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PERFECTIONNEMENTS APPORTES AUX PROCEDES POUR PURIFIER (DES PREPARATIONS 'DE VITAMINES.
L'invention est relative à des préparations de vitamines rortement purifiées et elle concerne, plus particulièrement, des procédés pour obtenir des matières ayant une activité élevée en vitamines B 12.
Des études récentes, faites dans le domaine de l'alimentation hu- maine et animale, ont montré la valeur importante de certaines substances con- tenues dans les produits animaux et qui peuvent également être préparées par la culture de divers micro-organismes sur ou dans des milieux appropriés.
Plus spécialement, des composés actifs qui ont été isolés à partir de ces sour- ces sont la vitamine B 12 et ses substances corrélatives telles que B 12a et B 12b. On a constaté que la purification de ces matières à base de vitamine B 12 à partir.des tissus animaux et des bouillons de fermentation micro-orga- niques était difficile et lente. Des méthodes et combinaisons de méthodes compliquées, par exemple la chromatographie, l'adsorption par des adsorbants solides et actifs, la précipitation sélective et analogue, ont été nécessaires, Il existe un:grand besoin pour une méthode industrielle et pratique par laquel- le on peut, d'une manière relativement simple, augmenter le potentiel ou l'ac- tivité des préparations de vitamines B 12.
L'expression "vitamine B 12" vi- se non seulement le produit spécifique mais également ses différentes autres formes qui sont en relation étroite avec ce produit : par exemple la vitamine B 12a et la vitamine B 12b, qui ont des propriétés chimiques, physiques et biologiques similaires et qui souvent coexistent avec ce produit dans des ma- tières naturelles ou qui peuvent en être dérivés par de simples réactions chi- miques.
On a trouvé qu'une purification rapide et efficace des solutions brutes contenant des vitamines B 12 et provenant pour ainsi dire de n'importe quelle source, peut être réalisée en mettant ces solutions en contact avec des résines échangeuses d'ions qui contiennent des groupements basiques., Le résultat de ce contact est un concentrat de vitamines B 12 ayant une activité nettement accrue,, En principe toute résine basique et échangeuse d'ions ou
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tout mélange de ces résines convient au procédé selon l'invention, par exem- ple les résines contenant des groupements amino, guanidino et des groupements d'ammonium quaternaire. En général, plus la basicité de la résine est forte plus elle est efficace et avant l'usage elle doit être traitée par un'alcali.
Des exemples de résines particulièrement utiles et que l'on trouve sur le marché sont la "Amberlite IR4B" qui est une résine échangeuse d'anions fai- blement basique qui contient des groupements amino modifiés, la "Amberlite IRA 400" qui est une résine échangeuse d'anions fortement basique et qui con- tient des groupements amino modifiés, ainsi que le "Dowex 1" qui est du type ammonium quaternaire et le "Dowex 2"o Les deux premières de ces résines sont fabriquées par le département des produits résineux de la Rohm and Haas Com- pany et les deux dernières par la Dow Chemical Company.
Suivant un mode de réalisation spécifique de l'invention on peut obtenir un concentrat de vitamines B 12 brutes, qui à l'essai donne à sec environ 2.000-4.000 mcg/g, qui contient une fraction sélectionnée partiel- lement purifiée par chromatographie ou par une méthode similaire. Ce con- centrat peut. ensuite être dissous dans l'eau et peut traverser une colonne contenant au moins une résine échangeuse d'ions basique, lavée au préalable d'abord avec un alcali dilué et ensuite avec de l'eau. Après que le concen- trat à circulé dans la colonne on fait passer de l'eau dans celle-ci.
Les liquides mélangés sont recueillis à la sortie de la colonne, leur pH est réglé à peu près au point neutre, ils sont séchés sous vide après congéla- tion ou par toute autre méthode appropriée A l'état sec le produit obte- nu a une activité double ou triple de celle des matières initiales. Des matières ayant une activité plus grande ou plus petite que la substance brute particulière ainsi traitée peuvent également être améliorées forte- ment par ce procédé. La réception du procédé pour un échantillon donné procure une purification encore plus grande mais il est évident que l'im- portance de l'amélioration obtenue par des traitements subséquents devient généralement et progressivement de m oins en moins apparents.
