Procédé de séparation de composés amino d'un mélange
La présente invention a pour objet un procédé de séparation de composés amino de mélanges les contenant, au moyen d'adsorbants constitués par des dérivés d'agrégats de cristallites de cellulose, particulièrement des dérivés contenant des groupes ionisables et susceptibles de fonctionner comme échangeurs d'ions.
La préparation des amino-acides à partir d'hydrolysats de protéines est un procédé assez pratique pour fabriquer ces composés de valeur au moyen de matériaux de départ peu coûteux; mais leur séparation, leur récupération et leur purification sont une question toute différente et c'est à ces dernières étapes que la présente invention se rapporte, ainsi qu'à la séparation et/ou la purification d'un grand nombre d'autres mélanges susceptibles d'être séparés. Au moyen des matériaux adsorbants considérés ici, des mélanges complexes d'aminoacides, tels qu'on en trouve dans les hydrolysats de protéines, peuvent être séparés en acides individuels ou en petits groupes de ces acides qui peuvent être séparés encore au moyen d'une ou de plusieurs étapes supplémentaires.
Ces étapes de séparation peuvent être mises en oeuvre avec avantage par rapport aux procédés utilisant des échangeurs d'ions classiques, y compris les échangeurs résineux et ceux dérivés de la cellulose classique.
Des dérivés d'échange d'ions d'agrégats de cristallites de cellulose possèdent un certain nombre de caractéristiques mécaniques et physiques désirables par rapport aux matériaux classiques. Par exemple, ils ne possèdent pas les couleurs sombres et les odeurs qui caractérisent fréquemment les matériaux résineux, et il est beaucoup plus facile de contrôler leur dimension de particules en comparaison de ces derniers.
Dans le cas de dérivés de cellulose classique, leur caractère fibreux conduit à un médiocre garnissage dans la colonne et à la création d'espaces d'air qui provoquent des canaux . D'autre part, les dérivés d'agrégats étant de forme particulaire non fibreuse présentent de bonnes caractéristiques de garnissage et ne provoquent pas de canaux .
Les dérivés d'agrégats sont susceptibles d'être passés au tamis pour produire des fragments de dimensions de particules précises et uniformes, et la dimension ellemême peut être si petite qu'elle représente un ordre de grandeur différent par rapport aux dérivés de cellulose fibreuse classique. Ainsi qu'il est bien connu, la netteté de séparation d'un mélange alimentaire est généralement augmentée lorsque la dimension des particules du matériau de l'échangeur est diminuée. En conséquence, les dérivés d'agrégats peuvent, si on le désire, avoir une aire de surface bien supérieure à celle des matériaux fibreux. Ces derniers sont difficiles à passer au tamis avec précision en raison de leur forme fibreuse et il n'est pas rare d'avoir des particules possédant une dimension de l'ordre d'l ou 2 microns mais avec une longueur allant jusqu'à 1000 microns ou plus.
I1 est particulièrement significatif que les dérivés d'agrégats aient une densité en masse plus élevée que les matériaux de cellulose classiques; ainsi pour des poids égaux des deux dérivés, le dérivé d'agrégats aurait un volume plus petit, peut-être seulement 50 o/o ou moins du volume du matériau classique. Si un mélange alimentaire devait être séparé pour chaque matériau, le dérivé des agrégats serait mouillé d'une façon beaucoup plus faible que le matériau classique, et à son tour la rétention ou la perte serait beaucoup plus faible. L'avantage du dérivé des agrégats est ainsi apparent, particulièrement dans le cas de mélanges alimentaires coûteux ou de composants de tels mélanges; de plus, la quantité de solvant éluant serait moindre et il y aurait moins de solvant à s'évaporer du composé élué.
Les dérivés des agrégats ont l'avantage particulièrement désirable d'être reproductibles dans un état de pureté élevée et uniforme. Cette caractéristique n'est pas seulement de grande valeur pour séparer des mélanges qui sont sensibles aux impuretés, mais elle représente aussi un perfectionnement par rapport aux dérivés de cellulose classique dont la reproductibilité fluctue de lot à lot. Ainsi qu'il est bien connu, la cellulose classique contient des régions amorphes distribuées dans les chaînes de cellulose de celle-ci, le contenu desquelles comprend des xylanes et des mannanes. La quantité de ces derniers matériaux est variable de cellulose à cellulose, ainsi que celle-ci varie d'usine à usine et de saison à saison, et à leur tour les dérivés faits à partir de celluloses sont variables de la même manière de lot à lot.
En raison de ces variations, il est pratiquement impossible d'obtenir des produits dérivés uniformes ou purs à partir de cellulose classique. En ce qui concerne la teneur en cendres, les dérivés d'agrégats de cristallites peuvent avoir une teneur en cendres inférieure à 500 parties par million ou même inférieure à 100 parties par million, alors que les dérivés de cellulose classique peuvent avoir une teneur en cendres supérieure à 800 parties par million.
