PROCEDE DE PURIFICATION DE LA THAUMATINEPROCESS FOR PURIFYING THAUMATIN
DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte à un procédé d'extraction de grande quantité d'un édulcorant naturel, la thaumatine, à partir de son fruit et ses applications industrielles, notamment en industrie alimentaire et pharmaceutique. ETAT DE LA TECHNIQUE La thaumatine est une protéine d'origine naturelle qui est issue d'un fruit d'Afrique tropicale, le Thaumatococcus daniellii. Elle est située dans la pulpe du fruit aussi appelée arille. L'arille est entouré d'un gel polysaccharique qui possède une forte propriété de gonflement et qui peut poser des problèmes lors des étapes d'extraction/purification. La molécule de thaumatine existe sous plusieurs formes, dont 2 isomorphes principaux désignés thaumatine I et II et plusieurs formes moins courantes mais toutes ces formes ont une structure très voisine. Ces protéines sont composées de 207 acides aminés et ont des poids moléculaires de respectifs de 22 209 et 22 293, poids proche des caséines du lait, de la trypsine et de la papaïne. La thaumatine possède 8 ponts di-sulfures entre les résidus cystéines qui lui confèrent sa structure quaternaire particulière. Son point iso-électrique est élevé, proche de Il, ce qui la classe parmi les protéines basiques et lui donne une charge positive à un pH acide ou neutre. La stabilité de la thaumatine dépend du pH : elle est plus stable à pH acide qu'à pH :neutre ou qu'à pH alcalin. Les propriétés organoleptiques de la thaumatine sont particulières : elle a un pouvoir sucrant très important et en ce sens peut être employée comme édulcorant intense, son pouvoir sucrant étant 2500 à 3000 fois plus élevé que le sucre courant, le saccharose. Elle a aussi le pouvoir de modifier la sensation gustative des aliments. En effet, elle tend à adoucir ou à masquer le goût des substances amères. Pour d'autres substances comme les arômes de fruits ou de plantes, elle tend à en prolonger et intensifier le goût. FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a process for extracting a large quantity of a natural sweetener, thaumatin, from its fruit and its industrial applications, in particular in the food and pharmaceutical industry. STATE OF THE ART Thaumatin is a naturally occurring protein derived from a tropical African fruit, Thaumatococcus daniellii. It is located in the fruit pulp also called aril. The aril is surrounded by a polysaccharide gel which has a high swelling property and which can cause problems during the extraction / purification steps. The thaumatin molecule exists in several forms, including 2 main isomorphs designated thaumatin I and II and several less common forms but all these forms have a very similar structure. These proteins are composed of 207 amino acids and have respective molecular weights of 22,209 and 22,293, weight close to the milk, trypsin and papain caseins. Thaumatin has 8 di-sulphide bridges between the cysteine residues which give it its particular quaternary structure. Its isoelectric point is high, close to II, which ranks it among the basic proteins and gives it a positive charge at an acidic or neutral pH. The stability of thaumatin depends on the pH: it is more stable at acid pH than at pH: neutral or at alkaline pH. The organoleptic properties of thaumatin are unique: it has a very strong sweetening power and in this sense can be used as an intense sweetener, its sweetness being 2500 to 3000 times higher than the common sugar, sucrose. It also has the power to change the taste of food. Indeed, it tends to soften or mask the taste of bitter substances. For other substances such as fruit or plant flavors, it tends to prolong and intensify the taste.
La thaumatine présente de nombreuses applications industrielles et notamment en tant qu'additif alimentaire et plus particulièrement comme substitut du sucre du commerce. "TALIN " (nom commercial de la thaumatine produite par le plus grand fournisseur actuel de ce produit) a une saveur sucrée, avec un pouvoir sucrant de 2000, c'est pourquoi il a été référencé comme un édulcorant intense naturel nommé E957 mais il est également utilisé à faibles doses, de l'ordre de quelques ppm, pour modifier la qualité sensorielle des produits. Les applications de la thaumatine sont nombreuses et peuvent à titre d'exemple servir dans les domaines de la fabrication de compositions aromatiques et mélanges d'épices, de boissons (jus de fruits, thés, R VBrevets\24900'4904--0602 1 5-DEPOTFRANCE doc février 2006 - 1:13 cafés, boissons carbonatées, sirops, concentrés poudre et liquide...), produits laitiers (yaourts, mousses), confiserie (Chewing-gum), crèmes glacées et sorbets, mélanges d'édulcorants (sucrettes), pâtisserie, biscuiterie, snacks, produits diététiques (faibles calories) et compléments alimentaires (vitamines) , produits déshydratés, divers plats cuisinés divers sauces et marinades et aussi dans l'élaboration de produits cosmétiques (bains de bouche, dentifrices) et/ou pharmaceutiques et/ou nutraceutiques (par ex. alicaments). Enfin des applications peuvent être également envisagées dans l'industrie du tabac. De nombreuses références dans l'état de l'art ont étudié le pouvoir sucrant de la thaumatine. Les travaux de Henk Van der Wel et al., "Influence of the chemical modification of the sweet-tasting proteins thaumatine and monellin on the sweetness intensity and character (1981), the quality of foods and beverages" (p 113-118) divulgue la localisation du centre actif du goût sucré de la thaumatine par modification des acides aminés responsables du goût sucré et ont montré que la création d'un complexe entre les protéines responsables du goût sucré avec de l'alginate de sodium était un bon procédé pour isoler les protéines depuis l'extrait brut du fruit. La publication de C.A.M Hough et al., Developments in Sweeteners, Applied science Publishers ltd pp 87-123 (1979) s'intéresse aux produits à pouvoir sucrant. Il décrit une méthode de purification de la thaumatine basée sur les travaux de Inglett et May de 1968 qui comprend l'homogénéisation des arilles suivis par une ultracentrifugation pour enlever les petites molécules puis une purification sur Sephadex G-50 et une séparation par une chromatographie échangeuse d'ions. Il est décrit dans l'art antérieur deux techniques pour la production de la thaumatine: (1) le génie génétique et le (2) l'extraction à partir du fruit. Le génie génétique (1) utilise de la thaumatine recombinante et les méthodes usuelles sont divulguées dans de nombreuses demandes de brevets notamment la demande WO 87/03007 qui décrit l'utilisation d'un gène spécifique utilisé pour la synthèse de la thaumatine I dans un hôte recombinant. L'extraction (2) à partir du fruit par le procédé de Tate & Lyle est décrit dans le brevet US4011206, qui a pour objet 3o l'extraction de la thaumatine à l'aide d'un sel d'aluminium qui a pour avantage, plus que d'autres sels comme le chlorure de sodium par exemple, d'inhiber le gonflement du gel de polysaccharides entourant les arilles. D'autre part l'utilisation de sel d'aluminium permet selon l'auteur du brevet d'obtenir un jus peu coloré, un jus qui se clarifie plus facilement et une extraction plus sélective de la thaumatine que le jus 35 obtenu avec du chlorure de sodium. Selon l'auteur la thaumatine aurait une affinité particulière et formerait un complexe avec l'aluminium. Cette méthode présente plusieurs inconvénients : son inefficacité pour obtenir de très grande quantité de thaumatine à échelle industrielle, l'utilisation de sel d'aluminium n'est pas recom- R.V13revets\24900A24904--060215-DEPOTFRANCE. doc - I5 février 2006 - mandé pour ses effets sur la santé si l'aluminium n'est pas parfaitement éliminé ultérieurement. La purification se fait par adsorption de la thaumatine du jus sur une résine échangeuse de cations (les résines à groupements sulphopropyles ou carboxyméthyles), qui laisse dans le jus la plupart des impuretés. La thaumatine adsorbée est libérée par élution à l'aide d'une solution d'acide organique en faible concentration et l'aluminium et autres sels présents sont éliminés par dialyse ou ultrafiltration, puis séchée par lyophilisation. Le brevet GB2015533 décrit une invention ou l'intérieur du fruit est séché, et où l'arille est ensuite séparée mécaniquement. La thaumatine est ensuite extraite à l'aide d'une solution faiblement acide (pH 2,0 à 4,5). Cette technique selon ses auteurs a l'avantage de permettre une extraction rapide et avec un rendement maximum de la thaumatine. Des articles de la littérature scientifique présentent un procédé similaire avec quelques variantes (van der Wel et al. (1972) : séchage de l'arille, extraction à l'eau, filtration des débris et séparation de la thaumatine par filtration sur gel ; McKenzie et al ; (1985) : extraction avec de l'eau et des sels en forte concentration (0,3 M), clarification et adsorption sur résine échangeuse d'ions chargée positivement). Ramsohoye (1990) a montré que l'extraction avec du chlorure de sodium en milieu acide donnait des résultats presque aussi bons que l'extraction avec un sel d'aluminium. Comme chez les autres auteurs, la purification se fait à l'aide de résine échangeuse de cations. La combinaison d'une étape de traitement enzymatique et de l'utilisation d'une membrane d'ultrafiltration a déjà été décrite pour la purification d'un composé biologique, en particulier dans "Purification and concentration of betalaines by ultra-filtration and reverse osmosis", Lee Y.N. et al, Journal of Food Science, vo147, p465475 (1982). Il est indiqué que le choix des conditions opératoires et de la préparation enzymatique est primordial pour obtenir une bonne purification et un bon rendement. Il existe un besoin pour une nouvelle méthode de purification de la thaumatine permettant de surmonter les inconvénients précédemment cités et utilisable à échelle industrielle pour la synthèse de très grandes quantités de produit. Thaumatin has many industrial applications and especially as a food additive and more particularly as a substitute for commercial sugar. "TALIN" (the commercial name of thaumatin produced by the current largest supplier of this product) has a sweet flavor, with a sweetening power of 2000, which is why it has been referenced as an intense natural sweetener named E957 but it is also used at low doses, of the order of a few ppm, to modify the sensory quality of the products. The applications of thaumatin are numerous and can, for example, be used in the fields of the manufacture of aromatic compositions and mixtures of spices, beverages (fruit juices, teas, R VBrevets \ 24900'4904--0602 1 5 -DEPOTFRANCE doc February 2006 - 1:13 coffees, carbonated beverages, syrups, powder and liquid concentrates ...), dairy products (yogurt, mousses), confectionery (chewing gum), ice creams and sherbets, sweetener mixtures ( sweeteners), pastry, biscuits, snacks, dietary products (low calories) and dietary supplements (vitamins), dehydrated products, various dishes prepared various sauces and marinades and also in the development of cosmetics (mouthwashes, dentifrices) and / or pharmaceutical and / or nutraceutical (eg, nutraceuticals). Finally, applications can also be envisaged in the tobacco industry. Numerous references in the state of the art have studied the sweetening power of thaumatin. The work of Henk Van der Wel et al., "Influence of the chemical modification of the sweet-tasting proteins thaumatin and monellin on the sweetness intensity and character (1981), the quality of foods and beverages" (p 113-118) discloses the localization of the active center of the sweet taste of thaumatin by modification of the amino acids responsible for the sweet taste and showed that the creation of a complex between the proteins responsible for the sweet taste with sodium alginate was a good process to isolate proteins from the raw extract of the fruit. The publication of C.A.M. Hough et al., Developments in Sweeteners, Applied Science Publishers Ltd. pp. 87-123 (1979) focuses on sweetening products. It describes a method of thaumatin purification based on the work of Inglett and May of 1968 which includes the homogenization of the arils followed by ultracentrifugation to remove the small molecules and purification on Sephadex G-50 and separation by chromatography exchange. ion. Two techniques for the production of thaumatin are described in the prior art: (1) genetic engineering and (2) extraction from the fruit. Genetic engineering (1) uses recombinant thaumatin and the usual methods are disclosed in numerous patent applications, in particular application WO 87/03007, which describes the use of a specific gene used for the synthesis of