DE1442350A1 - Verfahren zur Trennung eines in mindestens zwei Komponenten trennbaren fluessigen Gemisches - Google Patents

Description

Verfahren zur Trennung eines in mindestens zwei Komponenten trennbaren flüssigen Gemisches

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Trennung von Aminoverbindungen aus Gemischen von Aminoverbindungen mit Hilfe von wasserunlöslichen Adsorbentien, die aus Derivaten von Gellulose-Kristallit-Aggregaten zusammengesetzt sind, die ionisierbare Gruppen enthalten und fähig sind, als Ionenaustauscher zu wirken.

Die Herstellung von Aminosäuren aus J^rotein-Hydrolysaten ist eine an sich bekannte Arbeitsmethode, mit Hilfe deren man diese technisch wichtigen Verbindungen aus verhältnismäßig wohlfeilen Ausgangsrnaterialien gewinnen kann. Indessen ist

ihre Trennung, ihre Isolierung und ihre Reinigung ein anderes Problem, und diese letzten Stufen bilden insbesondere den Gegenstand der vorliegenden ßrfindungj daneben natürlich auch die Trennung und bzw, oder die Reinigung von vielen anderen trennbaren Aminoverbindungen enthaltenden Gemisches. Diese besteht grundsätzlich darin, data für den vorliegenden Zweck durohgesteuerte saure Hydrolyse gewonnene Cellulose-KriBtallit-Aggregate mit einem einheitlichen durchsehnitb-

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lichen Polymerisationsgrad verwendet werden.Mit Hilfe der adsor-Meren/Materialien der vorliegenden Erfindung können komplexe Gemische von Aminosä.uren_s wie sie zum Beispiel in Protein-Hydrolysaten vorhanden sind, in die einzelnen Aminosäuren oder in kleine Gruppen derselben getrennt werden, welch letztere ihrerseits mit Hilfe einer oder mehrerer zusätzlicher Arbeitsstufen weiter getrennt werden können«, Diese erf indungsgeraäßen Trennungsstufen lassen sich wesentlich vorteilhafter durchführen als diejenigen^ welche mit Hilfe der bekannten Ionenaustauscher, einschließlich der Austauscher auf Kunstharzbasis und der Austauscher _s die aus den bekannten Gellulosematerialien aufgebaut sind_? durchgeführt werden,»

Ionenaustauscher auf der Basis von Cellulose-Kristallit-Aggregat-=Dei"ivaten weisen eine Reihe von erwünschten charakteristischen physikalischen'und mechanischen Eigenschaften auf, durch welche sie den bekannten Austausch-Materialien überlegen sindo Sie sind zum Beispiel frei von dunklen Verfärbungen und von Gerüchen^ wie sie die Kunstharz-Materialien häufig aufweisen, und ihre Teilchengrößen können wesentlich leichter eingestellt werden als vergleichsweise die der bekannten Materialien

'//as die bekannten Cellulosederivate anbelangt, so gestattet ihre faserartige Matur nur eine lockere Packung innerhalb der Trennsäule, was die Bildung von luftgefüllten Hohlräumen zur Folge hat, die zur Ausbildung von Kanälen führen. Auf der

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anderen Seite sind die Derivate der Aggregate von einer nicht faserartigen Partikel-Form, lassen sich demzufolge dicht packen und zeigen keine Kanalbildung,

Man Kann die Derivate der Aggregate auch aussieben, um zu Fraktionen von genau festgelegter und einheitlicher Teilchengröße zu gelangen , und die Teilchengröße selbst kann so klein gewählt werden, daß man zu einem völlig anderen Größenordnungs-Bereich gelangt, wenn man sie mit jener der bekannten Cellulosederivate in Vergleich setzt.Bekanntlich viird die Schärfe der Trennung eines Beschickungs-Gemisches im allgemeinen umso, besser, Je kleiner die Teilchengröße des Austauscher-Materials ist. Demzufolge kann die Überfläche der Derivate der Aggregate gewünschtenfalls um ein Vielfaches größer eingestellt werden, als die der faserartigen Materialien. Das letztgenannte Material ist wegen seiner Faserstruktur durch Aussieben nur schwierig zu unterteilen, und es kommt nicht selten vor, daß man Produkte mi* einer Teilchengröße in Händen hat, deren eine Dimension sich in der Gröseenordnung von I oder 2 Mikron bewegt, deren Länge sich jedoch bis zu 1000 Mikron oder darüber hinaus erstreckt.

Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, daß die Derivate der Aggregate ein höheres Schüttgewicht aufweisen als die bekannten Gellulose-Materialienj das bedeutet, daß von glei chen Gelfichtsteilen der beiden Aggregate die Derivate der Aggregate ein kleiners Volumen, vielleicht nur 50 % oder weniger, des Volumens der bekannten Cellulose-Materialien

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einnehmen. Soll ein Beschickungs-Gemisch durch jedes dieser Materialien getrennt werden, so brauchen die Aggregat-Derivate wesentlich weniger stark benetzt werden, als das bekannte Material und entsprechend sind auch die zurückbehaltenen Mengen bzw. die Zurückhaitunge-Verluste kleiner. . Der technische Vorteil, der mit den Derivaten der Aggregate verbunden ist, ist ganz augenfällig und er wirkt sich besonders dann günstig aus, wenn es sich um die Trennung eines kostspieligen Beschickungs-Gemisches oder um die Trennung von dessen Komponenten handelt. Auch die Menge des zur Eluierung notwendigen Lösungsmittels kann geringer bemessen werden, und es braucht folglich auch nur eine kleinere Menge des Lösungsmittels aus der eluierten Verbindung abgedampft zu werden.