Les résines peuvent être mises simplement en contact avec les matières brutes contenant des vitamines B 12 par des procédés discontinus ou par charges ordinaires. On préfère toutefois se servir de colonnes ou de tours analogues à celles qui sont bien connues dans l'industrie chimi- que pour pouvoir effectuer des traitements continus ou semi-continus. Une colonne de ce genre peut être remplie avec de la matière résineuse, celle- ci étant lavée d'abord avec un alcali et ensuite avec de l'eau. Le concen= trat de vitamine B 12 traverse alors la colonne. Les produits recueillis à la sortie de la colonne peuvent être séchés de la manière usuelle pour obtenir une matière ayant une activité notablement plus élevée que la sub- ,stance initiale.
Les produits de sortie, au lieu d'être séchés, peuvent être soumis à un ou plusieurs autres traitements par des résines échangeuses d'ions et par recyclage dans la même colonne ou dans une masse résineuse fraîche ou régénérée. Suivant une variante on peut également les soumettre à d'autres purifications, par exemple à une précipitation par des solvants ou à une chromatographie sur d'autres adsorbants. La vitamine B 12 qui a été traitée par la résine et qui a été séchée convient tout particulièrement à une purification ultérieure par un traitement par solvant tel qu'une extrac- tion sélective par l'acide acétique. Cette dernière opération,peut être utilisée pour accroître le potentiel jusque dix fois et davantage quand on se sert d'une matière traitée par la résine.
Toutefois, si on ne fait pas intervenir le traitement par la résine il est plus difficile d'obtenir un degré de purification élevé par le traitement par solvant. Après la sortie de la vitamine B 12 hors de la tour à résine, le liquide de sortie peut con- tenir une quantité considérable de matières inorganiques. Celles-ci peuvent être écartées d'une manière particulièrement aisée par un traitement par sol- vant.
Dans certains cas les solutions de vitamines B 12, qui sortent de la colonne, contiennent de l'ammoniaque libre formé par le contact des sels d'ammonium de la matière brute avec la résine basique. Cet ammonia- que peut être neutralisé par un acide en formant un sel d'ammonium non-vo- latil. De préférence, on utilise toutefois un agent neutralisant tel que
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1'''anhydride carbonique pour former un produit tel que le carbonate d'ammonium qui peut être enlevé par simple évaporation et au cours du séchage après con- gélation. La contamination du concentrat de valeur de vitamines B 12 par un
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sel d'anmonium- non-volatil et inactif est ainsi évitée.
On doit veiller à ce que la vitesse de passage de la solution de vitamines B 12 soit suffisamment lente pour que l'on puisse utiliser au mieux l'effet de la résine échangeuse d'ions, La vitesse optimum pour une matière brute donnée de vitamines B 12 et pour une certaine sorte de résine peut être déterminée aisément par un homme du métier.
Par exemple, on a trouvé que pour
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une colonne contenant environ 660 cnop de 1!Amberlite IRA G.OO"P9 comme indiqué dans l'exemple I ci=dessous, une vitesse d'écoulement d'environ 3-5 ml/min est favorable., Les valeurs les plus favorables de la concentration en vita- minesB 12 dans lessolutions aqueuses,que l'on veut soumettre au traitement par la résine, varient avec la nature desmatières traitées et la méthode appliquée, ces valeurs pouvant être déterminées aisément Ainsi, un concen-
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trat, qui donne à l'essai (à sec) de oU00G..oU00 mcg/g en B 12 devrait avoir une teneur d'environ 50 à 110 mcg/ml en vitamine B 12 pure.
Par contre, un concentrât ayant une activité (à sec) en B 12 d'environ 50.000 mcg/g devrait, de préférence, être dilué jusqu'à contenir seulement environ 80=120 mcg/ml de B 12 pure. Une telle concentration est. utilisée quand on désire obtenir une amélioration considérable de la qualité de la matière afin que le spectre dabsorption caractéristique pour l'ultraviolet de la vitamine B 12 pure de- vienne apparent.
