with a salt (in the third document).
Le document FR 2581654 décrit l'adsorption du tryptophane sur une résine cationique forte polystyrénique faiblement réticulée. Le composé cible est précipité, puis dissout dans une solution acide, notamment une solution d'acide sulfurique ou chlorhydrique ayant un pH de 1 à 2. La solution acide est ensuite mise en contact avec une résine échangeuse de cations, qui est rincée à l'eau puis s'ensuit une élution par une base. Ce procédé de type « batch » est la voie couramment en usage aujourd'hui pour une mise en œuvre industrielle. Document FR 2581654 describes the adsorption of tryptophan on a weakly crosslinked polystyrenic strong cationic resin. The target compound is precipitated and then dissolved in an acid solution, in particular a sulfuric acid or hydrochloric acid solution having a pH of 1 to 2. The acidic solution is then brought into contact with a cation exchange resin, which is rinsed with water. water followed by an elution by a base. This process of the "batch" type is the way commonly used today for industrial implementation.
Le document FR 1502814 décrit l'adsorption du tryptophane sur une résine cationique forte ou sur une résine anionique forte. Dans ces deux cas, la résine sélectionnée présente un faible taux de réticulation. Dans le cas d'une résine cationique forte, le pH du mélange contenant le tryptophane est ajusté à 2 avant la mise en contact avec la résine. L'élution est effectuée en deux temps: d'abord une élution par une solution saline neutre pour éliminer des acides aminés polluants, puis une élution par une solution basique pour
désorber le tryptophane. Il s'agit d'un procédé nécessitant deux éluants distincts et des quantités importantes de régénérants. The document FR 1502814 describes the adsorption of tryptophan on a strong cationic resin or on a strong anionic resin. In these two cases, the selected resin has a low degree of crosslinking. In the case of a strong cationic resin, the pH of the tryptophan-containing mixture is adjusted to 2 before contacting the resin. The elution is carried out in two stages: first elution with a neutral saline solution to eliminate polluting amino acids, then elution with a basic solution for desorb tryptophan. This is a process requiring two separate eluents and large amounts of regenerants.
L'inconvénient des traitements sur résines décrits ci-dessus est de nécessiter une consommation importante de régénérant chimique concentré (usuellement 2 à 10 % en masse) pour éluer l'acide aminé après fixation. Une quantité d'effluents équivalente à celle de régénérant est également engendrée. The disadvantage of the resin treatments described above is to require a large consumption of concentrated chemical regenerant (usually 2 to 10% by weight) to elute the amino acid after fixation. An amount of effluent equivalent to that of the regenerant is also generated.
Le document US 5300653 décrit la séparation sur colonne unique en batch d'au moins un acide aminé aromatique d'autres acides aminés non aromatiques sur une résine cationique forte de type gel initialement convertie sous forme saline avec un métal alcalin. La solution contenant l'acide aminé présente de préférence un pH de 2 à 12. L'acide aminé est adsorbé lors du passage de la solution sur la résine, puis il est désorbé avec de l'eau dépourvue d'acide ou de base ou un solvant organique. US 5300653 discloses the batch single column separation of at least one aromatic amino acid from other nonaromatic amino acids on a strong gel type cationic resin initially converted to saline form with an alkali metal. The solution containing the amino acid preferably has a pH of 2 to 12. The amino acid is adsorbed during the passage of the solution on the resin, then it is desorbed with acid or base-free water or an organic solvent.
Un inconvénient de cette méthode est que le mode d'élution ne permet pas de maîtriser la forme ionique de la résine. En effet, les espèces cationiques présentes dans la solution à traiter sont susceptibles de s'échanger avec le métal alcalin, sans qu'aucun éluant ne permette de maintenir la forme ionique initiale. Les performances de séparation entre les acides aminés peuvent être affectées par ces mécanismes d'échange d'ions intempestifs : par conséquent, les rendements et puretés en acides aminés produits risquent de diminuer ou de varier de manière incontrôlée dans le temps. A disadvantage of this method is that the elution mode does not control the ionic form of the resin. Indeed, the cationic species present in the solution to be treated are likely to be exchanged with the alkali metal, without any eluent to maintain the original ionic form. The separation performance between the amino acids can be affected by these unwanted ion exchange mechanisms: therefore, the yields and purities of amino acids produced may decrease or vary uncontrollably over time.
La majorité de ces traitements sur résine repose sur une mise en œuvre de type « batch », c'est-à-dire discontinue. Les résines sont installées en colonne, et les éluants successifs (moût contenant l'acide aminé ; eaux de rinçage ; solutions régénérantes - salines, basiques, acides ou alcooliques) sont percolés successivement à travers la colonne. The majority of these resin treatments are based on a "batch" type of implementation, that is, discontinuous. The resins are installed in columns, and the successive eluents (must containing the amino acid, rinsing water, regenerating solutions - saline, basic, acidic or alcoholic) are percolated successively through the column.
Toutefois le document US 2013/0079527 susmentionné décrit une séparation semi-continue sur résine adsorbante de type XAD7, dans un système de chromatographie à lit mobile simulé (SMB, pour Simulated Moving Bed) comportant trois zones de séparation. Le système est élué à l'eau ou au sel. Cette méthode présente l'inconvénient d'opérer sur une résine adsorbante, donc une résine plus coûteuse que des résines échangeuses d'ions. Les résines adsorbantes ont également tendance à s'encrasser rapidement. Leur utilisation nécessite un protocole de nettoyage à l'alcool, à la base et à l'acide pour éliminer les impuretés responsables de
l'encrassement, ce qui accroît les contraintes opératoires en termes de coûts et d'équipements installés. However, the abovementioned US 2013/0079527 document describes a semi-continuous separation on adsorbent resin of XAD7 type, in a simulated moving bed chromatography (SMB) system comprising three separation zones. The system is eluted with water or salt. This method has the disadvantage of operating on an adsorbent resin, thus a more expensive resin than ion exchange resins. The adsorbent resins also tend to foul quickly. Their use requires an alcohol, base and acid cleaning protocol to remove the impurities responsible for fouling, which increases the operating constraints in terms of costs and installed equipment.
Ainsi, il existe un besoin de mettre au point un procédé de purification d'acide aminé aromatique amélioré, permettant notamment une séparation entre l'acide aminé cible et des impuretés telles que les sels, les sucres, les couleurs, avec une consommation minime de produits chimiques. Thus, there is a need to develop an improved aromatic amino acid purification process, in particular allowing a separation between the target amino acid and impurities such as salts, sugars, colors, with a minimal consumption of chemical products.
RESUME DE L'INVENTION SUMMARY OF THE INVENTION
L'invention concerne en premier lieu un procédé de purification d'un acide aminé à partir d'un mélange de départ, dans lequel l'acide aminé comporte un cycle aromatique et présente une constante d'acidité Ka, le procédé comprenant : The invention firstly relates to a process for purifying an amino acid from a starting mixture, wherein the amino acid has an aromatic ring and has an acid constant Ka, the process comprising:
une première étape de mise en contact du mélange de départ avec une résine cationique forte, à un pH supérieur ou égal à pKa ; a first step of contacting the starting mixture with a strong cationic resin at a pH greater than or equal to pKa;
une deuxième étape d'élution avec une solution aqueuse d'éluant présentant un pH supérieur au pH de la première étape, permettant de collecter un flux enrichi en l'acide aminé. Selon un mode de réalisation, le mélange de départ comprend en outre des sucres et/ou des sels, et dans lequel le flux enrichi en l'acide aminé comporte moins de sucres et/ou de sels que le mélange de départ. a second elution step with an aqueous eluent solution having a pH greater than the pH of the first stage, making it possible to collect a stream enriched with the amino acid. According to one embodiment, the starting mixture further comprises sugars and / or salts, and wherein the stream enriched in the amino acid has fewer sugars and / or salts than the starting mixture.
Selon un mode de réalisation, la deuxième étape d'élution est une étape d'élution isocratique. According to one embodiment, the second elution step is an isocratic elution step.
Selon un mode de réalisation, l'acide aminé présente une constante de basicité Kb et, lors de la première étape, le pH est inférieur ou égal à pKb-3, de préférence inférieur ou égal à pKb-4, de manière plus particulièrement préférée inférieur ou égal à pKb-5 et idéalement inférieur ou égal à pKb-6. According to one embodiment, the amino acid has a Kb basicity constant and, during the first step, the pH is less than or equal to pKb-3, preferably less than or equal to pKb-4, more particularly preferably less than or equal to pKb-5 and ideally less than or equal to pKb-6.
Selon un mode de réalisation, la deuxième étape d'élution est effectuée directement à la suite de la première étape de mise en contact, sans rinçage intermédiaire. According to one embodiment, the second elution step is performed directly following the first contacting step, without intermediate rinsing.
Selon un mode de réalisation, la solution d'éluant est une solution d'une base dans l'eau, la base étant de préférence de la soude, de la potasse, de l'ammoniac ou un mélange de ceux-ci, et de manière plus particulièrement préférée de l'ammoniac. According to one embodiment, the eluent solution is a solution of a base in water, the base preferably being sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or a mixture thereof, and more particularly preferably ammonia.
Selon un mode de réalisation, la concentration de la base dans la solution d'éluant est de 0,01 à 50 g/L, de préférence de 0,2 à 20 g/L, plus particulièrement de 0,5 à 10 g/L, et tout particulièrement de 1 à 5 g/L.
Selon un mode de réalisation, le rapport du nombre de moles de base dans la solution d'éluant utilisée à la deuxième étape sur le nombre de moles d'acide aminé dans le mélange de départ mis en contact à la première étape est inférieur ou égal à 3, de préférence inférieur ou égal à 2, de préférence inférieur ou égal à 1 ,5, de préférence inférieur ou égal à 1 , de préférence inférieur ou égal à 0,9, de préférence inférieur ou égal à 0,8, de préférence inférieur ou égal à 0,7, de préférence inférieur ou égal à 0,6, de préférence inférieur ou égal à 0,5, de préférence inférieur ou égal à 0,4. According to one embodiment, the concentration of the base in the eluent solution is from 0.01 to 50 g / l, preferably from 0.2 to 20 g / l, more particularly from 0.5 to 10 g / l. L, and most preferably from 1 to 5 g / L. According to one embodiment, the ratio of the number of moles of base in the eluent solution used in the second step to the number of moles of amino acid in the starting mixture contacted in the first step is less than or equal to at 3, preferably less than or equal to 2, preferably less than or equal to 1, 5, preferably less than or equal to 1, preferably less than or equal to 0.9, preferably less than or equal to 0.8, preferably less than or equal to 0.7, preferably less than or equal to 0.6, preferably less than or equal to 0.5, preferably less than or equal to 0.4.