Die Derivate der Aggregate weisen den besonders erwünschten Vorteil auf, daß sie in reproduzierbarer Weise in einem Zustand gleichmäßig hoher Reinheit gewonnen werden können. Diese charakteristische Eigenschaft ist nicht nur von Bedeutung bei.der Trennung von Gemischen, die gegen Verunreinigungen empfindlich sind, sondern sie begründet zugleich eine Überlegenheit gegenüber den bekannten Cellulose-Derivaten, deren eigenschaftsmäßige Reproduzierbarksit von Charge zu Charge schwankt» Es ist bekannt, daß die handelsübliche ^f.^:öä.j.uloss amorpiia B&gionen durch die Celluloseketten hin«· 'Uv·.·-0:1 V'-TttäiltJ enthält* cie^sn Gehalt u_o&. aus Xylaises und riamionsn baotsnt» Di© Mengs de*· letztgenannten Materialien schwankt von Cellulose zu Cellulose ebenso wie auch die Cellu-

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lose selbst τοπ Fabrik zu Fabrik und von Saison zu Saison verschieden ist und demzufolge sind auch die Derivate, die aus dieser Cellulose hergestellt werden, in gleicher Weise von Ansatz zu Ansatz mit verschiedenen Eigenschaften ausgestattet. Auf Grund dieser Schwankungen ist es praktisch unmöglich, aus der im Handel befindlichen Cellulose gleichmäßige oder reine Derivate herzustellen. Was den Aschegehalt anbelangt, so können die Derivate der Kristallit-Aggregate einen Aschegehalt von weniger als 500 Teilen pro Million Teile, ja sogar weniger als lOOOeilen pro Million Teile aufweisen, wohingegen die bekannten Cellulosederivate Aschegehalte von 800 Teilen pro Million Teile aufwärts besitzen.

Bei der Behandlung von trennbaren Beschickungs-Gemischen, wie zum Beispiel Aminosäuren und Proteinen, können die Aggregat-Derivate eine höhere Adsorptions-Kapazität aufweisen als die Kuntharz-Austauscher und auch als die Austauscher auf der Basis der bekannten Cellulosederivate. Darüber hinaus können diese Beschickungs-Gemische bzw. einzelne Komponenten derselben von den Derivaten der Aggregate unter milden Bedingungen desorbiert werden, das bedeutet, daß als Desorption- oder Eluierungsmittel schnwach reagierende chemische Stoffe, welche die Besohiokungs-Komponenten oder das Derivat nicht angreifen, verwendet werden können.

Aufgrund dieser technischen Vorteile und von weiter unten noch beschriebenen Vorteilen zeichnen sich die Derivate der Kristallit-Aggregate bei vielen Beschickungs-Gemischen durch

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eine überlegene Trennwirkung aus.

Die Ionenaustauscher-Derivate der Aggregate können sowohl Kationenaustauscher als auch Anionenaustauscher sein.

Zu den geeigneten Kationenaustauschern gehören die Garbonsäure-Derivate der Gellulose-Kristall!t-Aggregate,einschließlich der 6-Carboxyl- und der 2,3-Dicarboxyl-Derivate^; die gemischten Carboxyl- und Aldehyd-Gruppen enthaltenden Derivate der Aggregate j und die Garboxy-äther-Derivate der Aggregate, wie z.B. die Carboxymethyl-, Garboxyäthyl- und andere Garboxyalkyl-Derivate.Weitere brauchbare Materialien sind die jSsterderivate anorganischer Säuren, zum Beispiel die Phosphat- und Sulfat-Derivate der Aggregate ; ferner Äther-Derivate der Phosphonoalkyl-, Sulfoalkyl- und SuIf inoalkyL-Reihe, zum Beispiel die Phosphonomethyl-, Sulfomethyl-, Sulfoäthyl- und SuIfinomethyl-Derivate.Die Sulfoalkyl-Derivate enthalten Sulfonsäuregruppen; weiter geeignete Derivate sind die Phosphorigsäureester, die Borsäureester und die Sehwefligsäure%ter; ferner organische Säureester, wie zum Beispiel die Phthalsäure«, Sulfinsäuren und Oxalsäureester. Zu den brauchbaren. Estern gehören schließlich auch die Sulfonsäure- und die Garbonsäureester, in denen Substituentengruppen des Typs 'bSO„H und -RCOOH an die Kohlenstoffatome der Estergruppen -00C- über die Reste "R" gebunden sind,wobei die letztgenannten Heste beliebige Kohlenwassestoffreste darstellen können.

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Zu den Anionenaustauschern gehören die Alkylaminoalkyläther der Aggregate,bei denen die Alkylgruppen 1 bis 6 oder mehr Kohlenstoffatome enthalten können; unter diese Derivate fallen die Diäthylaminoäthyl- und TriäthylaminoäthylJ-äther der Aggregate. Ein weiteres derartiges Derivat ist der Diäthylamino-(2-hydroxypropyl)-äther. Einen noch anderen Anionenaustauscher stellt das Material dar, welches bei der Umsetzung von 'Epichlorhydrin und Triäthanolamin mit den Aggregaten in Gegenwart von Ätznatron gebildet wird. Hierzu gehören weiter die Mono-und Di-harnstoff-Derivate der Aggregate. Andere basische Gruppen enthaltende DErivate werden durch die Alkylaminoalkyl- und Alkylamino-dialkylester der Aggregate dargestellt.