Il est possible d'utiliser le nouveau procédé pour l'enlèvement d'impuretés, telles que les silicates, en faisant passer des volumes impor- tants de la solution brute de vitamines B 12 dans des quantités relativement
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faibles de résines. Par exemple, un concentrât contenant /000 meg,m -1 d'une matière qui par un essai à sec donne environ 25.000 mcg/g. peut passer dans une petite colonne à résine et on trouve alors que sa teneur en silice a près- que complètement disparu alors que son activité a augmenté. Des volumes con- sidérables de matières à vitamines B 12 de cette qualité peuvent être traités dans la même colonne à résine et malgré cela on obtient une réduction très substantielle de la teneur en silicium.
Ceci présente une importance consi- dérable en ce qui concerne la préparation de solutions parfaitement claires de vitamines B 12 pour un traitement parentéral. Si les silicates ne sont
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pas enlevés il existe une tendance, plus particulièrement pendant le'acidifi- cation et la déshydratation, à la formation de silice insoluble,.
Il existe deux méthodes normalisées, acceptées d'une manière gé- rérale, pour faire les essais de concentrats et solutions de vitamines B 12 et ces méthodes ont été appliquées pour les études qui ont conduit à l'inven-
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tion. La première est un essai microbiologique qui utilise le Lactdbacillus leichw.annii. La deuxième est une méthode spectographique quant,1¯tati.ve dite de Brunings, pour laquelle on détermine l'a.dsorption ultraviolettes des solu- T'ions aqueuses de vitamines B 12, aux longueurs d'ondes de 540 du 525 milli- microns.
La vitamine B 12 pure et cristallisée sert de norme pour les deux méthodes et on lui a.ttribue une activité de 1000 mcg/mg.
Si l'on se sert d'une matière initiale ayant une activité suffi- samment élevée, le concentrat de vitamines B 12, obtenu par le traitement à la résine, peut être aisément cristallisé. Ce fait constitue un des avan- tages principaux du procédé en question puisque l'obtention de cristaux de vitamines B 12 directement. à. partir des concentrais purifiés par des méthodes connues n'est nullement aisée.
Non seulement on enlève lesimpuretés inor- ganiques par le contact avec la résine mais on fait disparaître également des quantités considérables d'impuretés organiques qui se trouvent dans un grand
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msbre de concentrais de vitamines B 12. .'a,spect de la matière B 12 ainsi puy-iFiée est fortement amélioré., la couleur devient d9un ton. rosé plus vrai à cause de 1.'él,1>oination des différents con-caminants brunâtres ou jaunâtres.
Une indication de l'amélioration importante de la. qualité est obtenue.en com- parant le spectre d'abeorptîon ultraviolet des éehantillonp traités à. la résine et ceux qui ne le sont pas, Pour des concentrais bruts et non purifiés par le traitement avec échange datons, par exemple la fraction sélectionnée
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obtenue par la méthode Brunings dont question plus haut, le spectre d'absorp- tion ultraviolet, qui caractérise la vitamine B 12 pure, est presque complète- ment masqué. Des produits, qui ont été obtenus après un passage par les rési- nes échangeuses d'ions adoptées, ont un spectre d'absorption ultraviolet qui est plus près de celui de la vitamine pure.
Une autre particularité importante de l'invention est que les ré- sines échangeuses d'ions, qui ont été contaminées au cours de la purification des concentrats de vitamines B 12, peuvent être aisément régénérées et être utilisées plusieurs fois,, Ceci réduit, évidemment, très fortement le coût du traitement et rend le procédé plus avantageux du point de vue commercial, La résine usée, qui a adsorbé seulement les contaminants de quantités relati- vement réduites de matières B 12 brutes ou de concentrats déjà partiellement purifiés, peut être régénérée uniquement par un lavage avec un alcali dilué, par exemple une solutionà 4 % de soude ou de potasse caustique ou analogue,.
Des colonnes à résines plus fortement contaminées, contenant des quantités plus importantes d'impuretés absorbées, peuvent nécessiter un traitement à l'acide avant le lavage alcalin. Pour un tel traitement on se sert, de pré- férence, d'un acide fort, tel que l'acide chlorhydrique ou sulfurique, en so- lution diluée mais d'autres acides, tels que l'acide phosphorique, acétique ou bromhydrique, peuvent également être utilisés avec succès.,
Les exemples ci-dessous servent à illustrer l'invention mais ne limitent nullement la portée de celle-ci.
