Utilisation d'agrégats de cristallites de cellulose comme adsorbants en chromatographie
La présente invention concerne la chromatogra phie à colonne et particulièrement t elle se rapporte à un matériau adsorbant perfectionné destiné à être utilisé dans ladite colonne.
Comme il est bien connu, la chromatographie à colonne lest d'application générale dans des procédés tels que la séparation de mélanges, la purification des substances, la concentration de matériaux à partir de solutions et pour Ides buts analogues. Par exemple, dans le cas d'un mélange qui doit être dissous dans un solvant et la solution résultante introduite dans la colonne, le solvant passant à travers la colonne et laissant une quantité du mélange dans la partie supérieure. Alors, la colonne est lavée avec plusieurs parties d'un solvant ou éluant de façon à produire le chromatogramme; en d'autres mots, l'effet, des addi tions de solvant est Ide ! déplacer le mélange ou plutôt ses constituants vers le bas de la colonne.
Le taux de déplacement à travers la colonne est spécifique pour chaque constituant; il est évidemment désirable que les taux soient aussi différents que possible les uns des autres comme c'est sur cette base qu'une séparation des constituants peut être effectuée.
De préférence, les additions de solvant sont faites de façon continue plutôt que par lots séparés et les effluents de la colonne sont collectés dans une série de récipients, ou fractions, chaque fraction étant collectée pendant une période de temps définie, puis étant remplacée par un récipient suivant.
Les constituants qui forment le mélange seront alors séparés dans les diverses fractions en admixtion avec le solvant. Ainsi un constituant peut être présent dans une ou une pluralité de fractions successives, un autre constituant peut être trouvé dans le groupe suivant de fractions qui peut comprendre une ou une pluralité de fractions successives et ainsi de suite. Les constituants peuvent être recouvrés simplement en éliminant le solvent par évaporation.
I1 apparaît que la séparation du mélange en ses constituants dépend de plusieurs conditions dont une des plus importantes est le matériau adsorbant utilisé dans la colonne. L'invention a pour objet l'utilisation comme adsorbant dans la chromatographie à colonne d'agrégats de cristallites de cellulose obtenus par hydrolyse acide incomplête de la cellulose ces agrégats se présentant sousforme de particules à structure non fibreuse et d'un degré de polymérisation uniforme compris entre 15 et 375 unités d'anhydroglucose. Les agrégats sont obtenus par l'hydrolyse acide de la cellulose au cours de laquelle il se forme une partie soluble dans l'acide et une partie insoluble dans l'acide.
Cette dernière partie comprend un résidu cristallin ou reste; celui-ci est lavé et recouvré et est désigné sous le nom d'agrégats de cristallites de cellulose cu de cellulose d'un degré de polymérisation uniforme ou plus simplement cellulose D. P.
Parmi d'autres avantages, les agrégats de cristallites de cellulose présentent une capacité unique pour absorber et adsorber des composés chimiques. Il est particulièrement intéressant que les agrégats de cristallites possèdent la propriété d'adsorber sélectivement des matériaux hydrophobiques ou des matières oléagineuses. A ce sujet, il est important de noter la présence de nombreuses petites craquelures et fissures sur les surfaces des agrégats de cristallites.
Les agrégats sont en général d'une pureté élevée en raison de laquelle ils sont remarquablement libres de toute tendance pour contaminer des matériaux mis en contact avec eux, particulièrement des produits bio-chimiques délicats tels que les enzymes. Un autre avan tage des agrégats réside dans le fait que leur dimension de particules peut être contrôlée ainsi que la distribution de ! dimension de particules, c'est-à-dire que la dimension de particules et la distribution des dimensions de particules sont reproductibles d'un lot à un autre et elles peuvent être variées à volonté dans des gammes étendues de dimensions et de distribution de dimensions.
La préparation des agrégats de cristallites par l'hydrolyse acide et la nature des agrégats a été décrite en détail dans le brevet suisse No. 395 045.
On peut observer que le terme cristallites tel qu'utilisé ici désigne un amas disposé longitudinalement de chaînes de cellulose ou de molécules réunies étroitement, et que des agrégats sont constitués par des amas de cristallites. Les agrégats peuvent aussi être considérés comme comprenant des groupes droits, rigides, relativement non susceptibles d'être tordus et constitués par des chaînes linéaires. Comme indiqué par des essais de diffraction aux rayons X, les cristallites et les agrégats de cristallites possèdent une figure de diffraction nette, ce qui indique une structure sensiblement cristalline.
Bien que les chaînes de cristallites soient de longueur très uniforme, particulièrement en comparaison avec les chaînes de cellulose d'origine à proprement parler, elles présentent quelques variations et, pour cette raison, on préfère parler de longueur moyenne ou de valeur moyenne du degré de polymérisation uniforme.
Le procédé d'hydrolyse mentionné ci-dessus permet d'obtenir des agrégats de cristallites dans lesquels aucune chaîne constituante n'est connectée à une chaîne dans un agrégat voisin; au contraire, toutes les chaînes dans un agrégat sont séparées et libres de celles existant dans les agrégats voisins.
Les agrégats de cristallites de cellulose ou cellulose d'un degré polymérisation uniforme D. P. convenant pour être utilisés dans la mise en oeuvre de la présente invention sont caractérisés par un niveau moyen D. P. de 15 à 375.
En même temps que les propriétés de D. P. qui précèdent, les agrégats de cristallites ont une pureté chimique très élevée, le matériau comprenant au moins 95 O/o et préférablement au moins 97 O/o à 99 O/o de polyglucose ou d'unités anhydroglucose, sur la base d'une analyse chromatographique.
