DE2505307C2

DE2505307C2 - Verfahren zur Reinigung eines Alkali- oder Ammoniuminsulins

Info

Publication number: DE2505307C2
Application number: DE19752505307
Authority: DE
Inventors: Richard Lee Indianapolis Ind. Jackson
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1975-02-07
Filing date: 1975-02-07
Publication date: 1984-11-29
Also published as: DE2505307A1

Description

a) Reinheit des Insulins wenigstens etwa 80%,

b) Konzentration an Insulin von etwa 1 bis 8% auf Gewicht pro Volumen bezogen,

c) InsuJin-Gesamtmenge für eine Säulenbeladung von etwa 0,8 bis 6,7 g pro Liter Bettvolumen ausreichend und

d) einem pH-Wert von etwa 2,5 bis 3,5

auf die Säule aufbringt und mit einem wäßrigen Elutionsmlttel, dessen pH-Wert in dem unter d) angegebenen Bereich liegt, eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ale Gelfiltration bei einer Säulenbeladung von etwa 3,5 bis 5,0 g pro Liter Bettvolumen durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelfiltration bei einer Säulen-' beladung von etwa 4,5 g pro Liter Bettvolumen durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Insulin in 0,5 η Essigsäure löst und den pH-Wert mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure einstellt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Elutionsmlttel verwendet, das 0,5 η Essigsäure enthält. :

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Elutionsmlttel verwendet, das bis zu etwa 0,02 Mol, vorzugsweise etwa 0,01 Mol, eines anorganischen Salzes enthält.

Insulin wurde Im Jahre 1921 als Komponente des Pankreas entdeckt und erlangte dann weltweite Bedeutung zur Behandlung von Diabetes mellltus. Bei der Extraktion von Insulin aus Pankreasgewebe werden jedoch auch ziemliche Mengen an Nichtinsulinprotein entfernt, und dieses muß zur Reinigung des Insulins durch geeignete Methoden abgetrennt werden. Die wichtigste handelsübliche Form von Insulin Ist Zinkinsulin, so daß die letzte Stufe bei der Reinigung normalerweise In einer Auskrlstalllsatlon mit Zlnklonen besteht. In den letzten Jahren wurde nun jedoch festgestellt, daß auch In solchen handelsüblichen Zinkmischungen Nichtinsulinproteine, bei denen es sich hauptsächlich um ProInsulin und prolnsullnähnliches Protein handelt, In geringer Menge vorhanden sind. Diese Komponenten machen Im allgemeinen zwar weniger als etwa 8 Gew.-% aus, sind jedoch lnso-i fern störend, als man wenigstens einige von Ihnen für antigen oder Immunogen hält, wie beispielsweise berichtet wird In Science 161, 165 (1968), Diabetes 18, 725 (1968), Bio-Sclence 20, 701 (1970) und Ann. Rev. Med. 22, 1 (1971). Es besteht daher das Problem, wie man Nichtlnsullnprotelne In technischem Maßstab vom Insulin abtrennen kann. :

Durch bekannte Auftrenntechniken für biologische Substanzen In analytischem Maßstab, wie durch Elektrophorese und Ionenaustauschchromatographie, lassen sich auch die Nichtinsulinbestandteile von der Insulinkom ponente, die neben Insulin auch Insulinähnllche Proteine einschließt, aus technischen oder sogar rohen Insullnpräparatlonen abtennen. Hierdurch kann man sogar die Insulinkomponente im Insulin selbst und desamldlerte Insuline auftrennen. Im technischen Maßstab sind diese Verfahren jedoch nicht sonderlich geeignet.

Ein an einen technischen Maßstab leichter anpaßbares Verfahren 1st die Gelflltratin, und zwar sowohl die Gelexklusionschromatographie als auch die Gelpermeatlonschromatographle. Hierbei werden Proteine auf einer mit einem vernetzten Gel bepackten Säule voneinander getrennt. Solche Verfahren wurden daher In der Vergangenheit auch bereits zur Reinigung von Insulin herangezogen, wobei als Gele vorwiegend vernetzte Dextrane| verwendet wurden. ]