thaumatin I in a patient. recombinant host. The extraction (2) from the fruit by the method of Tate & Lyle is described in patent US4011206, which relates to the 3o extraction of thaumatin with the aid of an aluminum salt which has the advantage , more than other salts such as sodium chloride for example, to inhibit the swelling of the polysaccharide gel surrounding the arils. On the other hand, according to the author of the patent, the use of aluminum salt makes it possible to obtain a slightly colored juice, a juice which is more easily clarified and a more selective extraction of thaumatin than the juice obtained with chloride. sodium. According to the author, thaumatin has a particular affinity and forms a complex with aluminum. This method has several disadvantages: its inefficiency to obtain very large quantities of thaumatin on an industrial scale, the use of aluminum salt is not recommended. doc - I5 February 2006 - for its effects on health if aluminum is not perfectly eliminated later. Purification is by adsorption of thaumatin from the juice on a cation exchange resin (resins containing sulphopropyl or carboxymethyl groups), which leaves most of the impurities in the juice. The adsorbed thaumatin is released by elution with a low concentration of organic acid solution and the aluminum and other salts present are removed by dialysis or ultrafiltration and dried by lyophilization. GB2015533 discloses an invention wherein the interior of the fruit is dried, and where the aril is then mechanically separated. Thaumatin is then extracted with a weakly acidic solution (pH 2.0 to 4.5). This technique according to its authors has the advantage of allowing rapid extraction and with a maximum yield of thaumatin. Articles in the scientific literature show a similar process with some variations (van der Wel et al., 1972): aril drying, water extraction, debris filtration, and thaumatin separation by gel filtration; et al (1985): extraction with water and salts in high concentration (0.3 M), clarification and adsorption on positively charged ion exchange resin). Ramsohoye (1990) has shown that extraction with sodium chloride in an acidic medium gives results almost as good as extraction with an aluminum salt. As in other authors, the purification is done using cation exchange resin. The combination of an enzymatic treatment step and the use of an ultrafiltration membrane has already been described for the purification of a biological compound, in particular in "Purification and concentration of betalaines by ultrafiltration and reverse osmosis. ", Lee YN et al, Journal of Food Science, vol 147, p465475 (1982). It is stated that the choice of the operating conditions and the enzyme preparation is essential to obtain a good purification and a good yield. There is a need for a new thaumatin purification method to overcome the aforementioned disadvantages and usable on an industrial scale for the synthesis of very large quantities of product.
RESUME DE L'INVENTION Il a été maintenant trouvé que la combinaison d'une étape de traitement enzymatique et de l'utilisation d'une membrane d'ultrafiltration/diafiltration permet de purifier la thaumatine avec des résultats performants et peu coûteux. Le procédé selon l'invention permet une mise en oeuvre du procédé d'extraction à grande échelle. L'utilisation de l'étape d'enzymage permet d'éviter le colmatage de la membrane par effet de gel des polysaccharides. Ceux-ci sont, en effet, extraits et R VBrevets \24900`.24904--060215-UEPOTFRANCE doc - 15 février 2006 - 3/13 coupés ce qui permet leur élimination dans le perméat et permet d'obtenir ainsi une plus grande pureté et un meilleur rendement du produit. L'invention fournit donc un procédé de purification de la thaumatine comprenant la combinaison d'une étape de traitement enzymatique et d'une étape de ultra- filtration/diafiltration sur membrane. Ce procédé comprend avantageusement une étape de passage sur résine échangeuse après l'étape de traitement enzymatique et avant l'étape de ultrafiltration/diafiltration sur membrane. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'extraction et de purification de la thaumatine qui comporte les étapes suivantes : étape d'extraction; (ii) éventuellement étape de clarification; (iii) traitement enzymatique; (iv) passage sur résine échangeuse; (v) ultrafiltration/diaf ltration sur membrane; (vi) éventuellement cristallisation; (vii) éventuellement séchage. Selon un mode de réalisation, la résine est une résine échangeuse d'anions, de préférence forte. Selon un mode de réalisation, l'enzyme est choisie dans le groupe consistant en 20 pectinases, de cellulases, hémicellulases et leurs mélanges. Avantageusement, cet enzyme est un enzyme qui hydrolyse la cellulose, la cellobiose et les polymères de glucose. Selon un mode de réalisation, l'étape d'ultrafiltration/diafiltration sur membrane est mise en oeuvre sur une membrane ayant un seuil de coupure d'environ 10kD. 25 Selon un mode de réalisation, le procédé comprend une étape intermédiaire d'acidification à pH compris entre 2 et 6, de préférence entre 2,5 et 3,5, entre l'étape de passage sur résine échangeuse et l'étape d'ultrafiltration/diafiltration sur membrane. Selon un mode de réalisation, l'étape de traitement enzymatique a lieu après ou 30 avant l'étape de clarification. Selon un mode de réalisation, l'étape d'extraction (i) est mise en oeuvre avec une solution saline, de préférence acidifiée, éventuellement en deux ou plusieurs étapes d'extraction successives. Selon un mode de réalisation, l'étape de clarification (ii) est mise en oeuvre par 35 filtration sur adjuvant de filtration, de préférence de la silice, éventuellement précédée ou suivie d'une centrifugation, avec éventuellement un ajustement final à un pH entre 4,5 et 5. R VBrevers1,24900A24904-0602 15-DEPOTFRANCT duc - 15 février 2006 - 4'13 La thaumatine ainsi produite trouve des applications dans l'industrie alimentaire et pharmaceutique. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES La figure unique est une représentation schématique du procédé selon l'inven- tion, dans laquelle PVPP signifie polyvinylpolypyrolidone, Jus Ext. signifie jus d'extraction, Métabi. Na+ signifie métabisulfite de sodium, UF signifie ultrafiltration, DF signifie dialiltration et Tartrate de Na+/K+ signifie tartrate de potassium et de sodium. DESCRIPTION DETAILLEE DE MODES DE REALISATION DE L'INVENTION Selon l'invention, le traitement enzymatique permet d'hydrolyser les polysaccharides extraits en même temps que la thaumatine. La purification sur résine échangeuse (d'anions) est destinée à éliminer des substances colorantes et certains polysaccharides chargés et l'ultrafiltration/diafiltration a pour avantage d'éliminer dans le perméat., les ions et les petites molécules (dont les polysaccharides hydroly- sés). Ainsi, au moyen du traitement enzymatique suivi de la purification, un degré de pureté élevé peut être atteint, en réalisant une opération peu coûteuse. L'utilisation d'enzymes permet de réduire la taille des polysaccharides qui peuvent ainsi traverser la membrane d'ultrafiltration et être séparés de la thaumatine qui est retenue par la membrane. D'une manière générale on utilise un mélange enzymatique tels que ceux qui sont utilisés dans la production de sucres fermentescibles, dans la réduction de viscosité de jus de fruits ou dans la l'augmentation du rendement d'extraction de produits d'intérêt à partir de plantes; De tels enzymes sont par exemples choisis dans le groupe consistant en pectinases, de cellulases, hémicellulases et leurs mélanges. Le choix de la préparation enzymatique dépend de l'application particulière ciblée et de la nature souvent très diverse des impuretés à hydrolyser. On respectera aussi les conditions préconisées par le fournisseur de l'enzyme, en particulier en ce qui concerne le pH, la température et la concentration de l'enzyme. Pour le jus d'extraction de la thaumatine, des tests nous ont montrés que la préparation commerciale Celluclast , un enzyme qui hydrolyse la cellulose, la cellobiose et les polymères de glucose, donnait les meilleurs résultats. Le traitement enzymatique est mis en œuvre pendant une période de 1 à 4 heures, de préférence pendant 2 heures. Selon l'invention l'étape de traitement enzymatique peut avoir lieu avant ou après l'étape de clarification, c'est-à-dire que les étapes (ii) et (iii) peuvent être inver- sées. Selon l'invention, à l'issue de l'étape de traitement enzymatique, on procède à une purification en deux étapes, par (iv) passage sur résine, de préférence anionique, et par (v) ultrafiltration/diafiltration. Une étape intermédiaire entre les étapes (iv) et R\Brevets\24900'24904ù06021 DEPOTFRANC'E doc 15 fe ner 2006 - 5/13 (v) peut être prévue, cette étape intermédiaire étant l'acidification du produit qui est passé au travers des résines échangeuses. L'acidification peut être une acidification à pH compris entre 2 et 6, de préférence entre 2,5 et 3,5, avantageusement voisin de 3. De manière surprenante, l'utilisation des enzymes combinée au passage sur résines (échangeuses d'anions) et à l'ultrafiltration/diafiltration permet une purification importante de la thaumatine. Les résines échangeuses d'anions telles que celles décrites dans la présente invention sont des résines peu coûteuses utilisées dans l'industrie agro-alimentaire alors que les résines cationiques mentionnées dans les brevets antérieurs sont des résines coûteuses, utilisées principalement en pharmacie. to La purification sur résine échangeuse (d'anions) est destinée à éliminer des substances colorantes et certains polysaccharides chargés. Les résines échangeuses d'anions éliminent certains colorants qui auraient tendance à former des flocs insolubles avec les protéines s'ils étaient présents. Les résines échangeuses d'anions permettent aussi d'éliminer certains polysaccharides et certaines protéines chargées négativement. La 15 thaumatine globalement chargée positivement, n'est pas adsorbée par les résines échangeuses d'anions. Les résines échangeuses de cations peuvent être utilisées dans l'invention, mais elles ne sont pas préférées. Avantageusement les résines peuvent être choisies parmi les résines anioniques telles que la résine Purolite A600, la résine Rohm et Haas FPA40CI ou la résine Rohm et Haas IRA 402, à titre d'exemple la 20 résine Rohm et Haas FPA40CI. L'étape d'ultrafiltration/diafiltration est mise en oeuvre de façon classique, par exemple sur des modules de la société Orelis, avec un seuil de coupure approprié, par exemple 10kD. L'ultrafiltration/diafiltration a pour avantage d'éliminer dans le perméat, les ions et les petites molécules (dont les polysaccharides hydrolysés). 25 L'utilisation de l'étape d'enzymage permet d'éviter le colmatage de la membrane par effet de gel des polysaccharides. Ceux-ci sont, en effet, extraits et coupés ce qui permet leur élimination dans le perméat et permet d'obtenir ainsi une plus grande pureté et un meilleur rendement du produit. Ainsi, au moyen du traitement enzymatique suivi de la purification, un degré 30 de pureté élevé peut être atteint, en réalisant une opération peu coûteuse. L'étape d'extraction (i) extrait la substance active de la pulpe du fruit (en particulier du fruit de l'espèce thaumatococcus daniellii). Cette étape est généralement mise en oeuvre avec une solution saline, de préférence en utilisant du chlorure de sodium entre 1 et 50 g/l que l'on acidifiera entre pH 2 et 3 avec de l'acide chlor- 35 hydrique, avec éventuellement du métabisulfte de sodium. L'étape d'extraction peut être constituée de plusieurs étapes successives, par exemple 3 étapes. Les étapes d'extraction peuvent être mises en oeuvre au moyen d'une solution saline, par exemple dans une solution aqueuse de chlorure de sodium, à un pH allant de 1,8 à 6 R.ABrevets\249001,24904 -060215- DEPOTFRANC[ doc février 2006 - 6113 et de préférence à un pH de 2 à 3. La première étape d'extraction est avantageuse-ment mise en oeuvre en présence de polyvinylpolypyrolidone (PVPP), à un pH d'environ 2 de préférence à pH=2. De préférence la solution de chlorure de sodium est une solution de 0,1 à 5% et plus particulièrement une solution à 2% de NaCl et l'on opère à une température comprise entre 40 et 50 C, de préférence 42 à 48 C. A l'issue de chaque étape d'extraction les jus d'extraction sont recueillis et stockés, éventuellement après une étape de préfiltration. La préfiltration a typiquement lieu sur un tamis ayant une ouverture appropriée, par exemple 500 m. Suite à l'étape d'extraction, on procède à l'étape de clarification (ii). Cette étape de clarification peut cependant n'être qu'optionnelle, même si elle est préférée. Cette