Wie aus der beispielhaft angeführten Zusammenstellung erkennbar ist, enthalten einige der Derivate die ionisierbare Gruppe direkt an die Anhydroglukose-Einheiten der Kristallit-Aggregate gebunden, während andere wiederum derartige Gruppen an das Ende einer Kette gebunden enthalten, die selbst mit ihrem anderen Ende an die Anhydroglukose-Einheiten gebunden ist«

Bei den Aggregaten der Gellulose-Kristallite, aus denen die «-'■■ι jchie.'enartigen Derivate hergestellt werden,handelt es sich um kleine ,vorzugsweise zermahlene Aggregate «ir.,_ir-. .',eifh ■-. lose mit "einem auf einem annähernd einholt gestellte--n Polymerisationsgrad" (ievvH- \ . .·.

merization cellulose). Diese kleinen,zermahlenen Aggregate, ihre Eigenschaften und ein Verfahren zurZerkleinerung

BAD ORK3IINAL 809806/041G

der "Cellulose mit einem auf einen annähernd einheitlichen Wert eingestellten Polymerisationsgrad" sind in einer älteren Patentanmeldung - DAS 1 123 460 beschrieben. Sie stellen saure-unlösliche Produkte dar, die durch die gesteuerte saure Hydrolyse von Cellulose gewonnen werden, und der Wert des "annähernd einheitlich eingestellten Polymerisätionsgrades" (level-off D.P.value) spiegelt die Zerstörung der Ursprung-' liehen Faserstruktur des Cellulosehaltigen Ausgangsmaterials wider. Der Ausdruck" auf einen annähernd einheitlichen Wert eingestellter Polymerisäfcionsgrad"soll sich auf den durchschnittlichen Wert eines solchen annähernd einheitlich eingestellten Polymerisationsgrades des Celluloseproduktes beziehen, und er wird nach der Methode bestimmt, die in der Arbeit von OoA.Battiste "Hydrolysis and Crystallization of

Cellulose" in "Industrial and Engineering Chemistry",Bd.42 (1950),Seiten 502 bis 507 beschrieben ist.

Die Ausgangs-Aggregate sollen vorzugsweise eine Teilchengröße von 5 Mikron oder weniger aufweisen-.,gleichgültig, ob sie durch Zermahlen zerkleinert worden sind oder nicht. Da die Gewinnung von Produkten mit einer Teilchengröße von 5 Mikron oder weniger durch das Zermahlen begünstigt wird, ist es empfehlenswert, eine solche Arbeitsstufe einzuschalten und erforderlichenfalls von der Fraktionierung Gebrauch zu machen,um Produkte mit der gewünschten Teilchengröße zu erhalten.Zu Produkten mit einer Teilchengröße von 5 Mikron oder weniger kann man durch Ausfraktionieren der nicht zer-

mahlenen Aggregate gelangen, wenngleich hiermit auch eine Herabsetzung der Ausbeute verbunden sein kann. Die technisch brauchbaren Derivate sind durch ihre allgemeine Unlöslichkeit ausgezeichnet, und zwar einschließlich der Unlöslichkeit in Wasser, in zahlreichen trennbaren Beschickungsgemischen und in zahlreichen Eluierungsmitteln und Hegenerierungsmitteln. Die Derivate sind weiter dadurch charakterisiert, daß sie in Form diskreter, nicht faserartiger Teilchen mit einer Größe von vorzugsweise 30 bis 70 Mikron vorliegen, obwohl ihre Größe auch unter 30 Mikron bzw. unter 10 oder 5 Mikron, ja gewünschtenfalls auch zwischen 0,1 oder 0,2 und 1 Mikron oder -mehr liegen kann. Diese Derivate sind im wesentlichen top&hemische Derivate, und zwar insofern, als die Gelluloseketten, die in der Oberfläche der Aggregate liegen, zu einem erheblich größeren Anteil in Derivate übergeführt sind als sämtliche andere Ketten der Aggregate. In Form des Substitutionsgrades (D.S.) ausgedrückt, kann man sagen, daß die Derivate einen Substitutionsgrad von unter 1,0, vorzugsweise zwischen 0,01 und etwa 0,85 aufweisen.

Carbonsäurederivate,Derivate, die sowohl Carbonsäuregruppen als auch Aldehydgruppen enthalten, Esterderivate,Ätherderivate und kombinierte Derivate der Aggregate der Cellulose-Kristallite, sowie Arbeitsweisen zu ihrer Herstellung sind in der älteren Patentanmeldung A 36 370 IVb/12 d (P Ik 18 6l6.it-) Beschrieben worden.Wie in dieser Anmeldung gleichfalls ausgeführt worden ist,enthalten die Celluloseketten dar Kristallitaggregate an einem Ende eine potentielle Aldehydgruppe, die zu einer Hydroxylgruppe reduziert oder zu einer CarbonsäuKgruppe oxy«

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diert werden kann, bevor man das gewünschte Derivat der Aggregate bildet.