Dans le cas de mélanges alimentaires séparables tels que des amino-acides et des protéines, les dérivés d'agrégats peuvent présenter une capacité d'adsorption supérieure à celle de la résine et à celle des dérivés de cellulose classique. De plus, ces mélanges alimentaires ou leurs composants peuvent être abandonnés par désorption à partir des dérivés d'agrégats dans des conditions douces, c'est-à-dire que le solvant éluant ou de désorption peut être un produit chimique doux qui n'attaque pas les composants alimentaires ou le dérivé.
En raison de ces avantages et d'autres qui appa raîtront par la suite, les dérivés d'agrégats de cristallites sont susceptibles de fournir une action de séparation supérieure par rapport à un grand nombre de mélanges alimentaires.
Les dérivés d'échange d'ions des agrégats peuvent comprendre soit des échangeurs d'anions soit des échangeurs de cations.
Des échangeurs de cations convenables sont des dérivés carboxyle d'agrégats de cristallites de cellulose, y compris le carboxyle-6 et les dérivés de dicarboxyles en position 2 et 3, des dérivés contenant des mélanges de carboxyle et d'aldéhyde des agrégats, et des dérivés du type carboxyéther des agrégats tels que le carboxyméthyle, le carboxyéthyle et d'autres dérivés de carboxyallyle. D'autres matériaux utiles comprennent des dérivés d'ester d'acides inorganiques tels que les dérivés de phosphate et de sulfate des agrégats, d'autres dérivés d'éther des séries phosphonoalkyle, de sulfonikyle, et de sulfinoalkyle, tels que le phosphonométhyle, le sulfométhyle, le sulfoéthyle et des dérivés de sulfinométhyle. Les dérivés de sulfoalkyle comprennent des groupes d'acide sulfonique.
D'autres dérivés encore sont les esters d'acide phosphoreux, les esters d'acide borique, les esters d'acide sulfureux, également des esters d'acide organique tels que les esters de phtalate, de sulfinate et d'oxalate. D'autres esters comprennent les esters d'acide sulfonique et les esters d'acide carboxylique dans lesquels des parties du type -RSO8H et -RCOOH sont réunies au carbone carbonyl du groupe ester -OOC par les radicaux R, ces derniers étant n'importe quel radical hydrocarboné convenable.
Des échangeurs d'anions comprennent des éthers d'alkylaminoalkyl des agrégats dans lesquels les parties alkyle peuvent avoir de 1 à 6 atomes de carbone ou même plus; par exemple de tels dérivés comprennent les éthers de diéthylaminoéthyl et de triéthylaminoéthyle des agrégats. Un autre dérivé est le diéthylamino(hydroxy-2 propyl) éther. Un autre échangeur d'anions est constitué par le matériau formé en faisant réagir l'épichlorohydrine et le triéthanolamine avec les agrégats en présence de soude caustique. De plus, des dérivés de mono et diurée des agrégats. D'autres dérivés contenant, un groupe basique sont représentés à titre d'exemple par les esters d'alkylaminoalkyle et d'alkylaminodialkyle des agrégats.
Comme il peut être apparent, certains des dérivés ont un groupe ionisable fixé directement aux unités anhydroglucose des agrégats de cristallites, tandis que certains possèdent un tel groupe à l'extrémité d'une chaîne qui, à son autre extrémité, est fixée aux unités anhydroglucose.
Les agrégats de cristallites de cellulose à partir desquels les divers dérivés sont faits sont des agrégats de cellulose de petite dimension et préférablement désintégrés. Ces petits agrégats désintégrés, leurs propriétés et un procédé pour désintégrer la cellulose sont décrits dans le brevet suisse No 395045. Ce sont des produits insolubles dans l'acide, fabriqués par l'hydrolyse acide contrôlée de la cellulose. Ils sont composés de chaînes polymères ayant une longueur, ou degré de polymérisation (D. P.) sensiblement uniforme, bien que le D. P. de certaines chaînes puisse s'écarter quelque peu de la valeur moyenne, mesurée conformément aux indications contenues dans l'article de M. O. A. Battista sous le titre de Hydrolyse et cristallisation de la cellulose s, volume 42, < r Industrial and engineering chemistry pages 502-7 (1950).
I1 est préféré que les agrégats de départ aient une dimension de particules de 5 microns ou de moins, qu'ils aient ou non été soumis à l'attrition. Comme la production de dimensions de particules de 5 microns ou moins est favorisée par l'attrition, il est préférable d'exécuter cette étape et si nécessaire d'utiliser le fractionnement pour obtenir les dimensions désirées. Des dimensions de particules de 5 microns ou moins peuvent être obtenues par fractionnement des agrégats non soumis à l'attrition bien que le rendement puisse être inférieur.
Les dérivés utiles sont caractérisés par leur insolubilité générale y compris leur insolubilité dans l'eau, dans divers mélanges alimentaires séparables et dans divers éluants et régénérants; les dérivés sont encore carac térisés par le fait d'être sous forme de particules discrètes, particulaires non fibreuses d'une dimension dans la gamme préférée de 30 à 70 microns, bien qu'elles puissent être inférieures à 30 microns et même à 10 jusqu'à 5 microns, et si désiré de 0,1 ou 0,2 à un micron ou plus. Ces dérivés sont essentiellement des dérivés topochimiques du fait que les chaînes de cellulose disposées dans les surfaces des agrégats sont dérivées au lieu que toutes les chaînes des agrégats le soient.
En terme de degré de substitution (O. S.), les dérivés peuvent avoir un D. s. inférieur à 1,0, préférablement de 0,01 à environ 0,85.
Des dérivés carboxyle contenant à la fois des radicaux carboxyle et aldéhyde, des dérivés esters, des dérivés éthers et des dérivés de combinaison d'agrégats de cristallites de cellulose et leurs méthodes de préparation sont décrits dans le brevet suisse No 426757. Comme décrit dans ladite demande, les chaînes de cellulose des agrégats de cristallites ont à une extrémité un groupe aldéhyde potentiel qui peut être réduit en un groupe hydroxyle ou peut être oxydé en un groupe carboxyle avant de former un dérivé d'agrégats désiré.
L'invention est particulièrement intéressante dans la séparation et la purification de mélange alimentaires comportant des composants contenant des groupes amino, particulièrement des mélanges d'amino-acides provenant d'une source quelconque et désirablement des mélanges obtenus par hydrolyse acide, alcaline ou par action d'enzymes de diverses protéines à la fois d'origine animale et végétale et de mélanges à partir d'extraits biologiques.
A titre d'illustration, parmi les protéines qui peuvent être hydrolysées, on peut citer la caséine, la levure, l'albumine d'oeuf et aussi l'albumine de lait, de poisson, d'élastine, de kératine; les protéines végétales telles que le soja, l'édestine, la zéine, la gliadine; et aussi les protéines de colle, la gélatine, la fi broine de soie, la gomme de soie, I'hémoglobine, l'albumine de sérum, la globuline de sérum, la fibrine du sang, I'albumène de plasma bovin et le mélange de ceuxci avec l'hémoglobile, le sérum humain, le sérum de cheval.
De façon à séparer le mélange complexe d'aminoacides présent dans un hydrolysat de protéine, il est désirable de les séparer d'abord en une série de groupes en utilisant par exemple un échangeur de cations. A ce sujet, il est intéressant de noter que les amino-acides peuvent être classés en quatre groupes:
1) les aminoacides de base comprenant les acides diaminomonocarboxyliques possédant des points isoélectriques variant de 7,59 à 10,76 et comprenant l'histédine, la lysine, l'hydroxylysine et l'arginine, 2) les amino-acides neutres comprenant les acides monoaminomonocarboxyliques ayant des points isoélectriques de 5,6 à 6,3 et comprenant la sérine, la thréonine, la proline, l'hydroxyproline, la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine et la méthionine, 3) les amino-acides acidiques comprenant les acides monoaminodicarboxyliques avec des points isoélectriques de 2,77 à 3,22 et comprenant les acides glutamiques et aspartiques, et 4) les amino-acides aromatiques comprenant la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane.
I1 sera bien compris que la séparation initiale du mélange d'amino-acides à partir de l'hydrolysat de protéine en des groupes ne produira pas nécessairement des groupes de la composition qui précède, bien qu'en général on trouvera que l'ordre dans lequel les acides sont séparés par l'échangeur de cations est conforme à leur basicité croissante, c'est-à-dire que les acides les plus acides sont moins fortement adsorbés et tendent à passer hors de la colonne un, alors que les acides plus basiques sont plus fortement adsorbés et tendent à être retenus dans la colonne. Après séparation des groupes, la séparation des acides individuels d'un groupe peut être exécutée séparément, par exemple au moyen d'un matériau échangeur différent.
Les dérivés d'échange d'ions des agrégats de cristallites sont non seulement utiles pour la séparation de mélanges d'amino-acides mais ils sont aussi de grande valeur pour la séparation des peptides, et aussi des mélanges de protéines, y compris les divers mélanges de protéines décrits ci-dessus et aussi y compris d'autres mélanges de protéines tels que les enzymes, les extraits de muscle, les acides nucléiques et leurs produits de dégradation, etc. Ils sont également de valeur pour la purification des mélanges d'amino-acides, des diverses protéines, des acides nucléiques, etc.
La présente invention est aussi applicable à la purification des acides organiques impurs tels que les qualités commerciales sous lesquelles de tels acides sont fréquemment fournis. Un fractionnement d'acide impur est possible, dans lequel des matériaux de poids moléculaire inférieur et supérieur, ainsi que l'acide purifié luimême, peuvent être obtenus dans des fractions définies.
De même, des mélanges d'acides peuvent être séparés en leurs composants.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on fait passer une solution de ce mélange au contact d'un dérivé insoluble dans l'eau d'agrégats de cristallites de cellulose, ledit dérivé présentant des groupes fonctionnels échangeurs d'ion, en ce que l'on adsorbe au moins une partie desdits composés amino sur ledit dérivé, en ce que l'on élue lesdits composés amino avec un solvant éluant pour séparer les composés amino adsorbés et en ce que l'on récupère au moins une fraction contenant moins de composés amino que ledit mélange.
En général, le processus de fractionnement ou de séparation en un ou plusieurs de ses composants d'un mélange alimentaire tel qu'un mélange d'amino-acides ou d'autres composants contenant un groupe amino, comprend le fait de placer une solution du mélange à séparer sur la partie supérieure d'une colonne garnie de matériaux appropriés. Le mélange est alors élué à travers la colonne au moyen d'un éluant ou solvant convenable. En raison des différents degrés d'association qui peuvent exister entre les composants du mélange et le matériau dans la colonne, les composants se déplacent vers le bas de la colonne à des taux différents.
Une séparation est ainsi effectuée et des fractions successives de l'éluant et d'un ou plusieurs composants sont collectées lorsqu'ils émergent de la partie inférieure de la colonne.
Le choix de l'éluant dépendra du matériau de la colonne et des composants du mélange alimentaire; cependant, des éluants communément utilisés comprennent le chloroforme, des mélanges de chloroforme et de méthanol, les alcools à faible poids moléculaire ayant de 1 à 5 ou 6 atomes de carbone, des mélanges de n-butanol d'isopropanol et d'eau, de l'eau, des acides aqueux tels que le HC1 0,1N et le HCl 0,5N, des mélanges de butanol d'isopropanol et de 0,1N HCl en mélange, des mélanges de n-butanol d'isopropanol et de HC1 0,5N en mélange, des mélanges de n-butanol et d'acide acétique, des mélanges de n-butanol d'acide acétique et d'eau, des mélanges de n-butanol, d'acide acétique, d'eau et de 2éthylhexylamine, des mélanges de benzène,
d'acide citrique d'hydroxyde de sodium, de HCl et d'eau, des mélanges d'acide citrique, d'acide acétique, d'hydroxyde de sodium, d'acétate de sodium et d'eau, des mélanges d'acide phosphorique et d'hydroxyde de sodium, des mélanges d'éthanol et de HC1, des solutions de dioxane, de diméthyl formamide de sel aqueux telles que NaCl 0,1 N et analogues. Deux ou un plus grand nombre d'éluants peuvent être utilisés.
Le pH de l'éluant peut être un facteur dans la séparation des amino-acides, des protéines et autres mélanges. En changeant le pH de l'éluant, il peut être possible de faire varier le degré d'association des divers composants des mélanges alimentaires avec le matériau de la colonne, affectant ainsi le taux auquel ceux-ci se déplacent vers le bas dans la colonne. On peut préférer des valeurs de pH pour la séparation efficace de mé langes tels que des protéines et des amino-acides et ces valeurs peuvent être déterminées pour un mélange particulier.
Lorsqu'une séparation de lots est désirée, le matériau de la colonne peut être enlevé de la colonne sous la forme d'un cylindre humide et coupé en sections, chaque section correspondant à une bande de matériau plus des composants adsorbés et le dernier peut alors être enlevé au moyen d'un solvant convenable. L'emploi de dérivés d'agrégats dans cette dernière méthode de séparation fournit un avantage par rapport aux dérivés de cellulose classique en ce que ce dernier, lorsqu'il a été coupé en bandes, se coupera de façon nette et propre alors que les composés classiques, étant fibreux, ne se coupent pas de façon nette ou propre mais tendent à se déchirer. I1 peut encore être noté que les dérivés classiques tendent à donner des bandes le long de la colonne possédant des limites indistinctes en raison du caractère fibreux des dérivés.
Un matériau de colonne peut être régénéré en faisant passer un solvant ou une solution de régénération à travers la colonne qui déplacera toutes les substances qui peuvent être encore dans la colonne. Le solvant utilisé évidemment variera avec la substance sur la colonne et le matériau de la colonne. A titre d'exemple, on peut mentionner la régénération de la colonne de l'exemple 3 après la purification d'acide laurique et utilisant de l'éthanol comme éluant. Cette colonne peut être régénérée par lavage avec une solution d'acide chlorhydrique éthanolique à 0,5 N. Après régénération, la solution régénérante peut être déplacée par le solvant pour être utilisée pour l'éluant dans l'étape suivante.
En général, des substances régénératrices convenables comprennent 1'HCl éthanolique, 1'méthanol, des solutions aqueuses de chlorure de sodium, des solutions d'alcool basique telles que le NaOH éthanolique à 0,1 N, des solutions acides telles que l'HCl à 0,5 N, le chloroforme, etc. D'autres régénérants peuvent être choisis à partir de la liste cidessus d'éluants. L'invention peut être illustrée par les exemples suivants.
Exemple I
Un dépôt a été formé en dispersant un dérivé carboxyméthyle d'agrégats de cristallites de cellulose ayant un degré de substitution d'environ 0,5 dans un solvant comprenant un volume de butanol, deux volumes d'isopropanol et un volume d'eau. Le dépôt (qui fournissait une manière convenable de placer le dérivé dans la colonne d'échange, bien qu'il pouvait aussi être introduit dans celle-ci sous forme sèche) a été soigneusement versé sur le côté d'une colonne de verre de 62 cm de long ayant un diamètre intérieur de 1,5 cm. Un bouchon de verre préalablement introduit supportait le dérivé dans la colonne. Pendant que le solvant s'écoulait de la colonne, des quantités supplémentaire de dépôt étaient ajoutées à la partie supérieure.
Lorsque le dérivé ne sedéposait plus, on a laissé le solvant s'écouler en faisant attention d'empêcher que le dérivé ne sèche complètement.
Un mélange d'amino-acides de la qualité commerciale dite pure a été préparé en comprenant 20 milligrammes d'acide d-aspartique, 20 grammes de dl-alanine et 20 milligrammes de l-histidine. Le mélange a été dissous dans un solvant comprenant un volume de butanol, deux volumes d'isopropanol et un volume d'acide chlorhydrique 0,1N. Le volume total de la solution était de 10 millilitres qui ont été ajoutés à la partie supérieure de la colonne et on a permis à l'ensemble de s'écouler à travers celle-ci, en prenant soin de maintenir le niveau du liquide au-dessus de la partie supérieure des dérivés de garnissage. Après addition de la charge et sans exposer la partie supérieure du dérivé de garnissage, le solvant éluant a été introduit dans la colonne au taux de 3 millilitres pour 25 minutes.
Le solvant avait la même composition que celui utilisé pour fabriquer le dépôt du dérivé et il servait à aider à la circulation des amino-acides à travers la colonne à des taux différents permettant ainsi de réaliser le chromatogramme. L'effluent de la colonne a été collecté en fraction de 3 millilitres en utilisant un collecteur de fractions normal.
Des fractions ont été analysées comme suit. Un réactif tel que la ninhydrine a été préparé sous la forme d'une solution à 0,1 o dans un citrate tampon. Le citrate tampon a été réalisé en mélangeant 200 millilitres de soude caustique 1N avec de l'acide citrique, suffisamment d'acide étant ajouté pour donner un pH de 5,0.
Chaque fraction de 3 millilitres a été mélangée à 1 millilitre du réactif ninhydrine et le mélange placé dans de l'eau bouillante pendant 20 minutes. L'apparition d'une couleur bleue indiquait la présence d'amino-acide, alors que l'absence de couleur indiquait l'absence d'un tel acide. Les informations qualitatives suivantes peuvent être présentées sous forme de tableau:
No des fractions Résultats d'essais
1- 30 négatif
31- 81 bleue
82-89 négatif
90-119 bleue
120-150 négatif
151-179 bleue
180-200 négatif
En se reportant au groupe de numéros 31 à 81, on comprendra que la couleur bleue était moins intense dans les premières fractions du groupe, devenait graduellement plus intense, puis moins intense, la fraction du milieu ayant la couleur la plus intense. Ce phénomène était aussi vrai pour les échantillons 90 à 119 et 151 à 179.
L'intensité de la couleur d'une fraction a été interprétée comme étant proportionnelle à la concentration d'amino-acides dans celle-ci. Le test a indiqué que la fraction numéros 31 à 81 contenait de l'acide d-aspartique, la fraction numéros 90 à 119 contenait de la dl-alanine et la fraction numéros 151 à 179 contenait de la I-histidine.
Le travail qui précède a été répété en utilisant de la cellulose carboxyméthylique classique comme adsorbant dans la colonne, excepté que seulement 10 milligrammes de chacun des amino-acides étaient utilisés au lieu de 20 milligrammes de chacun de ceux-ci. Un tel emploi d'un niveau inférieur d'amino-acides devait, pensaiton, augmenter la sensibilité du mélange au pouvoir séparateur de l'adsorbant. De plus, un taux d'écoule ment plus rapide était réalisé avec le dérivé classique, à savoir 3 millimètres par 5 minutes. Cependant, aucune séparation des amino-acides n'a été obtenue, les informations qualitatives du test sont les suivantes:
No des fractions Résultats d'essais
1- 20 négatif
21- 39 bleue
40-200 négatif
I1 est apparent que les trois acides émergeaient ensemble de la colonne dans les numéros 21 à 39.
Exemple 2
Un hydrolysat de caséine a été soumis au traitement en utilisant la colonne de l'exemple précédent. De la caséine pure a été hydrolysée en soumettant celle-ci au reflux pendant 6 heures dans 150 millilitres d'acide chlorhydrique concentré. La caséine donnait l'analyse suivante: résidu après ignition 2,0 o/o; humidité 8,0 0/o; protéine 87,50/o; azote 13,7 0/o; du sucre réducteur était présent sous forme de traces. L'acide chlorhydrique utilisé était de la qualité connue aux Etats-Unis sous l'appellation C.
P., avait une densité de 1,19 et contenait de 37 à 38 ego de HC1. A la fin de l'hydrolyse, une partie aliquote de la solution d'hydrolysat résultante a été diluée avec de l'eau, si bien que la concentration finale de la solution aliquote correspondait approximativement à 4 milligrammes de la caséine originale par millilitre de solution aliquote diluée. Deux millilitres de la solution aliquote diluée, équivalant à environ 8 milligrammes de la caséine originale, ont été pris et utilisés comme alimentation à charger dans la colonne.
Comme indiqué, la colonne de l'exemple précédent a été utilisée pour la séparation. La colonne était d'abord lavée avec un mélange comprenant 1 volume de butanol, deux volumes d'isopropanol et 1 volume de 0,1 N HCl.
Après un tel lavage, le liquide de lavage a été déplacé de la colonne en versant dans celle-ci un mélange comprenant un volume de butanol, deux volumes d'isopropanol et un volume d'eau, cette étape étant désignée sous le nom d'équilibrage de la colonne. Alors, l'hydrolysat de caséine ou substance d'alimentation a été ajouté à la partie supérieure de la colonne, et lorsque le niveau correspondait à la surface supérieure de l'adsorbant dans la colonne, le solvant d'élution a été introduit, un tel solvant étant le même que celui utilisé dans l'exemple précédent. Le taux de circulation du solvant était aussi le même que dans l'exemple précédent.
Des fractions de 3 millilitres ont été collectées et analysées en ce qui concerne la teneur en amino-acide par le procédé décrit dans un article intitulé Méthodes Colorimétriques d'Analyse par Snell et Snell, 3e édition, édité à New York par Van Nostrand Co.,
Inc., pages 107-108 (1954). Ce procédé est un procédé quantitatif dans lequel l'intensité des couleurs est mesurée avec un spectrophotomètre, les intensités ainsi mesurées étant utilisées pour calculer la densité optique, ainsi que cela est indiqué dans la référence qui précède.
La densité optique est une mesure de l'absorption de la lumière par les amino-acides. De façon plus particulière, c'est le logarithme négatif du pourcentage de lumière transmise. En représentant graphiquement la densité optique par rapport aux numéros de fractions, une courbe a été obtenue ayant une pointe très aiguë et très haute pour la fraction No 40 (densité optique 0,61), la pointe commençant au No 35 et finissant au No 57. Les fractions Nos 1 à 34 avaient une densité optique nulle. Le reste des fractions, Nos 58 à 231, présentait une densité optique faible mais croissant graduellement, allant de 0,03 à 0,21.
Les informations de densité optique pour les Nos 35 à 57 sont les suivantes:
No No des fractions Densité optique des fractions Densité optique
35 0,03 47 0,28
36 0,15 48 0,24
37 0,31 49 0,22
38 0,46 50 0,17
39 0,57 51 0,15
40 0,61 52 0,10
41 0,52 53 0,09
42 0,46 54 0,05
43 0,41 55 0,04
44 0,38 56 0,02
45 0,31 57 0,01
46 0,30
Le matériau dans les échantillons Nos 35 à 57 contenait principalement de l'acide glutamique avec un peu d'acide aspartique. De façon plus spécifique, les échantillons No 35 à 46 contenait principalement de l'acide glutamique et les numéros 46 à 57 contenaient principalement de l'acide aspartique. La fraction No 40 contenait environ 4 O/o en poids de la teneur en aminoacide de la caséine originale.
Exemple 3
Deux millilitres d'acide laurique impur (qualité pratique de Eastman) dans de l'éthanol (0,1 gramme d'acide laurique pour 25 millilitres d'éthanol) ont
Différence Différence
No dans l'index No dans l'index des fractions de réfraction des fractions de réfraction
1 0 11 0,094
2 0,123 12 0,037
3 0,046 13 0,025
4 0 14 0,018
5 0 15 0,030
6 0,049 16 0,021
7 0,045 17 0
8 0,010 18 0,006
9 0,133 19-30 0
10 0,214
Si les renseignements précédents sont représentés sur du papier à coordonnées, on obtient une courbe montrant la variation du numéro de la fraction avec l'index de réfraction différentiel. Les deux premières pointes de cette courbe représentent des impuretés comprenant des composés organiques ayant moins de 12 atomes de carbone par molécule. La troisième pointe correspondant à la fraction No 10 est la plus élevée et représente l'acide laurique pur. Deux petites pointes suivantes représentent des impuretés comprenant des composés organiques ayant plus de 12 atomes de carbone.
Exemple 4
Deux millilitres d'acide myristique impur (Eastman) dans l'éthanol (0, 1 g d'acide myristique par 25 millilitres d'éthanol) ont été placés sur une colonne entassée (0,8 centimètre X 30 centimètres) qui avait été équilibrée avec de l'éthanol. Le matériau de la colonne était le même que celui utilisé dans l'exemple 3. L'échantillon a été élué avec de 1'éthanol sous une pression de 2,267 kg par cm2 d'azote. Le taux d'écoulement était de 2 millilitres pour 5 minutes. Des concentrations des fractions étaient suivies au moyen d'un réfractomètre différentiel Brice et Phoenix.