Comme bien des variantes, qui pa- raissent être nettement différentes, peuvent être prévues sans sortir de l'objet et du domaine de l'invention, celle-ci ne doit pas être considérée comme étant limitée aux modes de réalisation spécifiques indiqués dans ces exemples,
EXEMPLE I,
Une colonne en verre, ayant un diamètre de 37 mm et munie, à son extrémité inférieure, d'un disque filtrant, est remplie jusqu'à une hauteur de 165 mm avec une résine "Amberlite IRA 400" dont question plus haut, La colonne de résine est lavée avec une solutionà 4 % de soude caustique jusqu'à ce que le pH du liquide à la sortie reste invariable. La colonne est alors lavée jusqu'à ce que la solution, à la sortie de la colonne, soit devenue neu= tre.
Une solution de 0.20 g de vitamine B 12 brute, qui à l'essai donne 52.000 mcg/g de vitamine pure, est préparée dans 100 ml d'eau. La solution est ver- sée dans la colonne et peut percoler lentement dans celle-ci. Quand la pre- mière couleur rose apparaît à la sortie, la solution est recueillie. La co- lonne est lavée une fois avec de l'eau et une quantité de 120 ml est recueil- lie à la sortie. Celle-ci contient la plus grande partie de la vitamine et son pH est immédiatement réglé à 7 avec de l'acide chlorhydrique. La solu- tion aqueuse est congelée dans un flacon approprié et est séchée sous vide.
La couleur du produit obtenu est considérablement améliorée en étant d'un rouge clair plutôt que d'un rose jaunâtre comme la matière brute B 12 initia- le. Il donne à l'essai 110.000 mcg/g, ce qui constitue une amélioration de plus de 100 % en activité et le poids total représente une récupération de 85 % de la vitamine active. Un rendement plus grand est obtenu par un nou- veau lavage de la colonne.
EXEMPLE II.
Un concentrat aqueux de la vitamine B 12, qui a un volume de 175 ml et qui donne à l'essai 300 mcg/ml de vitamine pure est dilué avec de l'eau jusqu'à environ 700 ml. Cette solution traverse une colonne, qui a un diamè- tre intérieur de 50 mm et qui contient 660 cm3 de résine "Amberlite IRA 400", à une vitesse de 3 ml/ min. La colonne est lavée avec une quantité réduite d'eau et les liquides recueillis et mélangés sont neutralisés avec de.l'acide chlorhydrique dilué. La partie principale de la solution est ensuite séchée après congélation et on obtient 6,4 g du produit purifié donnant à l'essai 6600 mcg/g de vitamine B 12 pure. L'activité obtenue est plus du double de celle de la matière initiale sur une base sèche.
En soumettant le produit à une purification par solvant l'activité du produit est aisément rendue dix fois plus grande.
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EXEMPLE III9
Une colonne à résine contenant environ 190 cm3 de "Amberlite IRA 400" est utilisée pour purifier un concentrat de vitamine B 12 brute. Elle est alors lavée avec 850 ml d'acide chlorhydrique à 4 % pour enlever une quan- tité considérable d'impuretés colorées indésirables, adsorbées par la colonne.
Après que l'acide est sorti de la colonne, la résine est lavée à l'eau et en- suite avec une solution à 4 % de soude caustique. Ce lavage alcalin est pour- suivi jusqu'à ce que le liquide sortant de la colonne atteigne un pH invaria- ble. La colonne est ensuite lavée à l'eau jusqu'à ce que le liquide sortant soit devenu neutre. Quand l'eau en excès a été enlevée, on fait passer dans celle-ci 400 ml d'une solution d'un concentrat d'une autre vitamine B 12 bru- te (75 mcg/ml) ce qui correspond à sec à environ 3000 mcg/mg, à une vitesse d'environ 2 ml/min. Quand la première trace colorée apparaît dans le liqui- de, on commence à recueillir les matières. La colonne est finalement lavée avec 100 ml d'eau et le liquide ainsi que l'eau de lavage mélangés sont neu- tralisés avec de l'anhydride carbonique.