étape de clarification peut être mise en oeuvre par filtration. Cette filtration peut être effectuée par une technique de filtration à l'aide d'un adjuvant de filtration par exemple de la silice. Elle est avantageusement effectuée sur Kieselguhr à une température comprise entre 40 et 55 C, de préférence 53 C. On peut utiliser une étape de centrifugation avant ou après cette étape de filtration, ou à la place de la filtration sur silice. La clarification par centrifugation et/ou filtration sur Kieselguhr peut avantageusement être remplacée par une étape de filtration sur membrane, par exemple de la rnicrofiltration. De préférence à la fin de l'étape on procède à un ajustement du pH entre 4,5 à 5. SUMMARY OF THE INVENTION It has now been found that the combination of an enzymatic treatment step and the use of an ultrafiltration / diafiltration membrane makes it possible to purify thaumatin with efficient and inexpensive results. The process according to the invention makes it possible to implement the large-scale extraction process. The use of the enzymage step makes it possible to prevent membrane clogging by gel effect of the polysaccharides. These are, in fact, extracted and cut, which allows their removal in the permeate and thus makes it possible to obtain greater purity. and better product performance. The invention therefore provides a thaumatin purification process comprising the combination of an enzymatic treatment step and an ultrafiltration / diafiltration membrane step. This method advantageously comprises a step of passage over the exchange resin after the enzymatic treatment step and before the ultrafiltration / diafiltration membrane step. The invention more particularly relates to a process for extracting and purifying thaumatin which comprises the following steps: extraction step; (ii) optionally clarification step; (iii) enzymatic treatment; (iv) passage over exchange resin; (v) ultrafiltration / membrane diafiltration; (vi) optionally crystallization; (vii) possibly drying. According to one embodiment, the resin is an anion exchange resin, preferably strong. In one embodiment, the enzyme is selected from the group consisting of pectinases, cellulases, hemicellulases, and mixtures thereof. Advantageously, this enzyme is an enzyme that hydrolyzes cellulose, cellobiose and glucose polymers. According to one embodiment, the ultrafiltration / diafiltration membrane step is carried out on a membrane having a cut-off threshold of approximately 10 kD. According to one embodiment, the process comprises an intermediate acidification step at a pH of between 2 and 6, preferably between 2.5 and 3.5, between the step of passage over the exchange resin and the step of ultrafiltration / diafiltration on membrane. According to one embodiment, the enzymatic treatment step takes place after or before the clarification step. According to one embodiment, the extraction step (i) is carried out with a saline solution, preferably acidified, optionally in two or more successive extraction steps. According to one embodiment, the clarification step (ii) is carried out by filtering on filter aid, preferably silica, optionally preceded or followed by centrifugation, with possibly a final adjustment at a pH between 4,5 and 5. R VBrevers1,24900A24904-0602 15-DEPOTFRANCT duc - February 15, 2006 - 4'13 Thaumatin produced in this way has applications in the food and pharmaceutical industry. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES The single figure is a schematic representation of the process according to the invention, wherein PVPP is polyvinylpolypyrrolidone, Jus Ext. means extraction juice, Métabi. Na + stands for sodium metabisulfite, UF stands for ultrafiltration, DF stands for dialiltration and Na + / K + tartrate stands for potassium and sodium tartrate. DETAILED DESCRIPTION OF EMBODIMENTS OF THE INVENTION According to the invention, the enzymatic treatment makes it possible to hydrolyze the polysaccharides extracted at the same time as the thaumatin. Purification on exchange resin (anion) is intended to remove dyestuffs and some charged polysaccharides and the ultrafiltration / diafiltration has the advantage of eliminating in the permeate, ions and small molecules (including hydrolytic polysaccharides). his). Thus, by means of enzymatic treatment followed by purification, a high degree of purity can be achieved by performing an inexpensive operation. The use of enzymes makes it possible to reduce the size of the polysaccharides which can thus pass through the ultrafiltration membrane and be separated from the thaumatin which is retained by the membrane. In general, an enzymatic mixture such as those used in the production of fermentable sugars, in the reduction of viscosity of fruit juice or in the increase of the extraction yield of products of interest from plants; Such enzymes are for example selected from the group consisting of pectinases, cellulases, hemicellulases and mixtures thereof. The choice of the enzyme preparation depends on the particular application targeted and the often very diverse nature of the impurities to be hydrolysed. The conditions recommended by the supplier of the enzyme, in particular as regards the pH, the temperature and the concentration of the enzyme, will also be respected. For the thaumatin extraction juice, tests have shown us that Celluclast, an enzyme that hydrolyzes cellulose, cellobiose and glucose polymers, has the best results. The enzymatic treatment is carried out for a period of 1 to 4 hours, preferably for 2 hours. According to the invention, the enzymatic treatment step can take place before or after the clarification step, i.e. steps (ii) and (iii) can be inverted. According to the invention, at the end of the enzymatic treatment step, purification is carried out in two stages, (iv) passage over resin, preferably anionic, and (v) ultrafiltration / diafiltration. An intermediate step between steps (iv) and (v) may be provided, this intermediate step being the acidification of the product which has passed through. exchange resins. The acidification can be an acidification at pH of between 2 and 6, preferably between 2.5 and 3.5, advantageously close to 3. Surprisingly, the use of the enzymes combined with the passage over resins (anion exchangers ) and ultrafiltration / diafiltration allows significant