Procédé de séparation de composés amino d'un mélange
La présente invention a pour objet un procédé de séparation de composés amino de mélanges les contenant, au moyen d'adsorbants constitués par des dérivés d'agrégats de cristallites de cellulose, particulièrement des dérivés contenant des groupes ionisables et susceptibles de fonctionner comme échangeurs d'ions.
La préparation des amino-acides à partir d'hydrolysats de protéines est un procédé assez pratique pour fabriquer ces composés de valeur au moyen de matériaux de départ peu coûteux; mais leur séparation, leur récupération et leur purification sont une question toute différente et c'est à ces dernières étapes que la présente invention se rapporte, ainsi qu'à la séparation et/ou la purification d'un grand nombre d'autres mélanges susceptibles d'être séparés. Au moyen des matériaux adsorbants considérés ici, des mélanges complexes d'aminoacides, tels qu'on en trouve dans les hydrolysats de protéines, peuvent être séparés en acides individuels ou en petits groupes de ces acides qui peuvent être séparés encore au moyen d'une ou de plusieurs étapes supplémentaires.
Ces étapes de séparation peuvent être mises en oeuvre avec avantage par rapport aux procédés utilisant des échangeurs d'ions classiques, y compris les échangeurs résineux et ceux dérivés de la cellulose classique.
Des dérivés d'échange d'ions d'agrégats de cristallites de cellulose possèdent un certain nombre de caractéristiques mécaniques et physiques désirables par rapport aux matériaux classiques. Par exemple, ils ne possèdent pas les couleurs sombres et les odeurs qui caractérisent fréquemment les matériaux résineux, et il est beaucoup plus facile de contrôler leur dimension de particules en comparaison de ces derniers.
Dans le cas de dérivés de cellulose classique, leur caractère fibreux conduit à un médiocre garnissage dans la colonne et à la création d'espaces d'air qui provoquent des canaux . D'autre part, les dérivés d'agrégats étant de forme particulaire non fibreuse présentent de bonnes caractéristiques de garnissage et ne provoquent pas de canaux .
Les dérivés d'agrégats sont susceptibles d'être passés au tamis pour produire des fragments de dimensions de particules précises et uniformes, et la dimension ellemême peut être si petite qu'elle représente un ordre de grandeur différent par rapport aux dérivés de cellulose fibreuse classique. Ainsi qu'il est bien connu, la netteté de séparation d'un mélange alimentaire est généralement augmentée lorsque la dimension des particules du matériau de l'échangeur est diminuée. En conséquence, les dérivés d'agrégats peuvent, si on le désire, avoir une aire de surface bien supérieure à celle des matériaux fibreux. Ces derniers sont difficiles à passer au tamis avec précision en raison de leur forme fibreuse et il n'est pas rare d'avoir des particules possédant une dimension de l'ordre d'l ou 2 microns mais avec une longueur allant jusqu'à 1000 microns ou plus.
I1 est particulièrement significatif que les dérivés d'agrégats aient une densité en masse plus élevée que les matériaux de cellulose classiques; ainsi pour des poids égaux des deux dérivés, le dérivé d'agrégats aurait un volume plus petit, peut-être seulement 50 o/o ou moins du volume du matériau classique. Si un mélange alimentaire devait être séparé pour chaque matériau, le dérivé des agrégats serait mouillé d'une façon beaucoup plus faible que le matériau classique, et à son tour la rétention ou la perte serait beaucoup plus faible. L'avantage du dérivé des agrégats est ainsi apparent, particulièrement dans le cas de mélanges alimentaires coûteux ou de composants de tels mélanges; de plus, la quantité de solvant éluant serait moindre et il y aurait moins de solvant à s'évaporer du composé élué.
Les dérivés des agrégats ont l'avantage particulièrement désirable d'être reproductibles dans un état de pureté élevée et uniforme. Cette caractéristique n'est pas seulement de grande valeur pour séparer des mélanges qui sont sensibles aux impuretés, mais elle représente aussi un perfectionnement par rapport aux dérivés de cellulose classique dont la reproductibilité fluctue de lot à lot. Ainsi qu'il est bien connu, la cellulose classique contient des régions amorphes distribuées dans les chaînes de cellulose de celle-ci, le contenu desquelles comprend des xylanes et des mannanes. La quantité de ces derniers matériaux est variable de cellulose à cellulose, ainsi que celle-ci varie d'usine à usine et de saison à saison, et à leur tour les dérivés faits à partir de celluloses sont variables de la même manière de lot à lot.
En raison de ces variations, il est pratiquement impossible d'obtenir des produits dérivés uniformes ou purs à partir de cellulose classique. En ce qui concerne la teneur en cendres, les dérivés d'agrégats de cristallites peuvent avoir une teneur en cendres inférieure à 500 parties par million ou même inférieure à 100 parties par million, alors que les dérivés de cellulose classique peuvent avoir une teneur en cendres supérieure à 800 parties par million.
Dans le cas de mélanges alimentaires séparables tels que des amino-acides et des protéines, les dérivés d'agrégats peuvent présenter une capacité d'adsorption supérieure à celle de la résine et à celle des dérivés de cellulose classique. De plus, ces mélanges alimentaires ou leurs composants peuvent être abandonnés par désorption à partir des dérivés d'agrégats dans des conditions douces, c'est-à-dire que le solvant éluant ou de désorption peut être un produit chimique doux qui n'attaque pas les composants alimentaires ou le dérivé.
En raison de ces avantages et d'autres qui appa raîtront par la suite, les dérivés d'agrégats de cristallites sont susceptibles de fournir une action de séparation supérieure par rapport à un grand nombre de mélanges alimentaires.
Les dérivés d'échange d'ions des agrégats peuvent comprendre soit des échangeurs d'anions soit des échangeurs de cations.
Des échangeurs de cations convenables sont des dérivés carboxyle d'agrégats de cristallites de cellulose, y compris le carboxyle-6 et les dérivés de dicarboxyles en position 2 et 3, des dérivés contenant des mélanges de carboxyle et d'aldéhyde des agrégats, et des dérivés du type carboxyéther des agrégats tels que le carboxyméthyle, le carboxyéthyle et d'autres dérivés de carboxyallyle. D'autres matériaux utiles comprennent des dérivés d'ester d'acides inorganiques tels que les dérivés de phosphate et de sulfate des agrégats, d'autres dérivés d'éther des séries phosphonoalkyle, de sulfonikyle, et de sulfinoalkyle, tels que le phosphonométhyle, le sulfométhyle, le sulfoéthyle et des dérivés de sulfinométhyle. Les dérivés de sulfoalkyle comprennent des groupes d'acide sulfonique.
D'autres dérivés encore sont les esters d'acide phosphoreux, les esters d'acide borique, les esters d'acide sulfureux, également des esters d'acide organique tels que les esters de phtalate, de sulfinate et d'oxalate. D'autres esters comprennent les esters d'acide sulfonique et les esters d'acide carboxylique dans lesquels des parties du type -RSO8H et -RCOOH sont réunies au carbone carbonyl du groupe ester -OOC par les radicaux R, ces derniers étant n'importe quel radical hydrocarboné convenable.
Des échangeurs d'anions comprennent des éthers d'alkylaminoalkyl des agrégats dans lesquels les parties alkyle peuvent avoir de 1 à 6 atomes de carbone ou même plus; par exemple de tels dérivés comprennent les éthers de diéthylaminoéthyl et de triéthylaminoéthyle des agrégats. Un autre dérivé est le diéthylamino(hydroxy-2 propyl) éther. Un autre échangeur d'anions est constitué par le matériau formé en faisant réagir l'épichlorohydrine et le triéthanolamine avec les agrégats en présence de soude caustique. De plus, des dérivés de mono et diurée des agrégats. D'autres dérivés contenant, un groupe basique sont représentés à titre d'exemple par les esters d'alkylaminoalkyle et d'alkylaminodialkyle des agrégats.
Comme il peut être apparent, certains des dérivés ont un groupe ionisable fixé directement aux unités anhydroglucose des agrégats de cristallites, tandis que certains possèdent un tel groupe à l'extrémité d'une chaîne qui, à son autre extrémité, est fixée aux unités anhydroglucose.