La colonne est régénérée à nouveau par une lessive alcaline, après quoi on fait passer la solution neutralisante da.ns la. colonne, Les matières recueillies sont neutralisées à nouveau avec de l'anhydride carbonique et sont séchées à l'état congelé. Le produit don- ne à l'essai 14.500 mcg/g de matières solides de la vitamine B 12 pure. On obtient une récupération de plus de 95 % de la matière active.
EXEMPLE IV.
Un échantillon de vitamine B 12 brut qui a été concentré par les méthodes habituelles est soumis à la cristallisation préjugée par dissolu- tion dans un petit volume d'eau avec ensemencement par des cristaux de vita- mine B 12 et avec addition d'acétone. Il était impossible d'obtenir la for- mation de cristaux. Cette matière à une activité de 120.000 mcg/g en vitami- nes B 12. Un échantillon de cette matière avec une teneur totale en B 12 de 510.000 mcg était dissous dans l'eau, la solution traversant ensuite une colonne cylindrique ayant un diamètre intérieur de 25 mm et une longueur de 20 cm, cette colonne étant remplie de résine "Amberlite IRA 400", Le liquide de la colonne était neutralisé avec de l'acide sulfurique dilué et était séché sous vide à l'état congelé.
La récupération de l'acitivité en vitami- nes B 12 est à ce moment pour ainsi dire quantitative. Le produit séché est dissous dans du méthanol et la matière insoluble est enlevée par filtration.
Le solvant est enlevé du filtrat sous vide.9 ce qui donne un produit sec ayant une activité en vitamine B 12 de 160.000 mcg/g. Le produit sec est dissous dans un petit volume d'eau et on ajoute de l'acétone. La solution se trouble rapidement et après ensemencement on obtient la précipitation de cristaux de vitamines B 12. Une première récolte de cristaux est obtenue avec un poids de 190 mg. On obtient ensuite une deuxième récolte qui pèse 195 mg. L'activité totale en vitamines B 12 de ces deux précipités cris- tallisés est de 303.000 mcg, avec une récupération de 59 % de la matière bru- te utilisée.
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R E iT E N D I G A. T I 0 N Sa
1. - Procédé pour purifier des préparations de vitamines, ledit procédé consistant à mettre en contact des solutions impures contenant des vitamines B 12 avec des résines échangeuses d'ions basiques.
2. - Procédé pour purifier des préparations de vitamines, ledit procédé consistant à faire passer la solution impure, contenant la vitamine B 12, dans une colon.ne contenant au moins une résine échangeuse datons basi- que.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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IMPROVEMENTS TO PROCESSES FOR PURIFYING (PREPARATIONS 'OF VITAMINS.
The invention relates to highly purified vitamin preparations and more particularly relates to methods for obtaining materials having high vitamin B 12 activity.
Recent studies, carried out in the field of human and animal nutrition, have shown the important value of certain substances contained in animal products and which can also be prepared by the cultivation of various microorganisms on or in appropriate environments.
More especially, active compounds which have been isolated from these sources are vitamin B 12 and its related substances such as B 12a and B 12b. The purification of these vitamin B 12 materials from animal tissues and microorganic fermentation broths has been found to be difficult and slow. Complicated methods and combinations of methods, for example chromatography, adsorption by solid and active adsorbents, selective precipitation and the like, have been required. There is a great need for an industrial and practical method by which to do so. can, in a relatively simple way, increase the potential or activity of vitamin B 12 preparations.
The expression "vitamin B 12" refers not only to the specific product but also to its various other forms which are closely related to this product: for example vitamin B 12a and vitamin B 12b, which have chemical and physical properties. and similar biologicals and which often coexist with this product in natural materials or which can be derived therefrom by simple chemical reactions.
It has been found that rapid and efficient purification of crude solutions containing B 12 vitamins from virtually any source can be achieved by contacting such solutions with ion exchange resins which contain moieties. The result of this contact is a concentrate of vitamins B 12 with markedly increased activity ,, In principle any basic and ion exchange resin or
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any mixture of these resins is suitable for the process according to the invention, for example resins containing amino and guanidino groups and quaternary ammonium groups. In general, the stronger the basicity of the resin, the more effective it is and before use it must be treated with an alkali.