Selon un mode de réalisation, l'acide aminé est le tryptophane ou la phénylalanine ou la tyrosine ou l'histidine. According to one embodiment, the amino acid is tryptophan or phenylalanine or tyrosine or histidine.
Selon un mode de réalisation, la résine cationique forte est un copolymère polystyrène-divinylbenzène. According to one embodiment, the strong cationic resin is a polystyrene-divinylbenzene copolymer.
Selon un mode de réalisation, la résine cationique forte présente un taux de réticulation de 5 à 12 %, de préférence de 6 à 1 1 %, plus particulièrement de 7 à 10 %, de préférence de 8 à 9 %. According to one embodiment, the strong cationic resin has a degree of crosslinking of 5 to 12%, preferably 6 to 11%, more particularly 7 to 10%, preferably 8 to 9%.
Selon un mode de réalisation, la résine cationique forte est sous forme cationique monovalente, de préférence sous forme Na+ ou K+ ou NH4 +, et de manière plus particulièrement préférée sous forme NH4 +. According to one embodiment, the strong cationic resin is in monovalent cationic form, preferably in the Na + or K + or NH 4 + form , and more preferably in the NH 4 + form .
Selon un mode de réalisation, le procédé est mis en œuvre dans une installation chromatographique multi-colonnes, l'installation comportant de préférence 30 colonnes au plus, de manière plus particulièrement préférée 20 colonnes au plus, ou 12 colonnes au plus, ou 8 colonnes au plus, ou 6 colonnes au plus. According to one embodiment, the method is implemented in a multi-column chromatographic installation, the installation preferably comprising at most 30 columns, more preferably at most 20 columns, or at most 12 columns, or 8 columns. at most, or 6 columns at most.
Selon un mode de réalisation, le procédé est mis en œuvre dans une installation chromatographique à lit non-statique, et de préférence dans une installation chromatographique à lit mobile simulé, ou à lit mobile réel, ou à lit mobile simulé amélioré, ou à lit mobile simulé séquentiel, et de préférence à lit mobile simulé séquentiel. According to one embodiment, the method is implemented in a non-static bed chromatographic installation, and preferably in a simulated moving bed, moving bed, or improved simulated moving bed chromatographic installation, or in a bed sequential simulated mobile, and preferably sequentially simulated moving bed.
Selon un mode de réalisation, le mélange de départ est obtenu à l'issu du traitement d'un mélange brut, le mélange brut étant de préférence un moût fermentaire, synthétique ou enzymatique, et ledit traitement comportant de préférence une ou plusieurs étapes choisies parmi une centrifugation, une filtration frontale, une cristallisation, une filtration tangentielle, une microfiltration et une ultrafiltration. According to one embodiment, the starting mixture is obtained at the end of the treatment of a crude mixture, the crude mixture preferably being a fermentative, synthetic or enzymatic must, and said treatment preferably comprising one or more steps chosen from centrifugation, frontal filtration, crystallization, tangential filtration, microfiltration and ultrafiltration.
Selon un mode de réalisation, le procédé comprend une ou plusieurs étapes de concentration du flux enrichi en l'acide aminé, de préférence choisies parmi une concentration par évaporation et notamment par
évaporation à film tombant, une concentration par évaporation multi-effets, une concentration membranaire et notamment une nanofiltration. According to one embodiment, the process comprises one or more concentration steps of the stream enriched in the amino acid, preferably chosen from a concentration by evaporation and especially by falling film evaporation, a concentration by multi-effect evaporation, a membrane concentration and in particular nanofiltration.
Selon un mode de réalisation, à l'issue de la ou des étapes de concentration, un flux d'acide aminé concentré d'une part et un flux de solution d'éluant d'autre part sont collectés, le procédé comprenant le recyclage de ce flux de solution d'éluant vers la deuxième étape d'élution. According to one embodiment, at the end of the concentration step or steps, a concentrated amino acid stream on the one hand and a flow of eluent solution on the other hand are collected, the process comprising the recycling of this flow of eluent solution to the second elution step.
Selon un mode de réalisation, la différence entre le pH de la solution d'éluant utilisée à la deuxième étape et le pH de la première étape est supérieure ou égale à 2, de préférence supérieure ou égale à 4, plus particulièrement supérieure ou égale à 6, et notamment supérieure ou égale à 8. According to one embodiment, the difference between the pH of the eluent solution used in the second step and the pH of the first step is greater than or equal to 2, preferably greater than or equal to 4, more particularly greater than or equal to 6, and in particular greater than or equal to 8.
La présente invention permet de surmonter les inconvénients de l'état de la technique. Elle fournit plus particulièrement un procédé de purification d'acide aminé aromatique amélioré, permettant notamment une séparation entre l'acide aminé cible et des impuretés telles que les sels, les sucres, les couleurs, avec une consommation minime de produits chimiques. The present invention overcomes the disadvantages of the state of the art. More particularly, it provides an improved aromatic amino acid purification process, in particular allowing a separation between the target amino acid and impurities such as salts, sugars, colors, with a minimal consumption of chemicals.
Cela est accompli grâce à l'utilisation d'une résine cationique forte (résine échangeuse d'ions), qui n'est pas utilisée en mode d'échange d'ions. L'invention repose sur un mode d'élution chromatographique où l'acide aminé aromatique est séparé de sa solution initiale par un phénomène de retardation dû à son affinité avec la résine. Ainsi, l'invention prévoit de mettre en contact l'acide aminé sous forme majoritairement zwitterionique avec la résine (pH supérieur ou égal au pKa de l'acide aminé), puis de l'éluer avec une solution de pH plus élevé. This is accomplished through the use of a strong cationic resin (ion exchange resin), which is not used in ion exchange mode. The invention is based on a chromatographic elution mode where the aromatic amino acid is separated from its initial solution by a delay phenomenon due to its affinity with the resin. Thus, the invention provides for contacting the amino acid in predominantly zwitterionic form with the resin (pH greater than or equal to the pKa of the amino acid), and then eluting with a higher pH solution.
Le mode opératoire diffère des procédés existants qui mettent en œuvre un phénomène de capture par immobilisation de l'acide aminé, puis de désorption par un éluant de régénération concentré. The procedure differs from the existing methods which implement a capture phenomenon by immobilization of the amino acid, then desorption by a concentrated regeneration eluent.
Sans vouloir être liés par une théorie, les inventeurs estiment que le mécanisme de séparation mis en œuvre est probablement un phénomène d'adsorption par interaction hydrophobe entre les liaisons Pi du groupement aromatique et/ou du doublet du ou des atomes d'azote présents dans le cycle de l'acide aminé, et les fonctions hydrophobes de la matrice de la résine : la séparation ne consiste donc pas en une séparation par échange d'ions. Without wishing to be bound by theory, the inventors believe that the separation mechanism used is probably a phenomenon of adsorption by hydrophobic interaction between the P1 bonds of the aromatic group and / or the doublet of the nitrogen atom (s) present in the the amino acid cycle, and the hydrophobic functions of the matrix of the resin: the separation does not therefore consist of ion exchange separation.
La présente invention peut notamment être mise en œuvre avec une solution d'élution diluée et avec un ratio éluant / acide aminé plus faible, ce qui permet de minimiser les consommations chimiques et les quantités d'effluents.
L'invention permet également de mettre en œuvre un mécanisme de purification de façon contrôlée, évitant les variations importantes de rendement et de pureté en acides aminés produits. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES The present invention can in particular be implemented with a dilute elution solution and with a lower eluent / amino acid ratio, which makes it possible to minimize the chemical consumptions and the quantities of effluents. The invention also makes it possible to implement a purification mechanism in a controlled manner, avoiding significant variations in yield and purity in amino acids produced. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
La figure 1 représente de manière schématique une installation permettant de mettre en œuvre le procédé selon un mode de réalisation de l'invention. Figure 1 schematically shows an installation for implementing the method according to one embodiment of the invention.
La figure 2 illustre l'évolution de la concentration de tryptophane (en g/L, symbole O), de la conductivité (en mS/cm, symbole X) et du taux de matière sèche (en degrés Brix, symbole■) en fonction du volume injecté (en abscisse, en BV ou « Bed Volumes », c'est-à-dire en multiples du volume de lit) dans une colonne de séparation chromatographique. Les conditions opératoires sont précisées dans l'exemple 1 . Figure 2 illustrates the evolution of the tryptophan concentration (in g / L, symbol O), the conductivity (in mS / cm, symbol X) and the dry matter content (in degrees Brix, symbol ■) depending the injected volume (abscissa, BV or "Bed Volumes", that is, multiples of the bed volume) in a chromatographic separation column. The operating conditions are specified in Example 1.
La figure 3 illustre l'évolution de la concentration de tryptophane Figure 3 illustrates the evolution of tryptophan concentration
(en g/L, échelle de gauche, symbole O), de la conductivité (en mS/cm, échelle de gauche, symbole X) et du taux de matière sèche (en degrés Brix, échelle de droite, symbole■) sur plusieurs colonnes chromatographiques (en abscisse, le numéro de colonne) dans un système de purification de type SSMB. Les conditions opératoires sont précisées dans l'exemple 2. (in g / L, scale on the left, symbol O), conductivity (in mS / cm, scale on the left, symbol X) and dry matter content (in degrees Brix, scale on the right, symbol ■) on several Chromatographic columns (abscissa, column number) in a SSMB purification system. The operating conditions are specified in Example 2.
La figure 4 illustre l'évolution de la concentration de phénylalanine (en g/L, symbole O), de la conductivité (en mS/cm, symbole X) et du taux de matière sèche (en degrés Brix, symbole■) en fonction du volume injecté (en abscisse, en BV) dans une colonne de séparation chromatographique. Les conditions opératoires sont précisées dans l'exemple 3. Figure 4 illustrates the evolution of the phenylalanine concentration (in g / L, symbol O), the conductivity (in mS / cm, symbol X) and the dry matter content (in Brix, symbol ■) depending the injected volume (abscissa, BV) in a chromatographic separation column. The operating conditions are specified in Example 3.