Les agrégats de cristallites de cellulose à partir desquels les divers dérivés sont faits sont des agrégats de cellulose de petite dimension et préférablement désintégrés. Ces petits agrégats désintégrés, leurs propriétés et un procédé pour désintégrer la cellulose sont décrits dans le brevet suisse No 395045. Ce sont des produits insolubles dans l'acide, fabriqués par l'hydrolyse acide contrôlée de la cellulose. Ils sont composés de chaînes polymères ayant une longueur, ou degré de polymérisation (D. P.) sensiblement uniforme, bien que le D. P. de certaines chaînes puisse s'écarter quelque peu de la valeur moyenne, mesurée conformément aux indications contenues dans l'article de M. O. A. Battista sous le titre de Hydrolyse et cristallisation de la cellulose s, volume 42, < r Industrial and engineering chemistry pages 502-7 (1950).
I1 est préféré que les agrégats de départ aient une dimension de particules de 5 microns ou de moins, qu'ils aient ou non été soumis à l'attrition. Comme la production de dimensions de particules de 5 microns ou moins est favorisée par l'attrition, il est préférable d'exécuter cette étape et si nécessaire d'utiliser le fractionnement pour obtenir les dimensions désirées. Des dimensions de particules de 5 microns ou moins peuvent être obtenues par fractionnement des agrégats non soumis à l'attrition bien que le rendement puisse être inférieur.
Les dérivés utiles sont caractérisés par leur insolubilité générale y compris leur insolubilité dans l'eau, dans divers mélanges alimentaires séparables et dans divers éluants et régénérants; les dérivés sont encore carac térisés par le fait d'être sous forme de particules discrètes, particulaires non fibreuses d'une dimension dans la gamme préférée de 30 à 70 microns, bien qu'elles puissent être inférieures à 30 microns et même à 10 jusqu'à 5 microns, et si désiré de 0,1 ou 0,2 à un micron ou plus. Ces dérivés sont essentiellement des dérivés topochimiques du fait que les chaînes de cellulose disposées dans les surfaces des agrégats sont dérivées au lieu que toutes les chaînes des agrégats le soient.
En terme de degré de substitution (O. S.), les dérivés peuvent avoir un D. s. inférieur à 1,0, préférablement de 0,01 à environ 0,85.
Des dérivés carboxyle contenant à la fois des radicaux carboxyle et aldéhyde, des dérivés esters, des dérivés éthers et des dérivés de combinaison d'agrégats de cristallites de cellulose et leurs méthodes de préparation sont décrits dans le brevet suisse No 426757. Comme décrit dans ladite demande, les chaînes de cellulose des agrégats de cristallites ont à une extrémité un groupe aldéhyde potentiel qui peut être réduit en un groupe hydroxyle ou peut être oxydé en un groupe carboxyle avant de former un dérivé d'agrégats désiré.
L'invention est particulièrement intéressante dans la séparation et la purification de mélange alimentaires comportant des composants contenant des groupes amino, particulièrement des mélanges d'amino-acides provenant d'une source quelconque et désirablement des mélanges obtenus par hydrolyse acide, alcaline ou par action d'enzymes de diverses protéines à la fois d'origine animale et végétale et de mélanges à partir d'extraits biologiques.
A titre d'illustration, parmi les protéines qui peuvent être hydrolysées, on peut citer la caséine, la levure, l'albumine d'oeuf et aussi l'albumine de lait, de poisson, d'élastine, de kératine; les protéines végétales telles que le soja, l'édestine, la zéine, la gliadine; et aussi les protéines de colle, la gélatine, la fi broine de soie, la gomme de soie, I'hémoglobine, l'albumine de sérum, la globuline de sérum, la fibrine du sang, I'albumène de plasma bovin et le mélange de ceuxci avec l'hémoglobile, le sérum humain, le sérum de cheval.
De façon à séparer le mélange complexe d'aminoacides présent dans un hydrolysat de protéine, il est désirable de les séparer d'abord en une série de groupes en utilisant par exemple un échangeur de cations. A ce sujet, il est intéressant de noter que les amino-acides peuvent être classés en quatre groupes:
1) les aminoacides de base comprenant les acides diaminomonocarboxyliques possédant des points isoélectriques variant de 7,59 à 10,76 et comprenant l'histédine, la lysine, l'hydroxylysine et l'arginine, 2) les amino-acides neutres comprenant les acides monoaminomonocarboxyliques ayant des points isoélectriques de 5,6 à 6,3 et comprenant la sérine, la thréonine, la proline, l'hydroxyproline, la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine et la méthionine, 3) les amino-acides acidiques comprenant les acides monoaminodicarboxyliques avec des points isoélectriques de 2,77 à 3,22 et comprenant les acides glutamiques et aspartiques, et 4) les amino-acides aromatiques comprenant la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane.
I1 sera bien compris que la séparation initiale du mélange d'amino-acides à partir de l'hydrolysat de protéine en des groupes ne produira pas nécessairement des groupes de la composition qui précède, bien qu'en général on trouvera que l'ordre dans lequel les acides sont séparés par l'échangeur de cations est conforme à leur basicité croissante, c'est-à-dire que les acides les plus acides sont moins fortement adsorbés et tendent à passer hors de la colonne un, alors que les acides plus basiques sont plus fortement adsorbés et tendent à être retenus dans la colonne. Après séparation des groupes, la séparation des acides individuels d'un groupe peut être exécutée séparément, par exemple au moyen d'un matériau échangeur différent.
Les dérivés d'échange d'ions des agrégats de cristallites sont non seulement utiles pour la séparation de mélanges d'amino-acides mais ils sont aussi de grande valeur pour la séparation des peptides, et aussi des mélanges de protéines, y compris les divers mélanges de protéines décrits ci-dessus et aussi y compris d'autres mélanges de protéines tels que les enzymes, les extraits de muscle, les acides nucléiques et leurs produits de dégradation, etc. Ils sont également de valeur pour la purification des mélanges d'amino-acides, des diverses protéines, des acides nucléiques, etc.
La présente invention est aussi applicable à la purification des acides organiques impurs tels que les qualités commerciales sous lesquelles de tels acides sont fréquemment fournis. Un fractionnement d'acide impur est possible, dans lequel des matériaux de poids moléculaire inférieur et supérieur, ainsi que l'acide purifié luimême, peuvent être obtenus dans des fractions définies.
De même, des mélanges d'acides peuvent être séparés en leurs composants.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on fait passer une solution de ce mélange au contact d'un dérivé insoluble dans l'eau d'agrégats de cristallites de cellulose, ledit dérivé présentant des groupes fonctionnels échangeurs d'ion, en ce que l'on adsorbe au moins une partie desdits composés amino sur ledit dérivé, en ce que l'on élue lesdits composés amino avec un solvant éluant pour séparer les composés amino adsorbés et en ce que l'on récupère au moins une fraction contenant moins de composés amino que ledit mélange.
En général, le processus de fractionnement ou de séparation en un ou plusieurs de ses composants d'un mélange alimentaire tel qu'un mélange d'amino-acides ou d'autres composants contenant un groupe amino, comprend le fait de placer une solution du mélange à séparer sur la partie supérieure d'une colonne garnie de matériaux appropriés. Le mélange est alors élué à travers la colonne au moyen d'un éluant ou solvant convenable. En raison des différents degrés d'association qui peuvent exister entre les composants du mélange et le matériau dans la colonne, les composants se déplacent vers le bas de la colonne à des taux différents.
Une séparation est ainsi effectuée et des fractions successives de l'éluant et d'un ou plusieurs composants sont collectées lorsqu'ils émergent de la partie inférieure de la colonne.
Le choix de l'éluant dépendra du matériau de la colonne et des composants du mélange alimentaire; cependant, des éluants communément utilisés comprennent le chloroforme, des mélanges de chloroforme et de méthanol, les alcools à faible poids moléculaire ayant de 1 à 5 ou 6 atomes de carbone, des mélanges de n-butanol d'isopropanol et d'eau, de l'eau, des acides aqueux tels que le HC1 0,1N et le HCl 0,5N, des mélanges de butanol d'isopropanol et de 0,1N HCl en mélange, des mélanges de n-butanol d'isopropanol et de HC1 0,5N en mélange, des mélanges de n-butanol et d'acide acétique, des mélanges de n-butanol d'acide acétique et d'eau, des mélanges de n-butanol, d'acide acétique, d'eau et de 2éthylhexylamine, des mélanges de benzène,
d'acide citrique d'hydroxyde de sodium, de HCl et d'eau, des mélanges d'acide citrique, d'acide acétique, d'hydroxyde de sodium, d'acétate de sodium et d'eau, des mélanges d'acide phosphorique et d'hydroxyde de sodium, des mélanges d'éthanol et de HC1, des solutions de dioxane, de diméthyl formamide de sel aqueux telles que NaCl 0,1 N et analogues. Deux ou un plus grand nombre d'éluants peuvent être utilisés.