Examples of particularly useful resins which are commercially available are "Amberlite IR4B" which is a weakly basic anion exchange resin which contains modified amino groups, "Amberlite IRA 400" which is a resin. strongly basic anion exchanger which contains modified amino groups, as well as "Dowex 1" which is of the quaternary ammonium type and "Dowex 2" o The first two of these resins are manufactured by the resinous products department by the Rohm and Haas Company and the latter two by the Dow Chemical Company.
According to a specific embodiment of the invention, it is possible to obtain a concentrate of crude vitamins B 12, which on the test gives about 2,000-4,000 mcg / g on dryness, which contains a selected fraction partially purified by chromatography or by a similar method. This concentration can. then be dissolved in water and can pass through a column containing at least one basic ion exchange resin, washed beforehand first with dilute alkali and then with water. After the concentrate has circulated through the column, water is passed through it.
The mixed liquids are collected at the outlet of the column, their pH is adjusted approximately to the neutral point, they are dried under vacuum after freezing or by any other suitable method. In the dry state the product obtained has a activity double or triple that of the initial materials. Materials having greater or less activity than the particular raw material thus treated can also be greatly improved by this process. Acceptance of the process for a given sample provides even greater purification, but it is evident that the extent of the improvement obtained by subsequent treatments generally and gradually becomes less and less apparent.
The resins can be contacted simply with the raw materials containing B 12 vitamins by batch processes or by ordinary batching. It is however preferred to use columns or towers similar to those which are well known in the chemical industry in order to be able to carry out continuous or semi-continuous treatments. Such a column can be filled with resinous material, the latter being washed first with alkali and then with water. The vitamin B 12 concentrate then passes through the column. The products collected at the exit of the column can be dried in the usual manner to obtain a material having a significantly higher activity than the initial substance.
The output products, instead of being dried, can be subjected to one or more other treatments with ion exchange resins and by recycling in the same column or in a fresh or regenerated resinous mass. According to one variant, they can also be subjected to other purifications, for example to precipitation with solvents or to chromatography on other adsorbents. Vitamin B 12 which has been resin treated and dried is particularly suitable for further purification by solvent treatment such as selective extraction with acetic acid. The latter operation, can be used to increase the potential up to tenfold and more when using a resin treated material.
However, if the resin treatment is not involved, it is more difficult to achieve a high degree of purification by the solvent treatment. After the vitamin B 12 exits from the resin tower, the exit liquid may contain a considerable amount of inorganic material. These can be removed in a particularly easy manner by treatment with a solvent.
In some cases the solutions of vitamin B 12, which leave the column, contain free ammonia formed by the contact of the ammonium salts of the raw material with the basic resin. This ammonia can be neutralized with an acid forming a non-volatile ammonium salt. Preferably, however, a neutralizing agent such as
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Carbon dioxide to form a product such as ammonium carbonate which can be removed by simple evaporation and during post-freezing drying. Contamination of the valuable vitamin B 12 concentrate with a
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ammonium salt- non-volatile and inactive is thus avoided.
Care must be taken to ensure that the rate of passage of the solution of vitamins B 12 is slow enough so that the effect of the ion exchange resin can be used to the best advantage. The optimum speed for a given raw material of vitamins B 12 and for some sort of resin can be readily determined by one skilled in the art.
For example, we found that for
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a column containing about 660 cnop of 1! Amberlite IRA G.OO "P9 as shown in Example I below, a flow rate of about 3-5 ml / min is favorable., The most favorable values The concentration of vitamin B 12 in the aqueous solutions, which it is desired to subject to the treatment with the resin, vary with the nature of the materials treated and the method applied, these values being able to be easily determined.
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trat, which gives the test (dry) of oU00G..oU00 mcg / g of B 12 should have a content of about 50 to 110 mcg / ml of pure vitamin B 12.