In DE-OS 19 40130 (= GB-PS 12 85 024) wird unter anderem ein Verfahren zur Reinigung von Insulin; beschrieben, bei dem eine Lösung des zu reinigenden Insulins, das eine Reinheit von wenigstens etwa 80% aufweist, zunächst mit Zlnklonen und einem Cltratpuffer behandelt und dann einer Gelfiltration oder einer, Kombination aus Gelfiltration und Säulenchromatographie unterzogen wird. Dieses Verfahren geht somit von kristallinem Zinkinsulin aus, das sich wesentlich schlechter reinigen läßt als beispielsweise Natriuminsulin. Das. hiernach erhältliche gereinigte Insulin hat einen K^-Wert von 0,5, und dies bedeutet, daß die hierdurch erzielbare Abtrennung der störenden Verunreinigungen nicht sehr effektiv 1st. Man erhält hiernach Insulin mit einer Reinheit von 95%, das als Rest jedoch immer noch das Infolge seiner antlgenen Wirksamkeit sehr störende "' ProInsulin enthält. '

In Acta Biol. Med. Germ. 33, 399 bis 406 (1974) wird ein Verfahren zur Reinigung von kristallinem Insulin durch Gelchromatographie einer entsprechenden Lösung an Dextrangel (Sephadex® G-50 fein) beschrieben. Diese Gelfiltration wird In 50%lger Essigsäure, und somit In einem sauren System, durchgeführt, was ebenfalls ι einen nur ungenügenden Reinigungseffekt zur Folge hat.

Aus Experientla 28, 1169 (1972) und aus Chem. Abstracts 81 (1974), Referat 16 731 sind Verfahren zur Abtrennung höhermolekularer Fraktionen von Insulin und somit zur Reinigung von Insulin bekannt. Das erste

Verfahren besteht In einer Gelfiltration in einem sauren System. Beim zweiten Verfahren werden keine Angaben gemacht, welches Lösungsmittelsystem hierfür verwendet wird. Es dürfte sich dabei jedoch ebenfalls um ein essigsaures System handeln. Diese beiden Verfahren ergeben somit genau wie die oben beschriebenen Arbeitsweisen unter Verwendung 50%lger Essigsäure wiederum nur eine unvollständige Reinigung.

Es gibt auch bereits eine Reihe anderer Verfahren zur Reinigung von Insulin durch Gelchromatographie in einem sauren, beispielsweise essigsauren System. Alle diese bekannten Verfahren machen jedoch ausschließlich Gebrauch von kristallinem Zinkinsulin (Handelsinsulin), wodurch sich kein Insulin mit besonders hohem Reinheitsgrad erzielen läßt.

Die bekannten Verfahren zur Reinigung von Insulin durch Gelfiltration sind obigen Angaben zufolge insgesamt unbefriedigend, da sie trotz des dabei auftretenden Verlusts an Insulin kein Insulin mit der an sich erwünschten Reinheit ergeben, nämlich ein Produkt, das neben Insulin selbst praktisch nur noch nlchtstörende Insulinähnliche Proteine enthält. Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Reinigung von Insulin, das in einfacher Welse ein Produkt mit hohem Reinheitsgrad ergibt, und diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch das aus den Ansprüchen hervorgehende Verfahren gelöst.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren vorgeschriebenen verschiedenen Parameter ergeben nun überraschenderwelse ein Insulin mit einer so hohen Reinheit, daß der darin enthaltene Prolnsullngehalt weniger als 0,5 Gew.-« beträgt, während sich unter Anwendung eines bekannten Reinigungsverfahrens nur ein Insulin erzielen läßt, das immer noch etwa 5 Gew.-% oder sogar bis zu 10 Gew.-% und mehr Proinsulln enthält. Nach der in DE-OS 1940130 beschriebenen Arbeitsweise ergibt sich beispielsweise ein gereinigtes Insulin mit einem K,,-Wert von 0,5, während erflndungsgemäß gereinigtes Insulin über einen K^-Wert von etwa 0,7 bis 0,8 verfügt, was eine wesentlich bessere Abtrennung der störenden Verunreinigungen belegt. Erflndungsgemäß läßt sich daher im allgemeinen ein Insulin mit einer Reinheit von bis zu 99% oder jedenfalls einer Reinheit erzielen, daß praktisch keine störenden Verunreinigungen durch ProInsulin mehr vorhanden sind, was einen mit bekannten Verfahren nicht zu erreichenden Reinigungseffekt bedeutet. Der Reinheitsgrad von Insulin steht mit seiner antigenen Wirksamkeit In umgekehrter Beziehung, so daß jede noch so geringe prozentuale Verringerung der in Insullnen vorhandenen Verunreinigungen für den an Diabetes mellitus leidenden und mit Insulin zu behandelnden Patienten ganz wesentlich 1st. Daß sich dieser hohe Reinheitsgrad praktisch nur unter Anwendung der beim erfindungsgemäßen Verfahren vorgeschriebenen verschiedenen Parameter, und zwar insbesondere auch durch Verwendung eines Alkali- oder Ammoniuminsulins, erreichen läßt, 1st Im Lichte des Standes der Technik als besonders überraschend anzusehen.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann im allgemeinen jedes In Wasser quellbare und für Proteinlösungen geeignete Gel eingesetzt werden, das Im Trockenzustand und somit im nlchtgequollenen Zustand, eine Wasserrückaufnahme von wenigstens etwa 4 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des Trockengels, und einen Teilchendurchmesser von weniger als etwa 0,1 mm aufweist. Die Wasserrückaufnahme des Gels beträgt vorzugsweise etwa 4 bis 98%, und Insbesondere etwa 5 bis 20%. Die Durchmesser der Trockengelteilchen sind vorzugsweise kleiner als etwa 0,08 mm und liegen insbesondere zwischen etwa 0,02 .und 0,08 mm. Beispiele geeigneter Gele sind Stärke (unter Einschluß von Malsstärke), vernetztes Galactomannan, vernetztes Dextran, Agar oder Agarose, Polydcylamlde, Copolymere aus Acylamld und Methylenblsacrylamid, Copolymere aus Methylenblsacrylamld und Vinylethylcarbitol und/oder Vinylpyrrolidon. Bevorzugte Gele sind vernetzte Dextrangele.