En fonction du contenu en cendres, les agrégats contiennent préférablement moins de 100 parties par million (p.p.m.) bien que le contenu en cendres puisse aller d'environ 10 jusqu'à environ 400, 500 ou 600 p.p.m. A titre de comparaison, la cellulose fibreuse classique peut avoir 1000 à 4000 p.p.m. de cendres.
Les agrégats Ide cristallites de cellulose sont généralement utiles dans les procédés de séparation basés sur l'adsorption chromatographique. Non seulement le mélange peut être résolu en ses constituants, mais une substance peut être séparée d'une autre ou d'une pluralité de substances et, de façon analogue, deux ou un plus grand nombre de substances peuvent être séparées d'une ou d'une pluralité d'autres substances.
Les exemples qui suivent peuvent illustrer la mise en oeuvre des cristallites pour la séparation d'un mélange en ses composants.
Exemple I
Un dépôt a été formé en dispersant des agrégats de cristallites de cellulose dans un solvant préparé au moyen d' 1 volume de butanol, de 2 volumes d'isopropanol et 1 volume de 1N HC1. Les agrégats avaient un degré de polymérisation uniforme. D. P. de 220, une pureté supérieure à 96 O/o, un contenu en himidité d'environ 5 O/o et une dimension de particules dans une gamme d'ensemble allant de moins de 1 jusqu'à 250 microns dont environ 10 O/o avaient une dimension au-dessous de 44 microns, environ 40 O/o avaient une dimension dans la gamme de 44 à 74 microns et 40 à 50 O/o avaient une dimension supérieure à 74 microns.
Le dépôt (qui fournissait un moyen convenable pour placer les agrégats dans la colonne bien que ceux-ci pouvaient aussi être introduits sous forme sèche) a été versé soigneusement le long du bord d'une colonne de verre de 46 cm de longueur et ayant un diamètre intérieur de 2,5 cm, des mesures étant prises pour ne pas produire de poche d'air dans le produit. Un disque de verre fritté précédemment introduit supportait les agrégats dans la colonne. Comme le solvant t s'écoulait de la co- lonne, des quantités additionnelles ont été ajoutées à la partie supérieure de la colonne de façon à maintenir un excès de solvant à la partie supérieure de la colonne. Lorsque les agrégats ne se déposaient plus, on a laissé le solvant s'écouler.
Ensuite, un mélange d'amino-acides a été préparé et il comprenait 100 mg. de chacun des acides: aspartique, histidine et cystéine. Ceux-ci ont été dissous dans l'eau et la solution résultante a été complétée pour fournir un volume de 100 ml. Cette solution a été désignée sous le nom de solution mère. Environ 30 ml d'une telle solution mère ont été ajoutés à la partie supérieure de la colonne et, en même temps un collecteur automatique de fractions, contenant 50 tubes à essai de 10 ml a été placé en position au bas de la colonne pour recevoir les effluents. Toute la solution mère a été ajoutée à la colonne sous forme de parties de 30 ml, après quoi on a laissé le solvant butanol-isopropanol-HCl s'écouler de façon continue à la partie supérieure de la colonne et passer à travers celle-ci.
Le solvant ne dissolvait pas les amino-acides dans les conditions employées mais servait à ajouter leur écoulement à travers la colonne à des taux différents, produisant ainsi le chromatogramme.
Après 4 à 5 heures, tous les échantillons ont été recueillis, puis un essai au point de Feigl a été fait pour déterminer l'efficacité Ide séparation des amino-acides. Du papier filtre Whatman no. 1 a été aspergé avec une solution à 2 oxo de ninhydrine (hydrate de tricéto-hydrindène) et le papier a été séché au four à 1050 C pendant 5 minutes. Deux gouttes de chaque fraction ont été déposées sur le papier séché dans l'ordre numérique sur une série de parties espa cées, après quoi le papier a été séché de nouveau au four à 105 C pendant 5 minutes. I1 a été découvert que le premier amino-acide émerge ordinairement de la colonne après qu'un certain nombre de tubes à essai ont été recueillis.
Chacun des amino-acides donnait une couleur distinctive sur le filtre de papier
Whatman, les couleurs étant bien espacées les unes des autres le long du papier. Ainsi qu'il sera bien compris, des couleurs se développent par réaction entre l'acide ninhydrine et l'amino-acide. Les tubes à essai contenant les amino-acides ont été mis de côté et leur contenu analysé en ce qui concerne l'azote avec les résultats suivants:
No deéchanfflion imo-; aoide Azote en
suivant tle test
par Ipoint
6 Aspartique 0,06
25 Histidine 0,05
35 Cystéine 0,04
Etalon aucun 0,00
Le réactif ninhydrine a été préparé en dissolvant 2 g de celui-ci dans 50 ml d'eau, puis en ajoutant à la solution résultante un mélange de 80 mg de chlorure stanneux dans 50 ml d'eau.
On a laissé le mélange reposer dans le noir pendant 24 heures, après quoi le précipité a été enlevé par filtrage, laissant la solution mère de ninhydrine.
Exemple Il
De la pulpe de bois séchée à l'air en une quantité de 0,3 g a été hydrolysée en sucres, au moyen d'acide sulfurique conformément à la procédure classique décrite dans le manuel des méthodes chromatographiques Analyses des pulpes purifiées par chromatographie quantitatives (25 mars 1957) par J. F. Saeman, du Laboratoire des Produits Forestiers du département de l'Agriculture des Etats-Unis d'Amérique à Madison 5, Wisconsin. Après neutralisation et concentration on obtenait 15 ml d'une solution aqueuse de sucre, dont le contenu en sucre était le suivant: 95,66 O/o en poids de glucose, 2,86 O/o de mannose, et 1,48 O/o de xylose.
Une colonne d'agrégats de cristallites de cellulose a été préparée en utilisant les agrégats et le procédé décrits dans l'exemple I, à l'exception du fait que les agrégats avaient une dimension de particules dans la gamme de 40 à 250 ou 300 microns. La solution de sucres a été versée dans la partie supérieure de la colonne et on l'a laissée s'écouler vers le bas de celle-ci alors qu'un peu de la solution de sucres était encore présente aux environs du niveau de la substance adsorbante; plusieurs parties ! d'un éluant ont été ajoutées comprenant un mélange dans le rapport 9:1:1 (rapport de volumes) acétate éthylique, d'acide acétique et d'eau. Après quoi, l'éluant a été laissé s'écouler de façon continue dans la colonne. Un total de 45 fractions de 10 ml a été recueilli.
Le sucre a été détecté dans les fractions 13, 14 et 15 au moyen de l'essai classique au point de Vogel. La 14ème fraction a été évaporée jusqu'à environ 1 ml et le xylène a été identifié par le test classique de chromatographie au papier pour l'identification quantitative des sucres, comme décrit dans la référence Saeman mentionnée ci-dessus. Aucune autre des 45 fractions n'a été trouvée contenir un sucre quelconque; il est ainsi apparent que le glucose et le mannose ont été retenus dans la colonne, comme il est aussi apparent que la colonne avait séparé le sucre présent dans la plus faible concentration des deux autres.
Exemple 111
Les colonnes suivantes de matériau adsorbant ont été préparées: (1) les agrégats de cristallites de cellulose du type employé dans l'exemple I, (2) des agrégats de cristallites de cellulose du type employé dans l'exemple I excepté que ces agrégats avaient une dimension moindre que 44 microns, (3) un matériau adsorbant du commerce comprenant de la cellulose fibreuse classique qui avait été moulue jusqu'à une dimension moyenne de particules qui était plus grande que ce qui passe à travers un tamis à 200 mailles par unité de 2,5 cm et qui avait un contenu en humidité compris dans la gamme de 6 à 7 O/o en poids, (4) un adsorbant utilisé commercialement,
compre nant t des fibres d'acétate de cellulose classique dont le diamètre correspondait avec celui d'une fibre acétate de 8 derniers par filament (environ 30 microns de diamètre). Alors, un mélange a été fait en ajoutant environ 0,5 g d'encre noire soluble dans l'huile à 100 g d'huile de graine de coton. Le mélange d'huile soluble et d'encre noire a été ajouté à la partie supérieure de chacune des quatre colonnes et on l'a laissé se déplacer vers le bas sous l'influence de la pesanteur. 1 ml du mélange a été ajouté à chacune des colonnes excepté à la colonne (1) qui présentait une pénétration de mélange tellement lente que seulement 0,1 mi pouvait être ajouté initialement.
Cependant, après environ 1 h 2/4, un total de 0,8 ml a été ajouté à la colonne (1). Pendant que le test progressait, il devent évident que la colonne (1) présentait le mouvement vers le bas de beaucoup le plus lent du mélange d'huile; ce fait a été attribué à l'adsorption très élevée du mélange sur le matériau adsorbant. La colonne (1) présentait aussi le paroi de séparation la plus uniforme des composants du mélange, car on constatait la présence d'un certain nombre de bandes allant du gris léger au fond de la colonne au noir à la partie supérieure de la colonne. La colonne (2) présentait la pénétration la plus rapide par le mélange huileux et ce, par rapport au cas présenté par la colonne (1), et la séparation en bandes était tout à fait uniforme.
Dans le cas de la colonne (3) et de la colonne (4), la division se présentait et l'efficacité de séparation était jugée comme étant nettement inférieure à celle observée avec l'une ou l'autre des colonnes (1) ou (2).
Exemple IV
Trois colonnes de matériau adsorbant ont été préparées, les colonnes no. 1 et 2 étaient les mêmes que les colonnes no. 1 et 2 de l'exemple précédent, et la colonne no. 5 comprenait de la cellulose fibreuse classique qui était la même que celle de la colonne no. 3 de l'exemple précédent excepté que le produit avait été moulu pour passer à travers un tamis de 325 mailles par unité de 2,5 cm. Une encre à écrire bleue du commerce a été ajoutée à la partie supérieure de chaque colonne en quantité égale et on a laissé la percolation se produire à travers celle-ci pendant environ 72 heures. Après examen, les colonnes no. 1 et 2 montraient toutes les deux la séparation des composants de l'encre, un certain nombre de bandes allant du bleu léger à la partie inférieure de la colonne à un bleu foncé à la partie supérieure étant présentes.
Les échantillons no. 1 et 2 présentaient des bords très nets entre les différentes bandes et ils ne présentaient aucune évidence de formation de canaux. La colonne no. 3 présentait une formation, de canaux marquée et, bien qu'il y avait une légère séparation de l'encre en bandes, elle n'était pas nettement définie et les bords entre les bandes n'étaient pas nets, une partie de chaque bande s'étendant dans les bandes au-dessus et au-dessous d'elles.
Exemple V
Les quatre colonnes suivantes de matériau adsorbant ont été préparées: la colonne no. 6 comprenait la même substance que la colonne no. 1 de l'exemple précédent excepté qu'elle avait subi un lavage à l'éthanol et avait été séchée à l'air. Le no. 7 était le même que le no. 1 excepté qu'elle comprenait des particules qui ne passaient pas à travers un tamis à 200 mailles par unité de 2,5 cm, en d'autres mots, les particules avaient une dimension de 74 microns ou plus allant jusqu'à 250 microns.
La colonne no. 8 était la même que la colonne no. 1, excepté qu'elle comprenait des dimensions de particules qui passaient à travers un tamis de 200 mailles par unité de 2,5 cm; c'est-à-dire une dimension de particules auaessous de 74 microns et la colonne no. 9, qui était faite au moyen de la cellulose fibreuse classique de la colonne no. 3, avait une dimension de particules supérieure à 200 mailles par unité de 2,5 cm.
Alors, 4 ml de la teinture colorante rouge de Burnett pour aliments ont été pris et dilués dans l'eau pour former un volume de 20 moi; de façon analogue, 4ml de chaque teinture jaune et bleue de Burnett ont été pris et dilués, chacune pour former un volume de 20 ml; les trois teintures diluées ont été mélangées pour former un total de 100 ml constituant un mélange composite des teintures. 20 ml du mélange ont été ajoutées à la partie supérieure de chaque colonne. Après 96 heures, les colonnes no. 6, 7 et 8 présentaient le mélange de teintures séparé en bande inférieure bleue, une bande verte au-dessus de la bande bleue et une bande brunâtre au-dessus de la bande verte.
La colonne 6 présentait aussi une bande rougeâtre audessus de la bande brune et une bande encore plus foncée au-dessus du rouge; il était clair que les teintures jaune et bleue d'origine s'étaient combinées pour former la bande verte; des canaux se formaient dans la colonne no. 9 et bien qu'une séparation des couleurs se produisait, l'efficacité de séparation était inférieure à celle des autres colonnes, les bords entre les bandes étaient moins distincts.
Exemple Vl
Environ 0,5 O/o en poids d'une solution de teinture jaune soluble dans l'huile, à savoir la teinture jaune no. 6 connue aux Etats-Unis sous la marque P ara- keeta dans de Huile de graine de coton a été préparée, et la solution jaune résultante a été versée dans la partie supérieure d'une colonne contenant des agrégats de cristallites du type utilisé dans la colonne no. 1 de l'exemple I. Après que la solution a passé dans la colonne, deux bandes étaient apparentes, à savoir une bande inférieure très large ayant sensiblement la couleur de l'huile de graine de coton et une bande jaune supérieure plus étroite dans laquelle la teinture jaune s'est concentrée.
La séparation entre les deux bandes apparaissait tout à fait nette et com plète; il était clair d'après la simple observation visuelle que les agrégats avaient adsorbé l'huile de la teinture, cette dernière fut soluble dans l'huile, ou pour dire cela d'une autre maniére, les agrégats s'étaient montrés efficaces pour décolorer l'huile.
Exemple Vll
Les colonnes suivantes de matériau adsorbant ont été préparées; trois colonnes des agrégats de cristallites utilisés dans la colonne no. 1, une colonne des agrégats utilisés dans la colonne no. 2, une colonne de fibres de cellulose classique moulue utilisée dans la colonne no. 3 et une colonne identifiée ici comme étant la colonne no. 10 qui contenait un gel de silice comprenant des particules qui étaient retenues sur un tamis à 200 mailles par unité de 2,5 cm. Un mélange aqueux de teinture de Burnett pour légumes, soluble dans l'eau comprenant du vert Parakeet, du jaune et du rouge, a été préparé et versé à la partie supérieure de chacune des colonnes. La concentration de chacune des trois teintures dans la solution aqueuse était d'environ 0,5 O/o en poids.
Après que la solution de teinture ait été soumise à percolation dans chaque colonne, les bandes suivantes ont été abservées dans le cas des quatre colonnes contenant des agrégats de cristallites: la bande la plus basse était jaune et étroite; sur celle-ci se trouvait une bande légèrement plus large de couleur rouge et au-dessus du rouge se trouvait une bande rose ayant approximativement la même largeur; au-dessus de la bande rose se trouvait une très large bande grisXvert, puis on trouvait une très large bande vert foncé et à la partie supérieure il y avait une bande étroite noire. La séparation entre les bandes qui précèdent était tout à fait nette.
Par contraste, les colonnes contenant de la cellulose fibreuse classique et du gel de silice présentaient très peu de séparation des teintures dans les bandes distinctes et la formation de canaux était présente.
Dans d'autres procédés préférés, au lieu d'enlever les matériaux adsorbés de la colonne en faisant s'écouler un solvant ou un éluant à travers celle-ci, chaque bande ou zone de matériau adsorbé et l'adsorbant pouvaient être séparément enlevés de la colonne dans l'ordre et le matériau adsorbé recouvré à partir de celle-ci au moyen d'un solvant convenable, les solutions résultantes étant filtrées pour enlever l'adsorbant solide et le solvant était éliminé par évaporation laissant la substance séparée. A titre de variante, l'adsorbant avec le matériau adsorbeé peut être enlevé de la colonne sous la forme d'un cylindre humide et coupé en sections, chaque section correspondant à une bande d'adsorbant plus le matériau adsorbé et ce dernier peut alors être enlevé au moyen d'un solvant, comme il a été décrit.
A titre d'illustration des autres procédés de séparation qui sont envisagés, il y a l'isolement des hormones telles que le stilbestrol à partir des sources naturelles en contenant; la séparation des acides gras non saturés, comme ceux-ci se présentent, soit dans l'huile de maïs, soit dans l'huile de graine de coton, à partir des acides gras saturés, par exemple, de l'acide stéarique, peut être séparé à partir de l'acide oléique, ou la séparation des acides gras individuels non saturés les uns des autres. La séparation des amino-acides, qu'ils soient contenus dans divers mélanges naturels ou produits par la dégradation de la caséine, du collagène, de la gélatine et d'autres matériaux à base de protéine, telle qu'au moyen de l'hydrolyse avec un acide dilué ou des enzymes protéolytiques. a une importance particulière.
D'autres séparations comprennent celle des alcaloïdes à partir des plantes, des teintures à partir des sources naturelles, et les unes des autres, des stérols et des composés associés à partir des produits naturels, la séparation des isotopes. Le sang peut être séparé au moins en certains de ses constituants. I1 est également envisagé de recouvrer des vitamines à partir de mélanges naturels dans lesquels elles sont présentes, ainsi par exemple, un tel mélange après un traitement préliminaire approprié peut être dissous par exemple dans de l'éther de pétrole versé dans la colonne; après quoi l'éther de pétrole ou le méthanol, ou d'autres solvants convenables peuvent être utilisés pour éluer la vitamine.
En général, la vitamine A peut être recouvrée dans les foies des animaux, la vitamine D dans les huiles de foie de poisson, les tocophérols à partir d'huile de germes de céréales, la vitamine B2 à partir de produits laitiers, etc. Les vitamines peuvent non seulement être isolées, mais aussi purifiées comme peuvent l'être les produits chimiques en général. Les agrégats de cristallites de cellulose sont encore convenables pour désodoriser ou pour décolorer de nombreux produits commerciaux, y compris des aliments et des ingrédients pour aliments.
I1 sera bien compris que les diverses séparations sont produites par le fonctionnement du mécanisme de l'adsorption et/ou l'absorption qui, pour la convenance, peut être désigné ici sous le nom d'action de sorption > ou de mécanisme de solution, et qui évidemment dépendent des solvants et des éluants employés. En général, il est ordinairement avantageux que le mélange à résoudre en ses constituants soit dissous dans un hydrocarbure saturé tel que l'hexane, l'heptane, l'éther de pétrole, et substances analogues. D'autres solvants sont les hydrocarbures cycliques tels que le cyclohexane, et les esters d'hydrocarbures aromatiques, des hydrocarbures chlorurés, des alcools, des acides et des bases.
Les constituants du mélange résolu Idoivent être aisément solubles dans l'éluant utilisé. Ce dernier évidemment ne doit pas réagir avec les agrégats de cristallites ou les constituants du mélange. D'une façon générale, des éluants convenables sont des alcools, des éthers, des hydrocarbures chlorurés et des hydrocarbures aromatiques. En général aussi, des liquides plus polaires que les constituants adsorbés déplaceront ces derniers dans les agrégats de cristallites. Préférablement, l'éluant comprend un mélange d'au moins deux solvants de puissance variable pour les matériaux adsorbés, au moins un des solvants étant plus pauvre que l'autre, c'est-à-dire qu'il a moins de puissance de solvant pour les matériaux adsorbés que les autres.
Bien que la description qui précède se réfère à la séparation de solutions, il sera bien compris que celles-ci peuvent comprendre soit de véritables solutions ou des solution colloïdales ou des dispersions qui ne présentent pas des matières en particules lorsqu'on les examine au microscope, le terme matière en particules se rapporte à la présence de particules séparées dans la solution. D'une façon plus large, l'invention est aussi applicable aux dispersions colloïdales qui présentent des matières en particules au microscope et è la séparation des émulsions, que celles-ci soient stables ou non.
n apparaîtra clairement à l'homme de l'art que l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation décrits, mais qu'elle est susceptible de nombreuses variantes et modifications suivant les conditions diverses de mise en oeuvre rencontrées dans la pratique.
I1 demeure d'autre part entendu que l'invention ne s'applique pas à la séparation de substances destinées à des usages thérapeutiques.
Use of cellulose crystallite aggregates as adsorbents in chromatography
The present invention relates to column chromatography and particularly to it relates to an improved adsorbent material intended for use in said column.
As is well known, ballast column chromatography is of general application in processes such as separation of mixtures, purification of substances, concentration of materials from solutions and for the like purposes. For example, in the case of a mixture which is to be dissolved in a solvent and the resulting solution introduced into the column, the solvent passing through the column and leaving a quantity of the mixture at the top. Then, the column is washed with several parts of a solvent or eluent so as to produce the chromatogram; in other words, the effect of solvent additions is good! move the mixture or rather its constituents to the bottom of the column.
The rate of displacement through the column is specific for each component; it is obviously desirable that the levels be as different as possible from each other as it is on this basis that a separation of the constituents can be effected.
Preferably, the solvent additions are made continuously rather than in separate batches and the column effluents are collected in a series of vessels, or fractions, each fraction being collected for a defined period of time, and then being replaced by a next container.
The constituents which form the mixture will then be separated in the various fractions in admixture with the solvent. Thus one component can be present in one or a plurality of successive fractions, another component can be found in the next group of fractions which can include one or a plurality of successive fractions and so on. The constituents can be recovered simply by removing the solvent by evaporation.
It appears that the separation of the mixture into its constituents depends on several conditions, one of the most important of which is the adsorbent material used in the column. The invention relates to the use as an adsorbent in column chromatography of aggregates of cellulose crystallites obtained by incomplete acid hydrolysis of cellulose, these aggregates being in the form of particles with a non-fibrous structure and of a uniform degree of polymerization. between 15 and 375 anhydroglucose units. The aggregates are obtained by the acid hydrolysis of cellulose during which a part soluble in acid and a part insoluble in acid is formed.
This latter part comprises a crystalline residue or remains; this is washed and recovered and is referred to as aggregates of cellulose or cellulose crystallites of a uniform degree of polymerization or more simply cellulose D. P.
Among other advantages, cellulose crystallite aggregates exhibit a unique ability to absorb and adsorb chemical compounds. It is of particular interest that the crystallite aggregates possess the property of selectively adsorbing hydrophobic materials or oleaginous materials. In this regard, it is important to note the presence of numerous small cracks and cracks on the surfaces of the crystallite aggregates.
Aggregates are generally of high purity due to which they are remarkably free of any tendency to contaminate materials contacted with them, particularly delicate biochemicals such as enzymes. Another advantage of aggregates is that their particle size can be controlled as well as the distribution of! particle size, that is, the particle size and particle size distribution are reproducible from batch to batch and can be varied at will over wide ranges of size and size distribution .
The preparation of crystallite aggregates by acid hydrolysis and the nature of the aggregates has been described in detail in Swiss Patent No. 395,045.
It can be seen that the term crystallites as used herein denotes a longitudinally arranged cluster of closely joined cellulose chains or molecules, and that aggregates are formed by clusters of crystallites. Aggregates can also be thought of as comprising groups that are straight, rigid, relatively non-twistable and formed by linear chains. As indicated by X-ray diffraction tests, crystallites and aggregates of crystallites exhibit a sharp diffraction pattern, indicating a substantially crystalline structure.
Although the crystallite chains are very uniform in length, especially in comparison with the original cellulose chains themselves, they exhibit some variation and, for this reason, it is preferred to speak of average length or average value of the degree of uniform polymerization.
The hydrolysis process mentioned above makes it possible to obtain aggregates of crystallites in which no constituent chain is connected to a chain in a neighboring aggregate; on the contrary, all the chains in an aggregate are separate and free from those existing in neighboring aggregates.
Cellulose or cellulose crystallite aggregates of a uniform degree of polymerization D. P. suitable for use in the practice of the present invention are characterized by an average D. P. level of 15 to 375.
Along with the above DP properties, the crystallite aggregates have a very high chemical purity, the material comprising at least 95 O / o and preferably at least 97 O / o to 99 O / o of polyglucose or units. anhydroglucose, based on chromatographic analysis.
Depending on the ash content, the aggregates preferably contain less than 100 parts per million (ppm) although the ash content can range from about 10 up to about 400, 500 or 600 ppm By comparison, fibrous cellulose conventional can have 1000 to 4000 ppm of ash.
Cellulose crystallite aggregates are generally useful in separation processes based on chromatographic adsorption. Not only can the mixture be resolved into its constituents, but one substance can be separated from another or a plurality of substances and, analogously, two or more substances can be separated from one or more. 'a variety of other substances.
The examples which follow can illustrate the use of crystallites for the separation of a mixture into its components.
Example I
A deposit was formed by dispersing aggregates of cellulose crystallites in a solvent prepared using 1 volume of butanol, 2 volumes of isopropanol and 1 volume of 1N HCl. The aggregates had a uniform degree of polymerization. DP of 220, a purity greater than 96 O / o, a moisture content of about 5 O / o and a particle size in an overall range from less than 1 up to 250 microns of which about 10 O / o had a size below 44 microns, about 40 O / o had a size in the range of 44 to 74 microns, and 40 to 50 O / o had a size greater than 74 microns.
The deposit (which provided a suitable means for placing the aggregates in the column although these could also be introduced in dry form) was poured carefully along the edge of a glass column 46 cm long and having a internal diameter of 2.5 cm, measures being taken not to produce an air pocket in the product. A previously introduced sintered glass disc supported the aggregates in the column. As the solvent t flowed out of the column, additional amounts were added to the top of the column so as to maintain an excess of solvent at the top of the column. When the aggregates no longer settled, the solvent was allowed to drain.
Then a mixture of amino acids was prepared and it included 100 mg. of each of the acids: aspartic, histidine and cysteine. These were dissolved in water and the resulting solution was made up to provide a volume of 100 ml. This solution has been referred to as the stock solution. About 30 ml of such stock solution was added to the top of the column and at the same time an automatic fraction collector, containing 50 10 ml test tubes was placed in position at the bottom of the column to receive effluents. All of the stock solution was added to the column as 30 ml portions, after which the butanol-isopropanol-HCl solvent was allowed to flow continuously to the top of the column and pass through it. .
The solvent did not dissolve the amino acids under the conditions employed but served to add their flow through the column at different rates, thereby producing the chromatogram.
After 4 to 5 hours, all samples were collected, then a Feigl point test was done to determine the efficiency of amino acid separation. Whatman filter paper no. 1 was sprayed with a 2-oxo solution of ninhydrin (triketo-hydrindene hydrate) and the paper was oven dried at 1050 C for 5 minutes. Two drops of each fraction were placed on the dried paper in numerical order on a series of spaced parts, after which the paper was again oven dried at 105 ° C for 5 minutes. It has been found that the first amino acid usually emerges from the column after a number of test tubes have been collected.
Each of the amino acids gave a distinctive color on the paper filter
Whatman, the colors being well spaced from each other along the paper. As will be understood, colors develop by reaction between ninhydrin acid and amino acid. The test tubes containing the amino acids were set aside and their contents analyzed for nitrogen with the following results:
No deéchanfflion imo-; nitrogen aid
following the test
by Ipoint
6 Aspartic 0.06
25 Histidine 0.05
35 Cysteine 0.04
Standard none 0.00
The ninhydrin reagent was prepared by dissolving 2 g thereof in 50 ml of water, then adding to the resulting solution a mixture of 80 mg of stannous chloride in 50 ml of water.
The mixture was left to stand in the dark for 24 hours, after which the precipitate was filtered off, leaving the stock ninhydrin solution.
Example It
Air-dried wood pulp in an amount of 0.3 g was hydrolyzed to sugars, using sulfuric acid according to the standard procedure described in the manual of chromatographic methods Analyzes of purified pulps by quantitative chromatography (25 March 1957) by JF Saeman, Forest Products Laboratory, United States Department of Agriculture, Madison 5, Wisconsin. After neutralization and concentration, 15 ml of an aqueous sugar solution were obtained, the sugar content of which was as follows: 95.66 O / o by weight of glucose, 2.86 O / o of mannose, and 1.48 O / o xylose.
A column of cellulose crystallite aggregates was prepared using the aggregates and method described in Example I, except that the aggregates had a particle size in the range of 40 to 250 or 300 microns. . The sugar solution was poured into the top of the column and allowed to flow down the column while some of the sugar solution was still present around the level of the substance. adsorbent; several parts! An eluent was added comprising a 9: 1: 1 (volume ratio) mixture of ethyl acetate, acetic acid and water. After that, the eluent was allowed to flow continuously through the column. A total of 45 10 ml fractions were collected.
Sugar was detected in fractions 13, 14 and 15 using the standard Vogel point test. The 14th fraction was evaporated to about 1 ml and the xylene was identified by the standard paper chromatography test for the quantitative identification of sugars, as described in the Saeman reference mentioned above. None of the other 45 fractions were found to contain any sugar; it is thus apparent that glucose and mannose were retained in the column, as it is also apparent that the column had separated the sugar present in the lower concentration from the other two.
Example 111
The following columns of adsorbent material were prepared: (1) aggregates of cellulose crystallites of the type employed in Example I, (2) aggregates of cellulose crystallites of the type employed in Example I except that these aggregates had a size less than 44 microns, (3) a commercial adsorbent material comprising conventional fibrous cellulose which had been ground to an average particle size which was greater than what passes through a 200 mesh per unit sieve of 2.5 cm and which had a moisture content in the range of 6 to 7 O / o by weight, (4) an adsorbent used commercially,
comprising conventional cellulose acetate fibers whose diameter corresponded to that of a last 8 acetate fiber per filament (approximately 30 microns in diameter). Then, a mixture was made by adding about 0.5 g of oil soluble black ink to 100 g of cottonseed oil. The mixture of soluble oil and black ink was added to the top of each of the four columns and allowed to move downward under the influence of gravity. 1 ml of the mixture was added to each of the columns except column (1) which had such a slow mixing penetration that only 0.1 ml could be added initially.
However, after about 1 2/4 h, a total of 0.8 ml was added to column (1). As the test progressed, it became evident that column (1) exhibited the much slower downward movement of the oil mixture; this fact has been attributed to the very high adsorption of the mixture on the adsorbent material. Column (1) also exhibited the most uniform separation wall of the components of the mixture, as a number of bands were observed ranging from light gray at the bottom of the column to black at the top of the column. Column (2) exhibited the fastest penetration by the oily mixture compared to the case presented by column (1), and the separation into bands was quite uniform.
In the case of column (3) and column (4), division occurred and the separation efficiency was judged to be significantly lower than that observed with either column (1) or (2).
Example IV
Three columns of adsorbent material were prepared, columns no. 1 and 2 were the same as columns no. 1 and 2 of the previous example, and column no. 5 included conventional fibrous cellulose which was the same as that of column no. 3 of the previous example except that the product had been ground to pass through a screen of 325 mesh per unit of 2.5 cm. Commercial blue writing ink was added to the top of each column in equal amounts and percolation was allowed to occur through it for about 72 hours. After examination, columns no. 1 and 2 both showed the separation of the ink components, with a number of bands ranging from light blue at the bottom of the column to dark blue at the top being present.
Samples no. 1 and 2 showed very sharp edges between the different bands and they showed no evidence of channel formation. Column no. 3 had a marked, channel formation, and although there was a slight separation of the ink into stripes it was not sharply defined and the edges between the stripes were not sharp, part of each stripe extending in bands above and below them.
Example V
The following four columns of adsorbent material were prepared: column no. 6 included the same substance as column no. 1 of the previous example except that it had been washed with ethanol and had been air dried. The no. 7 was the same as no. 1 Except that it included particles which did not pass through a 200 mesh sieve per 2.5 cm unit, in other words, the particles had a size of 74 microns or more up to 250 microns.
Column no. 8 was the same as column no. 1, except that it included sizes of particles which passed through a 200 mesh sieve per 2.5 cm unit; that is, a particle size below 74 microns and column no. 9, which was made using the conventional fibrous cellulose of column no. 3, had a particle size greater than 200 meshes per 2.5 cm unit.
Then, 4 ml of Burnett's red food coloring tincture was taken and diluted in water to make a 20 ml volume; analogously, 4ml of each yellow and blue Burnett's tincture was taken and diluted, each to form a volume of 20ml; the three diluted tinctures were mixed to form a total of 100 ml constituting a composite mixture of the tinctures. 20 ml of the mixture was added to the top of each column. After 96 hours, columns no. 6, 7 and 8 showed the dye mixture separated into a lower blue band, a green band above the blue band, and a brownish band above the green band.