Différence Différence
No dans l'index No dans l'index des fractions de réfraction des fractions de réfraction
1 0 19 0,075
2 0 20 0,075
3 0 21 0,075
4 0 22 0,075
5 0,028 23 0,089
6 O 24 0,084
7 0 25 0,072
8 0,046 26 0,079
9 0,022 27 0,039
10 0 28 0,070
11 0,208 29 0,048
12 0,304 30 0,075
13 0,219 31 0,020
14 0,060 32 0
15 0,036 33 0
16 0,067 34 0
17 0,043 35 0
18 0,099
En représentant graphiquement les informations qui précèdent sur du papier à coordonnées, la courbe résultante a sa pointe la plus élevée correspondant à la fraction 12 et représente l'acide myristique pur. Des pointes plus faibles précédant et suivant la pointe la plus haute représentent des impuretés organiques contenant respectivement moins de et plus de 14 atomes de carbone par molécule.
D'un point de vue plus large, les dérivés d'agrégats de cristallites ont d'utiles applications à la séparation, à la récupération et/ou à la purification de mélanges et de compositions de caractère varié. Ainsi ils peuvent être employés pour des produits tels que des racémates, des lipides, des composés ayant des branches droites et des branches en chaîne, des terres rares. Aussi ils permettent de récupérer des acides organiques tels que les acides citrique, tartrique, etc. à partir d'eaux usées et de déchets de citrons, ainsi que de purifier de tels acides et des acides gras saturés et non saturés à poids moléculaire plus élevé tels que les acides linoléique, linolénique, oléique, ricinoléique, stéarique, palmitique, etc.
Des amino-acides peuvent être recouvrés à partir de résidus de traitements d'aliments, des enzymes à partir de source naturelle, des métaux à partir de bains de traitement tels que des bains de décapage et de traite- ments anodiques, le cuivre à partir des eaux de déchets de filage de rayonne de cupramonium, des métaux de valeur tels que de l'argent à partir de résidus photographiques. L'invention est aussi de valeur pour purifier des intermédiaires chimiques, des tanins, des nitrites, des hexosephosphates, des alcools complexes, des alcools gras supérieurs, des teintures, etc. Des pigments de plantes peuvent être isolés des mélanges naturels de ceux-ci. Ainsi, le carotène peut être séparé d'autres pigments de plantes.
Des impuretés de métaux lourds tels que le cuivre et le fer peuvent être enlevées du vin, et le vin autrement amélioré par rapport à sa pureté, organoleptiques et autres qualités. Le whisky peut être amélioré de façon analogue. L'eau peut être adoucie ou complètement désionisée.
Il sera bien entendu évident que, dans ces opérations, un dérivé d'échange de cations sera employé pour adsorber les substances cationiques et un dérivé d'échange d'anions sera utilisé pour adsorber les substances anioniques. I1 sera aussi apprécié que dans certaines des applications qui précèdent telles que l'adoucissement ou la désionisation de l'eau ou la déminéralisation des solutions pour les libérer d'impuretés minérales ou pour recouvrer des métaux de valeur, le procédé général comprend le fait de verser le mélange alimentaire, par exemple un mélange à partir duquel des impuretés doivent être enlevées, dans une colonne d'adsorbant. L'effluent sera le produit alimentaire déminéralisé, alors que les impuretés minérales ou mécaniques sont retenues sur la colonne et peuvent être enlevées convenablement.
Une expérience intéressante peut être exécutée avec un mélange de teintures. Approximativement 50 milligrammes de chacune des trois teintures suivantes solubles dans l'eau ont été mélangés dans 250 millilitres d'eau de la couleur jaune dite parakeet No 5, parakeet rouge No 2 et parakeet vert No 1. Deux colonnes ont alors été montées, une contenant de la cellulose carboxyméthylique classique sous forme fibreuse et l'autre contenant des agrégats de cristallites de cellulose carboxyméthylique sous forme particulaire non fibreuse. La même quantité de mélange de teintures a été versée à la partie supérieure de chaque colonne en même temps, puis on a simplement laissé descendre par gravité. Après environ deux heures, les deux colonnes ont été examinées.
Dans la colonne contenant le dérivé de cellulose classique, la partie la plus basse de la colonne, comprenant environ 1/5 de la longueur, n'était pas mouillée. Immédiatement au. dessus de celle-ci, il y avait une bande jaune comprenant les 2/5 de la colonne, et au-dessus de ceci, il y avait une bande verte comprenant aussi environ 2/5 de la colonne. Dans la colonne contenant le dérivé d'agrégats, la partie la plus basse de la colonne, environ 1/5 de la longueur, n'était pas mouillée.
Au-dessus de ceci, il y avait une large bande bleue comprenant environ 1/5 de la colonne. Au-dessus de cette dernière, il y avait trois bandes étroites de vert clair, de brun rougeâtre et de vert clair, respectivement. Audessus de la bande mentionnée en dernier, il y avait une large bande bleu clair comprenant environ 1/5 de la colonne, et finalement au sommet de la colonne, il y avait une bande verte de largeur assez substantielle. I1 était apparent que le dérivé des agrégats était capable de séparer le mélange de couleur en un plus grand nombre de composants; de plus, ce dérivé ne présentait pas le phénomène de formation de canaux et les bandes étaient définies nettement, alors que le dérivé classique de cellulose présentait la formation de canaux et délimitait les bandes indistinctement.
Comme indiqué ci-dessus, bien que l'emploi de dérivés d'agrégats de cristallites de cellulose ayant des propriétés d'échanges d'ions soit préféré, il y a d'autres dérivés des agrégats de cristallites qui, bien que ne pré- sentant pas une action d'échange d'ions en raison du manque de groupes ionisants, sont néanmoins de valeur comme adsorbants pour la séparation, la purification, la récupération ou pour traiter autrement les mélanges alimentaires décrits ci-dessus. Ces derniers dérivés sont effectifs par l'opération d'adsorption de liaison d'hydrogène et/ou des forces de Van de Waals et sont aussi préparés suivant le procédé décrit dans le brevet suisse
No 426757.
N'importe lequel des dérivés décrits ici des agrégats de cristallites de cellulose peut être soumis à l'attrition en présence d'eau pour former un gel, et sous cette forme il convient pour être utilisé dans l'électrophorèse de gel pour purifier des composés impurs, pour recouvrer des composés désirés, et analogues.
Un autre avantage des dérivés d'agrégats du type à échange d'ions est le fait que les ions échangeables sont plus accessibles que dans le cas de matériaux de dérivés de cellulose classique et du type résine. Dans les matériaux du type résine, l'échangeur n'est pas ordinairement une longue chaîne de polymère mais plutôt un polymère à réseau à trois dimensions ayant beaucoup d'ions échangeables placés de telle façon dans le milieu intérieur amorphe qu'ils sont inaccessibles aux ions d'échange et au milieu éluant. Et dans les dérivés de cellulose classique, la présence de groupes ionisables à l'intérieur des régions amorphes ou matrices, tend à les rendre accessibles. Dans les résultats, les dérivés d'agrégats, en raison de la plus grande accessibilité de leurs groupes ionisables placés sur la surface, tendent à donner un taux d'échange plus élevé.
Une autre considération réside dans la tendance de certains matériaux classiques à se gonfler pendant l'usage, et il faut noter que les dérivés d'agrégats se gonflent beaucoup moins dans l'eau que les dérivés de cellulose classique. Le fait que le gonflement des derniers dérivés est difficile sinon impossible à contrôler, facteur considéré comme ayant une relation avec la présence de régions amorphes dans les chaînes moléculaires des dérivés, est peut-être plus significatif. L'objection au gonflement est que si celui-ci est suffisamment prononcé, une résistance indésirable au flux d'alimentation ou d'éluant se développe. Lorsque le gonflement est difficile à contrôler, il est évident que la résistance d'écoulement peut devenir un facteur sérieux.
Contrairement au matériau du type résine, les dérivés d'agrégats sont inertes pour un grand nombre de solvants et fournissent ainsi une gamme étendue d'éluants et aussi de régénérants susceptibles d'être employés.
Etant moins sujets aux attaques, les dérivés sont plus facilement régénérés que les matériaux du type résine.
De plus, en raison de l'absence de régions amorphes, ils peuvent être régénérés au moyen d'une variété d'agents beaucoup plus étendue que les dérivés de cellulose classique. Ces derniers, en raison de la présence d'aires amorphes, sont sujets à l'attaque par les régénérants acides.
D'intérêt particulier est le fait que les dérivés d'agrégats possèdent un caractère hydrophile. Ceci est apparent parce que les agrégats de cristallites de cellulose à partir desquels les dérivés sont préparés, contiennent un nombre élevé de groupes hydroxyle dont au moins certains survivent à la conversion des agrégats en dérivés. En raison de leur caractère hydrophile, les dérivés sont de valeur particulière pour séparer des mélanges alimentaires dont les composants contiennent des groupes amino.
Tel qu'utilisé ici, le terme adsorbant est destiné à désigner à la fois les dérivés des groupes ionisables et ceux qui ne possèdent pas de tels groupes.
Les termes mélange liquide ou mélange fluide sont destinés à couvrir des mélanges alimentaires séparables qui sont à l'état liquide ou liquéfié ou à l'état fluide et comprennent des solutions, des solutions colloïdales, des suspensions colloidales et des dépôts. Ces termes comprennent aussi des mélanges fondus si de tels mélanges ne sont pas liquides aux températures normales. Des suspensions colloïdales peuvent comprendre des protéines, des polypeptides, etc. De plus, certains mélanges alimentaires liquides peuvent être introduits dans une colonne de séparation sans être d'abord transformés dans une solution au moyen d'un solvant.