Die vorliegende Erfindung ist von besonderer technischer Bedeutung bei der trennung und Reinigung von Beschickungs-Gernischen, die Komponenten aufweisen, welche Aminogruppen enthalten, besonders von Gemischen von Aminosäuren aus beliebigen Ausgangsmaterialien, und ganz besonders von Gemischen, wie sie durch saure, alkalische oder enzymatische Hydrolyse von verschiedenen Protein-Materialien, die sowohl tierischer als auch pflanzlicher Herkunft sein können, erhalten werden, und auch bei der Trennung und Reinigung von Gemischen aus biologischen Extrakten, Zu den Proteinen, die hydrolysiert werden können, gehören Gasein, Hefe, Ei«»Albumin und auch Albumine aus Milch, Fischen, Elastin_s Keratin; pflanzliche Proteine, wie Soja, Edestin, Zein, Gliadin; ferner Proteine aus Leim, Gelatine, Seidenfibroin, Seidengummi, Hämoglobin, Serum-Albumin, Serum-Globolin, Blut-Fibrin;Rinderplasma-Albumin und Gemische hieraus mit Hämoglobin, Menschenserum und Pferdeserum.

Um das komplexe Gemisch der Aminosäuren, die in einem Protein-Hydrolysat vorhanden sind, zu trennen, ist es empfehlenswert, es zunächst in eine Serie von Amino säure gruppe η zu tren«= nen und zwar beispielsweise mit Hilfe eines Kationenaustauschers, In diesem Zusammenhang ist der Hinweis von Interesse _s daß man die Aminosäuren in vier Gruppen unterteilen kann :

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(1) in basische Aminosäuren, die aus Diamino-monocarbonsäuren bestehen, welche isoelektrische Punkte zwischen 7,59 und. 10,76 aufweisen, und zu denen Histidin,Lysin,Hydroxylysin und Arginin gehören ;

(2) in neutrale Aminosäuren, die aus Monoamino-monocarbonsäuren bestehen, welche isoelektrische Punkte zwischen 5»6 und 6,3 aufweisen, und zu denen Serin, Threonin, Prolin, Hydroxyprolin, Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin und Methionin gehören j

(3) in saure Aminosäuren, die aus Monoamino-dicarbonsäuren bestehen und isoelektrische Punkte zwischen 2,77 und 3#22 aufweisen, und zu denen Glutaminsäure und Asparaginsäure gehören ; und

(^) in aromatische Aminosäuren, zu denen Phenylalanin , Tyrosin und Tryptophan gehören.

Es versteht sich von selbst, daß die anfängliche Aufspaltung der Gemische der Aminosäuren aus den Protein-Hydrolysaten in Aminosäure-Gruppen nicht zwangsläufig zu Gruppen der vorstehend angeführten Zusammensetzung führt, wenn man auch im allgemeinen feststellen kann, daß die Reihenfolge, in welcher, die Säuren durch den Kationenaustauscher getrennt werden, etwa in Übereinstimmung mit der zunehmenden Basizität steht, das heißt, die stärker sauren Aminosäuren werden weniger fesifc adsorbiert und zeigen eine Neigung, aus der Austauschersäule als erste auszutreten, während die sätkrer basisichen Aminosäuren fester adsorbiert werden und dazu neigen, in der Austauschersäule zurückzubleiben. Nach der Trennung der Aminosäuregruppen

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kann die Trennung der einzelnen Säuren einer Amino säuregruppe in einem separaten Arbeitsgang durchgeführt werden, zum Beispiel mit Hilfe eines andersartigen Ausfcausohermaterials.

Die Ionenaustausch-Derivate der Kristallit-Aggregate sind nicht nur brauchbar zur Trennung von Gemischen von Aminosäuren, sondern sie sind auch von technischer Bedeutung bei der Trennung von Peptiden und auch bei der» Trennung von Gemischen von Proteinen, einschließlich der verschiedenen Proteingemische j die weiter oben angeführt sind und auch einschließlich anderer Proteingemisofoe^ wie zum Beispiel von Enzymen, Muskelextrakte.n _s von Nucleinsäuren und deren Abbauprodtikten u.dgl, mehr« Sie sind weiter von technischer Bedeutung bei der Reinigung von Gemischen von Aminosäuren, von den versehiedenen Proteinen, Nucleinsäuren U₉dgl· Hierbei ist die Reinigung und die Gewinnung von Enzymhaltigen Materialien aus tierischen Milz«_iü3erz.-v Nieren=» und Leberpräparaten von besonderer Bedeutung«,

Im allgemeinen besteht das Verfahren sum Fraktionieren bzw» zum Aufspalten eines AusgangsgemisoJi©s₃ i'Ji© S₅₅B₈ eines Ge«

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BADORiGINAL

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oder Lösungsmittels eluiert. Auf Grund der verschiedenen Assoziierungsgrade, die zwischen den Komponenten des Gemisches und dem Material in der Austauschersäule bestehen, wandern die Komponenten in der Säule mit verschiedener Geschwindigkeit von oben nach unten. Auf diese Weise wird eine Erennung erzielt, und es werden die aufeinanderfolgenden Fraktionen des Eluats und eine oder mehrere Komponenten so gesammelt, wie sie am Boden der Säule austreten.

Die Auswahl des geeigneten Eluierungsmittels hängt von dem Austauschermaterial in der Kolonne und von den Komponenten des Beschickungs-Gemisches ab; zu den für gewöhnlich verwendeten Eluierungsmitteln gehören Chloroform,'Gemische aus Chloroform und Methanol, niedermolekulare Alkohole, die 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthalten, Gemische aus n-Butanol, Isopropanol und W,asser, Wasser selbst, wässrige Säuren, wie zum Beispiel 0,1-n Salzsäure und ü,5~ra Salzsäure, Gemische aus n-Butanll, Isopropanol und 0,1-n Salzsäure, Gemische aus n-Butanol, Isopropanol und 0,5-n Salzsäure, Gemische aus a-Butanol und Essigsäure; Gemische aus n-Butanol,Essigsäure und Wasser, Gemische ausn-Butanol, Essigsäure, Wasser und 2-Äthylhexylamin, ferner Benzok, Bemische aus Citronensäure, Natriumhydroxyd, Salzsäure und Wasser, Gemische aus Citronensäure, Essigsäure, Natriumhydroxyd, Natriumacetat und Wasser, Gemische aus Phosphorsäure und Natriumhydroxyd, Gemische aus Äthanol und Salzsäure, fenner Dioxan, Dimethylformamid, wässrige Salzlösungen,wie zum Beispiel ü,l -n Kochsalzlösung und dergleichensehr. Es können zwei oder mehr verschiedene

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iSluierungsmittel verwendet werden.