Die Art der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Säule ist nicht kritisch. Wahl von Höhe, Durchmesser oder Konfiguration der Säule hängen von den gewünschten Verfahrensparametern ab. Mit zunehmender Säulenhöhe wird natürlich die Fließgeschwindigkeit langsamer, da der Säulenrückdruck umgekehrt proportional zur Säulenhöhe 1st. Ein übereinander aufgestockter Säulenaufbau wird daher bevorzugt. Für normale Produktionszwecke ist Im allgemeinen eine Anordnung aus sechs Sektionen ausreichend.

Die Insulin-Gesamtmenge (Alkall- oder Ammonlumlnsulln) Ist beim erfindungsgemäßen Verfahren so gewählt, daß sie für eine Säulenbeladung von etwa 0,8 bis 6,7 g pro Liter Bettvolumen ausreicht, wobei eine Säulenbeladung von etwa 3,5 bis 5,0 g pro Liter Bettvolumen bevorzugt ist und am besten bei einer Säulenbeladung von etwa 4,5 g pro Liter Bettvolumen gearbeitet wird. Natürlich lassen sich ohne weiteres optimale Bedingungen für jede vorgegebene Säule ermitteln.

: Das Gel läßt sich nach irgendeiner bekannten Methode aufquellen und dann in die Säule packen. Im allge- so meinen wird das Gel im Elutlonsmittel aufgequollen. Wahlwelse kann man das Gel jedoch auch In 30%lgem wäßrigem Ethanol aufquellen, dann dekantieren und das Quellmittel durch das Elutlonsmittel ersetzen.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsmaterial benötigte wäßrige Lösung eines Alkall- oder Ammoniuminsulins läßt sich In beliebiger Welse herstellen. So kann man das Insulin beispielsweise In einer entsprechenden Menge Elutlonslösung lösen. Man kann das Insulin aber auch In einem wäßrigen Medium lösen, das etwas stärker sauer 1st als das Elutionsmedlum, dessen Azidität jedoch immer noch Innerhalb des pH-Bereichs des Elutionsmedlums Hegt. Ein In einem solchen Fall geeignetes Elutlonsmittel 1st beispielsweise 0,5 η Essigsäure, die einen pH-Wert von etwa 2,5 hat. Das Alkall- oder Ammonlumlnsulln 1st normalerweise alkalisch oder basisch. Nach Lösen des Insulins In einem neutralen oder sauren wäßrigen Medium steigt der pH-Wert der erhaltenen Lösung daher an. Löst man das Insulin somit in 1,0 η Essigsäure, dann erhöht sich der pH- Wert der erhaltenen Lösung auf etwa 2,7. Je nach der Konzentration des verwendeten Insulins kann die Insulinlösung jedoch auch einen pH-Wert von bis zu 3,2 haben. Diese Erhöhung des pH-Werts ist normal und verursacht keine Probleme, sofern der pH-Wert der Insulinlösung .licht über etwa 3,5 hinausgeht. Wahlweise kann man das Insulin auch In 0,5 η Essigsäure lösen und den pH-Wert mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf unter etwa 3,2 einstellen. .