In contrast, a concentrate having a (dry) B 12 activity of about 50,000 mcg / g should preferably be diluted to contain only about 80 = 120 mcg / ml of pure B 12. Such a concentration is. used when it is desired to obtain a considerable improvement in the quality of the material so that the characteristic absorption spectrum for the ultraviolet of pure vitamin B 12 becomes apparent.
It is possible to use the new process for the removal of impurities, such as silicates, by passing large volumes of the crude solution of vitamins B 12 in relatively large quantities.
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low in resins. For example, a concentrate containing / 000 meg, m -1 of a material which on a dry run gives about 25,000 mcg / g. can pass through a small resin column and it is found that its silica content has almost completely disappeared while its activity has increased. Considerable volumes of vitamin B 12 material of this quality can be processed in the same resin column and despite this a very substantial reduction in the silicon content is obtained.
This is of considerable importance in the preparation of perfectly clear solutions of B 12 vitamins for parenteral treatment. If silicates are not
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not removed there is a tendency, especially during acidification and dehydration, to the formation of insoluble silica.
There are two generally accepted standard methods for testing B 12 vitamin concentrates and solutions and these methods have been applied for the studies which led to the invention.
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tion. The first is a microbiological test that uses Lactdbacillus leichw.annii. The second is a quantum spectographic method known as Brunings' state, for which the ultraviolet adsorption of aqueous solutions of vitamins B 12 is determined at wavelengths of 540 to 525 milli- microns.
Pure, crystallized vitamin B 12 serves as the standard for both methods and has been assigned an activity of 1000 mcg / mg.
If a starting material having a sufficiently high activity is used, the vitamin B 12 concentrate obtained by the resin treatment can be easily crystallized. This fact constitutes one of the main advantages of the process in question since obtaining crystals of vitamins B 12 directly. at. starting from concentrates purified by known methods is by no means easy.
Not only are inorganic impurities removed by contact with the resin, but considerable quantities of organic impurities which are found in a large quantity are also removed.
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The amount of vitamin B 12 concentrate is greatly improved. The spect of the B 12 material thus puy-iFied is greatly improved, the color becomes tone. rosé more true because of the el, 1> oination of the various brownish or yellowish con-caminants.
An indication of the significant improvement in the. quality is obtained by comparing the ultraviolet aborption spectrum of the samples treated with. the resin and those which are not, For raw concentrates and not purified by the treatment with date exchange, for example the selected fraction
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obtained by the Brunings method referred to above, the ultraviolet absorption spectrum, which characterizes pure vitamin B 12, is almost completely masked. Products, which have been obtained after passage through the adopted ion exchange resins, have an ultraviolet absorption spectrum which is closer to that of pure vitamin.
Another important feature of the invention is that the ion exchange resins, which have been contaminated during the purification of vitamin B 12 concentrates, can be easily regenerated and be used several times. , very much the cost of treatment and makes the process more advantageous from a commercial point of view. Spent resin, which has adsorbed only contaminants from relatively small amounts of raw materials B 12 or already partially purified concentrates, can be regenerated. only by washing with dilute alkali, for example a 4% solution of soda or caustic potash or the like ,.
Heavily contaminated resin columns, containing greater amounts of absorbed impurities, may require acid treatment prior to alkaline washing. For such a treatment one uses, preferably, a strong acid, such as hydrochloric or sulfuric acid, in dilute solution but other acids, such as phosphoric, acetic or hydrobromic acid, can also be used successfully.,
The examples below serve to illustrate the invention but in no way limit the scope thereof.
As many variants, which appear to be markedly different, can be provided without departing from the object and scope of the invention, this should not be construed as being limited to the specific embodiments indicated in these examples. ,
EXAMPLE I,
A glass column, having a diameter of 37 mm and provided, at its lower end, with a filter disc, is filled to a height of 165 mm with an "Amberlite IRA 400" resin referred to above. of resin is washed with a 4% solution of caustic soda until the pH of the liquid at the outlet remains unchanged. The column is then washed until the solution, at the outlet of the column, has become neutral.
A solution of 0.20 g of crude vitamin B 12, which in the test gives 52,000 mcg / g of pure vitamin, is prepared in 100 ml of water. The solution is poured into the column and can slowly percolate through it. When the first pink color appears at the outlet, the solution is collected. The column is washed once with water and a quantity of 120 ml is collected at the outlet. This contains most of the vitamin and its pH is immediately adjusted to 7 with hydrochloric acid. The aqueous solution is frozen in a suitable flask and dried in vacuo.
The color of the product obtained is considerably improved by being a light red rather than a yellowish pink like the original B 12 raw material. It gave 110,000 mcg / g on the test, which is an improvement of over 100% in activity and the total weight represents an 85% recovery of the active vitamin. A greater yield is obtained by washing the column again.
EXAMPLE II.
An aqueous concentrate of vitamin B 12, which has a volume of 175 ml and which in the test gives 300 mcg / ml of pure vitamin is diluted with water to about 700 ml. This solution is passed through a column, which has an internal diameter of 50 mm and which contains 660 cm3 of "Amberlite IRA 400" resin, at a rate of 3 ml / min. The column is washed with a reduced amount of water and the collected and mixed liquids are neutralized with dilute hydrochloric acid. The main part of the solution is then dried after freezing and 6.4 g of the purified product are obtained, giving in the test 6600 mcg / g of pure vitamin B 12. The activity obtained is more than double that of the starting material on a dry basis.
By subjecting the product to solvent purification the activity of the product is easily made ten times greater.
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EXAMPLE III9
A resin column containing approximately 190 cm3 of "Amberlite IRA 400" is used to purify a crude vitamin B 12 concentrate. It is then washed with 850 ml of 4% hydrochloric acid to remove a considerable amount of unwanted colored impurities adsorbed by the column.
After the acid has left the column, the resin is washed with water and then with a 4% solution of caustic soda. This alkaline washing is continued until the liquid leaving the column reaches a constant pH. The column is then washed with water until the exiting liquid has become neutral. When the excess water has been removed, 400 ml of a solution of a concentrate of another raw vitamin B 12 (75 mcg / ml) are passed through it, which corresponds to dryness approximately. 3000 mcg / mg, at a rate of approximately 2 ml / min. When the first colored trace appears in the liquid, the material begins to collect. The column is finally washed with 100 ml of water and the liquid as well as the mixed washing water are neutralized with carbon dioxide.
The column is regenerated again with an alkaline lye, after which the neutralizing solution is passed through. Column. The collected material is neutralized again with carbon dioxide and dried in the frozen state. The product tested 14,500 mcg / g solids of pure vitamin B 12. A recovery of more than 95% of the active material is obtained.
EXAMPLE IV.
A sample of crude vitamin B 12 which has been concentrated by the usual methods is subjected to prejudiced crystallization by dissolution in a small volume of water with inoculation with crystals of vitamin B 12 and with the addition of acetone. It was not possible to obtain the formation of crystals. This material has an activity of 120,000 mcg / g in vitamin B 12. A sample of this material with a total B 12 content of 510,000 mcg was dissolved in water, the solution then passing through a cylindrical column having an internal diameter. of 25 mm and a length of 20 cm, this column being filled with resin "Amberlite IRA 400". The liquid of the column was neutralized with dilute sulfuric acid and was dried under vacuum in the frozen state.
The recovery of the activity in vitamins B 12 is at this moment, so to speak, quantitative. The dried product is dissolved in methanol and the insoluble material is removed by filtration.
The solvent is removed from the filtrate in vacuo to give a dry product having a vitamin B 12 activity of 160,000 mcg / g. The dry product is dissolved in a small volume of water and acetone is added. The solution quickly becomes cloudy and after inoculation the precipitation of crystals of B 12 vitamins is obtained. A first crop of crystals is obtained with a weight of 190 mg. A second crop is then obtained which weighs 195 mg. The total vitamin B 12 activity of these two crystallized precipitates is 303,000 mcg, with a recovery of 59% of the raw material used.
EMI5.2
R E iT E N D I G A. T I 0 N Sa
1. - A process for purifying vitamin preparations, said process comprising contacting impure solutions containing B 12 vitamins with basic ion exchange resins.
2. - A process for purifying vitamin preparations, said process consisting in passing the impure solution, containing vitamin B 12, through a colon containing at least one basic date exchange resin.
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