Le pH de l'éluant peut être un facteur dans la séparation des amino-acides, des protéines et autres mélanges. En changeant le pH de l'éluant, il peut être possible de faire varier le degré d'association des divers composants des mélanges alimentaires avec le matériau de la colonne, affectant ainsi le taux auquel ceux-ci se déplacent vers le bas dans la colonne. On peut préférer des valeurs de pH pour la séparation efficace de mé langes tels que des protéines et des amino-acides et ces valeurs peuvent être déterminées pour un mélange particulier.
Lorsqu'une séparation de lots est désirée, le matériau de la colonne peut être enlevé de la colonne sous la forme d'un cylindre humide et coupé en sections, chaque section correspondant à une bande de matériau plus des composants adsorbés et le dernier peut alors être enlevé au moyen d'un solvant convenable. L'emploi de dérivés d'agrégats dans cette dernière méthode de séparation fournit un avantage par rapport aux dérivés de cellulose classique en ce que ce dernier, lorsqu'il a été coupé en bandes, se coupera de façon nette et propre alors que les composés classiques, étant fibreux, ne se coupent pas de façon nette ou propre mais tendent à se déchirer. I1 peut encore être noté que les dérivés classiques tendent à donner des bandes le long de la colonne possédant des limites indistinctes en raison du caractère fibreux des dérivés.
Un matériau de colonne peut être régénéré en faisant passer un solvant ou une solution de régénération à travers la colonne qui déplacera toutes les substances qui peuvent être encore dans la colonne. Le solvant utilisé évidemment variera avec la substance sur la colonne et le matériau de la colonne. A titre d'exemple, on peut mentionner la régénération de la colonne de l'exemple 3 après la purification d'acide laurique et utilisant de l'éthanol comme éluant. Cette colonne peut être régénérée par lavage avec une solution d'acide chlorhydrique éthanolique à 0,5 N. Après régénération, la solution régénérante peut être déplacée par le solvant pour être utilisée pour l'éluant dans l'étape suivante.
En général, des substances régénératrices convenables comprennent 1'HCl éthanolique, 1'méthanol, des solutions aqueuses de chlorure de sodium, des solutions d'alcool basique telles que le NaOH éthanolique à 0,1 N, des solutions acides telles que l'HCl à 0,5 N, le chloroforme, etc. D'autres régénérants peuvent être choisis à partir de la liste cidessus d'éluants. L'invention peut être illustrée par les exemples suivants.
Exemple I
Un dépôt a été formé en dispersant un dérivé carboxyméthyle d'agrégats de cristallites de cellulose ayant un degré de substitution d'environ 0,5 dans un solvant comprenant un volume de butanol, deux volumes d'isopropanol et un volume d'eau. Le dépôt (qui fournissait une manière convenable de placer le dérivé dans la colonne d'échange, bien qu'il pouvait aussi être introduit dans celle-ci sous forme sèche) a été soigneusement versé sur le côté d'une colonne de verre de 62 cm de long ayant un diamètre intérieur de 1,5 cm. Un bouchon de verre préalablement introduit supportait le dérivé dans la colonne. Pendant que le solvant s'écoulait de la colonne, des quantités supplémentaire de dépôt étaient ajoutées à la partie supérieure.
Lorsque le dérivé ne sedéposait plus, on a laissé le solvant s'écouler en faisant attention d'empêcher que le dérivé ne sèche complètement.
Un mélange d'amino-acides de la qualité commerciale dite pure a été préparé en comprenant 20 milligrammes d'acide d-aspartique, 20 grammes de dl-alanine et 20 milligrammes de l-histidine. Le mélange a été dissous dans un solvant comprenant un volume de butanol, deux volumes d'isopropanol et un volume d'acide chlorhydrique 0,1N. Le volume total de la solution était de 10 millilitres qui ont été ajoutés à la partie supérieure de la colonne et on a permis à l'ensemble de s'écouler à travers celle-ci, en prenant soin de maintenir le niveau du liquide au-dessus de la partie supérieure des dérivés de garnissage. Après addition de la charge et sans exposer la partie supérieure du dérivé de garnissage, le solvant éluant a été introduit dans la colonne au taux de 3 millilitres pour 25 minutes.
Le solvant avait la même composition que celui utilisé pour fabriquer le dépôt du dérivé et il servait à aider à la circulation des amino-acides à travers la colonne à des taux différents permettant ainsi de réaliser le chromatogramme. L'effluent de la colonne a été collecté en fraction de 3 millilitres en utilisant un collecteur de fractions normal.
Des fractions ont été analysées comme suit. Un réactif tel que la ninhydrine a été préparé sous la forme d'une solution à 0,1 o dans un citrate tampon. Le citrate tampon a été réalisé en mélangeant 200 millilitres de soude caustique 1N avec de l'acide citrique, suffisamment d'acide étant ajouté pour donner un pH de 5,0.
Chaque fraction de 3 millilitres a été mélangée à 1 millilitre du réactif ninhydrine et le mélange placé dans de l'eau bouillante pendant 20 minutes. L'apparition d'une couleur bleue indiquait la présence d'amino-acide, alors que l'absence de couleur indiquait l'absence d'un tel acide. Les informations qualitatives suivantes peuvent être présentées sous forme de tableau:
No des fractions Résultats d'essais
1- 30 négatif
31- 81 bleue
82-89 négatif
90-119 bleue
120-150 négatif
151-179 bleue
180-200 négatif
En se reportant au groupe de numéros 31 à 81, on comprendra que la couleur bleue était moins intense dans les premières fractions du groupe, devenait graduellement plus intense, puis moins intense, la fraction du milieu ayant la couleur la plus intense. Ce phénomène était aussi vrai pour les échantillons 90 à 119 et 151 à 179.
L'intensité de la couleur d'une fraction a été interprétée comme étant proportionnelle à la concentration d'amino-acides dans celle-ci. Le test a indiqué que la fraction numéros 31 à 81 contenait de l'acide d-aspartique, la fraction numéros 90 à 119 contenait de la dl-alanine et la fraction numéros 151 à 179 contenait de la I-histidine.
Le travail qui précède a été répété en utilisant de la cellulose carboxyméthylique classique comme adsorbant dans la colonne, excepté que seulement 10 milligrammes de chacun des amino-acides étaient utilisés au lieu de 20 milligrammes de chacun de ceux-ci. Un tel emploi d'un niveau inférieur d'amino-acides devait, pensaiton, augmenter la sensibilité du mélange au pouvoir séparateur de l'adsorbant. De plus, un taux d'écoule ment plus rapide était réalisé avec le dérivé classique, à savoir 3 millimètres par 5 minutes. Cependant, aucune séparation des amino-acides n'a été obtenue, les informations qualitatives du test sont les suivantes:
No des fractions Résultats d'essais
1- 20 négatif
21- 39 bleue
40-200 négatif
I1 est apparent que les trois acides émergeaient ensemble de la colonne dans les numéros 21 à 39.
Exemple 2
Un hydrolysat de caséine a été soumis au traitement en utilisant la colonne de l'exemple précédent. De la caséine pure a été hydrolysée en soumettant celle-ci au reflux pendant 6 heures dans 150 millilitres d'acide chlorhydrique concentré. La caséine donnait l'analyse suivante: résidu après ignition 2,0 o/o; humidité 8,0 0/o; protéine 87,50/o; azote 13,7 0/o; du sucre réducteur était présent sous forme de traces. L'acide chlorhydrique utilisé était de la qualité connue aux Etats-Unis sous l'appellation C.
P., avait une densité de 1,19 et contenait de 37 à 38 ego de HC1. A la fin de l'hydrolyse, une partie aliquote de la solution d'hydrolysat résultante a été diluée avec de l'eau, si bien que la concentration finale de la solution aliquote correspondait approximativement à 4 milligrammes de la caséine originale par millilitre de solution aliquote diluée. Deux millilitres de la solution aliquote diluée, équivalant à environ 8 milligrammes de la caséine originale, ont été pris et utilisés comme alimentation à charger dans la colonne.
Comme indiqué, la colonne de l'exemple précédent a été utilisée pour la séparation. La colonne était d'abord lavée avec un mélange comprenant 1 volume de butanol, deux volumes d'isopropanol et 1 volume de 0,1 N HCl.