Das als Ausgangsmaterial benötigte Alkall- oder Ammonlumlnsulln muß eine Reinheit von wenigstens etwa 80% haben und kann nach Irgendeinem bekannten Verfahren hergestellt werden. Es wird vorzugsweise gemäß US-PS 37 19 655 hergestellt. Unter einer Reinheit von wenigstens 80% Ist zu verstehen, daß der Insulingehalt

unter Einschluß der nlchtlnsullnähnlichen Proteine mit hypoglykämlscher Wirksamkeit wenigstens etwa 80% der gesamten vorhandenen Proteine betragen muß.

Die Konzentration an Alkall- oder Ammonlumlnsulln in der auf die Säule aufgegebenen Insulinlösung beträgt etwa 1 bis 8%, auf Gewicht pro Volumen bezogen. Die bevorzugte Konzentration liegt bei etwa 4 bis 6%. S Das Alkali- oder Ammoniuminsulin soll zur Erzielung sauberer Ergebnisse In einem Lösungsmittelvolumen gelöst werden, das geringer ist als das Auftrennvolumen, worauf im folgenden näher eingegangen wird.

Bei der Chromatographie wird der Verteilungskoeffizient K,, als das Verhältnis aus der Konzentration an gelöstem Stoff In der mobilen Phase und der Konzentration an gelöstem Stoff In der stationären Phase definiert. Bei der Gelfiltration Ist die mobile Phase das sich Im Hohlraum zwischen den Gelteilchen bewegende Lösungsmlttel. Die stationäre Phase Ist das in den Gelteilchen aufgesogene Lösungsmittel, nämlich das in den Poren der Gelteilchen eingefangene Lösungsmittel. Der Wert K„ gibt somit den Teil an aufgesogenem Lösungsmittel an, der von einem gelösten Stoff durchdrungen werden kann.

Über den Verteilungskoeffizient K,, läßt sich das Elutlonsvolumen V„ eines gelösten Stoffs durch folgende Gleichung ausdrücken:

v_p = v„ + k„ · v„

worin V₀ das Leervolumen der Säule und V, das Volumen des aufgesogenen Lösungsmittels darstellen. Löst man diese Gleichung nach K_d auf, dann ergibt sich folgender Zusammenhang:

V-V

"²V¹

Wird die Dichte von Wasser als Einheit angenommen, dann gilt

V, = a · W_r,

worin α das Gewicht des Gels Im Trockenzustand ist und W_f die Wasserrückaufnahme bedeutet. Der Verteilungskoeffizient K₀- läßt sich demnach aus folgender Gleichung bestimmen:

aW_r '

Enthält eine Lösung zwei gelöste Stoffe, dann ergibt sich das Elutlonsvolumen für jeden gelösten Stoff aus folgenden Gleichungen:

V,' = V₀ + K/V,-V," = V₀ + K/'V„.

Das Abtrennvolumen V_s ist die Differenz zwischen den Elutionsvolumina aus den beiden gelösten Stoffen, wobei folgendes gilt:

V₅ = (K/' - K/)V,..

Das Ausmaß der Trennung zweier (oder mehrerer) gelöster Stoffe ist somit wenigstens zum Teil von der Säulenbeladung abhängig. Da sich die Menge an niedermolekularem gelöstem Stoff der Grenze der verfügbaren Poren nähert, muß die Trennung zweier gelöster Stoffe notwendigerweise abnehmen. Innerhalb der beim erfindungsgemäßen Verfahren vorgeschriebenen Werte für die Säulenbeladung kann das Ausmaß der Trennung daher schwanken.