purification of thaumatin. Anion exchange resins such as those described in the present invention are inexpensive resins used in the food industry while the cationic resins mentioned in the previous patents are expensive resins, used mainly in pharmacy. The exchange resin (anion) purification is intended to remove dyestuffs and some charged polysaccharides. Anion exchange resins remove certain dyes that would tend to form insoluble flocs with proteins if present. Anion exchange resins also make it possible to eliminate certain polysaccharides and certain negatively charged proteins. The globally positively charged thaumatin is not adsorbed by the anion exchange resins. The cation exchange resins can be used in the invention, but they are not preferred. Advantageously, the resins may be chosen from anionic resins such as Purolite A600 resin, Rohm and Haas FPA40CI resin or Rohm and Haas IRA 402 resin, for example Rohm and Haas FPA40CI resin. The ultrafiltration / diafiltration step is carried out in a conventional manner, for example on modules from the company Orelis, with an appropriate cut-off threshold, for example 10 kD. Ultrafiltration / diafiltration has the advantage of removing in the permeate, ions and small molecules (including hydrolysed polysaccharides). The use of the enzyming step makes it possible to prevent the gel membrane clogging of the polysaccharides. These are, in fact, extracted and cut which allows their removal in the permeate and allows to obtain a greater purity and a better yield of the product. Thus, by means of enzymatic treatment followed by purification, a high degree of purity can be achieved by performing an inexpensive operation. The extraction step (i) extracts the active substance from the fruit pulp (in particular the fruit of the species thaumatococcus daniellii). This step is generally carried out with a saline solution, preferably using sodium chloride between 1 and 50 g / l, which will be acidified between pH 2 and 3 with hydrochloric acid, possibly with sodium metabisulfide. The extraction step may consist of several successive steps, for example 3 steps. The extraction steps can be carried out using a saline solution, for example in an aqueous solution of sodium chloride, at a pH ranging from 1.8 to 6 R.Attractions \ 249001,24904 -060215- DEPOTFRANC [doc February 2006 - 6113 and preferably at a pH of 2 to 3. The first extraction step is advantageously carried out in the presence of polyvinylpolypyrrolidone (PVPP), at a pH of about 2, preferably at pH = 2. Preferably, the sodium chloride solution is a solution of 0.1 to 5% and more particularly a 2% solution of NaCl and the reaction is carried out at a temperature of between 40 and 50 ° C., preferably 42 to 48 ° C. At the end of each extraction step the extraction juices are collected and stored, possibly after a prefiltration step. Pre-filtration typically takes place on a sieve having a suitable opening, for example 500 m. Following the extraction step, the clarification step (ii) is carried out. This clarification step may, however, be optional, even if it is preferred. This clarification step can be carried out by filtration. This filtration can be carried out by a filtration technique using a filter aid for example silica. It is advantageously carried out on Kieselguhr at a temperature of between 40 and 55 ° C., preferably 53 ° C.. A centrifugation step may be used before or after this filtration step, or instead of filtration on silica. The clarification by centrifugation and / or filtration on Kieselguhr can advantageously be replaced by a membrane filtration step, for example microfiltration. Preferably at the end of the step a pH adjustment is made between 4.5 to 5.
Lorsqu'une opération de cristallisation (vi) est introduite on obtient avantageusement un grand degré de pureté. L'étape de cristallisation peut être effectuée par exemple au moyen d'un tartrate alcalin, par exemple au moyen de tartrate de potassium et de sodium et permet d'obtenir un très bon degré de purification, notamment si l'on veut d'obtenir un produit de qualité très pure, pour un usage pharmaceutique par exemple. Le séchage (vii) s'effectue avantageusement par lyophilisation ou par toute autre technique connue de l'homme de l'art qui ne dénature pas la molécule. EXEMPLES Dans un premier temps on prépare les produits de départ suivants: 50 kg de pulpe (congelée) 3 kg NaCl et 0,45 kg PVPP pour la première extraction 3 kg NaCl pour la deuxième extraction 3 kg NaCl pour la troisième extraction 2 fois 30 g de métabisulfite de sodium 101 HCI dilué à 2,3% Dans une cuve agitée de 300 1 qui est utilisée comme cuve d'extraction, introduire 140 1 d'eau chaude à environ 60 C. Agiter pour mélanger. R 'vBrevets\24900`24904-060215-DEPOTFRANCE. Aoc - 15 (écrier 2006 - 7r 13 Dans 10 1 d'eau, dissoudre les produits chimiques (NaCl + PVPP) et introduire la solution dans la cuve d'extraction. Ajouter l'acide chlorhydrique concentré (HCI 23%) en vérifiant le pH. Pour la première extraction, le pH est de 2,0 +/- 0,1 au départ. When a crystallization operation (vi) is introduced, a high degree of purity is advantageously obtained. The crystallization step can be carried out for example by means of an alkaline tartrate, for example by means of potassium and sodium tartrate, and makes it possible to obtain a very good degree of purification, especially if one wants to obtain a product of very pure quality, for a pharmaceutical use for example. The drying (vii) is advantageously carried out by lyophilization or by any other technique known to those skilled in the art which does not denature the molecule. EXAMPLES Firstly, the following starting materials were prepared: 50 kg pulp (frozen) 3 kg NaCl and 0.45 kg PVPP for the first extraction 3 kg NaCl for the second extraction 3 kg NaCl for the third extraction 2 times g of sodium metabisulphite 101 HCl diluted to 2.3% In a stirred tank of 300 liters which is used as an extraction tank, introduce 140 liters of hot water at about 60 ° C. Stir to mix. R 'vBrevets \ 24900`24904-060215-DEPOTFRANCE. Aoc - 15 (December 2006 - 7r 13 In 10 liters of water, dissolve the chemicals (NaCl + PVPP) and introduce the solution into the extraction tank Add the concentrated hydrochloric acid (HCI 23%) by checking the pH For the first extraction, the pH is 2.0 +/- 0.1 at the start.