Après un tel lavage, le liquide de lavage a été déplacé de la colonne en versant dans celle-ci un mélange comprenant un volume de butanol, deux volumes d'isopropanol et un volume d'eau, cette étape étant désignée sous le nom d'équilibrage de la colonne. Alors, l'hydrolysat de caséine ou substance d'alimentation a été ajouté à la partie supérieure de la colonne, et lorsque le niveau correspondait à la surface supérieure de l'adsorbant dans la colonne, le solvant d'élution a été introduit, un tel solvant étant le même que celui utilisé dans l'exemple précédent. Le taux de circulation du solvant était aussi le même que dans l'exemple précédent.
Des fractions de 3 millilitres ont été collectées et analysées en ce qui concerne la teneur en amino-acide par le procédé décrit dans un article intitulé Méthodes Colorimétriques d'Analyse par Snell et Snell, 3e édition, édité à New York par Van Nostrand Co.,
Inc., pages 107-108 (1954). Ce procédé est un procédé quantitatif dans lequel l'intensité des couleurs est mesurée avec un spectrophotomètre, les intensités ainsi mesurées étant utilisées pour calculer la densité optique, ainsi que cela est indiqué dans la référence qui précède.
La densité optique est une mesure de l'absorption de la lumière par les amino-acides. De façon plus particulière, c'est le logarithme négatif du pourcentage de lumière transmise. En représentant graphiquement la densité optique par rapport aux numéros de fractions, une courbe a été obtenue ayant une pointe très aiguë et très haute pour la fraction No 40 (densité optique 0,61), la pointe commençant au No 35 et finissant au No 57. Les fractions Nos 1 à 34 avaient une densité optique nulle. Le reste des fractions, Nos 58 à 231, présentait une densité optique faible mais croissant graduellement, allant de 0,03 à 0,21.
Les informations de densité optique pour les Nos 35 à 57 sont les suivantes:
No No des fractions Densité optique des fractions Densité optique
35 0,03 47 0,28
36 0,15 48 0,24
37 0,31 49 0,22
38 0,46 50 0,17
39 0,57 51 0,15
40 0,61 52 0,10
41 0,52 53 0,09
42 0,46 54 0,05
43 0,41 55 0,04
44 0,38 56 0,02
45 0,31 57 0,01
46 0,30
Le matériau dans les échantillons Nos 35 à 57 contenait principalement de l'acide glutamique avec un peu d'acide aspartique. De façon plus spécifique, les échantillons No 35 à 46 contenait principalement de l'acide glutamique et les numéros 46 à 57 contenaient principalement de l'acide aspartique. La fraction No 40 contenait environ 4 O/o en poids de la teneur en aminoacide de la caséine originale.
Exemple 3
Deux millilitres d'acide laurique impur (qualité pratique de Eastman) dans de l'éthanol (0,1 gramme d'acide laurique pour 25 millilitres d'éthanol) ont
Différence Différence
No dans l'index No dans l'index des fractions de réfraction des fractions de réfraction
1 0 11 0,094
2 0,123 12 0,037
3 0,046 13 0,025
4 0 14 0,018
5 0 15 0,030
6 0,049 16 0,021
7 0,045 17 0
8 0,010 18 0,006
9 0,133 19-30 0
10 0,214
Si les renseignements précédents sont représentés sur du papier à coordonnées, on obtient une courbe montrant la variation du numéro de la fraction avec l'index de réfraction différentiel. Les deux premières pointes de cette courbe représentent des impuretés comprenant des composés organiques ayant moins de 12 atomes de carbone par molécule. La troisième pointe correspondant à la fraction No 10 est la plus élevée et représente l'acide laurique pur. Deux petites pointes suivantes représentent des impuretés comprenant des composés organiques ayant plus de 12 atomes de carbone.
Exemple 4
Deux millilitres d'acide myristique impur (Eastman) dans l'éthanol (0, 1 g d'acide myristique par 25 millilitres d'éthanol) ont été placés sur une colonne entassée (0,8 centimètre X 30 centimètres) qui avait été équilibrée avec de l'éthanol. Le matériau de la colonne était le même que celui utilisé dans l'exemple 3. L'échantillon a été élué avec de 1'éthanol sous une pression de 2,267 kg par cm2 d'azote. Le taux d'écoulement était de 2 millilitres pour 5 minutes. Des concentrations des fractions étaient suivies au moyen d'un réfractomètre différentiel Brice et Phoenix.
Différence Différence
No dans l'index No dans l'index des fractions de réfraction des fractions de réfraction
1 0 19 0,075
2 0 20 0,075
3 0 21 0,075
4 0 22 0,075
5 0,028 23 0,089
6 O 24 0,084
7 0 25 0,072
8 0,046 26 0,079
9 0,022 27 0,039
10 0 28 0,070
11 0,208 29 0,048
12 0,304 30 0,075
13 0,219 31 0,020
14 0,060 32 0
15 0,036 33 0
16 0,067 34 0
17 0,043 35 0
18 0,099
En représentant graphiquement les informations qui précèdent sur du papier à coordonnées, la courbe résultante a sa pointe la plus élevée correspondant à la fraction 12 et représente l'acide myristique pur. Des pointes plus faibles précédant et suivant la pointe la plus haute représentent des impuretés organiques contenant respectivement moins de et plus de 14 atomes de carbone par molécule.
D'un point de vue plus large, les dérivés d'agrégats de cristallites ont d'utiles applications à la séparation, à la récupération et/ou à la purification de mélanges et de compositions de caractère varié. Ainsi ils peuvent être employés pour des produits tels que des racémates, des lipides, des composés ayant des branches droites et des branches en chaîne, des terres rares. Aussi ils permettent de récupérer des acides organiques tels que les acides citrique, tartrique, etc. à partir d'eaux usées et de déchets de citrons, ainsi que de purifier de tels acides et des acides gras saturés et non saturés à poids moléculaire plus élevé tels que les acides linoléique, linolénique, oléique, ricinoléique, stéarique, palmitique, etc.
Des amino-acides peuvent être recouvrés à partir de résidus de traitements d'aliments, des enzymes à partir de source naturelle, des métaux à partir de bains de traitement tels que des bains de décapage et de traite- ments anodiques, le cuivre à partir des eaux de déchets de filage de rayonne de cupramonium, des métaux de valeur tels que de l'argent à partir de résidus photographiques. L'invention est aussi de valeur pour purifier des intermédiaires chimiques, des tanins, des nitrites, des hexosephosphates, des alcools complexes, des alcools gras supérieurs, des teintures, etc. Des pigments de plantes peuvent être isolés des mélanges naturels de ceux-ci. Ainsi, le carotène peut être séparé d'autres pigments de plantes.
Des impuretés de métaux lourds tels que le cuivre et le fer peuvent être enlevées du vin, et le vin autrement amélioré par rapport à sa pureté, organoleptiques et autres qualités. Le whisky peut être amélioré de façon analogue. L'eau peut être adoucie ou complètement désionisée.
Il sera bien entendu évident que, dans ces opérations, un dérivé d'échange de cations sera employé pour adsorber les substances cationiques et un dérivé d'échange d'anions sera utilisé pour adsorber les substances anioniques. I1 sera aussi apprécié que dans certaines des applications qui précèdent telles que l'adoucissement ou la désionisation de l'eau ou la déminéralisation des solutions pour les libérer d'impuretés minérales ou pour recouvrer des métaux de valeur, le procédé général comprend le fait de verser le mélange alimentaire, par exemple un mélange à partir duquel des impuretés doivent être enlevées, dans une colonne d'adsorbant. L'effluent sera le produit alimentaire déminéralisé, alors que les impuretés minérales ou mécaniques sont retenues sur la colonne et peuvent être enlevées convenablement.
Une expérience intéressante peut être exécutée avec un mélange de teintures. Approximativement 50 milligrammes de chacune des trois teintures suivantes solubles dans l'eau ont été mélangés dans 250 millilitres d'eau de la couleur jaune dite parakeet No 5, parakeet rouge No 2 et parakeet vert No 1. Deux colonnes ont alors été montées, une contenant de la cellulose carboxyméthylique classique sous forme fibreuse et l'autre contenant des agrégats de cristallites de cellulose carboxyméthylique sous forme particulaire non fibreuse. La même quantité de mélange de teintures a été versée à la partie supérieure de chaque colonne en même temps, puis on a simplement laissé descendre par gravité. Après environ deux heures, les deux colonnes ont été examinées.