so Das erfindungsgemäß zu verwendende wäßrige Elutionsmedium hat einen pH-Wert, der Innerhalb des pH-Werts der zu eluierenden wäßrigen Insulinlösung liegt, nämlich innerhalb eines pH-Werts von etwa 2,5 bis 3,5, Im allgemeinen kann es sich beim Elutionsmedium um eine wäßrige Lösung irgendeiner anorganischen oder organischen Säure handeln, gegenüber welcher Proteine stabil sind und die den obigen pH-Bereich ergibt. Beispiele für solche Säuren sind Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, N-Buttersäure, Isobuttersäure oder Pentancarbonsäure. Essigsäure wird bevorzugt. Bei Verwendung von Chlorwasserstoffsäure muß dem Elutionsmedium auch ein Konservierungsmittel, wie Phenol, beigegeben werden, während Essigsäure selbst als Konservierungsmittel wirkt. Der bevorzugte pH-Wert liegt bei etwa 2,5. Das besonders bevorzugte Elutionsmedium besteht daher aus einer 0,5 η Essigsäurelösung.

Das Elutionsmittel kann gewünschtenfalls bis zu etwa 0,02 Mol eines anorganischen Salzes pro Liter enthalten, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Ammoniumchlorid. Bevorzugt wird eine Salzkonzentration von 0,01 Mol, wobei vorzugsweise Natriumchlorid verwendet wird. Durch Verwendung eines solchen Salzes läßt sich die Auftrennung verbessern und die Absorption basischer Substanzen durch das Gel verhindern.

Die Elution der Säule wird bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 30° C durchgeführt. Vorzugswelse wird bei Umgebungstemperatur oder darunter gearbeitet.

Der Verlauf der Elution wird In geeigneter Welse, beispielsweise durch Messung der Ultraviolettabsorption einer jeden Fraktion bei 280 ΐημ verfolgt. Die das gewünschte gereinigte Insulin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und dann normalerweise zu Zinkinsulin umgesetzt, da dies die derzeit wichtigste Insulinform darstellt.

Die Umwandlung zu Zinkinsulin von erfindungsgemäß gereinigtem Alkall- oder Ammoniuminsulin erfolgt vorzugsweise bei einem pH-WErt von 6,0 In Gegenwart eines Ammoniumacetatpuffers. Eine Isolierung des Alkali- oder Ammoniuminsulins aus dem Elutlonsmltte! oder eine Konzentrierung der Lösung des gereinigten Insulins vor der Kristallisation mit Zink sind nicht erforderlich. Die beim erfindungsgemäßen Verfahren als Eluat anfallende gereinigte Insulinlösung ist nämlich bereits so konzentriert, daß Salz- oder isoelektrische Ausfällungen nicht erforderlich sind, obwohl derartige Verfahren gewünschtenfalls zusätzlich angewandt werden können.

Die gegenüber bekannten Verfahren erfindungsgemäß erzielbare höhere Reinheit des jeweiligen Alkall- oder Ammoniuminsulins und somit auch des daraus gegebenenfalls anschließend hergestellten Zinkinsulins läßt sich durch mehrere Methoden belegen. Eine Möglichkeit hierzu besteht in einer direkten Analyse von Zinkinsulin bezüglich seiner Nichtinsullnproteinkomponenten, wie Proinsulin und Glucagon. Die Gegenwart hochmolekularer Proteine, wozu normalerweise auch das proteolytische Enzym Proaminase gehört, läßt sich ermitteln. Indem man die Stabilität einer Protamininsullnsuspension bei erhöhter Temperatur mißt. Bei Anwesenheit von Protaminase dissoziiert der Protamln-Insulin-Komplex nämlich infolge Protaminabbau. Welter kann man auch andere physikalische Eigenschaften messen, wie die Löslichkeit des Zinkinsulins bei neutralem pH-Wert und die Färbung der erhaltenen Lösung. Schließlich läßt sich die Reinheit des jeweiligen Insulins auch anhand seiner spezifischen Wirksamkeit bei biologischen und immunologischen Versuchen ermitteln.