Der pH-Wert des Eluierungsmittels kann bei der Trennung von Aminosäuren, Proteinen und anderen Gemischen ein wichtiger Faktor sein«, Durch Änderung des pH-Wertes des ü'luierungsmittels kann man möglichervieise den Assoziierungsgrad der verschiedenen Komponenten der Beschickungsgemische mit dem Material der Aus tauscher säule variieren und auf diese Weise die Geschwindigkeit, mit der sie in der Säule von oben nach unten wandern, beeinflussen. Ss können bevorzugt anzuwendende pH-i/\fei*te für eine wirksame Trennung von Gemischen, wie Protein- und Aminosäuregemische, existieren, und diese Werte können für jedes bestimmte Gemisch ermittelt werden.

Will man die Trennung absatzweise durchführen, so kann man das Material der Austauschersäule aus der Säule in Form eines feuchten Zylinders herausnehmen und in einzelne Abschnitte zerschneiden^ wobei jeder Zylinderabschnitt einem Band aus dem Material plus den absorbierten Komponenten entspricht, und die letztgenannten können dann mit Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels hieraus entfernt werden,, Die Anwendung der Derivate der Aggregate bei dieser letztgenannten Trennungsmethode bringt gegenüber den bekannten Cellulosederivaten den Vorteil mit sich, daß sich die Aggregatderivate beim Zerschneiden in einzelne Bänder scharfund sauber zerschneiden lassen, wohingegen die bekannten Derivate, welche bekanntlich faserartig sind, sich nicht scharf und sauber zer scjjneiden lassen, vielmehr zum Auseinanderreis sen neigen.

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Es ist weiter darauf hinzuweisen, daß die bekannten Derivate auf Grund ihrer Faserstruktur die Neigung zeigen, in der Längsrichtung der Austauschersäule Bänder zu liefern, die ungenaue Begrenzungen aufweisen.

Das Material der Austauschersäule kann dadurch regeneriert werden, daß man ein eine Regenerierung bewirkendes Lösungsmittel oder eine entsprechend wirkende Lösung durch die Kolonne schickt, die jede Substanz, die etwa noch in der Säule anwesend ist, verdrängt. Das zu verwendende Lösungsmittel wird natürlich je nach der Substanz, welche in der Säule adsor~ biert worden war und je nach dem Austauschermaterial variiert werden müssen. Hierzu sei beispielsweise auf die Regenerierung der Säule im nachfolgenden Beispiel 3 verwiesen, bei welchem nach der Reinigung der Larinsäure Äthanol als Eluierungsmittel verwendet wird. Zur Regenerierung der Austauschersäule kann diese mit 0,5- η äthanolischer Salzsäure gewaschen werden. Nach der Regeneration kann die regenerierende Lösung durch das Lösungsmittel verdrängt werden, welches beim nächsten Ansatz zur Eluierung verwendet wird. In der Regel gehören zu den in Frage kommenden Regenerierungsmitteln äthanolisohe Salzsäure, Äthanol selbst, wäßrige Natriumchlorid-Lösungen, basische Alkohollösungen, wie zum Beispiel ö,l-n äbhanolische Natronlauge, wäßrige Saäurelösungen, wie 0,5- η Salzsäure, Chlorof ana. und dergleichen mehr» Weitere geeignete Regenerlerungsaiittel können aus der welter oben angeführten Zusammenstellung der Eluierungsmittel entnommen werden.

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Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

Durch Dispergieren eines Garboxymethyl-Derivats der Gellulose-Kristallit-Aggregate, das einen Substitutionsgrad von etwa 0,5 aufweist, in einem Lösungsmittel, das aus einem Volumen •Butanol, zwei Volumina Isopropanol und einem Volumen Wasser bestand, wurde eine breiartige Masse hergestellt. Diese breiartige Masse ( die eine geeignete Form darstellte,um das Derivat in die Austauschersäule zu füllen, wenngleich dieses Material natürlich auch in trockener Form eingefüllt werden könnte ),wurde vorsichtig längs der Wand einer Glaskolonne von 62 cm länge und 1,5cm Innendurchmesser heruntergegossen. Ein vorher eingeführter Glasstöpsel trug das Derivat in der Säule, Nach Maßgabe des aus der Säule abfließenden Lösungsmittels wurden weitere Mengen der breiartigen Masse von oben eingefüllt. Setzte sich das Derivat nicht weiter ab, so ließ man Lösungsmittel ablaufen, achtete aber sorgfältig darauf, daß das Derivat nicht austrocknete.

Nun wurde ein Gemisch von Aminosäuren technischer Reinheit hergest§.lt, das aus 2o mg d-Asparaginsäure, 20 mg d,l-Alanin und 20 mg !-Histidin bestand* Dieses Gemisch wurde In einem Lösungsmittel gelöst, das au« einem Volumen Butanlol, zwei. Volumin· Isopropanol und einem Volumen 0,1-n Salzsäure bestand· Ώ&β Gesamtvolumen der Lösung betrug 10 ml. Es wurde auf den Kopf der Säule aufgegeben und durch die Säule hin-

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durchlaufen gelassen, wobei man sorgfältig darauf achtete, daß das Flüssigkeitsniareau oberhalb der Oberkante der aus den Derivaten bestehenden Füllung lag. Nach Einfüllung der Charge und ohne die Oberkante der Derivat-Füllung freizulegen, wurde das eluierende Lösungsmittel auf die Säule aufgegeben, und zwar mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 3 ml in 25 Minuten, Das Lösungsmittel hatte die gleiche Zusammensetzung wie dasjenige, das zur Herstellung der breiartigen Masse verwendet worden war, und es diente nun dazu, die Wanderung der Aminosäuren durch die Säule mit verschiedenen Wanderungsgeschwindigkeiten zu bewirken und auf diese Weise das Chromatograram zu entwickeln. Die aus der Säule austretende Flüssigkeit wurde in Fraktionen von je 3 ml unter Anwendung eines Standard-Fraktionssammlers aufgefangen.

Die Fraktionen wurden in folgender Weise analysiert. Es wurde zunächst ein Ninhydrin-Reagenz in Form einer 0,1 $igen Lösung in einem Gitrat-Puffer hergestellt. Der Citrat-Puffer wurde in der Weise hergestellt, daß man 200 ml einer 0,1-n Natronlauge mit Citronensäure versetzte und soviel Säure zugab, daß das Gemisch einen pH-Wert von 5#0 aufwies. Jede aufgefangene 3 ml-fraktion wurde mit 1 ml des Nirihydrin-Reagenzes vermischt, und das Gemisch wurde 20 Minuten lang in siedendes Wasser gestellt. Das Auftreten der blauen Färbung zeigte die Anwesenheit der Aminosäure an, während das Fehlen der blauen Färbung die Abwesenheit einer derartigen Säure erkennen ließ. Die so ermittelten qualitativen Werte sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt :

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Fraktion Hr. Versuchsergebnisse

1-30 negativ

31 - 81 blau

82-89 negativ 90 - 119 . "blau

120 - 150 negativ

151 - 179 blau

180 - 200 negativ

Bezüglich der Fraktionsgruppen Nr, 31 - 8l sei darauf hingewiesen, daß die blaue Färbung in den Anfangsfraktionen dieser Gruppe weniger intensiv war, nach und nach aber intensiver wurde und dann wieder weniger intensiv blieb, wobei die mittleren Fraktionen die intensivste Färbung aufwiesen. Das gleiche Phänomen wurde auch bei den Fraktionsgruppen Nr. 90 119 und 151 - 179 festgestellt.Es wurde angenommen, daß die Intensität der Färbung einer Fraktion proportional der Konzentration der darin enthaltenen Aminosäure war. Der Versuch zeigte an, daß die Fraktionen der Nummern 31 - 81 ü-i-^e d-Äsparaginsäure, die Fraktionen der Nummern 90 - 119 das d_s!«Alanin und die Fraktionen der Nummern 151 - 179 das !-Histidin enthielten»

Die oben beschriebene Versuchsreihe wurde unter Verwendung von bekannter Carboxymethylcellulose als Adsorptionsmittel in der Säule wiederholt mit der Abweichung, daß nur 10 mg anstatt 20 mg von jeder Aminosäure verwendet wurden. Der Gehalt an Aminosäure wurde absichtlich niedriger eingestellt, da angenommen wurde, daß hierdurch die Empfindlichkeit des

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Gemisches für das Trennvermögen des Adsorptionsmittel erhöht würde. Außerdem wurde "bei dem bekannten Derivat eine höhere Durchflußgeschwind!gkeit, nämlich 3 ml in 5 Minuten, eingehalten.Es trat jedoch keine Trennung der Aminosäuren ein, sondern es wurden die folgenden qualitativen Versuchsergebnisse erhalten :

Fraktion Nr, Versuchsergebnis 1-20 negativ

21 - 39 blau

40 - 200 negativ

Hieraus ist klar erkennbar, daß alle drei Aminosäuren gemein« sam mit den Fraktionen der Nummern21 bis 39 aus der Säule austraten.

Beispiel 2

Ks wurde ein Gasein-Hydrolysat der Behandlung unterworfen, und zwar unter Anwendung der im vorangehenden Beispiel beschriebenen Säule. Reines Casein wurde in der Weise hydrolysiert, daß man daselbe 6 Stunden in 150 ml konzentrierter Salzsäure unter Bückfluß erhitzte,Das Casein zeigte die folgenden Analysenwerte : 2,o: % Glührückstand; 8 °i Feuchtigkeit ; 87,5 /έ Protein; 13,7 % Stickstoff j reduzierende Zucker waren in Spuren anwesend. Als Salzsäure diente chemisch reine Säure ; sie hatte ein spezifisches Gewicht ran 1,19 and enthielt, zwischen 37 und 38# HOl. Nach Beendigung der Hydrolyse wurde ein aliquoter feil der entstehenden Hydrolysat-Lösung mit Wasser verdünnt, so daß die Endkonzentration der aliquoten

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Lösung annähernd k- rag des ursprünglichen Caseins je ml der verdünnten aliquoten Lösung entsprach. 2 ml der verdünnten ali quoten Lösung,die etwa 8 mg des ursprünglichen Caseins äquivalent waren, wurden dann als die Beschickung, die auf die Austauschersäule aufgegeben wurde, verwendet.

Wie "bereits erwähnt _t wurde die. Austauschersäule des vorangehenden Beispiels für die Trennung benutzt.Die Säule wurde zunächst mit einem Gemisch gespült, das aus einem Volumen Bütanol, zwei Volumina Ispropanol und einem Volumen 0,1-n Salzsäure bestand. Nach einer derartigen Spülung wurde die Spülflüssigkeit aus der Kolonne dadurch verdrängt, daß man auf sie ein Gemisch aufgäbe, das aus einem Volumen Bütanol, zwei Volumina Isopropanol und einem Volumen Wasser bestand, eine Stufe, die man als "Grleichgewichtseinsteilung" der Säule bezeichnen kann. Es wurde dann das aus dem Casein-Hydrolysat bestehende Beschickungs-Material am Kopf der Kolonne aufgegeben und, wenn das Flüssigkeitsniveau der Beschickung mit der Oberkante des Adsorptionsmittels in der Säule übereinstimmte, wurde das Eluierungsmittel aufgegeben, als welches das gleiche Lösungsmittel verwendet wurde, das im vorangehenden Beispiel zur Anwendung kam. Die Durchfluflgesohwindigkeit des Lösungsmittels war ebenfalls die gleiche wie im vorangehenden Beispiel und das Eluat wurde in Form von 3 ml-Fraktfionen gesammelt und auf den Gehalt an Aminosäuren unter Benutzung der Methode analyBierfc, die In dem Buch von Snell und Snell "Colorimetric Methods öf Analysis¹¹ _Λ 3. Auf lage, Verlag Van Nostrand Co.Ine·, Selten 107-lOB ( 195** ) beschrieben ist· Diese Methode 1st eine quantitativ· Methode, bei welcher die Intensität der Farbe mit einem

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— (Cl —

Spektrophotometer gemessen wird, und die so bestimmten Intensitäten zur Berechnung der optischen Dichte verwendet werden, wie es im einzelnen in der vorstehend angeführten Bezugliteratur beschrieben ist.Die optische Dichte ist ein Maß für die Lichtabsorption durch die Aminosäuren; genauer gesagt, sie ist der negative Logarithmus der Prozentwerte des 'durchgelassenen Lichts. Durch Auftragen der optischen Dichte gegen die Fraktionsnummern wurde eine Kurve erhalten, die einen sehr hohen, scharfen Scheitelpunkt bei Fraktion Nr. 4ü (optische Dichte 0,6l) aufwies, wobei der Scheitelpunkt bei Frasktion Nr.35 beginnt und bei Fraktion Nr.57 endet. Die Fraktionen der Nummern 1 bis 34 wiesen keine optische Dichte auf. Der Rest der Fraktionen, das sind die Fraktionen der Nummern 58 bis 231, zeigte nur eine geringe, aber allmählich zunehmende optische Dichte, die in der Größenordnung von 0,03 bis 0,21 lag.Die Werte für die optischen Dichten waren bei den Fraktionen der Nummern 35 bis 57 die folgenden :

Fraktion Nr.	optische Dichte	Fraktion Nr.	optische Dichte
35	0,03	47	0,28
36	0,15	48	0,24 ·
37	0,31	49	0,22
38	0,46	50	0,17
3$	0,57	51	0,15
40	0,61	52	0,10
4i	0,52	53	0,09
42	0,46	54	0,05
43	0,41	55	0,04
44	0,38	56	0,02
45	0,31	57	0,01
46	0,30

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Das Material in den Fraktionen der Wummern 35 bis 57 bestand hauptsächlich aus Glutaminsäure neben etwas Asparaginsäure. Genauer gesagt, die Fraktionen der Nummern 35 bis ^6 enthielten im wesentlichen Glutaminsäure und die Fraktionen der Nummern ^6 bis 57 enthielten in der Hauptsache Asparaginsäure,, Die Fraktion Nr.*K) enthielt etwa ^- Gewichtsprozent des Aminosäuregehalts des ursprünglichen Gaseins»

Ebenso können Alkaloide, die aus natürlichen stickstoffhaltigen organischen Basen, im allgemeinen aus tertiären Aminen, bestehen, gereinigt werden.

Es ist natürlich selbstverständlich, daß bei diesen Arbeitsgängen ein Derivat vom Charakter eines Kationenaustauschers verwendet wird, wenn es sich darum handelt, kationische Substanzen zu adsorbeiren und daß andererseits ein Derivat vom Charakter eines Anionenaustauschers verwendet wird, wenn es sich darum handelt, anionische Substanzen zu adsorbieren.

Jedes der unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fallenden Derivate der Kristallit-Aggregate kann in Gegenwart von Wasser zermahlen werden, um ein Gel zu bilden, und es ist in dieser Form brauchbar zur Anwendung bei der Gel-Elektrophorese zum Zweck der Trennung von Stoffgemischen, der Reinigung von Verunreinigungen enthaltenden Verbindungen, zur Isolierung der gewünschten Verbindungen und dergleichen mehr_e