La figure 5 illustre l'évolution de la concentration d'histidine (en g/L, symbole O), de la conductivité (en mS/cm, symbole X) et du taux de matière sèche (en degrés Brix, symbole ■) en fonction du volume injecté (en abscisse, en BV) dans une colonne de séparation chromatographique. Les conditions opératoires sont précisées dans l'exemple 5. Figure 5 illustrates the evolution of the histidine concentration (in g / L, symbol O), the conductivity (in mS / cm, symbol X) and the dry matter content (in degrees Brix, symbol ■) in function of the injected volume (abscissa, in BV) in a chromatographic separation column. The operating conditions are specified in Example 5.
DESCRIPTION DE MODES DE REALISATION DE L'INVENTION DESCRIPTION OF EMBODIMENTS OF THE INVENTION
L'invention est maintenant décrite plus en détail et de façon non limitative dans la description qui suit. The invention is now described in more detail and without limitation in the description which follows.
L'invention permet de collecter sous forme purifiée un acide aminé aromatique présent dans un mélange de départ, généralement une solution aqueuse (moût de fermentation, synthétique, ou issu d'enzymation)
contenant des impuretés de diverses natures : couleur, sels / minéraux, sucres. The invention makes it possible to collect, in purified form, an aromatic amino acid present in a starting mixture, generally an aqueous solution (fermentation, synthetic or enzymatic fermentation mash). containing impurities of various natures: color, salts / minerals, sugars.
Ainsi, selon un mode de réalisation, le mélange de départ contient des sucres, par exemple des nutriments de fermentation (glucose et/ou saccharose, etc.) et/ou des métabolites. La teneur totale en sucres (et en particulier la teneur en monosaccharides et disaccharides) dans le mélange de départ peut ainsi être par exemple de 0,01 à 100 g/L, et de préférence de 0,1 à 15 g/L. Thus, according to one embodiment, the starting mixture contains sugars, for example fermentation nutrients (glucose and / or sucrose, etc.) and / or metabolites. The total sugar content (and in particular the content of monosaccharides and disaccharides) in the starting mixture can thus be, for example, from 0.01 to 100 g / l, and preferably from 0.1 to 15 g / l.
Selon un mode de réalisation, le mélange de départ contient des sels, qui peuvent être des sels minéraux et/ou des sels organiques. La teneur totale en sels dans le mélange de départ peut ainsi être par exemple de 0,01 à 80 g/L, et de préférence de 0,5 à 20 g/L. According to one embodiment, the starting mixture contains salts, which may be inorganic salts and / or organic salts. The total content of salts in the starting mixture can thus be, for example, from 0.01 to 80 g / l, and preferably from 0.5 to 20 g / l.
La conductivité du mélange de départ peut être par exemple de 1 à 200 mS/cm, de préférence de 2 à 100 mS/cm, et notamment de 5 à 50 m S/cm. The conductivity of the starting mixture can be, for example, from 1 to 200 mS / cm, preferably from 2 to 100 mS / cm, and especially from 5 to 50 m S / cm.
Selon un mode de réalisation, le mélange de départ est obtenu à l'issue d'un prétraitement par clarification du bouillon de culture (ou d'enzymation). Cette opération de clarification peut être menée par diverses technologies : According to one embodiment, the starting mixture is obtained after pretreatment by clarification of the culture broth (or enzymation). This clarification operation can be carried out by various technologies:
- Décantation / centrifugation. - Decantation / centrifugation.
- Filtration tangentielle sur membrane organique, plane ou spiralée, avec un seuil de coupure typiquement compris entre 2000 et 300.000 Da. Tangential filtration on an organic, flat or spiral membrane, with a cut-off threshold typically between 2000 and 300,000 Da.
- Filtration tangentielle sur membrane céramique, avec un seuil de coupure typiquement supérieur à 10.000 Da. Tangential filtration on a ceramic membrane, with a cut-off threshold typically greater than 10,000 Da.
- Filtration sur filtre inox. - Filtration on stainless steel filter.
- Combinaison des opérations précédentes, l'ordre pouvant être ajusté selon les cas en fonction de la nature du mélange de départ et des objectifs du procédé. Combination of the above operations, the order being adjustable according to the case depending on the nature of the starting mixture and the objectives of the process.
L'acide aminé aromatique est de préférence la phénylalanine, le tryptophane, la tyrosine, l'histidine, ou un dérivé de ceux-ci. On peut également chercher à récupérer un mélange d'acides aminés aromatiques. The aromatic amino acid is preferably phenylalanine, tryptophan, tyrosine, histidine, or a derivative thereof. One can also seek to recover a mixture of aromatic amino acids.
L'invention prévoit une séparation chromatographique sur une résine cationique forte. Par « résine cationique forte », on entend une résine ayant des fonctions acides greffées qui sont des acides forts. The invention provides for chromatographic separation on a strong cationic resin. By "strong cationic resin" is meant a resin having grafted acid functional groups which are strong acids.
Selon un mode de réalisation préféré, la « résine cationique forte » signifie une résine comportant des fonctions acide sulfonique.
Selon un mode de réalisation, la résine cationique est une résine polystyrène-divinylbenzène (DVB) forte. According to a preferred embodiment, the "strong cationic resin" means a resin comprising sulfonic acid functions. According to one embodiment, the cationic resin is a strong polystyrene-divinylbenzene (DVB) resin.
Selon un mode de réalisation, la résine est sous forme de particules, dont le diamètre volumique moyen (Dv50) est de préférence de 20 à 600 μιτι, notamment de 200 à 350 μιτι. De préférence, la distribution du diamètre volumique des particules de résine présente un seul maximum (distribution monodisperse). Le coefficient d'uniformité de cette distribution peut être par exemple inférieur ou égal à 1 ,5, ou inférieur ou égal à 1 ,3, ou inférieur ou égal à 1 ,15. La distribution de taille des particules de résine peut être déterminée par granulométrie laser (norme NF 13320). According to one embodiment, the resin is in the form of particles, whose average volume diameter (Dv50) is preferably from 20 to 600 μιτι, in particular from 200 to 350 μιτι. Preferably, the distribution of the volume diameter of the resin particles has only one maximum (monodisperse distribution). The coefficient of uniformity of this distribution may be, for example, less than or equal to 1, 5, or less than or equal to 1, 3, or less than or equal to 1, 15. The size distribution of the resin particles can be determined by laser granulometry (standard NF 13320).
La résine est de préférence une résine macro-réticulée (et donc n'est pas une résine de type gel). Ainsi, selon des modes de réalisation, le taux de réticulation de la résine (taux de DVB lorsque la résine est le copolymère susmentionné) vaut de 5 à 6 % ; ou de 6 à 7 % ; ou de 7 à 8 % ; ou de 8 à 9 % ; ou de 9 à 10 % ; ou de 10 à 1 1 % ; ou de 1 1 à 12 %. On définit le taux de réticulation comme le rapport de la quantité de monomères agents de réticulation (par exemple monomères DVB) sur la quantité totale de monomères (par exemple monomères DVB et autres monomères de la résine) qui sont mis en œuvre dans la fabrication de la résine (les quantités étant exprimées en moles). The resin is preferably a macro-cross-linked resin (and therefore is not a gel-like resin). Thus, according to embodiments, the degree of crosslinking of the resin (DVB content when the resin is the abovementioned copolymer) is from 5 to 6%; or 6-7%; or 7 to 8%; or from 8 to 9%; or from 9 to 10%; or from 10 to 1 1%; or from 1 to 12%. The degree of crosslinking is defined as the ratio of the amount of crosslinking monomer monomers (for example DVB monomers) to the total amount of monomers (for example DVB monomers and other monomers of the resin) which are used in the manufacture of the resin (the amounts being expressed in moles).
Selon un mode de réalisation, la résine est sous forme monovalente. Par exemple, elle peut être sous forme Na+, K+ ou de préférence NH4 +. According to one embodiment, the resin is in monovalent form. For example, it may be in the Na + , K + or preferably NH 4 + form .
Optionnellement, le procédé de l'invention peut comprendre une étape préliminaire de conditionnement de la résine sous une forme ionique souhaitée, notamment sous forme Na+, K+ ou de préférence NH4 +. Cette étape préliminaire peut être effectuée notamment en faisant passer une solution saline ou basique appropriée sur la résine. Optionally, the method of the invention may comprise a preliminary step of conditioning the resin in a desired ionic form, especially in Na + , K + or preferably NH 4 + form . This preliminary step can be carried out in particular by passing an appropriate saline or basic solution on the resin.
Les acides aminés se comportent comme des acides et bases faibles. Ils présentent une constante d'acidité Ka et une constante de basicité Kb. On définit pKa = - log-io(Ka) et pKb = - log-io(Kb). Le pKa et le pKb représentent les pH de demi-dissociation, c'est-à-dire les pH auxquels la fonction acide, respectivement la fonction basique, des acides aminés est à moitié ionisée. Amino acids behave like weak acids and bases. They have an acid constant Ka and a basicity constant Kb. We define pKa = - log-io (Ka) and pKb = - log-io (Kb). PKa and pKb represent the pH of half-dissociation, that is to say the pH at which the acid function, respectively the basic function, of the amino acids is half-ionized.
On appelle zwitterion la forme de l'acide aminé dans laquelle à la fois fonction acide et la fonction aminé (basique) sont ionisées. Zwitterion is the form of the amino acid in which both the acid function and the amine (basic) function are ionized.
Les valeurs de pKa et de pKb pour les quatre acides aminés aromatiques susmentionnés sont les suivantes : The pKa and pKb values for the four aromatic amino acids mentioned above are as follows:
- Phénylalanine : pKa = 1 ,8 et pKb = 9,1 . Phenylalanine: pKa = 1.8 and pKb = 9.1.
- Tryptophane : pKa = 2,4 et pKb = 9,4.
- Tyrosine : pKa = 2,2 et pKb = 9,1 . Tryptophan: pKa = 2.4 and pKb = 9.4. Tyrosine: pKa = 2.2 and pKb = 9.1.
- Histidine : pKa = 1 ,8 et pKb = 9,2. Histidine: pKa = 1, 8 and pKb = 9.2.
L'invention prévoit une étape de mise en contact d'un mélange de départ (ou charge, ou produit d'alimentation) avec une résine chromatographique, puis une étape d'élution. The invention provides a step of contacting a starting mixture (or filler, or feed product) with a chromatographic resin, then an elution step.