Das in obiger Welse erhaltene Zinkinsulin ist Infolge seiner besonderen Reinheit ein begehrtes Material zur Formulierung der verschiedenen pharmazeutischen Formen von Insulin, wie normalem Insulin, Isophaninsulin, Protamlnzinkinsulin, Zinklnsullnsuspenslonen oder Globininsulin. Ferner erlaubt dieses reinere Zinkinsulin die Herstellung eines neutralen Insulins, das stabiler ist als saures Insulin, da die bisher in Zinkinsulin vorhandenen Verunreinigungen bei neutralem pH-Wert häufig teilweise ausfallen. Zu solchen Verunreinigungen gehören beispielsweise Insulinabbauende Enzyme, wie Trypsin und Chymotrypsin, die die Stärke der Insulinpräparation vermindern. Weiter lassen sich mit einem solchen reineren Zinkinsulin auch länger wirksame Schweine- und Rinderinsulinzubereitungen formulieren, ohne daß wie bisher eine weitere Reinigung erforderlich 1st. Bei der Herstellung von Isophaninsulin aus solchem Zinkinsulin braucht man zudem beispielsweise weniger Protamin, da durch das Fehlen der sauren Proteinverunreinigungen nur die zur Ausfällung des Insulins erforderliche Proteinmenge verwendet werden muß.

Das erflndungsgemäße Verfahren kann gewünschtenfalls auch mit anderen Reinigungsverfahren kombiniert werden. Man kann die Alkali- oder Ammoniuminsulinlösung daher vor Durchführung dieses Verfahrens -³⁰ beispielsweise ein- oder mehrmals filtrieren, und gleiches gilt auch für das elulerte Insulin vor seiner Umwandlung zu Zlnklnsulln.

Beispiel 1

Ein vernetztes Dextrangel mit einer Wasserrückaufnahme von 5% und einer Teilchengröße von 0,02 bis 0,08 mm wird mit 0,5 η Essigsäure äquilibriert. Mit dem so gequollenen Gel wird eine 10 cm χ 100 cm messende Säule bis auf ein Bettvolumen von 7 Liter (Bettiefe 89 cm) bepackt. Hierauf löst man 17,5 g eines aus Rlnderpankreas erhaltenen und nach dem Verfahren von US-PS 37 19 655 hergestellten Natriuminsulins, das über eine Stärke von 23,8 Einheiten/mg (Reinheit = 92,5%) und einen Proinsulingehalt von 4,21 Gew.-« verfügt, in «o 400 ml 0,5 η Essigsäure. Die Insulinlösung wird auf die Säule gegeben und dann von dieser bei einem Druck von 0,34 bar, was einer Fließgeschwindigkeit von 900 ml pro Stunde (lineare Fließgeschwindigkeit 0,19 ml/cm²/Minute) entspricht, mit 0,5 η Essigsäure elulert. Nach Elution des Hohlraumvolumens (1725 ml) werden Fraktionen von jeweils etwa 23,5 ml aufgefangen, deren Proteingehalt man durch Messen der Ultraviolettabsorption bei 280 mp bestimmt. Es werden auch die Feststoffkonzentrationen in mg pro ml ermittelt. Insge- ⁴$ samt werden 240 Fraktionen gesammelt. Die erhaltenen Fraktionen werden zu den folgenden vier Gruppen vereinigt:

Cimnnp Vnlnmen Fraktionen Prozent Fest- Identifizieriins

■) Prozentuale Menge der gesamten eluierten Feststoffe

' Die Gruppe C wird mit 3,0 ml einer 20%lgen Zinkchloridlösung versetzt und die Losung mit 0,5 η Ammoniumhydroxid auf ein Volumen von 3025 ml verdünnt. Die LOsung wird mit verdünntem Ammoniumhydroxid auf pH 6,0 eingestellt. Das ausgefallene Zlnklnsulln wird abzentrlfuglert, der Reihe nach mit Wasser, absolutem es Alkohol und Ether gewaschen und schließlich unter Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an Zinkinsulin betragt 13,9 g. Das erhaltene Insulin hat eine Starke von 25,6 Einheiten pro mg (Reinheit = 99,6%) und einen Prolnsulingehalt von 0,44%.

Gruppe	Volumen in ml	Fraktionen	Prozent Fest stoffe ^a) in %	Identifizierung
A	1405	10 bis 69	1,4	Hochmolekulare Proteine und Enzyme
B-I	1193	70 bis 119	2,4	Vorwiegend Proinsulin
B-2	978	120 bis 160	9,7	Proinsulin und Insulin zwischenprodukte
Γ.	1520	161 bis 225	86.4	Insulin