Column 6 also had a reddish band above the brown band and an even darker band above the red; it was clear that the original yellow and blue dyes had combined to form the green band; channels formed in column no. 9 and although color separation occurred, the separation efficiency was lower than that of the other columns, the edges between the bands were less distinct.
Example Vl
About 0.5% by weight of an oil soluble yellow dye solution, namely yellow dye no. 6 known in the United States as P arakeeta in Cottonseed Oil was prepared, and the resulting yellow solution was poured into the top of a column containing aggregates of crystallites of the type used in the column no. 1 of Example I. After the solution had passed through the column, two bands were apparent, namely a very wide lower band having substantially the color of cottonseed oil and a narrower upper yellow band in which the yellow dye has become concentrated.
The separation between the two bands appeared quite clear and complete; it was clear from simple visual observation that the aggregates had adsorbed the oil from the dye, the latter was soluble in the oil, or to put it another way, the aggregates had been shown to be effective in bleaching oil.
Example Vll
The following columns of adsorbent material were prepared; three columns of crystallite aggregates used in column no. 1, a column of aggregates used in column no. 2, a column of conventional ground cellulose fibers used in column no. 3 and a column identified here as being column no. 10 which contained silica gel comprising particles which were retained on a 200 mesh screen per 2.5 cm unit. A water-soluble, water-soluble Burnett's vegetable tincture mixture comprising Parakeet green, yellow and red was prepared and poured onto the top of each of the columns. The concentration of each of the three dyes in the aqueous solution was about 0.5% by weight.
After the dye solution was percolated through each column, the following bands were left out for the four columns containing crystallite aggregates: the lower band was yellow and narrow; on this was a slightly wider band of red color and above the red was a pink band of approximately the same width; above the pink band was a very wide grayXvert band, then there was a very wide dark green band and at the top there was a narrow black band. The separation between the preceding bands was quite clear.
In contrast, columns containing conventional fibrous cellulose and silica gel exhibited very little dye separation in the distinct bands and channel formation was present.
In other preferred methods, instead of removing adsorbed materials from the column by flowing a solvent or eluent therethrough, each band or area of adsorbed material and the adsorbent could be separately removed from the column. the column in order and the adsorbed material recovered therefrom by means of a suitable solvent, the resulting solutions being filtered to remove the solid adsorbent and the solvent being removed by evaporation leaving the substance separated. Alternatively, the adsorbent with the adsorbed material can be removed from the column as a wet cylinder and cut into sections, each section corresponding to a strip of adsorbent plus the adsorbed material and the latter can then be removed with solvent, as described.
By way of illustration of other separation methods which are contemplated, there is the isolation of hormones such as stilbestrol from natural sources containing it; the separation of unsaturated fatty acids, as these occur in either corn oil or cottonseed oil, from saturated fatty acids, for example, stearic acid, can be separated from oleic acid, or the separation of individual unsaturated fatty acids from each other. The separation of amino acids, whether contained in various natural mixtures or produced by the degradation of casein, collagen, gelatin and other protein-based materials, such as by means of hydrolysis with dilute acid or proteolytic enzymes. has special importance.
Other separations include that of alkaloids from plants, tinctures from natural sources, and from each other, sterols and related compounds from natural products, isotope separation. Blood can be separated into at least some of its constituents. It is also envisaged to recover vitamins from natural mixtures in which they are present, thus for example such a mixture after a suitable preliminary treatment can be dissolved for example in petroleum ether poured into the column; after which petroleum ether or methanol, or other suitable solvents can be used to elute the vitamin.
In general, vitamin A can be recovered in animal livers, vitamin D in fish liver oils, tocopherols from grain germ oil, vitamin B2 from dairy products, etc. Vitamins can not only be isolated, but also purified as can chemicals in general. Cellulose crystallite aggregates are still suitable for deodorizing or bleaching many commercial products, including food and food ingredients.
It will be understood that the various separations are produced by the operation of the adsorption and / or absorption mechanism which, for convenience, may be referred to herein as the sorption action or the solution mechanism, and which obviously depend on the solvents and eluents employed. In general, it is ordinarily advantageous that the mixture to be resolved into its constituents is dissolved in a saturated hydrocarbon such as hexane, heptane, petroleum ether, and the like. Other solvents are cyclic hydrocarbons such as cyclohexane, and esters of aromatic hydrocarbons, chlorinated hydrocarbons, alcohols, acids and bases.
The constituents of the resolved mixture should be readily soluble in the eluent used. The latter obviously must not react with the aggregates of crystallites or the constituents of the mixture. Generally, suitable eluents are alcohols, ethers, chlorinated hydrocarbons and aromatic hydrocarbons. Also in general, liquids more polar than the adsorbed constituents will displace the latter in the crystallite aggregates. Preferably, the eluent comprises a mixture of at least two solvents of variable strength for the adsorbed materials, at least one of the solvents being leaner than the other, that is to say it has less power of solvent for adsorbed materials than others.
Although the foregoing description refers to the separation of solutions, it will be understood that these may include either actual solutions or colloidal solutions or dispersions which do not exhibit particulate matter when examined under a microscope. , the term particulate matter refers to the presence of separated particles in solution. More broadly, the invention is also applicable to colloidal dispersions which exhibit particulate matter under a microscope and to the separation of emulsions, whether these are stable or not.
It will be clear to those skilled in the art that the invention is not limited to the embodiments described, but that it is susceptible of numerous variants and modifications depending on the various conditions of implementation encountered in practice.
On the other hand, it remains understood that the invention does not apply to the separation of substances intended for therapeutic uses.