Dans la première étape, le pH est supérieur ou égal au pKa de l'acide aminé aromatique recherché (ou aux pKa des acides aminés aromatiques recherchés, s'il y en a plusieurs), afin d'assurer que l'acide aminé soit d'une façon significative sous forme de zwitterion. In the first step, the pH is greater than or equal to the pKa of the desired aromatic amino acid (or pKa of the desired aromatic amino acids, if there are several), to ensure that the amino acid is significantly in the form of zwitterion.
Selon certains modes de réalisation, le pH lors de la première étape est supérieur ou égal à pKa+0,5 ; ou supérieur ou égal à pKa+1 ; ou supérieur ou égal à pKa+1 ,5 ; ou supérieur ou égal à pKa+2 ; ou supérieur ou égal à pKa+2,5 ; ou supérieur ou égal à pKa+3. In some embodiments, the pH in the first step is greater than or equal to pKa + 0.5; or greater than or equal to pKa + 1; or greater than or equal to pKa + 1, 5; or greater than or equal to pKa + 2; or greater than or equal to pKa + 2.5; or greater than or equal to pKa + 3.
Il faut noter que le pH lors de la première étape peut également être inférieur ou égal à pKa + 3 ; ou inférieur ou égal à pKa + 2,5 ; ou inférieur ou égal à pKa + 2 ; ou inférieur ou égal à pKa + 1 ,5 ; ou inférieur ou égal à pKa + 1 ; ou inférieur ou égal à pKa + 0,5. It should be noted that the pH in the first step may also be less than or equal to pKa + 3; or less than or equal to pKa + 2.5; or less than or equal to pKa + 2; or less than or equal to pKa + 1, 5; or less than or equal to pKa + 1; or less than or equal to pKa + 0.5.
Selon certains modes de réalisation, le pH lors de la première étape est inférieur ou égal à pKb-3 ; ou inférieur ou égal à pKb-3,5 ; ou inférieur ou égal à pKb-4 ; ou inférieur ou égal à pKb -4,5 ; ou inférieur ou égal à pKb-5 ; ou inférieur ou égal à à pKb-5,5 ; ou inférieur ou égal à pKb-6. In some embodiments, the pH in the first step is less than or equal to pKb-3; or less than or equal to pKb-3.5; or less than or equal to pKb-4; or less than or equal to pKb -4.5; or less than or equal to pKb-5; or less than or equal to pKb-5.5; or less than or equal to pKb-6.
Par exemple, le pH lors de la première étape peut être compris entre pKa et pKb-3, ou entre pKa et pKb-4, ou entre pKa et pKb-5, ou entre pKa et pKb-6. For example, the pH in the first step may be between pKa and pKb-3, or between pKa and pKb-4, or between pKa and pKb-5, or between pKa and pKb-6.
Selon certains modes de réalisation, le pH lors de la première étape vaut de 1 ,8 à 1 ,9 ; ou de 1 ,9 à 2,0 ; ou de 2,0 à 2,1 ; ou de 2,1 à 2,2 ; ou de 2,2 à 2,3 ; ou de 2,3 à 2,4 ; ou de 2,4 à 2,5 ; ou de 2,5 à 2,6 ; ou de 2,6 à 2,7 ; ou de 2,7 à 2,8 ; ou de 2,8 à 2,9 ; ou de 2,9 à 3,0 ; ou de 3,0 à 3,2 ; ou de 3,2 à 3,4 ; ou de 3,4 à 3,6 ; ou de 3,6 à 3,8 ; ou de 3,8 à 4,0 ; ou de 4,0 à 4,5 ; ou de 4,5 à 5,0 ; ou de 5,0 à 5,5 ; ou de 5,5 à 6,0 ; ou de 6,0 à 6,5 ; ou de 6,5 à 7,0. In some embodiments, the pH in the first step is from 1.8 to 1.9; or from 1.9 to 2.0; or from 2.0 to 2.1; or from 2.1 to 2.2; or from 2.2 to 2.3; or from 2.3 to 2.4; or from 2.4 to 2.5; or from 2.5 to 2.6; or from 2.6 to 2.7; or 2.7 to 2.8; or 2.8 to 2.9; or from 2.9 to 3.0; or from 3.0 to 3.2; or 3.2 to 3.4; or from 3.4 to 3.6; or from 3.6 to 3.8; or from 3.8 to 4.0; or from 4.0 to 4.5; or 4.5 to 5.0; or from 5.0 to 5.5; or 5.5 to 6.0; or 6.0 to 6.5; or 6.5 to 7.0.
Le pH de la charge (mélange de départ) peut être ajusté avant la mise en contact avec la résine par ajout d'acide ou de base. The pH of the feed (starting mixture) can be adjusted before contacting the resin by addition of acid or base.
Dans la deuxième étape, l'éluant est une solution aqueuse présentant un pH supérieur à celui de la première étape. L'éluant peut être une solution aqueuse basique, telle qu'une solution de NH3 ou NaOH notamment. In the second step, the eluent is an aqueous solution having a pH higher than that of the first step. The eluent may be a basic aqueous solution, such as a solution of NH 3 or NaOH in particular.
La différence de pH entre la deuxième étape et la première étape (ΔρΗ) peut valoir de 0,5 à 1 ,0 ; ou de 1 ,0 à 1 ,5 ; ou de 1 ,5 à 2,0 ; ou de 2,0 à
2,5 ; ou de 2,5 à 3,0 ; ou de 3,0 à 3,5 ; ou de 3,5 à 4,0 ; ou de 4,0 à 4,5 ; ou de 4,5 à 5,0 ; ou de 5,0 à 5,5 ; ou de 5,5 à 6,0 ; ou de 6,0 à 6,5 ; ou de 6,5 à 7,0 ; ou de 7,0 à 7,5 ; ou de 7,5 à 8,0 ; ou de 8,0 à 8,5 ; ou de 8,5 à 9,0 ; ou de 9,0 à 9,5 ; ou de 9,5 à 10,0 ; ou de 10,0 à 10,5 ; ou de 10,5 à 1 1 ,0 ; ou de 1 1 ,0 à 1 1 ,5 ; ou de 1 1 ,5 à 12,0. The difference in pH between the second step and the first step (ΔρΗ) can be from 0.5 to 1.0; or from 1.0 to 1.5; or from 1.5 to 2.0; or from 2.0 to 2.5; or from 2.5 to 3.0; or from 3.0 to 3.5; or from 3.5 to 4.0; or from 4.0 to 4.5; or 4.5 to 5.0; or from 5.0 to 5.5; or 5.5 to 6.0; or 6.0 to 6.5; or 6.5 to 7.0; or from 7.0 to 7.5; or 7.5 to 8.0; or from 8.0 to 8.5; or 8.5 to 9.0; or 9.0 to 9.5; or 9.5 to 10.0; or from 10.0 to 10.5; or from 10.5 to 11.0; or from 1, 0 to 1, 1, 5; or from 1, 5 to 12.0.
Le pH de l'éluant (deuxième étape) peut valoir notamment de 7,0 à 7,5 ; ou de 7,5 à 8,0 ; ou de 8,0 à 8,5 ; ou de 8,5 à 9,0 ; ou de 9,0 à 9,5 ; ou de 9,5 à 10,0 ; ou de 10,0 à 10,5 ; ou de 10,5 à 1 1 ,0 ; ou de 1 1 ,0 à 1 1 ,5 ; ou de 1 1 ,5 à 12,0 ; ou de 12,0 à 12,5 ; ou de 12,5 à 13,0 ; ou de 13,0 à 13,5 ; ou de 13,5 à 14,0. The pH of the eluent (second stage) can be in particular from 7.0 to 7.5; or 7.5 to 8.0; or from 8.0 to 8.5; or 8.5 to 9.0; or 9.0 to 9.5; or 9.5 to 10.0; or from 10.0 to 10.5; or from 10.5 to 11.0; or from 1, 0 to 1, 1, 5; or from 1, 5 to 12.0; or from 12.0 to 12.5; or from 12.5 to 13.0; or from 13.0 to 13.5; or from 13.5 to 14.0.
L'éluant peut être une solution d'une base dans l'eau, par exemple NaOH ou NH3, à une concentration de 0,001 à 0,01 g/L ; ou de 0,01 à 0,1 g/L ; ou de 0,1 à 0,5 g/L ; ou de 0,5 à 1 g/L ; ou de 1 à 2 g/L ; ou de 2 à 3 g/L ; ou de 3 à 4 g/L ; ou de 4 à 5 g/L ; ou de 5 à 6 g/L ; ou de 6 à 7 g/L ; ou de 7 à 8 g/L ; ou de 8 à 9 g/L ; ou de 9 à 10 g/L ; ou de 10 à 15 g/L ; ou de 15 à 20 g/L ; ou de 20 à 25 g/L ; ou de 25 à 50 g/L ; ou de 50 à 100 g/L. The eluent may be a solution of a base in water, for example NaOH or NH 3 , at a concentration of 0.001 to 0.01 g / L; or from 0.01 to 0.1 g / L; or from 0.1 to 0.5 g / L; or from 0.5 to 1 g / L; or 1 to 2 g / L; or from 2 to 3 g / L; or from 3 to 4 g / L; or from 4 to 5 g / L; or from 5 to 6 g / L; or from 6 to 7 g / L; or 7 to 8 g / L; or from 8 to 9 g / L; or from 9 to 10 g / L; or from 10 to 15 g / L; or from 15 to 20 g / L; or from 20 to 25 g / L; or from 25 to 50 g / L; or from 50 to 100 g / L.
Selon un mode de réalisation, le nombre de moles de base utilisée pour l'élution, rapporté au nombre de moles d'acide aminé injecté, est inférieur ou égal à 3 ; ou inférieur ou égal à 2 ; ou inférieur ou égal à 1 ,5 ; ou inférieur ou égal à 1 ; ou inférieur ou égal à 0,9 ; ou inférieur ou égal à 0,8 ; ou inférieur ou égal à 0,7 ; ou inférieur ou égal à 0,6 ; ou inférieur ou égal à 0,5 ; ou inférieur ou égal à 0,4. According to one embodiment, the number of moles of base used for the elution, relative to the number of moles of amino acid injected, is less than or equal to 3; or less than or equal to 2; or less than or equal to 1, 5; or less than or equal to 1; or less than or equal to 0.9; or less than or equal to 0.8; or less than or equal to 0.7; or less than or equal to 0.6; or less than or equal to 0.5; or less than or equal to 0.4.
L'élution est de préférence isocratique, c'est-à-dire que la composition de l'éluant ne varie pas dans le temps. Elution is preferably isocratic, i.e. the eluent composition does not change over time.
Dans un mode de réalisation préféré, le cation de la base utilisée pour l'élution est le cation de la résine. Ainsi, par exemple, si la résine est sous forme Na+, l'éluant peut être une solution de NaOH ; si la résine est sous forme K+, l'éluant peut être une solution de KOH ; et si la résine est sous forme NH4 +, l'éluant peut être une solution d'ammoniac. In a preferred embodiment, the cation of the base used for elution is the cation of the resin. Thus, for example, if the resin is in Na + form, the eluent may be a solution of NaOH; if the resin is in K + form, the eluent may be a KOH solution; and if the resin is in NH 4 + form , the eluent may be an ammonia solution.
L'élution par la base permet de maintenir la forme ionique de la résine, qui pourrait sinon être modifiée par les sels minéraux présents dans solution de charge. En outre, sans vouloir être tenu par une théorie, les inventeurs font l'hypothèse d'un effet de charge osmotique sur la résine, qui tend également à libérer les espèces adsorbées. The elution by the base makes it possible to maintain the ionic form of the resin, which could otherwise be modified by the mineral salts present in the charge solution. In addition, without wishing to be bound by theory, the inventors hypothesize an osmotic charge effect on the resin, which also tends to release the adsorbed species.
L'acide aminé aromatique recherché présente une affinité plus forte pour la résine que la plupart des autres impuretés. On récupère donc les impuretés (par exemple sucres et sels) dans la fraction raffinât, tandis que l'acide aminé est récupéré dans l'extrait.
Selon un mode de réalisation, la teneur massique totale en sucres (en particulier en monosaccharides et disaccharides) dans l'extrait est réduite d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, ou d'au moins 95 %, ou d'au moins 98 %, ou d'au moins 99 %, ou d'au moins 99,5 %, ou d'au moins 99,9 %, par rapport à la teneur massique totale en sucres (en particulier e, monosaccharides et disaccharides) dans le mélange de départ. De préférence, l'extrait (flux enrichi en l'acide aminé) est dépourvu ou essentiellement dépourvu de sucres (en particulier de monosaccharides et disaccharides). The desired aromatic amino acid has a stronger affinity for the resin than most other impurities. The impurities (for example sugars and salts) are thus recovered in the raffinate fraction, while the amino acid is recovered in the extract. According to one embodiment, the total mass content of sugars (in particular monosaccharides and disaccharides) in the extract is reduced by at least 80%, preferably by at least 90%, or at least 95%, or at least 98%, or at least 99%, or at least 99,5%, or at least 99,9%, based on the total mass content of sugars (in particular e, monosaccharides and disaccharides) in the starting mixture. Preferably, the extract (stream enriched with the amino acid) is free or essentially free of sugars (in particular monosaccharides and disaccharides).
Selon un mode de réalisation, la teneur massique totale en sels dans l'extrait est réduite d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, ou d'au moins 95 %, ou d'au moins 98 %, ou d'au moins 99 %, ou d'au moins 99,5 %, ou d'au moins 99,9 %, par rapport à la teneur massique totale en sucres (en particulier de monosaccharides et disaccharides) dans le mélange de départ. De préférence, l'extrait (flux enrichi en l'acide aminé) est dépourvu ou essentiellement dépourvu de sels. According to one embodiment, the total mass content of salts in the extract is reduced by at least 80%, preferably at least 90%, or at least 95%, or at least 98%, or at least 99%, or at least 99,5%, or at least 99,9%, based on the total mass content of sugars (in particular of monosaccharides and disaccharides) in the starting mixture . Preferably, the extract (stream enriched with the amino acid) is free or essentially free of salts.
Selon un mode de réalisation, certaines impuretés très retenues peuvent être désorbées par une élution complémentaire par un éluant aqueux, salin ou polaire. According to one embodiment, certain impurities retained can be desorbed by a complementary elution by an aqueous eluent, saline or polar.
Selon un mode de réalisation, aucun rinçage intermédiaire n'est prévu entre l'étape de mise en contact et l'étape d'élution. L'injection de l'éluant suit ainsi directement l'injection du mélange de départ. According to one embodiment, no intermediate rinsing is provided between the contacting step and the eluting step. The injection of the eluent thus directly follows the injection of the starting mixture.
Selon un mode de réalisation, l'acide aminé récupéré dans l'extrait issu de la séparation chromatographique subit des traitements complémentaires, tels que : According to one embodiment, the amino acid recovered in the extract resulting from the chromatographic separation undergoes additional treatments, such as:
- Décoloration sur charbon. - Discoloration on charcoal.
- Déminéralisation. - Demineralization.
- Concentration sur membrane de type osmose inverse ou nanofiltration. - Membrane concentration of reverse osmosis or nanofiltration type.
- Evaporation ou évaporation multi-effets, ce qui permet d'optimiser les consommations énergétiques. - Evaporation or evaporation multi-effects, which optimizes energy consumption.
- Cristallisation. - Crystallization.
- Combinaison des opérations précédentes, l'ordre pouvant être ajusté selon les cas en fonction de la nature du mélange de départ et les objectifs du procédé. - Combination of previous operations, the order can be adjusted according to the case depending on the nature of the starting mixture and the objectives of the process.
Selon un mode de réalisation préféré, l'éluant (de préférence une solution de NH3) est séparé de l'acide aminé et récupéré lors des étapes de
post-traitement susmentionnées, afin d'être recyclé en tête du procédé de séparation chromatographique. According to a preferred embodiment, the eluent (preferably a solution of NH 3 ) is separated from the amino acid and recovered during the steps of post-treatment, in order to be recycled at the beginning of the chromatographic separation process.
Le procédé selon l'invention peut être discontinu (« batch »), semi- continu ou continu. De préférence, il est semi-continu ou continu. The process according to the invention may be discontinuous ("batch"), semi-continuous or continuous. Preferably, it is semi-continuous or continuous.
La séparation chromatographique selon l'invention peut être mise en œuvre dans une unité chromatographique à lit statique ou, de préférence, dans une unité chromatographique à lit non-statique. The chromatographic separation according to the invention can be carried out in a static bed chromatographic unit or, preferably, in a non-static bed chromatographic unit.
Dans un système chromatographique à lit statique, le mélange de composés à séparer percole dans une enceinte (ou colonne), généralement cylindrique. La colonne contient un lit de matériau poreux (phase stationnaire) perméable aux fluides. La vitesse de percolation de chaque composé dans le mélange dépend des propriétés physiques du composé. Les composés les plus retenus sur la phase stationnaire percolent plus lentement que les composés les moins retenus sur la phase stationnaire. Ce principe permet d'effectuer la séparation souhaitée. In a static bed chromatographic system, the mixture of compounds to be separated percolates in a chamber (or column), which is generally cylindrical. The column contains a bed of porous material (stationary phase) permeable to fluids. The rate of percolation of each compound in the mixture depends on the physical properties of the compound. The most retained compounds on the stationary phase percolate more slowly than the least retained compounds on the stationary phase. This principle makes it possible to perform the desired separation.
Il est possible d'effectuer un tel traitement dans plusieurs colonnes en série ou en parallèle, mais généralement une séparation chromatographique dans un système à lit statique est mise en œuvre avec une colonne unique. It is possible to perform such processing in several columns in series or in parallel, but generally a chromatographic separation in a static bed system is implemented with a single column.
Des exemples de tels systèmes chromatographiques à lit statique sont les systèmes HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance) ou CYCLOJET™ (système avec recyclage à l'état stationnaire). Examples of such static bed chromatographic systems are HPLC (high performance liquid chromatography) or CYCLOJET ™ systems (stationary recycling system).
Le système CYCLOJET™ est tel que décrit dans le document US 6,063,284, auquel il est fait expressément référence. Il s'agit d'un système de séparation chromatographique discontinue à colonne unique, dans lequel les espèces (i) les plus retenues puis (ii) les moins retenues sont collectées séparément à la sortie de la colonne, la portion non-séparée du chromatogramme étant recyclée par la pompe principale, et le mélange à séparer étant périodiquement injecté au moyen d'une boucle d'injection située essentiellement au milieu de la portion recyclée du chromatogramme. Après plusieurs cycles chromatographiques, le procédé atteint un état stationnaire périodique dans lequel la quantité de produits injectés est égale à la quantité de produits séparés collectés séparément à la sortie de la colonne. The CYCLOJET ™ system is as described in US 6,063,284, to which reference is expressly made. It is a discontinuous column chromatographic separation system in which the (i) most retained and then (ii) least retained species are collected separately at the exit of the column, the non-separated portion of the chromatogram. being recycled by the main pump, and the mixture to be separated is periodically injected by means of an injection loop located essentially in the middle of the recycled portion of the chromatogram. After several chromatographic cycles, the process reaches a periodic steady state in which the quantity of products injected is equal to the quantity of separated products collected separately at the outlet of the column.
Une variante du système CYCLOJET™ utilisant deux colonnes est décrite dans le document US 5,630,943, auquel il est fait expressément référence.
Un système à lit non-statique est un système multi-colonnes, dans lequel les positions relatives du lit de phase stationnaire et des points d'injection ou de collecte des flux se déplacent au cours du temps. A variant of the CYCLOJET ™ system using two columns is described in US 5,630,943, to which reference is expressly made. A non-static bed system is a multi-column system in which the relative positions of the stationary phase bed and injection or flow collection points move over time.
Des exemples de tels systèmes chromatographiques à lit non-statique sont les systèmes SMB (lit mobile simulé), iSMB (lit mobile simulé amélioré), SSMB (lit mobile simulé séquentiel), AMB (lit mobile réel), VARICOL™, MODICON™, POWERFEED™, MCSGP ou GSSR (chromatographie de gradient multi-colonnes). Examples of such non-static bed chromatographic systems are SMB (simulated moving bed), iSMB (enhanced simulated moving bed), SSMB (sequential simulated moving bed), AMB (real moving bed), VARICOL ™, MODICON ™, POWERFEED ™, MCSGP or GSSR (multi-column gradient chromatography).
Un système SMB comprend une pluralité de colonnes individuelles contenant un adsorbant, qui sont connectées en série. Un flux d'éluant traverse les colonnes selon une première direction. Les points d'injection du flux d'alimentation et de l'éluant, ainsi que les points de collecte des composés séparés, sont décalés périodiquement et simultanément au moyen d'un ensemble de vannes. L'effet global est de simuler le fonctionnement d'une colonne unique contenant un lit mobile d'adsorbant solide, l'adsorbant solide se déplaçant dans une direction à contre-courant du flux d'éluant. Ainsi, un système SMB est composé de colonnes qui contiennent des lits stationnaires d'adsorbant solide à travers lesquels passe l'éluant, mais le fonctionnement est tel qu'un lit mobile continu à contre- courant est simulé. An SMB system comprises a plurality of individual adsorbent containing columns, which are connected in series. An eluent stream flows through the columns in a first direction. The injection points of the feed stream and the eluent, as well as the collection points of the separated compounds, are periodically and simultaneously offset by means of a set of valves. The overall effect is to simulate the operation of a single column containing a solid adsorbent moving bed, the solid adsorbent moving in a countercurrent direction of the eluent stream. Thus, an SMB system is composed of columns which contain stationary beds of solid adsorbent through which the eluent passes, but the operation is such that a counter-current continuous moving bed is simulated.
La forme la plus conventionnelle d'un système SMB est le système SMB à quatre zones. D'autres formes possibles sont les systèmes SMB à trois zones et les systèmes SMB à deux zones (tels que décrits dans l'article « Two Section Simulated Moving Bed Process » de Kwangnam Lee, dans Séparation Science and Technology 35(4):519-534, 2000, auquel il est fait expressément référence). The most conventional form of an SMB system is the four-zone SMB system. Other possible forms are three-zone SMB systems and two-zone SMB systems (as described in Kwangnam Lee's "Two Section Simulated Moving Bed Process", in Separation Science and Technology 35 (4): 519 -534, 2000, which is expressly referred to).
Dans les systèmes iSMB et SSMB, il y a au moins une étape dans laquelle le système fonctionne en boucle fermée, sans entrée ou sortie de produit. In the iSMB and SSMB systems, there is at least one step in which the system operates in a closed loop, without product input or output.
Un système iSMB est tel que décrit dans les documents EP 0342629 et US 5,064,539, auxquels il est fait expressément référence. An iSMB system is as described in EP 0342629 and US 5,064,539, to which reference is expressly made.
Un système SSMB découpe les introductions et collectes des flux en sous séquences appliquées de façons périodiques. An SSMB system cuts the introductions and collection of flows in subsequences applied in periodic ways.
D'autres variantes des systèmes SMB sont : le système SMB variant dans le temps et le système POWERFEED™, tels que décrits dans le document US 5,102,553 et dans l'article « PowerFeed opération of simulated moving bed units: changing flow-rates during the switching interval », de Zhang et al. dans Journal of Chromatography A, 1006:87-99, 2003, auxquels
il est fait expressément référence; le système MODICON™, tel que décrit dans le document US 7,479,228, auquel il est fait expressément référence ; et le système SMB avec recirculation interne, tel que décrit dans le document US 8,282,831 , auquel il est fait expressément référence. Other variants of the SMB systems are: the time-varying SMB system and the POWERFEED ™ system, as described in US 5,102,553 and in the article "PowerFeed operation of simulated moving bed units: changing flow-rates during the switching interval ", by Zhang et al. in Journal of Chromatography A, 1006: 87-99, 2003, to which it is expressly referred to; the MODICON ™ system, as described in US 7,479,228, to which reference is expressly made; and the SMB system with internal recirculation, as described in US 8,282,831, to which reference is expressly made.
Un système AMB présente un fonctionnement similaire à un système An AMB system has a similar operation to a system
SMB. Toutefois, au lieu de déplacer les points d'injection du flux d'alimentation et de l'éluant, ainsi que des points de collecte, au moyen d'un système de vannes, un ensemble d'unités d'adsorption (colonnes) sont déplacées physiquement par rapport aux points d'alimentation et de collecte. A nouveau, le fonctionnement permet de simuler un lit mobile continu à contre-courant. SMB. However, instead of moving injection points of the feed stream and eluent, as well as collection points, by means of a valve system, a set of adsorption units (columns) are physically displaced from the feeding and collection points. Again, the operation simulates a continuous moving bed against the current.
Un système de chromatographie VARICOL™ est tel que décrit dans les documents US 6,136,198, US 6,375,839 US 6,413,419 et US 6,712,973, auxquels il est fait expressément référence. Un système VARICOL™ comprend une pluralité de colonnes individuelles contenant un adsorbant qui sont reliées en série. On fait passer un éluant dans les colonnes selon une première direction. Contrairement au système SMB, les points d'injection pour le mélange à séparer et pour l'éluant et les points de collecte des composés séparés dans le système sont déplacés périodiquement mais de manière asynchrone, au moyen d'un ensemble de vannes. L'effet global est de créer des zones de séparation de longueur variable dans le temps, allouant ainsi la phase stationnaire de manière dynamique dans les zones où elle est la plus utile, et permettant une puissance de séparation similaire avec moins d'unités de séparation chromatographique et une productivité accrue. Contrairement à un système SMB, un système VARICOL™ ne simule pas le fonctionnement d'une colonne unique contenant un lit mobile d'adsorbant solide, l'adsorbant solide se déplaçant dans une direction à contre-courant du flux d'éluant, et ainsi le principe de fonctionnement du VARICOL™ ne peut pas être mis en œuvre dans un système AMB équivalent. A VARICOL ™ chromatography system is as described in US 6,136,198, US 6,375,839 US 6,413,419 and US 6,712,973, to which reference is expressly made. A VARICOL ™ system comprises a plurality of individual adsorbent-containing columns that are connected in series. An eluent is passed through the columns in a first direction. Unlike the SMB system, the injection points for the mixture to be separated and for the eluent and the collection points of the separated compounds in the system are moved periodically but asynchronously, by means of a set of valves. The overall effect is to create time-varying separation zones over time, thus dynamically allocating the stationary phase to areas where it is most useful, and allowing similar separation power with fewer separation units. chromatography and increased productivity. Unlike an SMB system, a VARICOL ™ system does not simulate the operation of a single column containing a solid adsorbent moving bed, the solid adsorbent moving in a countercurrent direction of the eluent stream, and so the operating principle of VARICOL ™ can not be implemented in an equivalent AMB system.
Un exemple préféré de lit mobile simulé est représenté en référence à la figure 1 , sous la forme d'un système de chromatographie de type lit mobile simulé séquentiel (SSMB) sur six cellules ou colonnes. Ce système peut être opéré selon un fonctionnement cyclique en quatre phases. A preferred example of a simulated moving bed is shown with reference to Figure 1, in the form of a sequential simulated moving bed chromatography (SSMB) system on six cells or columns. This system can be operated according to a cyclic operation in four phases.
- Phase n °1 (partie A de la figure) : phase de boucle, durant laquelle on maintient une circulation continue en boucle fermée sur toutes les cellules placées en série, pour déplacer le volume interstitiel d'une cellule vers la suivante, sans injection d'éluant.
- Phase n °2 (partie B de la figure) : charge / injection de charge. La charge (F) est injectée en tête de la quatrième cellule. Simultanément, on collecte un volume sensiblement identique de raffinât (R) en sortie de la cinquième cellule. Les cellules 4 et 5 constituent ici la zone 3. Les cellules 2 et 3 constituent la zone de séparation entre extrait et injection de charge. Elles constituent ici la zone 2. Phase n ° 1 (part A of the figure): loop phase, during which a continuous closed-loop circulation is maintained on all the cells placed in series, to move the interstitial volume from one cell to the next, without injection eluent. - Phase 2 (part B of the figure): charge / charge injection. The charge (F) is injected at the top of the fourth cell. Simultaneously, a substantially identical volume of raffinate (R) is collected at the outlet of the fifth cell. The cells 4 and 5 here constitute the zone 3. The cells 2 and 3 constitute the separation zone between the extract and the charge injection. Here they constitute zone 2.
- Phase n °3 (partie B de la figure) : élution de l'extrait. L'éluant (EL) et injecté sur la première cellule pour éluer l'extrait (EX), qui est collecté en volume sensiblement identique au bas de la première cellule. La cellule n °1 constitue ici la zone 1 . - Phase 3 (part B of the figure): elution of the extract. The eluent (EL) and injected on the first cell to elute the extract (EX), which is collected in substantially the same volume at the bottom of the first cell. Cell No. 1 here constitutes zone 1.
- Les phases n °2 et 3 sont de préférence opérées simultanément pour accroître la productivité du système. Phases 2 and 3 are preferably operated simultaneously to increase the productivity of the system.
- Phase n °4 : élution du raffinât. L'éluant (EL) est injecté en tête de la première cellule, et le raffinât (R) est collecté en volume sensiblement identique sortie de la cinquième. La cellule n °6 est ici une cellule tampon permettant d'assurer la séparation entre la queue de l'extrait et la tête du raffinât. Elle constitue la zone 4. Cette zone peut être omise dans le cas où le degré de pureté et/ou le rendement recherché est relativement limité. - Phase n ° 4: elution of the raffinate. The eluent (EL) is injected at the top of the first cell, and the raffinate (R) is collected in substantially identical volume out of the fifth. Cell # 6 is here a buffer cell to ensure separation between the tail of the extract and the head of the raffinate. It constitutes zone 4. This zone may be omitted in the case where the degree of purity and / or the desired yield is relatively limited.
Ces phases sont opérées dans l'ordre dans un mode de réalisation préféré, de 1 à 4. Leur enchaînement constitue une séquence complète. These phases are operated in the order in a preferred embodiment, from 1 to 4. Their sequence constitutes a complete sequence.
Chaque séquence (phases n °1 à 4) est répétée six fois en décalant les entrées et sorties de cellules par incrémentation du numéro de cellule, de la gauche vers la droite du système : la charge est ainsi injectée en haut de cellule n °1 en séquence n °1 , puis en haut de cellule n °2 en séquence n °2, etc. Each sequence (phases 1 to 4) is repeated six times by shifting the cell inputs and outputs by incrementing the cell number, from the left to the right of the system: the charge is thus injected at the top of cell # 1 in sequence # 1, then at the top of cell # 2 in sequence # 2, etc.
Un cycle de production complet est réalisé après achèvement des six séquences successives, quand le point d'injection de la charge, initialement en entrée de cellule n °1 , revient de nouveau en entrée de cellule n °1 . A complete production cycle is carried out after completion of the six successive sequences, when the injection point of the charge, initially at the input of cell No. 1, returns again to the input of cell No. 1.
Dans ce qui précède, on a donné une description du système SSMB en référence au cas où les cellules correspondent à des colonnes. Ceci n'est pas limitatif, et l'invention s'applique aussi aux systèmes dans lesquels les cellules, ou encore compartiments, sont des parties de colonne. In the foregoing, a description of the SSMB system has been given with reference to the case where the cells correspond to columns. This is not limiting, and the invention also applies to systems in which the cells, or compartments, are column parts.
Par ailleurs, le nombre de colonnes présentes en zones 1 , 2, 3 et 4 peut varier en fonction de la qualité de séparation désirée. On peut donc concevoir des systèmes du même type avec une cellule, deux cellules, trois cellules, quatre cellules et jusqu'à douze cellules ou plus.
Le procédé peut encore être mis en œuvre dans une installation multi- colonnes non continue à boucle fermée ou à boucle ouverte, telle que le système DCC décrit dans le brevet WO 2007/012750. Moreover, the number of columns present in zones 1, 2, 3 and 4 may vary according to the desired quality of separation. Systems of the same type can therefore be designed with one cell, two cells, three cells, four cells and up to twelve cells or more. The method can still be implemented in a non-continuous closed-loop or open-loop multi-column system, such as the DCC system described in patent WO 2007/012750.
Selon un mode de réalisation, une installation multi-colonnes (notamment du type SMB ou analogue) contient une ou plusieurs zones de nettoyage, permettant de déconnecter une colonne de la boucle de séparation, afin de désorber périodiquement des composés (impuretés) fortement adsorbés, puis de régénérer et rééquilibrer l'adsorbant avec l'éluant de la séparation. According to one embodiment, a multi-column installation (in particular of the SMB type or the like) contains one or more cleaning zones, making it possible to disconnect a column from the separation loop, in order to periodically desorb strongly adsorbed compounds (impurities), then regenerate and rebalance the adsorbent with the eluent of the separation.
EXEMPLES EXAMPLES
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter. The following examples illustrate the invention without limiting it.
Exemple 1 - étude de la rétention du tryptophane Example 1 - Study of Tryptophan Retention
Dans cet exemple, on traite un moût de fermentation de tryptophane, prétraité par ajustement à pH = 2,6, puis microfiltration et diafiltration sur membranes céramiques. In this example, a tryptophan fermentation must is pretreated by adjustment to pH = 2.6, followed by microfiltration and diafiltration on ceramic membranes.
Le produit est traité sur une résine Applexion® XA2014-22 sur un volume de 30 mL par colonne (dans cet exemple, 30 mL représente 1 BV où BV signifie le volume de lit, ou Bed Volume, de résine). La résine est une résine cationique forte, de type polymérique polystyrène-DVB avec 8 % de DVB, de granulométrie monodisperse 220 μιτι, et de capacité d'échange ionique 1 ,8 eq/Lresine. La résine est préalablement convertie sous la forme Na à l'aide d'une solution de soude à 4 %. The product is treated on Applexion® XA2014-22 resin on a volume of 30 mL per column (in this example, 30 mL represents 1 BV where BV stands for bed volume, or Bed Volume, resin). The resin is a strong cationic resin, of the polystyrene-DVB polymer type with 8% DVB, with a 220 μιτι monodisperse granulometry, and with an ion exchange capacity of 1.8 eq / L resin . The resin is previously converted to the Na form using a 4% sodium hydroxide solution.
Le mélange de départ pour l'étape de chromatographie contient 17,5 g/L de tryptophane, 3,7 g/L de sucres résiduels, et présente une conductivité de 18,5 mS/cm induite par les sels en solution. The starting mixture for the chromatography step contains 17.5 g / L of tryptophan, 3.7 g / L of residual sugars, and has a conductivity of 18.5 mS / cm induced by salts in solution.
Ce mélange est injecté en excès sur la résine. Lors de la phase d'injection, on observe une différence de comportement des différentes espèces sur la résine : This mixture is injected in excess on the resin. During the injection phase, a difference in the behavior of the different species on the resin is observed:
- Les impuretés salines ne sont pas retenues sur la résine: on estime qu'un phénomène d'exclusion d'ions entre leur charge ionique et les charges de la résine empêche leur pénétration au sein de la matrice. Une conductivité identique à celle du mélange de départ est mesurée en sortie de colonne pendant l'étape d'élution.
- Les sucres, espèces neutres, peuvent pénétrer dans la matrice de la résine, et sont légèrement ralentis, mais non retenus : ils sont co-élués avec les sels pendant la phase d'injection. - Saline impurities are not retained on the resin: it is estimated that a phenomenon of exclusion of ions between their ionic charge and the charges of the resin prevents their penetration into the matrix. A conductivity identical to that of the starting mixture is measured at the column outlet during the elution stage. - Sugars, neutral species, can penetrate into the matrix of the resin, and are slightly slowed, but not retained: they are co-eluted with the salts during the injection phase.
- Le tryptophane, injecté majoritairement sous forme zwitterionique à pH = 2,6 subit quant à lui un phénomène de retardation par interaction entre son groupe aromatique et ceux de la résine. Tryptophan, mainly injected in zwitterionic form at pH = 2.6, undergoes a retardation phenomenon by interaction between its aromatic group and those of the resin.
L'élution du tryptophane ainsi retenu est obtenue avec une concentration de soude de 4 g/L, à 2 BV/h. The elution of the tryptophan thus retained is obtained with a sodium hydroxide concentration of 4 g / L, at 2 BV / h.
La figure 2 représente l'évolution des concentrations en un point du système qui voit se dérouler l'ensemble des étapes de séparation, du début de l'élution du raffinât à la fin de rinçage de l'extrait. La phase A est la phase d'injection du mélange de départ, la phase B est la phase d'élution avec la solution de soude. FIG. 2 represents the evolution of the concentrations at a point in the system which sees all of the separation steps taking place, from the beginning of the elution of the raffinate to the end of rinsing of the extract. Phase A is the injection phase of the starting mixture, phase B is the elution phase with the sodium hydroxide solution.
Ce système permet d'opérer avec les performances suivantes : This system allows you to operate with the following performances:
- 205,6 g de tryptophane traité par litre de résine sur un cycle de production de 8 heures ; 205.6 g of tryptophan treated per liter of resin over an 8 hour production cycle;
- concentration < 100 / cm pendant la collecte de l'extrait de tryptophane, correspondant à 99,5 % de déminéralisation. Exemple 2 - séparation multi-colonnes du tryptophane concentration <100 / cm during the collection of the tryptophan extract, corresponding to 99.5% of demineralization. Example 2 - multi-column separation of tryptophan
Dans cet exemple, l'invention est appliquée en mode chromatographique sur un système continu et multi-colonnes à un moût de fermentation à pH = 4 contenant du tryptophane à 40 g/L. Les impuretés principales sont des résidus de substrats, des minéraux, ainsi que des résidus solides de métabolisme cellulaire. In this example, the invention is applied in chromatographic mode on a continuous multi-column system to a fermentation mash at pH = 4 containing tryptophan at 40 g / L. The main impurities are substrate residues, minerals, as well as solid residues of cellular metabolism.
Le pH du moût est ici ajusté à 2,7 par ajout de H2S04. A ce pH supérieur au pKa, le tryptophane se trouve sous une forme majoritairement zwitterionique. The pH of the must is adjusted to 2.7 by adding H 2 SO 4 . At this pH higher than pKa, tryptophan is in a predominantly zwitterionic form.
Il est ensuite clarifié par microfiltration tangentielle sur une membrane céramique. Les matières solides en suspension sont retenues par la membrane et concentrées dans une fraction dénommée rétentat. Le tryptophane, ainsi que la majorité des impuretés solubles, sont transportés, quant à eux, à travers la membrane vers une fraction appelée perméat. It is then clarified by tangential microfiltration on a ceramic membrane. The suspended solids are retained by the membrane and concentrated in a fraction called retentate. Tryptophan, as well as the majority of soluble impurities, are transported through the membrane to a fraction called permeate.
En fin de concentration, un ajout d'eau dans le compartiment rétentat permet de diluer puis de reconcentrer le rétentat : cette opération, dite de diafiltration, permet d'augmenter le rendement global en tryptophane en diminuant sa teneur résiduelle dans le compartiment rétentat.
Le perméat de microfiltration ainsi traité contient 98 % du tryptophane initialement présent dans le moût, à une concentration de 15 g/L. Les impuretés y sont présentes à hauteur de 25 g/L de sels minéraux : sa conductivité vaut 15,9 mS/cm. On mesure également un taux de sucres de 3 g/L At the end of the concentration, an addition of water in the retentate compartment makes it possible to dilute and reconcentrate the retentate: this operation, known as diafiltration, makes it possible to increase the overall yield of tryptophan by decreasing its residual content in the retentate compartment. The microfiltration permeate thus treated contains 98% of the tryptophan initially present in the must, at a concentration of 15 g / l. The impurities are present at 25 g / L of mineral salts: its conductivity is 15.9 mS / cm. We also measure a sugar content of 3 g / L
Ce perméat est utilisé comme produit d'alimentation du système SSMB décrit ci-dessus. This permeate is used as feedstock of the SSMB system described above.
Suivant le principe du SSMB préalablement exposé, le système utilisé dans ce cas précis est constitué de 9 cellules de séparation, mises en œuvre sous forme de colonnes, et réparties comme suit : According to the principle of the SSMB previously exposed, the system used in this case consists of 9 separation cells, implemented in column form, and distributed as follows:
- Zone 1 : trois colonnes = zone d'élution du tryptophane ; - Zone 1: three columns = elution zone of tryptophan;
- Zone 2 : deux colonnes = zone de séparation ; - Zone 2: two columns = separation zone;
- Zone 3 : trois colonnes = zone de ralentissement du tryptophane ; Zone 3: three columns = slowdown zone of tryptophan;
- Zone 4 : une colonne = zone de boucle. - Zone 4: a column = loop area.
Chaque colonne contient 475 mL de résine Applexion® XA2014-22. On définit ainsi la taille d'un volume de lit, ou Bed Volume : 1 BV = 475 mL. Each column contains 475 mL of Applexion® XA2014-22 resin. This defines the size of a bed volume, or Bed Volume: 1 BV = 475 mL.
La résine est initialement conditionnée sous forme NH4 + par percolation d'ammoniaque NH3 de concentration 3 N. The resin is initially packaged in NH 4 + form by percolation of ammonia NH 3 concentration 3 N.
On opère le système à 4,5 BV/h. The system is operated at 4.5 BV / h.
Le produit d'alimentation est injecté en tête de zone 3. A chaque période de production sont injectés 7,5 BV de produit d'alimentation. Sur trois colonnes, le tryptophane est ralenti par phénomène de retardation sur la résine, et ainsi séparé des impuretés qui sont éluées et collectées, en sortie de zone, dans une fraction dite « raffinât ». La majorité des impuretés (sels et sucres) sont éluées dans ce raffinât : sa conductivité vaut 17,6 mS/cm. The feed product is injected at the top of zone 3. At each production period, 7.5 BV of feed product are injected. On three columns, the tryptophan is slowed by a phenomenon of retardation on the resin, and thus separated from the impurities which are eluted and collected at the outlet of the zone, in a so-called "raffinate" fraction. The majority of impurities (salts and sugars) are eluted in this raffinate: its conductivity is 17.6 mS / cm.
Le système est réglé de telle manière que 0,1 % du tryptophane initial est élué dans la fraction raffinât. The system is set so that 0.1% of the initial tryptophan is eluted in the raffinate fraction.
En tête de zone 1 est injecté de l'ammoniaque dilué à 2 g/L (éluant) qui permet de désorber le tryptophane. A chaque période de production sont injectés 5 BV d'éluant. Le tryptophane est récupéré lors de cette élution dans une fraction dite « extrait ». La conductivité de l'extrait est inférieure à 200 μβ/ατι : celui-ci est déminéralisé à hauteur de 98,8 % par rapport au produit d'alimentation. On mesure également une réduction de 89 % des sucres résiduels, et de 75 % de la couleur. At the head of zone 1 is injected ammonia diluted to 2 g / L (eluent) which allows to desorb tryptophan. Each production period is injected with 5 BV of eluent. Tryptophan is recovered during this elution in a fraction called "extract". The conductivity of the extract is less than 200 μβ / ατι: it is demineralized up to 98.8% with respect to the feed product. A reduction of 89% of the residual sugars and 75% of the color is also measured.
Une très faible quantité d'éluant ammoniacal est utilisé : le ratio éluant / produit d'alimentation vaut 0,67 (volume / volume). Aussi, un phénomène de concentration est observé pendant cette opération : le tryptophane est élué à 20 g/L (contre 15 g/L dans le produit d'alimentation). Plus de 99 % du
tryptophane initial est récupéré dans l'extrait au cours de cette étape. A chaque séquence du cycle SSMB, la quantité de NH3 utilisée est de 0,59 mol par L de résine, pour une quantité de tryptophane injectée de 1 ,47 mol / L de résine (soit 0,4 mole NH3 par mole de tryptophane) : ceci démontre que le mécanisme de rétention n'est pas l'échange d'ions. A very small amount of ammonia eluent is used: the eluent / feed ratio is 0.67 (volume / volume). Also, a phenomenon of concentration is observed during this operation: tryptophan is eluted at 20 g / L (against 15 g / l in the feed product). More than 99% of Initial tryptophan is recovered in the extract during this step. At each sequence of the SSMB cycle, the amount of NH 3 used is 0.59 mol per L of resin, for an amount of tryptophan injected with 1.47 mol / L of resin (ie 0.4 mole NH 3 per mole of tryptophan): this demonstrates that the retention mechanism is not ion exchange.
Le profil mesuré dans les neuf colonnes, en régime permanent, et pendant une étape de boucle, est représenté sur la figure 3. The profile measured in the nine columns, steady state, and during a loop step, is shown in Figure 3.
Y sont représentés les profils de concentrations en tryptophane, de Brix (représentatif de la concentration de matière sèche) et de conductivité (représentatif de la concentration en impuretés salines). On observe ainsi la séparation entre la zone d'élution du tryptophane (zone 1 , colonnes n °2, 3 et 4) et la zone de collecte du raffinât (zone 3, colonnes n °7, 8 et 9). The profiles of tryptophan, Brix (representative of the dry matter concentration) and conductivity concentrations (representative of the salt impurity concentration) are represented. There is thus the separation between the elution zone of tryptophan (zone 1, columns 2, 3 and 4) and the raffinate collection zone (zone 3, columns 7, 8 and 9).
Exemple 3 - étude de la rétention de la phénylalanine Example 3 - Study of the retention of phenylalanine
Cet exemple est mis en œuvre à partir d'un moût de fermentation de phénylalanine, prétraité par ajustement à pH=2, puis microfiltration sur membranes céramiques. This example is implemented from a phenylalanine fermentation must, pretreated by adjustment to pH = 2, and then microfiltration on ceramic membranes.
Le produit est traité sur une résine Applexion® XA2014-22, sur un volume de 30 mL par colonne = 1 BV. La résine est préalablement convertie sous la forme NH4 + à l'aide de NH3 à 3%, rincée, puis équilibrée par passage de NH3 à 2 g/L. The product is treated on an Applexion® XA2014-22 resin, on a volume of 30 mL per column = 1 BV. The resin is previously converted to the NH 4 + form using 3% NH 3 , rinsed and then equilibrated by passing NH 3 at 2 g / l.
Le produit d'alimentation de chromatographie contient 32,76 g/L de phénylalanine et présente une conductivité de 36,8 mS/cm due à la concentration saline du milieu. The chromatography feedstock contains 32.76 g / L phenylalanine and has a conductivity of 36.8 mS / cm due to the saline concentration of the medium.
Le produit d'alimentation est injecté en excès sur la résine, à 4 BV/h : on observe un phénomène de rétention de phénylalanine par rapport aux sels et aux sucres, puis une fuite de l'acide aminé. Une fois la concentration en sortie égale à la concentration d'entrée en acide aminé, l'injection de produit d'alimentation est arrêtée. The feed product is injected in excess on the resin at 4 BV / h: phenylalanine retention phenomenon is observed with respect to the salts and sugars, followed by leakage of the amino acid. Once the output concentration is equal to the input amino acid concentration, the feed injection is stopped.
L'élution de phénylalanine est faite avec une concentration de NH3 deThe elution of phenylalanine is made with a concentration of NH 3 of
2 g/L, à 4 BV/h. 2 g / L, at 4 BV / h.
La figure 4 représente l'évolution des concentrations en un point du système qui voit se dérouler l'ensemble des étapes de séparation, du début de l'élution raffinât à la fin de rinçage de l'extrait. La phase A est la phase d'injection du mélange de départ, la phase B est la phase d'élution avec la solution de NH3. FIG. 4 represents the evolution of the concentrations at a point in the system which sees all of the separation steps taking place, from the beginning of the raffinate elution to the end of rinsing of the extract. Phase A is the injection phase of the starting mixture, phase B is the elution phase with the NH 3 solution.
Ce système permet d'opérer avec les performances suivantes :
- 169 g de phénylalanine traité par litre de résine sur un cycle de production de 6,75 heures. This system allows you to operate with the following performances: 169 g of phenylalanine treated per liter of resin over a production cycle of 6.75 hours.
- concentration d'environ 600 μβ/ατι pendant la collecte de l'extrait de phénylalanine, correspondant à 98,5% de déminéralisation. concentration of approximately 600 μβ / ατι during the collection of the phenylalanine extract, corresponding to 98.5% of demineralization.
Exemple 4 - étude de la rétention de l'histidine Example 4 - Histidine Retention Study
Cet exemple est mis en œuvre à partir d'une solution d'histidine à 12,98 g/L, de conductivité 17,48 mS/cm et contenant 3,9 g/L de sucres. La solution est préalablement ajustée à pH = 2,7 par ajout d'H2S04. This example is carried out using a histidine solution at 12.98 g / L, with a conductivity of 17.48 mS / cm and containing 3.9 g / L of sugars. The solution is previously adjusted to pH = 2.7 by adding H 2 SO 4 .
Le produit est traité sur une résine Applexion® XA2014-22, sur un volume de 17 mL par colonne (= 1 BV). La résine est préalablement convertie sous la forme NH4 + à l'aide de NH3 à 3%, rincée, puis équilibrée par passage de NH3 à 2 g/L. The product is treated on an Applexion® XA2014-22 resin, on a volume of 17 mL per column (= 1 BV). The resin is previously converted to the NH 4 + form using 3% NH 3 , rinsed and then equilibrated by passing NH 3 at 2 g / l.
Le produit d'alimentation est injecté en excès sur la résine, à 2 BV/h : on observe un phénomène de rétention de l'histidine, puis une fuite de l'acide aminé. Une fois la concentration en sortie égale à la concentration d'entrée en acide aminé, l'injection de produit d'alimentation est arrêtée. The feed product is injected in excess on the resin, at 2 BV / h: a retention phenomenon of histidine is observed, then a leakage of the amino acid. Once the output concentration is equal to the input amino acid concentration, the feed injection is stopped.
L'élution de l'histidine est faite avec une concentration de NH3 de 2 g/L, à 2 BV/h. The elution of histidine is made with an NH 3 concentration of 2 g / L, at 2 BV / h.
La figure 5 représente l'évolution des concentrations en un point du système qui voit se dérouler l'ensemble des étapes de séparation, du début de l'élution raffinât à la fin de rinçage de l'extrait. La phase A est la phase d'injection du mélange de départ, la phase B est la phase d'élution avec la solution de NH3. FIG. 5 represents the evolution of the concentrations at a point in the system which sees all of the separation steps running from the beginning of the raffinate elution to the end of rinsing of the extract. Phase A is the injection phase of the starting mixture, phase B is the elution phase with the NH 3 solution.
Ce système permet d'opérer avec les performances suivantes : This system allows you to operate with the following performances:
- 120 g d'histidine traité par litre de résine sur un cycle de production de 30 heures. - 120 g of histidine treated per liter of resin over a 30-hour production cycle.
- Concentration d'environ 220 μβ/ατι pendant la collecte de l'extrait de phénylalanine, correspondant à 98,8% de déminéralisation.
- Concentration of about 220 μβ / ατι during the collection of phenylalanine extract, corresponding to 98.8% of demineralization.