Dans la colonne contenant le dérivé de cellulose classique, la partie la plus basse de la colonne, comprenant environ 1/5 de la longueur, n'était pas mouillée. Immédiatement au. dessus de celle-ci, il y avait une bande jaune comprenant les 2/5 de la colonne, et au-dessus de ceci, il y avait une bande verte comprenant aussi environ 2/5 de la colonne. Dans la colonne contenant le dérivé d'agrégats, la partie la plus basse de la colonne, environ 1/5 de la longueur, n'était pas mouillée.
Au-dessus de ceci, il y avait une large bande bleue comprenant environ 1/5 de la colonne. Au-dessus de cette dernière, il y avait trois bandes étroites de vert clair, de brun rougeâtre et de vert clair, respectivement. Audessus de la bande mentionnée en dernier, il y avait une large bande bleu clair comprenant environ 1/5 de la colonne, et finalement au sommet de la colonne, il y avait une bande verte de largeur assez substantielle. I1 était apparent que le dérivé des agrégats était capable de séparer le mélange de couleur en un plus grand nombre de composants; de plus, ce dérivé ne présentait pas le phénomène de formation de canaux et les bandes étaient définies nettement, alors que le dérivé classique de cellulose présentait la formation de canaux et délimitait les bandes indistinctement.
Comme indiqué ci-dessus, bien que l'emploi de dérivés d'agrégats de cristallites de cellulose ayant des propriétés d'échanges d'ions soit préféré, il y a d'autres dérivés des agrégats de cristallites qui, bien que ne pré- sentant pas une action d'échange d'ions en raison du manque de groupes ionisants, sont néanmoins de valeur comme adsorbants pour la séparation, la purification, la récupération ou pour traiter autrement les mélanges alimentaires décrits ci-dessus. Ces derniers dérivés sont effectifs par l'opération d'adsorption de liaison d'hydrogène et/ou des forces de Van de Waals et sont aussi préparés suivant le procédé décrit dans le brevet suisse
No 426757.
N'importe lequel des dérivés décrits ici des agrégats de cristallites de cellulose peut être soumis à l'attrition en présence d'eau pour former un gel, et sous cette forme il convient pour être utilisé dans l'électrophorèse de gel pour purifier des composés impurs, pour recouvrer des composés désirés, et analogues.
Un autre avantage des dérivés d'agrégats du type à échange d'ions est le fait que les ions échangeables sont plus accessibles que dans le cas de matériaux de dérivés de cellulose classique et du type résine. Dans les matériaux du type résine, l'échangeur n'est pas ordinairement une longue chaîne de polymère mais plutôt un polymère à réseau à trois dimensions ayant beaucoup d'ions échangeables placés de telle façon dans le milieu intérieur amorphe qu'ils sont inaccessibles aux ions d'échange et au milieu éluant. Et dans les dérivés de cellulose classique, la présence de groupes ionisables à l'intérieur des régions amorphes ou matrices, tend à les rendre accessibles. Dans les résultats, les dérivés d'agrégats, en raison de la plus grande accessibilité de leurs groupes ionisables placés sur la surface, tendent à donner un taux d'échange plus élevé.
Une autre considération réside dans la tendance de certains matériaux classiques à se gonfler pendant l'usage, et il faut noter que les dérivés d'agrégats se gonflent beaucoup moins dans l'eau que les dérivés de cellulose classique. Le fait que le gonflement des derniers dérivés est difficile sinon impossible à contrôler, facteur considéré comme ayant une relation avec la présence de régions amorphes dans les chaînes moléculaires des dérivés, est peut-être plus significatif. L'objection au gonflement est que si celui-ci est suffisamment prononcé, une résistance indésirable au flux d'alimentation ou d'éluant se développe. Lorsque le gonflement est difficile à contrôler, il est évident que la résistance d'écoulement peut devenir un facteur sérieux.
Contrairement au matériau du type résine, les dérivés d'agrégats sont inertes pour un grand nombre de solvants et fournissent ainsi une gamme étendue d'éluants et aussi de régénérants susceptibles d'être employés.
Etant moins sujets aux attaques, les dérivés sont plus facilement régénérés que les matériaux du type résine.
De plus, en raison de l'absence de régions amorphes, ils peuvent être régénérés au moyen d'une variété d'agents beaucoup plus étendue que les dérivés de cellulose classique. Ces derniers, en raison de la présence d'aires amorphes, sont sujets à l'attaque par les régénérants acides.
D'intérêt particulier est le fait que les dérivés d'agrégats possèdent un caractère hydrophile. Ceci est apparent parce que les agrégats de cristallites de cellulose à partir desquels les dérivés sont préparés, contiennent un nombre élevé de groupes hydroxyle dont au moins certains survivent à la conversion des agrégats en dérivés. En raison de leur caractère hydrophile, les dérivés sont de valeur particulière pour séparer des mélanges alimentaires dont les composants contiennent des groupes amino.
Tel qu'utilisé ici, le terme adsorbant est destiné à désigner à la fois les dérivés des groupes ionisables et ceux qui ne possèdent pas de tels groupes.
Les termes mélange liquide ou mélange fluide sont destinés à couvrir des mélanges alimentaires séparables qui sont à l'état liquide ou liquéfié ou à l'état fluide et comprennent des solutions, des solutions colloïdales, des suspensions colloidales et des dépôts. Ces termes comprennent aussi des mélanges fondus si de tels mélanges ne sont pas liquides aux températures normales. Des suspensions colloïdales peuvent comprendre des protéines, des polypeptides, etc. De plus, certains mélanges alimentaires liquides peuvent être introduits dans une colonne de séparation sans être d'abord transformés dans une solution au moyen d'un solvant.
Process for separating amino compounds from a mixture
The present invention relates to a process for separating amino compounds from mixtures containing them, by means of adsorbents constituted by derivatives of aggregates of cellulose crystallites, particularly derivatives containing ionizable groups and capable of functioning as exchangers of cellulose. ions.
The preparation of amino acids from protein hydrolysates is a fairly convenient process for making these valuable compounds using inexpensive starting materials; but their separation, recovery and purification are an entirely different matter and it is to these latter stages that the present invention relates, as well as to the separation and / or purification of a large number of other potentially mixtures. to be separated. By means of the adsorbent materials considered herein, complex mixtures of amino acids, as found in protein hydrolysates, can be separated into individual acids or into small groups of such acids which can be further separated by means of a or several additional steps.
These separation steps can be carried out with advantage over methods using conventional ion exchangers, including resinous exchangers and those derived from conventional cellulose.
Ion exchange derivatives of cellulose crystallite aggregates possess a number of desirable mechanical and physical characteristics over conventional materials. For example, they do not have the dark colors and odors that frequently characterize resinous materials, and their particle size is much easier to control compared to the latter.
In the case of conventional cellulose derivatives, their fibrous character leads to poor packing in the column and to the creation of air spaces which cause channels. On the other hand, the aggregate derivatives being of non-fibrous particulate form exhibit good packing characteristics and do not cause channels.
The aggregate derivatives are likely to be sieved to produce fragments of precise and uniform particle sizes, and the size itself may be so small as to be an order of magnitude different from conventional fibrous cellulose derivatives. . As is well known, the separation sharpness of a food mixture is generally increased as the particle size of the exchanger material is decreased. Accordingly, aggregate derivatives can, if desired, have a much larger surface area than fibrous materials. The latter are difficult to sieve with precision due to their fibrous form and it is not uncommon to have particles having a size of the order of 1 or 2 microns but with a length of up to 1000 microns or more.
It is particularly significant that the aggregate derivatives have a higher bulk density than conventional cellulose materials; thus for equal weights of the two derivatives, the aggregate derivative would have a smaller volume, perhaps only 50% or less of the volume of the conventional material. If a food mixture were to be separated for each material, the aggregate derivative would be wetted in a much weaker fashion than the conventional material, and in turn the retention or loss would be much lower. The advantage of the aggregate derivative is thus apparent, particularly in the case of expensive food mixtures or components of such mixtures; in addition, the amount of eluting solvent would be less and there would be less solvent to evaporate from the eluted compound.
The derivatives of the aggregates have the particularly desirable advantage of being reproducible in a state of high and uniform purity. This feature is not only of great value in separating mixtures which are sensitive to impurities, but it also represents an improvement over conventional cellulose derivatives whose reproducibility fluctuates from batch to batch. As is well known, conventional cellulose contains amorphous regions distributed in the cellulose chains thereof, the contents of which include xylans and mannans. The quantity of these latter materials is variable from cellulose to cellulose, so this varies from plant to plant and from season to season, and in turn derivatives made from celluloses are variable in the same way from batch to. lot.
Due to these variations, it is virtually impossible to obtain uniform or pure derivative products from conventional cellulose. Regarding the ash content, the crystallite aggregate derivatives may have an ash content of less than 500 parts per million or even less than 100 parts per million, while the conventional cellulose derivatives may have an ash content. greater than 800 parts per million.
In the case of separable food mixtures such as amino acids and proteins, the aggregate derivatives may exhibit a higher adsorption capacity than that of the resin and that of conventional cellulose derivatives. In addition, these food mixtures or their components can be abandoned by desorption from the aggregate derivatives under mild conditions, i.e. the eluting or desorbing solvent can be a mild chemical which does not attack. not the food components or the derivative.
Because of these advantages and others which will become apparent later, the crystallite aggregate derivatives are likely to provide superior separating action over many food mixtures.
The ion exchange derivatives of the aggregates can include either anion exchangers or cation exchangers.
Suitable cation exchangers are carboxyl derivatives of aggregates of cellulose crystallites, including carboxyl-6 and derivatives of dicarboxyls in position 2 and 3, derivatives containing mixtures of the carboxyl and aldehyde aggregates, and carboxyether type derivatives of aggregates such as carboxymethyl, carboxyethyl and other carboxyallyl derivatives. Other useful materials include ester derivatives of inorganic acids such as phosphate and sulfate derivatives of aggregates, other derivatives of phosphonoalkyl, sulfonikyl, and sulfinoalkyl series ether, such as phosphonomethyl, sulfomethyl, sulfoethyl and sulfinomethyl derivatives. The sulfoalkyl derivatives include sulfonic acid groups.
Still other derivatives are esters of phosphorous acid, esters of boric acid, esters of sulfurous acid, also esters of organic acid such as esters of phthalate, sulfinate and oxalate. Other esters include sulfonic acid esters and carboxylic acid esters in which parts of the type -RSO8H and -RCOOH are joined to the carbonyl carbon of the ester group -OOC by the radicals R, the latter being any what suitable hydrocarbon radical.
Anion exchangers include alkylaminoalkyl ethers of aggregates in which the alkyl moieties may have 1 to 6 carbon atoms or even more; for example such derivatives include the diethylaminoethyl and triethylaminoethyl ethers of the aggregates. Another derivative is diethylamino (2-hydroxypropyl) ether. Another anion exchanger consists of the material formed by reacting epichlorohydrin and triethanolamine with the aggregates in the presence of caustic soda. In addition, mono and diurea derivatives of the aggregates. Other derivatives containing a basic group are represented by way of example by the alkylaminoalkyl and alkylaminodialkyl esters of the aggregates.
As may be apparent, some of the derivatives have an ionizable group attached directly to the anhydroglucose units of the crystallite aggregates, while some have such a group at the end of a chain which at its other end is attached to the anhydroglucose units. .
The aggregates of cellulose crystallites from which the various derivatives are made are small and preferably disintegrated cellulose aggregates. These small disintegrated aggregates, their properties and a method for disintegrating cellulose are described in Swiss Patent No. 395045. They are acid insoluble products produced by the controlled acid hydrolysis of cellulose. They are composed of polymer chains having a substantially uniform length, or degree of polymerization (DP), although the DP of some chains may deviate somewhat from the average value, measured according to the indications contained in the article by MOA Battista. under the title Hydrolysis and crystallization of cellulose s, volume 42, <r Industrial and engineering chemistry pages 502-7 (1950).
It is preferred that the starting aggregates have a particle size of 5 microns or less, whether or not they have been subjected to attrition. Since the production of particle sizes of 5 microns or less is favored by attrition, it is preferable to perform this step and if necessary use fractionation to achieve the desired sizes. Particle sizes of 5 microns or less can be obtained by fractionating the aggregates not subject to attrition although the yield may be lower.
Useful derivatives are characterized by their general insolubility including their insolubility in water, in various separable food mixtures and in various eluents and regenerants; the derivatives are further characterized by being in the form of discrete, non-fibrous particulate particles of a size in the preferred range of 30 to 70 microns, although they may be less than 30 microns and even less than 10 up to 10. to 5 microns, and if desired from 0.1 or 0.2 to one micron or more. These derivatives are essentially topochemical derivatives in that the cellulose chains arranged in the surfaces of the aggregates are derived instead of all the chains of the aggregates.
In terms of degree of substitution (O. S.), the derivatives can have a D. s. less than 1.0, preferably 0.01 to about 0.85.
Carboxyl derivatives containing both carboxyl and aldehyde radicals, ester derivatives, ether derivatives and combination derivatives of cellulose crystallite aggregates and their methods of preparation are described in Swiss Patent No. 426757. As described therein. In application, the cellulose chains of the crystallite aggregates have at one end a potential aldehyde group which can be reduced to a hydroxyl group or can be oxidized to a carboxyl group before forming a desired aggregate derivative.
The invention is particularly useful in the separation and purification of food mixtures comprising components containing amino groups, particularly mixtures of amino acids from any source and desirably mixtures obtained by acid, alkaline or action hydrolysis. enzymes of various proteins of both animal and vegetable origin and mixtures from biological extracts.
By way of illustration, among the proteins which can be hydrolyzed, there may be mentioned casein, yeast, egg albumin and also milk, fish, elastin and keratin albumin; vegetable proteins such as soy, edestin, zein, gliadin; and also glue proteins, gelatin, silk fibroin, silk gum, hemoglobin, serum albumin, serum globulin, blood fibrin, bovine plasma albumin and the mixture. of these with hemoglobile, human serum, horse serum.
In order to separate the complex mixture of amino acids present in a protein hydrolyzate, it is desirable to first separate them into a series of groups using, for example, a cation exchanger. In this regard, it is interesting to note that amino acids can be classified into four groups:
1) basic amino acids comprising diaminomonocarboxylic acids having isoelectric points varying from 7.59 to 10.76 and comprising histedine, lysine, hydroxylysine and arginine, 2) neutral amino acids comprising acids monoaminomonocarboxylic having isoelectric points of 5.6 to 6.3 and comprising serine, threonine, proline, hydroxyproline, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine and methionine, 3) acidic amino acids comprising monoaminodicarboxylic acids with isoelectric points of 2.77 to 3.22 and comprising glutamic and aspartic acids, and 4) aromatic amino acids comprising phenylalanine, tyrosine and tryptophan.
It will be understood that the initial separation of the mixture of amino acids from the protein hydrolyzate into groups will not necessarily produce groups of the foregoing composition, although in general the order will be found in which acids are separated by the cation exchanger conforms to their increasing basicity, i.e. the more acidic acids are less strongly adsorbed and tend to pass out of column one, while the more acidic acids Bases are more strongly adsorbed and tend to be retained in the column. After separation of the groups, the separation of the individual acids from a group can be carried out separately, for example by means of a different exchange material.
Ion exchange derivatives of crystallite aggregates are not only useful for the separation of mixtures of amino acids but they are also of great value for the separation of peptides, and also mixtures of proteins, including the various mixtures of proteins described above and also including other mixtures of proteins such as enzymes, muscle extracts, nucleic acids and their degradation products, etc. They are also of value for the purification of mixtures of amino acids, various proteins, nucleic acids, etc.
The present invention is also applicable to the purification of impure organic acids such as the commercial grades in which such acids are frequently supplied. Impure acid fractionation is possible, where lower and higher molecular weight materials, as well as the purified acid itself, can be obtained in defined fractions.
Likewise, mixtures of acids can be separated into their components.
The process according to the invention is characterized in that a solution of this mixture is passed into contact with a derivative insoluble in water of aggregates of cellulose crystallites, said derivative having ion exchange functional groups. , in that at least part of said amino compounds is adsorbed on said derivative, in that said amino compounds are eluted with an eluting solvent to separate the adsorbed amino compounds and in that at least one is recovered fraction containing less amino compounds than said mixture.
In general, the process of splitting or separating into one or more of its components from a food mixture such as a mixture of amino acids or other components containing an amino group, comprises placing a solution of the mixture to be separated on the top of a column packed with suitable materials. The mixture is then eluted through the column using a suitable eluent or solvent. Due to the different degrees of association that may exist between the components of the mixture and the material in the column, the components move down the column at different rates.
A separation is thus carried out and successive fractions of the eluent and of one or more components are collected as they emerge from the lower part of the column.
The choice of eluent will depend on the material of the column and the components of the feed mixture; however, commonly used eluents include chloroform, mixtures of chloroform and methanol, low molecular weight alcohols having 1 to 5 or 6 carbon atoms, mixtures of isopropanol n-butanol and water, water, aqueous acids such as 0.1N HCl and 0.5N HCl, mixtures of isopropanol butanol and 0.1N HCl mixed, mixtures of isopropanol n-butanol and HCl 0 , 5N mixed, mixtures of n-butanol and acetic acid, mixtures of n-butanol acetic acid and water, mixtures of n-butanol, acetic acid, water and 2ethylhexylamine , mixtures of benzene,
citric acid, sodium hydroxide, HCl and water, mixtures of citric acid, acetic acid, sodium hydroxide, sodium acetate and water, mixtures of acid phosphoric acid and sodium hydroxide, mixtures of ethanol and HCl, solutions of dioxane, aqueous salt dimethyl formamide such as 0.1 N NaCl and the like. Two or more eluents can be used.
The pH of the eluent can be a factor in the separation of amino acids, proteins and other mixtures. By changing the pH of the eluent, it may be possible to vary the degree of association of the various components of the feed mixtures with the column material, thereby affecting the rate at which these move down the column. . PH values may be preferred for the efficient separation of mixtures such as proteins and amino acids and these values may be determined for a particular mixture.
When batch separation is desired, the column material can be removed from the column as a wet cylinder and cut into sections, each section corresponding to a web of material plus adsorbed components and the last can then be removed with a suitable solvent. The use of aggregate derivatives in this latter separation method provides an advantage over conventional cellulose derivatives in that the latter, when cut into strips, will cut neatly and cleanly while the compounds Conventionals, being fibrous, do not cut neat or clean but tend to tear. It can be further noted that conventional derivatives tend to give bands along the column having indistinct boundaries due to the fibrous character of the derivatives.
Column material can be regenerated by passing a solvent or regeneration solution through the column which will displace any substances that may still be in the column. The solvent used of course will vary with the substance on the column and the material of the column. By way of example, mention may be made of the regeneration of the column of Example 3 after the purification of lauric acid and using ethanol as eluent. This column can be regenerated by washing with a 0.5N ethanolic hydrochloric acid solution. After regeneration, the regenerating solution can be displaced by the solvent to be used for the eluent in the next step.
In general, suitable regenerating substances include ethanolic HCl, methanol, aqueous sodium chloride solutions, basic alcohol solutions such as 0.1 N ethanolic NaOH, acidic solutions such as HCl. at 0.5 N, chloroform, etc. Other regenerants can be chosen from the above list of eluents. The invention can be illustrated by the following examples.
Example I
A deposit was formed by dispersing a carboxymethyl derivative of aggregates of cellulose crystallites having a degree of substitution of about 0.5 in a solvent comprising one volume of butanol, two volumes of isopropanol and one volume of water. The deposit (which provided a convenient way to place the derivative in the exchange column, although it could also be introduced therein in dry form) was carefully poured over the side of a 62 glass column. cm long having an inner diameter of 1.5 cm. A previously introduced glass stopper supported the derivative in the column. As the solvent flowed from the column, additional amounts of sediment were added to the top.
When the derivative no longer deposited, the solvent was allowed to flow out, taking care to prevent the derivative from drying completely.
A so-called pure commercial grade amino acid mixture was prepared comprising 20 milligrams of d-aspartic acid, 20 grams of dl-alanine and 20 milligrams of l-histidine. The mixture was dissolved in a solvent comprising one volume of butanol, two volumes of isopropanol and one volume of 0.1N hydrochloric acid. The total volume of the solution was 10 milliliters which was added to the top of the column and the whole was allowed to flow through it, taking care to keep the liquid level low. above the upper part of the filling derivatives. After addition of the feed and without exposing the upper part of the packing derivative, the eluting solvent was introduced into the column at the rate of 3 milliliters for 25 minutes.
The solvent had the same composition as that used to make the deposit of the derivative and it served to aid the circulation of amino acids through the column at different rates thus allowing the chromatogram to be made. The column effluent was collected in a 3 milliliter fraction using a normal fraction collector.
Fractions were analyzed as follows. A reagent such as ninhydrin was prepared as a 0.1o solution in citrate buffering. The citrate buffer was made by mixing 200 milliliters of 1N caustic soda with citric acid, enough acid being added to give a pH of 5.0.
Each 3 milliliter fraction was mixed with 1 milliliter of the ninhydrin reagent and the mixture placed in boiling water for 20 minutes. The appearance of a blue color indicated the presence of amino acid, while the absence of color indicated the absence of such an acid. The following qualitative information can be presented in tabular form:
No. of fractions Test results
1- 30 negative
31- 81 blue
82-89 negative
90-119 blue
120-150 negative
151-179 blue
180-200 negative
Referring to the group of numbers 31 to 81, it will be understood that the blue color was less intense in the first fractions of the group, gradually became more intense, then less intense, the middle fraction having the most intense color. This phenomenon was also true for samples 90 to 119 and 151 to 179.
The intensity of the color of a fraction was interpreted as being proportional to the concentration of amino acids therein. The test indicated that fraction numbers 31 to 81 contained d-aspartic acid, fraction numbers 90 to 119 contained dl-alanine and fraction numbers 151 to 179 contained I-histidine.
The foregoing work was repeated using conventional carboxymethyl cellulose as the adsorbent in the column, except that only 10 milligrams of each of the amino acids were used instead of 20 milligrams of each. Such use of a lower level of amino acids would, it was believed, increase the sensitivity of the mixture to the resolving power of the adsorbent. In addition, a faster flow rate was achieved with the conventional derivative, namely 3 millimeters per 5 minutes. However, no separation of amino acids was obtained, the qualitative information of the test is as follows:
No. of fractions Test results
1- 20 negative
21- 39 blue
40-200 negative
It is apparent that the three acids emerged together from the column in numbers 21 to 39.
Example 2
A casein hydrolyzate was subjected to the treatment using the column of the previous example. Pure casein was hydrolyzed by subjecting it to reflux for 6 hours in 150 milliliters of concentrated hydrochloric acid. Casein gave the following analysis: residue after ignition 2.0%; humidity 8.0 0 / o; protein 87.50 / o; nitrogen 13.7 0 / o; reducing sugar was present in trace amounts. The hydrochloric acid used was of the grade known in the United States as C.
P., had a specific gravity of 1.19 and contained 37 to 38 ego of HCl. At the end of the hydrolysis, an aliquot of the resulting hydrolyzate solution was diluted with water so that the final concentration of the aliquot was approximately 4 milligrams of the original casein per milliliter of solution. diluted aliquot. Two milliliters of the diluted aliquot, equivalent to approximately 8 milligrams of the original casein, was taken and used as feed to load into the column.
As indicated, the column from the previous example was used for the separation. The column was first washed with a mixture comprising 1 volume of butanol, two volumes of isopropanol and 1 volume of 0.1 N HCl.
After such washing, the washing liquid was removed from the column by pouring therein a mixture comprising one volume of butanol, two volumes of isopropanol and one volume of water, this step being referred to as column balancing. Then, the casein hydrolyzate or feed substance was added to the top of the column, and when the level matched the top surface of the adsorbent in the column, the eluting solvent was introduced, a such solvent being the same as that used in the previous example. The solvent circulation rate was also the same as in the previous example.
Fractions of 3 milliliters were collected and analyzed for amino acid content by the method described in an article entitled Colorimetric Methods of Analysis by Snell and Snell, 3rd Edition, edited in New York by Van Nostrand Co. ,
Inc., pp 107-108 (1954). This method is a quantitative method in which the intensity of the colors is measured with a spectrophotometer, the intensities thus measured being used to calculate the optical density, as indicated in the preceding reference.
Optical density is a measure of the absorption of light by amino acids. More specifically, it is the negative logarithm of the percentage of transmitted light. By plotting the optical density against the fraction numbers, a curve was obtained having a very sharp and very high point for fraction No 40 (optical density 0.61), the point starting at No 35 and ending at No 57 Fractions Nos. 1 to 34 had zero optical density. The rest of the fractions, Nos. 58 to 231, exhibited a low but gradually increasing optical density, ranging from 0.03 to 0.21.
The optical density information for Nos. 35 to 57 is as follows:
No No of fractions Optical density of fractions Optical density
35 0.03 47 0.28
36 0.15 48 0.24
37 0.31 49 0.22
38 0.46 50 0.17
39 0.57 51 0.15
40 0.61 52 0.10
41 0.52 53 0.09
42 0.46 54 0.05
43 0.41 55 0.04
44 0.38 56 0.02
45 0.31 57 0.01
46 0.30
The material in samples Nos. 35 to 57 mainly contained glutamic acid with some aspartic acid. More specifically, Samples Nos. 35 to 46 mainly contained glutamic acid and Nos. 46 to 57 mainly contained aspartic acid. Fraction # 40 contained about 40% by weight of the amino acid content of the original casein.
Example 3
Two milliliters of impure lauric acid (Eastman's practical grade) in ethanol (0.1 gram of lauric acid per 25 milliliters of ethanol) have
Difference Difference
Index no. Refractive fractions index no. Refractive fractions
1 0 11 0.094
2 0.123 12 0.037
3 0.046 13 0.025
4 0 14 0.018
5 0 15 0.030
6 0.049 16 0.021
7 0.045 17 0
8 0.010 18 0.006
9 0.133 19-30 0
10 0.214
If the foregoing information is plotted on coordinate paper, a curve is obtained showing the variation of the fraction number with the differential refractive index. The first two points of this curve represent impurities comprising organic compounds having less than 12 carbon atoms per molecule. The third point corresponding to fraction No. 10 is the highest and represents pure lauric acid. The next two small dots represent impurities comprising organic compounds having more than 12 carbon atoms.
Example 4
Two milliliters of impure myristic acid (Eastman) in ethanol (0.1 g of myristic acid per 25 milliliters of ethanol) were placed on a packed column (0.8 cm X 30 cm) which had been equilibrated. with ethanol. The column material was the same as that used in Example 3. The sample was eluted with ethanol at a pressure of 2.267 kg per cm2 of nitrogen. The flow rate was 2 milliliters per 5 minutes. Concentrations of the fractions were monitored using a Brice and Phoenix differential refractometer.
Difference Difference
Index no. Refractive fractions index no. Refractive fractions
1 0 19 0.075
2 0 20 0.075
3 0 21 0.075
4 0 22 0.075
5 0.028 23 0.089
6 O 24 0.084
7 0 25 0.072
8 0.046 26 0.079
9 0.022 27 0.039
10 0 28 0.070
11 0.208 29 0.048
12 0.304 30 0.075
13 0.219 31 0.020
14 0.060 32 0
15 0.036 33 0
16 0.067 34 0
17 0.043 35 0
18 0.099
By plotting the above information on coordinate paper, the resulting curve has its highest point corresponding to fraction 12 and represents pure myristic acid. Lower peaks preceding and following the highest peak represent organic impurities containing less than and more than 14 carbon atoms per molecule, respectively.
From a broader perspective, the crystallite aggregate derivatives have useful applications in the separation, recovery and / or purification of mixtures and compositions of various character. Thus they can be used for products such as racemates, lipids, compounds having straight branches and chain branches, rare earths. They also make it possible to recover organic acids such as citric acids, tartaric acids, etc. from wastewater and waste from lemons, as well as purifying such acids and higher molecular weight saturated and unsaturated fatty acids such as linoleic, linolenic, oleic, ricinoleic, stearic, palmitic, etc.
Amino acids can be recovered from food processing residues, enzymes from natural sources, metals from processing baths such as pickling baths and anodic treatments, copper from Cupramonium rayon spinning waste waters, valuable metals such as silver from photographic residue. The invention is also of value in purifying chemical intermediates, tannins, nitrites, hexosephosphates, complex alcohols, higher fatty alcohols, tinctures, etc. Plant pigments can be isolated from natural mixtures thereof. Thus, carotene can be separated from other plant pigments.
Heavy metal impurities such as copper and iron can be removed from wine, and wine otherwise improved with respect to its purity, organoleptics and other qualities. Whiskey can be improved in a similar fashion. The water can be softened or completely deionized.
It will of course be evident that in these operations a cation exchange derivative will be employed to adsorb cationic substances and an anion exchange derivative will be used to adsorb anionic substances. It will also be appreciated that in some of the foregoing applications such as the softening or deionization of water or the demineralization of solutions to free them from mineral impurities or to recover valuable metals, the general process includes: pouring the food mixture, for example a mixture from which impurities are to be removed, into an adsorbent column. The effluent will be the demineralized food product, while mineral or mechanical impurities are retained on the column and can be removed properly.
An interesting experiment can be performed with a mixture of tinctures. Approximately 50 milligrams of each of the following three water-soluble tinctures were mixed in 250 milliliters of water of the color yellow called parakeet No 5, red parakeet No 2 and green parakeet No 1. Two columns were then mounted, one containing conventional carboxymethyl cellulose in fibrous form and the other containing aggregates of carboxymethyl cellulose crystallites in non-fibrous particulate form. The same amount of dye mix was poured to the top of each column at the same time, then simply let down by gravity. After about two hours, both columns were examined.
In the column containing the conventional cellulose derivative, the lowermost part of the column, being about 1/5 the length, was not wet. Immediately at. above this there was a yellow band comprising 2/5 of the column, and above this there was a green band also comprising about 2/5 of the column. In the column containing the aggregate derivative, the lowest part of the column, about 1/5 the length, was not wetted.
Above this there was a wide blue band comprising about 1/5 of the column. Above the latter, there were three narrow bands of light green, reddish brown, and light green, respectively. Above the last mentioned band there was a wide light blue band comprising about 1/5 of the column, and finally at the top of the column there was a green band of quite substantial width. It was apparent that the aggregate derivative was able to separate the color mixture into a larger number of components; moreover, this derivative did not exhibit the phenomenon of channeling and the bands were clearly defined, whereas the classical cellulose derivative exhibited the formation of channels and delimited the bands indistinctly.
As indicated above, although the use of cellulose crystallite aggregate derivatives having ion exchange properties is preferred, there are other crystallite aggregate derivatives which, although not preferable. Not feeling an ion exchange action due to the lack of ionizing groups, are nevertheless of value as adsorbents for the separation, purification, recovery or otherwise processing of the food mixtures described above. These latter derivatives are effective by the operation of adsorption of hydrogen bonding and / or Van de Waals forces and are also prepared according to the process described in the Swiss patent.
No 426757.
Any of the derivatives described herein of cellulose crystallite aggregates can be subjected to attrition in the presence of water to form a gel, and as such it is suitable for use in gel electrophoresis to purify compounds. impure, to recover desired compounds, and the like.
Another advantage of the ion exchange type aggregate derivatives is that the exchangeable ions are more accessible than in the case of conventional cellulose derivative materials and the resin type. In resin-type materials, the exchanger is not usually a long polymer chain but rather a three-dimensional lattice polymer having many exchangeable ions placed in such a way in the amorphous interior medium that they are inaccessible to humans. exchange ions and eluting medium. And in conventional cellulose derivatives, the presence of ionizable groups inside the amorphous or matrix regions tends to make them accessible. In the results, the aggregate derivatives, due to the greater accessibility of their ionizable groups placed on the surface, tend to give a higher exchange rate.
Another consideration is the tendency of some conventional materials to swell during use, and it should be noted that aggregate derivatives swell much less in water than conventional cellulose derivatives. Perhaps more significant is the fact that the swelling of the latter derivatives is difficult if not impossible to control, a factor considered to be related to the presence of amorphous regions in the molecular chains of the derivatives. The objection to swelling is that if swelling is sufficiently severe, undesirable resistance to the feed or eluent flow develops. When swelling is difficult to control, it is obvious that flow resistance can become a serious factor.
Unlike resin-type material, aggregate derivatives are inert to a large number of solvents and thus provide a wide range of eluents and also regenerants that can be employed.
Being less subject to attack, the derivatives are more easily regenerated than the resin type materials.
In addition, due to the lack of amorphous regions, they can be regenerated using a much wider variety of agents than conventional cellulose derivatives. The latter, due to the presence of amorphous areas, are subject to attack by acid regenerants.
Of particular interest is the fact that the aggregate derivatives have a hydrophilic character. This is apparent because the aggregates of cellulose crystallites from which the derivatives are prepared contain a high number of hydroxyl groups, at least some of which survive the conversion of the aggregates to derivatives. Due to their hydrophilic character, the derivatives are of particular value for separating food mixtures whose components contain amino groups.
As used herein, the term adsorbent is intended to denote both derivatives of ionizable groups and those which do not have such groups.
The terms liquid mixture or fluid mixture are intended to cover separable food mixtures which are in the liquid or liquefied state or in the fluid state and include solutions, colloidal solutions, colloidal suspensions and deposits. These terms also include molten mixtures if such mixtures are not liquid at normal temperatures. Colloidal suspensions can include proteins, polypeptides, etc. In addition, some liquid food mixtures can be introduced into a separation column without first being converted into a solution using a solvent.