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Ein weiterer Vorteil der Aggregat-Derivate vom Ionenaustauscher-Typ ist der Umstand, daß die austauschbaren Ionen leichter zugänglich sind als die von Ionenaustauschern vom Typ der Kunstharze und vom Typ der aus den bekannten Cellulose-Derivaten bestehenden Materialien, Bei den Materialien vom Typ der Kunstharze besteht der Austauscher für gewöhnlich nicht aus einer langen Polymerisat-Kette, sondern er stellt weit häufiger ein dreidimensionales, vernetztes Polymerisat dar, bei welchem viele austauschbare Ionen in dessen amorphen Innern örtlich so angeordnet sind, daß sie für die auszutauschenden Ionen und für das' eluierende Medium nur schwer zugänglich sind. Und bei den bekannten Cellulosederivaten ist das Vorhandensein der ionisierbaren Gruppen im Innern der amorphen Regionen bzw. der Matrizen die Ursache dafür, daß sie weniger leicht zugänglich sind. Im Ergebnis erfolgt also bei den Aggregat-Derivaten auf Grund des Umstandes, daß die ionisierbaren Gruppen mehr in ihrer überfläche angeordnet und daher leichter zugänglich sind, der Austausch mit einer grös« seren Geschwindigkeit.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der Neigung der bekannten Materialien, während des Gebrauchs zu quellen, und es ist wesentlich, darauf hinzuweisen, daß die Aggregat-Derivate im Wasser weit weniger quellen als die Derivate der bekannten Cellulose-Arten« Von vielleicht noch größerer Bedeutung ist der Umstand, daß daß Quellen der letztgenannten Derivate nur schwer, 3a fest überhaupt nicht zu steuern ist, eine

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Tatsache, die - wie man annehmen kann - mit dem Vorhandensein der amorphen Hegionen in den Molekül-Ketten der Derivate in Beziehung steht. Der Nachteil dieses Quellens besteht darin, daß sich dann, wenn es in starkem Ausmaß eintritt, ein unerwünschter Widerstand gegen den Durchfluß der Beschickung bzw. des Eluierungsmittels ausbildet. Ist aber das Quellen nur schwierig zu steuern, so ist klar, daß der Strömungswiderstand zu einem ernsten Störungsfaktor werden kann.

Im Gegensatz zu den Austauscher-Materialien vom Typ der Kunstharze sind die Aggregat-Derivate gegenüber vielen Lösungsmitteln inert, und es kann aus diesem Grunde eine Vielzahl von Eluierungsmitteln und auch von Regenerierungsmitteln verwendet werden. Da die Derivate der Aggregate dem Angriff weniger ausgesetzt sind, werden sie auch leichter regeneriert als die Materialien vom Typ der Kuntharze. Darüber hinaus können sie auf Grund der Abwesenheit von amorphen Regionen mit Hilfe einer weit größeren Anzahl von Mitteln regeneriert werden als die bekannten Cellulose-Derivate. Die letztgenannten Derivate sind wegen des Vorhandenseins der amorphen Zonen hingegen dem Angriff durch saure Regenerierungsmittel ausgesetzt.

Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, daß die Derivate der Aggregate einen hydrophilen Charakter aufweisen. Dies " erklärt sich aus dem Umstand,,daß die Cellulose-Kristallit-Aggregate¹, aus denen die Derivate gewonnen werden, eine große ·

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Zahl von Hydroxylgruppen enthalten, von denen mindestens einige die Umwandlung der Aggregate überstehen. Auf Grund dieses hydrophilen Charakters sind die Derivate von besonderem Wert für die Trennung von Beschickungs-Gemischen, deren Komponenten Aminogruppen enthalten.

Der in dieser Erfindungs-Beschreibung gebrauchte Ausdruck "Adsorptions-Material" soll sowohl solche Derivate bezeichnen, die ionisierbare Gruppen enthalten, als auch solche, die derartige Gruppen nicht enthalten.

Unter den Ausdrucken " flüssiges Gemisch" bzw. " fließfähiges Gemisch " sollen trennbare Beschickungs-Gemische verstanden werden, die in einem flüssigen oder verflüssigten bzw, fließfähigen Zustand vorliegen. Zu ihnen gehören Lösungen, kolloidale Lösungen, kolloidale Suspensionen und breiartige Massen. Unter diese Bezeichnungen fallen auch geschmolzene Gemische, falls derartige Gemische bei normalen Temperaturen nicht flüssig sind. Zu den kolloidalen Suspensionen gehören auch Suspensionen eines trennbaren Virus, Enzyme, Proteine, Poly.peptide und dergleichen mehr. Darüber hinaus können auch manche flüssigen Beschickungs-Gemische in die Trennsäule eingeführt werden, ohne daß sie vorher mit Hilfe eines Lösungsmittels in eine Lösung umgewandelt wurden.

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Claims (5)

1./ Verfahren zur Trennung von Verbindungen aus einem Gemisch, insbesondere von Aminoverbindungen, bei dem eine Lösung dieses Gemisches mit einem wasserunlöslichem, lonenaustauschaktive Gruppen enthaltenden Cellulose-Derivat in Kontakt gebracht wird, wobei zumindest ein Teil der Aminoverbindungen hiervon absorbiert wird, zum Entfernen der absorbiesten Verbindungen diese mit einem Eluierungslosungsniittel eluiert werden und mindestens eine Fraktion, die weniger Verbindungen enthält als das Gemisch, gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Cellulose durch gesteuerte saure Hydrolyse gewonnene Gellulöse-Kristallit-Aggregate mit einem einheitlichen durchschnittlichen Polymerisationsgrad verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch von Aminosäuren behandelt wird»

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch von Proteinen behandelt x^ird,

k_a Verfahren nach Anspruch I₃ dadurch gekennzeichnet, daß als Geraisch ein Hydrolysat von Protein oder Kasein verwendet wird»

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch von Alkaloiden behandelt wird.

"■i t Μ leriagen (Art 7 S t Abs. 2 Nr. I .Setz 3 des Änderung«. ♦· *· »■ »6'

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