Introduire ensuite la pulpe dans la cuve d'extraction et agiter de manière à obtenir un bon brassage. Réguler la température à 42 C. Première Extraction et Préfiltration Au bout d'une heure, arrêter l'agitation et vidanger le jus d'extraction en le passant sur un tamis de 500 pm pour éliminer les débris de végétaux du jus d'extraction. Dissoudre 30g de métabisulfite de sodium dans 1 1 d'eau chaude environ et le verser dans la cuve de stockage. La pulpe reste dans la cuve d'extraction. Deuxième Extraction et Préfiltration Préparer la solution pour l'extraction 2: Dans 150 1 d'eau à une température de 42 C environ, ajouter le sel. Ajuster le pH à 2,5. Introduire la solution dans la cuve 15 d'extraction. Agiter. Au bout d'une heure, arrêter l'agitation et vidanger le jus d'extraction en le passant sur un tamis de 500 m pour éliminer les débris de végétaux du jus d'extraction. Dissoudre 30g de métabisulfite de sodium dans 1 1 d'eau chaude environ et le verser dans la cuve de stockage. La pulpe reste dans la cuve d'extraction. 20 Troisième extraction et Préfiltration Préparer la solution pour l'extraction 2: Dans 150 1 d'eau à une température de 42 C environ, ajouter le sel. Ajuster le pH à 2,5. Introduire la solution dans la cuve d'extraction. Agiter. Au bout d'une heure, arrêter l'agitation et vidanger le jus d'extraction en le 25 passant sur un tamis de 500 gm pour éliminer les débris de végétaux du jus d'extraction et le verser dans la cuve de stockage_ La pulpe reste dans la cuve d'extraction. Filtration sur Kieselguhr Les trois jus d'extraction et de préfiltration sont filtrés sur Kieselguhr. 30 L'appareil de filtration est un filtre à plateaux horizontaux d'une surface de 1,5 m2 de marque Della Toffola (modèle ECP). Un gâteau de filtration est formé sur les plateaux avec environ 4 kg de Kieselguhr. Le mélange de jus d'extraction est passé dans le filtre, en ajoutant graduellement 4kg supplémentaires de Kieselguhr. Enzymage 35 La solution d'enzymage utilisée est 200 ml de Celluclast 1.5 L FG de la société Novozymes. R.ABrevetsV24900A24904-060215-DFPOTFRANCF doc . 15 février 2006- 8/13 Chauffer le mélange des jus clarifiés entre 54 et 56 C, de préférence à 53 C. Ajuster le pH avec NaOH 1N jusqu'à 4,5, puis ajouter l'enzyme. Agiter pendant 1 heure au minimum, de préférence 2 heures tout en maintenant la température. Résines Anioniques La résine anionique utilisée est la résine Rohm et Haas FPA40CI. A la fin de l'enzymage, faire passer le jus sur 2 colonnes de résine en série de 30 1 chacune (ou une colonne unique de 60 1) à une vitesse comprise de préférence entre 100 et 600 1/h. On soutire ainsi un jus échangé. Acidification L'acidification du jus échangé à pH 3 dans le bac d'acidification se fait à l'aide d'une solution d'HCI diluée (HCI à 2,3%). Ultrafiltration/diafiltration On utilise un pilote MF/UF de filtration tangentielle de la société Orelis, munie d'un module membranaire en spirale modèle Persep 10kd de 5m2 de surface : Les pressions opératoires sont de 1,8 bar en entrée et 1 bar en sortie environ. La température est régulée à 40 C. Le perméat qui contient les impuretés qui sont passées au travers de la membrane est éliminé. On remplace le volume de perméat par un égal volume de solution de diafiltration qui consiste en de l'eau acidifiée à pH 3 avec de l'acide chlorhydrique. Le volume de solution de diafiltration est égal à quatre fois le volume initial de jus. Puis le jus ainsi récupéré est concentré jusqu'à obtenir un volume d'environ 25 1. Cristallisation Verser le tartrate de potassium et de sodium dans la solution de thaumatine en agitant et en maintenant la température à 40 C pendant environ une heure environ. Then introduce the pulp into the extraction tank and shake to obtain a good mixing. Regulate the temperature to 42 C. First extraction and pre-filtration After one hour, stop stirring and drain the extraction juice by passing it through a 500 μm sieve to remove plant debris from the extraction juice. Dissolve 30g of sodium metabisulfite in about 1 L of warm water and pour it into the storage tank. The pulp remains in the extraction tank. Second extraction and pre-filtration Prepare the solution for extraction 2: In 150 liters of water at a temperature of approximately 42 ° C, add the salt. Adjust the pH to 2.5. Introduce the solution into the extraction tank. Shake. After one hour, stop the agitation and drain the extraction juice by passing it over a 500-m screen to remove plant debris from the extraction juice. Dissolve 30g of sodium metabisulfite in about 1 L of warm water and pour it into the storage tank. The pulp remains in the extraction tank. Third extraction and pre-filtration Prepare the solution for extraction 2: In 150 liters of water at a temperature of about 42 ° C., add the salt. Adjust the pH to 2.5. Introduce the solution into the extraction tank. Shake. After one hour, stop the stirring and drain the extraction juice by passing it through a 500-gm sieve to remove plant debris from the extraction juice and pour it into the storage tank. The pulp remains in the extraction tank. Filtration on Kieselguhr The three extraction and prefiltration juices are filtered on Kieselguhr. The filter apparatus is a Della Toffola brand 1.5 m2 horizontal plate filter (ECP model). A filter cake is formed on trays with about 4 kg of Kieselguhr. The extraction juice mixture is passed through the filter, gradually adding an additional 4 kg of Kieselguhr. Enzymage The enzyming solution used is 200 ml of Celluclast 1.5 L FG from Novozymes. R.ABrevetsV24900A24904-060215-DFPOTFRANCF doc. February 15, 2006- 8/13 Heat the mixture of clarified juices between 54 and 56 C, preferably at 53 C. Adjust the pH with 1N NaOH to 4.5, then add the enzyme. Stir for at least 1 hour, preferably 2 hours while maintaining the temperature. Anionic Resins The anionic resin used is Rohm Resin and Haas FPA40CI. At the end of the enzymage, pass the juice on 2 columns of resin in series of 30 1 each (or a single column of 60 1) at a speed preferably between 100 and 600 1 / h. We thus withdraw an exchanged juice. Acidification The acidification of the juice exchanged at pH 3 in the acidification tank is done using a dilute solution of HCI (2.3% HCl). Ultrafiltration / diafiltration An MF / UF tangential flow filtration pilot from Orelis, equipped with a Persep 10kd spiral membrane module with a surface area of 5m2, is used: The operating pressures are 1.8 bar at the inlet and 1 bar at the outlet about. The temperature is regulated at 40 C. The permeate which contains the impurities which have passed through the membrane is eliminated. The volume of permeate is replaced by an equal volume of diafiltration solution which consists of water acidified to pH 3 with hydrochloric acid. The volume of diafiltration solution is equal to four times the initial volume of juice. The juice thus recovered is then concentrated to a volume of approximately 1. Crystallization Pour the potassium and sodium tartrate into the thaumatin solution while stirring and maintaining the temperature at 40 ° C. for about one hour.
La vitesse d'agitation est augmentée à une valeur correspondant à une vitesse en bout de pales de 1,3 m/s environ. La cristallisation commence lorsque la solution commence à se troubler. Refroidir la solution sous agitation à 10 C à raison de 4 C/heure. Lorsque la température de 4 C est atteinte, laisser la solution sous agitation à cette température, pendant une durée d'au moins 6 heures puis arrêter l'agitation. Pour récupérer les cristaux, laisser sédimenter la suspension puis éliminer le liquide surnageant ou passer la suspension de cristaux sur un filtre sécheur ou sur une essoreuse. Les cristaux sont lavés trois fois à l'aide d'eau déminéralisée froide (4 C) pour éliminer les sels de tartrate. Pour une plus grande élimination des sels de tartrate, il est possible de redissoudre les cristaux dans de l'eau acidifiée à pH 3 avec de l'acide chlorhydrique (environ 25 1) puis d'effectuer une diafiltration avec de l'eau acidifiée à pH 3 avec de l'acide chlorhydrique (environ 50 1). La solution ainsi diafiltrée R.ABrevets\24900A24904-0602 1 5-DEPOTFRANCF doc-5 février 2006 - 9/13 pourra aussi être passée sur une cartouche de membrane filtrante (taille de pore 0,2 m) pour assurer une bonne qualité bactériologique du produit. Séchage Le séchage peut-être effectué par des techniques connues de séchage de bio- molécules, comme la lyophilisation ou la zéodratation ou le séchage des cristaux sur un filtre sécheur. Le produit est une poudre blanche ou de couleur légèrement crème. Résultats d'Analyse Le procédé selon l'invention permet l'obtention de thaumatine en des quantités considérables par rapport aux procédés de l'état de la technique. Différentes tailles de lots de pulpe ont été traités par le présent procédé, de 25 à 300 kg mais il est possible de traiter des lots beaucoup plus gros par ce procédé. Les rendements de récupération de la thaumatine purifiée varient entre 51 et 84 % selon les lots et est en moyenne de 70 à 75% par rapport à la thaumatine présente dans la pulpe au départ. En outre la pureté de la thaumatine obtenue par ce procédé est nettement plus grande. Un exemple détaillé d'analyse d'un lot typique de thaumatine cristallisée et séchée est donné ci-dessous. Dans le même tableau ont été reportés les résultats d'analyse d'un lot selon l'état de la technique illustrée par le brevet antérieur US4011206. Analyse Présente invention Comparatif Azote total (Kjeldahl) 16,1% 14-15% Matière sèche 98,8% 91-92% Aluminium 17 mg/kg 300 mg/kg Plomb 0,27 mg/kg ND* Arsenic <0,6 gg/kg ND* Cendres sulfuriques 0,3% 7,5% Carbohydrates 0,21 % 1 % *ND = non déterminé The stirring speed is increased to a value corresponding to a speed at the end of the blades of about 1.3 m / s. Crystallization begins when the solution begins to be disturbed. Cool the solution with stirring at 10 C at 4 C / hour. When the temperature of 4 C is reached, let the solution stir at this temperature for a period of at least 6 hours and stop stirring. To recover the crystals, allow the suspension to settle and then remove the supernatant liquid or pass the suspension of crystals on a drying filter or on a wringer. The crystals are washed three times with cold demineralized water (4 C) to remove the tartrate salts. For a greater elimination of tartrate salts, it is possible to redissolve the crystals in acidified water at pH 3 with hydrochloric acid (approximately 25 l) and then to diafiltration with acidified water at room temperature. pH 3 with hydrochloric acid (about 50 l). The solution thus diafiltered may also be passed through a filter membrane cartridge (pore size 0.2 m) to ensure a good bacteriological quality of the membrane. product. Drying Drying can be carried out by known techniques for drying biomolecules, such as lyophilization or zeodration or drying of the crystals on a drying filter. The product is a white powder or slightly creamy color. Results of Analysis The process according to the invention makes it possible to obtain thaumatin in considerable quantities compared to the methods of the state of the art. Different sizes of pulp lots have been processed by the present process from 25 to 300 kg, but much larger batches can be processed by this process. The recovery yields of the purified thaumatin vary between 51 and 84% depending on the batch and is on average 70 to 75% compared to the thaumatin initially present in the pulp. In addition, the purity of the thaumatin obtained by this process is significantly greater. A detailed example of analysis of a typical batch of crystallized and dried thaumatin is given below. In the same table were reported the results of analysis of a lot according to the state of the art illustrated by the prior patent US4011206. Comparative Analysis Total Nitrogen (Kjeldahl) 16.1% 14-15% Dry matter 98.8% 91-92% Aluminum 17 mg / kg 300 mg / kg Lead 0.27 mg / kg ND * Arsenic <0.6 gg / kg ND * Sulfur ash 0.3% 7.5% Carbohydrates 0.21% 1% * ND = Not determined
On constate qu'il y a moins d'impuretés dans la thaumatine produite par le procédé faisant l'objet de la présente de demande de brevet, que dans le brevet antérieur. R Brevets.24900y24904-060215- DEPOTFRANCE doc (écrier 2006 - 10/13 It is found that there is less impurity in the thaumatin produced by the process subject of the present patent application, than in the prior patent. R Patents.24900y24904-060215- DEPOTFRANCE doc (write 2006 - 10/13