Nachdem der Feststoffgehalt der Gruppe C 86,4% der gesamten elulerten Feststoffe beträgt, müßte die maximale Feststoffausbeute aus Gruppe C 86,4% von 17,5 g oder 15,1 g ausmachen. Auf Einheitsbasis bezogen sollte die maximale Ausbeute etwa 360 000 Einheiten betragen. Die Ausbeute an Zinklnsulln aus Gruppe C entspricht somit einer 91,9%lgen Ausbeute, auf das Gewicht bezogen, und einer 98,9%lgen Ausbeute auf Einheiten bezogen. Bezogen auf das eingesetzte Ausgangsmaterial betragen Gewichtsausbeute bzw. Einheitsausbeute 79,4% bzw. 85,4%. _Λ

Die Gruppe B-2 wird mit überschüssigen Zinkionen in der oben für Gruppe C beschriebenen Welse ausgefällt,

worauf man den Niederschlag in 0,5 η Essigsäure löst und auf einer kleineren Säule erneut filtriert. Der Insulln peak wird In der für die Gruppe C beschriebenen Welse umkristallisiert, wodurch man weitere 1,0 g Zinklnsulln

ίο mit einer Stärke von 26,7 Einheiten pro mg (Reinheit = 100%) erhält. Bezogen auf das verwendete Ausgangs materlal beträgt die Gesamtausbeute an Zinklnsulln somit 85,1% auf Gewichtsbasis und 91,8% auf Elnheitsbasts.

Das In Beispiel 1 beschriebene Verfahren läßt sich unter Bezug auf die Zeichnung besser verstehen. Die Zeichnung stellt ein Elutlonsdlagramm für Beispiel 1 dar, nämlich eine Auftragung der optischen Dichte bei 280 ηιμ für verschiedene Fraktionen gegenüber der Fraktlonszahl. Das Diagramm ergibt somit den Proteingehalt is der während der Elution gesammelten Fraktionen an. Die Zusammenfassung einzelner Gruppen Ist durch die gestrichelten senkrechten Linien angegeben. Aus dem Diagramm ergibt sich deutlich, daß das Ausgangsmateris! praktisch aus Insulin besteht und sich die Insulinkomponente wirksam von Prolnsulln und ähnlichen Proteinen abtrennen läßt.

Beispiel 2

Das In Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, wobei man anstelle von Rindernatriuminsulin jedoch 30 g Schwelnenatrlumlnsulln verwendet und die Menge an 0,5 η Essigsäure, In der das Insulin gelöst wird, auf 600 ml erhöht. Das Schweinenatrlumlnsulin hat eine Stärke von 23,3 Einheiten pro mg (Reinheit = 90,7%) und einen Prolnsulingehalt von 2,42 Gew.-%. Man gelangt zu folgenden Ergebnissen:

Gruppe Volumen Fraktionen Feststoffe")

in ml

_:

A 1410 10 bis 69 1,3

B-I 1200 70 bis 119 2,7

B-2 820 120 bis 154 6,0

,C 1920 155 bis 235 90,0

*) Prozentuale Menge der gesamten elulerten Feststoffe

Die Gruppe C ergibt 26,5 g Zinklnsulln mit einer Stärke von 25,3 Einheiten pro mg (Reinheit = 98,6%) und einem Prolnsulingehalt von 0,57%. Die Ausbeute an Zinkinsulin entspricht somit einer Gewinnung von 98,1% auf Gewichtsbasis oder von 95,9% auf Einheitenbasis.

•'S Vergleichsversuch

Stellt man aus dem gleichen Pankreasansatz ein Zinklnsulln her, wobei man anstelle der alkalischen Kristallisation und der Gelfiltration jedoch mit einer herkömmlichen Isoelektrischen Ausfällung aus wäßrigen Lösungsmitteln oder aus Wasser-Alkohol-Lösungsmitteln arbeitet, dann erhält man die gleiche Ausbeute pro kg so Pankreas. Die Stärke dieses Zinkinsulins beträgt jedoch nur 24,3 Einheiten pro mg (Reinheit = 94,6%) und sein Prolnsulingehalt Hegt bei 13,8%.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung eines Alkall- oder Ammonlumlnsulins durch Aufbringen einer wäßrigen Lösung eines Insulinsalzes auf eine ein gequollenes Gel enthaltende Säule, wobei das Gel im Trockenzustand eine Wasserrückaufnahme von etwa 4 bis 98 Gew.-* und einen Teilchendurchmesser von weniger als etwa 0,1 mm aufweist, und Eluieren des Insulins bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 30° C mit einem wäßrigen Elutlonsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung eines Alkali- oder Ammoniuminsulins mit den Kenndaten: