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Verfahren zur Reinigung von Alkali- oder Ammoniuminsulin Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Alkali-oder Ammoniuminsulin durch Gelfiltration
bei einem pH-Wert von 2,0 bis 3,5.
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Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Reinigung eines Alkali-oder
Ammoniuminsulins geschaffen, das darin besteht, daß man ein Gel, das im Trockenzustand
eine Wasserrückaufnahme von wenigstens etwa 4 Gewichtsprozent aufweist, und dessen
Teilchendurchmesser kleiner als etwa 100 Mikron ist, aufquillt, mit dem aufgequollenen
Gel eine Säule bepackt, die bepackte Säule mit einer wässrigen Lösung eines Alkali-
oder Ammoniuminsulins mit einer Reinheit von wenigstens etwa 80 % versetzt, wobei
die
Insulinkonzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 8 Prozent, auf Gewicht pro Volumen
bezogen, liegt, die Insulingesamtmenge für eine Säulenbeladung im Bereich von etwa
0,8 bis etwa 6,7 g pro Liter Bettvolumen ausreicht und der pH-Wert der Lösung im
Bereich von etwa 2,0 bis etwa 3,5 liegt, und schließlich das Insulin bei einer Temperatur
im Bereich von etwa 5 bis etwa 30 OC mit einem wässrigen Eluiermittel, dessen pH-Wert
im gleichen Bereich wie der der Insulinlösung liegt, von der Säule eluiert.
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Aus der Zeichnung geht ein Elutionsdiagramm für Beispiel 1 hervor.
Das Diagramm stellt eine Auftragung der optischen Dichte bestimmter Fraktionen der
Insulinlösung während der Gelfiltration bei 280 m/u dar.
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Seitdem Insulin im Jahre 1921 als Komponente des Pancreas entdeckt
wurde, erlangte es weltweite Bedeutung zur Behandlung von Diabetes mellitus. Bei
den Extraktionsverfahren zur Entfernung von Insulin aus Pancreasgewebe werden jedoch
auch ziemliche Mengen an Nichtinsulinprotein entfernt, und es wurden daher große
Anstrengungen zur Entwicklung von Reinigungsverfahren von Insulin, nämlich Verfahren
zur Abtrennung des Insulins von dem Nichtinsulinprotein, unternommen. Mehrere zur
Insulinreinigung entwickelte Verfahren wurden auch technisch von Bedeutung.
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Eine dieser technisch wichtigen Methoden und eine der ersten überhaupt
bedient sich des allgemeinen Phänomens, daß ein Protein am isoelektrischen Punkt
minimal löslich ist, wenn die sonstigen Faktoren konstant gehalten werden.
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So wird in US-PS 1 469 994 ein Reinigungsverfahren beschrieben, bei
dem die in einem wässrigen Pacreasextrakt befindlichen Nichtinsulinproteine an ihrem
isoelektrischen Punkt ausgefällt werden. Die isoelektrische Ausfällung von Insulin
aus einem wässrigen Pancreasextrakt bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 7 geht
aus US-PS 1 520 673 hervor.
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Nach einem anderen Verfahren erfolgt die Ausfällung von Insulin durch
Zugabe einer ausreichenden Menge eines anorganischen Salzes. Das erste Verfahren
zum Aussalzen von Insulin ist in US-PS 1 547 515 beschrieben, und besteht in einer
Zugabe von Natriumchlorid zu einem Extraktionslösungsmittel. In US-PS 2 449 076
wird ein Differentialaussalzverfahren beschrieben, das darin besteht, daß man Insulin
aus einem neutralisierten Extrakt durch Zugabe von Natriumchlorid aussalzt, das
Ganze abfiltriert, den Rückstand wieder auflöst und das Insulin erneut aussalzt,
wobei allerdings die Salzkonzentration niedriger ist als diejenige beim ersten Aussalzen.
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Ein drittes technisch wichtiges Verfahren zur Reinigung von Insulin
besteht in einer Ausfällung oder Auskristallisation von Insulin aus einer Lösung
in Form eines Zinkinsulinkomplexes.
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Im allgemeinen wird Zinkinsulin aus einer gepufferten wässrigen Lösung
ausgefällt, die Zinkionen enthält. Hierzu werden verschiedene Puffer verwendet,
und nach US-PS 2 626 228 gelangt beispielsweise ein Zitronensäure-Zitrat-Puffer
zur Anwendung.
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Den heutigen technischen Verfahren zur Reinigung von Insulin liegen
alle drei oben erwähnten Methoden zugrunde. Zinkinsulin ist die wichtigste handelsübliche
Form von Insulin, und die letzte Stufe der Insulinreinigung besteht daher normalerweise
in einer Auskristallisation mit Zinkionen.
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In den letzten Jahren wurde jedoch festgestellt, daß Nichtinsulinproteine,
bei denen es sich hauptsächlich um Proinsulin und proinsulinähnliches Protein handelt,
in geringerer Menge in handelsüblichen Zinkinsulinen vorhanden sind. Diese Komponenten
machen im allgemeinen zwar weniger als etwa 8 Gewichtsprozent der handelsüblichen
Zinkinsuline aus, doch nimmt man an, daß einige dieser Komponenten antigen oder
immunogen sind. Es wird in diesem Zusammenhang beispielsweise
auf
Chance et al., Science 161, 165 (1968), Steiner et al., Diabetes 18, 725 (1968),
Bromer, BioScience 20, 701 (1970) und Rubenstein et al., Ann. Rev. Med. 22, 1 (1971)
verwiesen.
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Es besteht daher das Problem, wie man Nichtinsulinproteine in technischem
Maßstab von Insulin abtrennen kann.
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Unter dem Begriff Insulin versteht man nicht nur Insulin selbst, sondern
auch alle insulinähnlichen Proteine, wie Desamidoinsulin. Insulin und insulinähnliche
Proteine verfügen über ähnliche hypoglykämische Wirkungen, und eine Abtrennung des
Insulins von allen anderen pancreatischen Proteinen ist daher normalerweise nicht
erforderlich, d.h.man braucht normalerweise kein homogenes Insulin.
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Durch bekannte Auftrenntechniken für biologische Substanzen in analytischem
Maßstab, wie durch Elektrophorese und Ionenaustauschchromatographie, lassen sich
auch die Nichtinsulinbestandteile von der Insulinkomponente aus technischen oder
sogar rohen Insulinpräparationen abtrennen. Mit diesen Techniken kann man sogar
die Insulinkomponente im Insulin selbst und desamidierte Insuline auftrennen. Im
technischen Maßstab sind diese Verfahren jedoch nicht sonderlich geeignet.
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Ein Verfahren, das sich leichter an einen technischen Maßstab anpassen
läßt, ist die Gelfiltration, worunter man sowohl die Gelexklusionschromatographie
als auch die Gelpermeationschromatographie versteht. Bei diesem Verfahren werden
Proteine auf einer Säule voneinander getrennt, die ein Gel enthält, welches derart
vernetzt ist, daß es innerhalb jedes Gelteilchens Poren gibt. Diese Poren haben
ein begrenztes meßbares Volumen, das zum Quellungsgrad des Gels direkt proportional
und zum Vernetzungsgrad umgekehrt proportional ist. Da kleinere Moleküle wesentlich
leichter in diese Poren eintreten können als größere, wird der Strom der kleineren
Moleküle durch die Säule im Verhältnis zu
den größeren Molekülen,
die nur teilweise oder überhaupt nicht in die Poren gelangen können, erschwert.
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Die Gelfiltration wurde in der Vergangenheit bereits zur Reinigung
von Insulin eingeführt. Bei der Isolierung von Insulin aus einem einzigen Katzenpancreas
erhielt man Rohinsulin durch Säure-Alkohol-Extraktion und anschließende alkalische
Fällung zur Entfernung von inaktivem Material, Konzentration, isoelektrische Ausfällung
und schließlich Aussalzen mit Natriumchlorid. Dieses Rohinsulin wurde dann auf eine
mit einem vernetzten Dextrangel gefüllte Säule gegeben und von dieser mit 1,0 m
Essigsäure eluiert. Davoren, Biochim. Biophys. Acta 63, 150 (1962).
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Zur Isolierung von Insulin aus Fisch wurden Drüsen in Wasser homogenisiert
und die Proteine mit Trichloressigsäurelösung ausgefällt. Die Ausfällung wurde mit
Säure-Äthanol extrahiert, worauf man die Extrakte zur Entfernung der Lipide mit
Methylenchlorid behandelte. Die zurückbleibenden Feststoffe wurden isoliert, in
5,0 m Essigsäure aufgenommen und über einer mit einem vernetzten Dextrangel gefüllten
Säule unter Verwendung von 5,0 m Essigsäure als Eluiermittel filtriert. Humbel,
Biochem. Biophys. Res.
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Commun. 12, 333 (1963). Es werden Ausbeuten von etwa 80 % angegeben.
Humbel weist jedoch darauf hin, daß die Elutionsbedingungen für eine gute Abtrennung
des Insulins von anderen Proteinen eine Dissoziation der Insulinmoleküle begünstigen
sollten. Er berichtet ferner, daß eine 1 r° m Essigsäure kein zufriedenstellendes
Lösungsmittel ist, da das Insulin nach Yphantis und Waugh LBiochim. Biophys. Acta
26, 218 (1957)/ darin nicht vollständig dissoziiert wird.
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Von Epstein et al., Biochemistry 2, 461 (1963) wurde bereits ein Rohextrakt
von Rinderpancreas durch ein vernetztes Dextrangel filtriert. Als Eluliermittel
wurde
0,2 m Ammoniumbicarbonat verwendet, nämlich ein von Humbel
ebenfalls empfohlenes Lösungsmittel. Epstein et al. berichten von einer etwa 60-prozentigen
Ausbeute.
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Insulin wurde auch bereits aus menschlichem Pancreas isoliert.
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Die Drüsen wurden zuerst homogenisiert und extrahiert. Durch Fraktionierung
mit Ammoniumsulfat wurde eine gewisse Menge an inaktivem Material abgetrennt. Das
Insulin wurde dann ausgefällt, und zwar zuerst mit Natriumchlorid und dann durch
eine isoelektrische Fällung. Das dabei erhaltene Insulin wurde in 0,5 n Essigsäure
gelöst und durch vernetztes Dextrangel filtriert. Das filtrierte Insulin wurde anschließend
in Zinkinsulin umgewandelt. Jackson et al., Diabetes 18, 206 (1969). Die Ausbeute
an Insulin nach der Gelfiltration betrug etwa 60 %.
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Nach ZA-PS 69/5280 (die der BE-PS 737 257 entspricht), wurde schließlich
auch bereits eine Kombination aus Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie
eingesetzt. Bei dem einzigen Beispiel, das sich mit einer Gelfiltration befaßt (Beispiel
1), wird Zinkinsulin durch eine mit-vernetztem Dextrangel gefüllte Säule filtriert,
wobei man eine Ausbeute von 80 z erhält. Als Eluiermittel wird 1,0 m Essigsäure
verwendet. Es ist jedoch zu beachten, daß bei diesem Verfahren nach Filtration ein
Aussalzen, eine isoelektrische Ausfällung und ein Zinkkristallisationsverfahren
für erforderlich gehalten werden, damit man Zinkinsulin erhält.
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Jedes bekannte Verfahren unter Verwendung der Gelfiltration zur Reinigung
von Insulin führte jedoch zu einem starken Verlust an Insulin. Darüberhinaus können
dem Stand der Technik keine verlässlichen Angaben entnommen werden, daß man infolge
des Einsatzes einer Gelfiltration nur Insulin (unter Einschluß von insulinähnlichen
Proteinen der oben erwähnten Art) erhält.
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Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann im allgemeinen jedes in Wasser
quellbare Gel eingesetzt werden, das sich zusammen mit Proteinlösungen verwenden
läßt. Die Wasserrückaufnahme des Gels im trockenen oder nicht gequollenen Zustand
sollte jedoch wenigstens etwa 4 Gewichtsprozent betragen, bezogen auf das Gewicht
des Trockengels, und der Teilchendurchmesser sollte kleiner sein als etwa 100 Mikron.
Die Wasserrückaufnahme des Gels liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 4 bis etwa
98 %, und sie beträgt insbesondere etwa 5 bis etwa 20 %. Die Durchmesser der Trockengelteilchen
sind vorzugsweise kleiner als etwa 80 Mikron, wobei ein besonders günstiger Teilchendurchmesserbereich
zwischen etwa 20 und etwa 80 Mikron liegt.
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Beispiele geeigneter Gele sind unter anderem Stärke (unter Einschluß
von Maisstärke), vernetztes Galactomannan, vernetztes Dextran, Agar oder Agarose,
Polyacylamide, Copolymere von Acylamid und Methylenbisacrylamid, Copolymere von
MethylenbisE.crylamid mit Vinyläthylcarbitol und mit Vinylpyrrolidon und dergleichen.
Bevorzugte Gele sind vernetzte Dextrane, wie das von Pharmacia Fine Chemicals, Inc.,
Piscataway, N.J., V.St.A. hergestellte und vertriebene Sephadex.
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Die Art der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Säule ist
nicht kritisch. Wahl von Höhe, Durchmesser oder Konfiguration der Säule hängen von
den gewünschten Verfahrensparametern ab. Mit zunehmender Säulenhöhe wird natürlich
die Fließgeschwindigkeit langsamer, was in anderen Worten ausgedrückt bedeutet,
daß der Säulenrückdruck umgekehrt proportional zur Säulenhöhe ist. Ein übereinander
aufgestockter Säulenaufbau wird daher bevorzugt, wie beispielsweise die Pharmacis
Sectional Column KS-370. Für normale Produktionszwecke reicht eine Anordnung aus
sechs Sektionen.
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Approximativ erhält man eine zufriedenstellende Insulinreinigung mit
einer Säulenbeladung von etwa 4,5 g Alkali- oder Ammoniuminsulin pro Liter Bettvolumen,
und diese Beladung wird besonders bevorzugt. Die Säulenbeladungen können jedoch
im allgemeinen zwischen etwa 0,8 und etwa 6,7 g pro Liter Bettvolumen liegen, und
der bevorzugte Bereich beträgt etwa 3,5 bis etwa 5,0 g pro Liter Bettvolumen. Natürlich
lassen sich ohne weiteres optimale Bedingungen für jede vorgegebene Säule ermitteln.
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Das Gel läßt sich nach irgendeiner bekannten Methode aufquellen und
dann in die Säule packen. Im allgemeinen wird das Gel in dem eluierenden Medium
aufgequollen. Wahlweise kann man das Gel jedoch auch in 30-prozentigem wässrigem
Äthanol aufquellen, dann dekantieren und das Quellmedium durch das Eluiermedium
ersetzen.
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Die Alkali- oder Ammoniuminsulinlösung läßt sich in beliebiger Weise
herstellen. So kann man das Insulin beispielsweise in einer entsprechenden Menge
Elutionslösung lösen. Man kann das Insulin jedoch auch in einem wässrigen Medium
lösen, das etwas stärker sauer ist als das Elutionsmedium, dessen Azidität jedoch
immer noch innerhalb des pH-Bereiches des Elutionsmediums liegt. Verwendet man als
Elutionsmedium beispielsweise 0,5 n Essigsäure mit einem pH-Wert von 2,5, dann kann
man das Insulin in enem wässrigen Medium mit einem pH-Wert von etwa 2,3 lösen, d.h.
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in 1,0 n Essigsäure.
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Das Alkali- oder Ammoniuminsulin ist normalerweise alkalisch oder
basisch. Nach Lösen des Insulins in einem neutralen oder sauren wässrigen Medium
steigt der pH-Wert der erhaltenen Lösung daher an. Löst man das Insulin daher in
1,0 n Essigsäure, dann erhöht sich der pH-Wert der erhaltenen Lösung auf etwa 2,7.
Je nach der Konzentration des verwendeten Insulins kann die Insulinlösung jedoch
auch einen pH-Wert von bis zu 3,2 haben. Diese Erhöhung des pH-Wertes ist normal
und verursacht keine Probleme, sofern der pH-Wert der Insulinlösung nicht über etwa
3,5 hinausgeht.
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Wahlweise kann man das Insulin auch in 0,5 n Essigsäure lösen und
den pH-Wert mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf unter etwa 3,2 einstellen.
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Das Alkali- oder Ammoniuminsulin kann im allgemeinen nach orgendeinem
bekannten Verfahren hergestellt werden. Vorzugsweise erfolgt die Herstellung des
Alkali- oder Ammoniuminsulins jedoch nach der in US-PS 3 719 655 beschriebenen Arbeitsweise.
Wie oben angegeben muß dieses Insulin allerdings eine Reinheit von wenigstens etwa
80 % haben. Dies bedeutet, daß der Insulingehalt unter Einschluß der insulinähnlichen
Proteine mit hypoglykämischer Wirksamkeit wenigstens etwa 80 % der gesamten vorhandenen
Proteine ausmachen muß.
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Die Konzentration an Alkali- oder Ammoniuminsulin in der auf die Säule
aufgegebenen Insulinlösung beträgt, wie oben bereits angegeben, etwa 1 bis etwa
8 %, und zwar bezogen auf Gewicht pro Volumen. Die bevorzugte Konzentration liegt
bei etwa 4 bis etwa 6 %.
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Damit man zu sauberen Ergebnissen gelangt, sollte das Alkali-oder
Ammoniuminsulin in einem Lösungsmittelvolumen gelöst werden, das geringer ist als
das Auftrennvolumen, worauf im folgenden näher eingegangen wird.
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Bei der Chromatographie wird der Verteilungskoeffizient Kd als das
Verhältnis aus der Konzentration des gelösten Stoffes in der mobilen Phase und der
Konzentration des gelösten Stoffes in der stationen Phase definiert. Bei der Gelfiltration
ist die mobile Phase das sich in den Hohlraum zwischen den Gelpartikeln bewegende
Lösungsmittel, und die stationäre Phase ist das Lösungsmittel, das in den Gelteilchen
aufgesogen ist, d.h. in den Poren innerhalb eines jeden Gelteilchens eingefangen
ist. Der Wert Kd gibt somit den Teil an aufgesogenem Lösungsmittel an, der von einem
gelösten Stoff durchdrungen werden kann.
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Über den Verteilungskoeffizienten Kd läßt sich das Elutionsvolumen
Ve eines gelösten Stoffes durch folgende Gleichung ausdrücken: Ve V + Kd . V.
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worin V0 das Leervolumen der Säule und Vi das Volumen des aufgesogenen
Lösungsmittels darstellen. Löst man diese Gleichung nach Kd auf, dann ergibt sich
folgender Zusammenhang:
Wird die Dichte von Wasser als Einheit angenommen, dann gilt Vi
= a.Wr worin a das Gewicht des Trockengels ist und Wr die Wasserrückaufnahme bedeutet.
Der Verteilungskoeffizient Kd wird somit
und kann vom Fachmann experimentell bestimmt werden.
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Unter der Voraussetzung, daß eine Lösung zwei gelöste Stoffe enthält,
läßt sich das Elutionsvolumen für jeden gelösten Stoff wie folgt ausdrücken: Ve'
=Vo + Kd'Vi Ve"=Vo e d + Kd1,Vi.
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Das Abtrennvolumen V5 ist die Differenz zwischen den Elutionsvolumina
aus den beiden gelösten Stoffen: Vs = Ve" - Ve' V d (Kd X Kd )Vi S = (Kd'1 - K Aus
obigen Ausführungen ergibt sich, daß das Ausmaß der Trennung zweier (oder mehrerer)
gelöster Stoffe zum Teil von der Säulenbeladung abhängt. Da sich die Menge an niedermolekularem
gelöstem Stoff der Grenze der verfügbaren Poren nähert, muß die Trennung zweier
gelöster Stoffe-notwendigerweise abnehmen. Innerhalb der als Teil der Erfindung
angegebenen Beladungsgrenzwerte kann das Ausmaß der Trennung schwanken. Gelegentlich
kann man auch eine höhere Säulenbeladung auswählen, um die Abtrennung gegenüber
der Produktivität auszubalancieren.
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Wie bereits oben angegeben, kann das Elutionsmedium einen pH-Wert
im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 3,5 haben. Im allgemeinen kann es sich beim Elutionsmedium
um eine wässrige Lösung irgendeiner anorganischen oder organischen Säure handeln,
der gegenüber Proteine stabil sind. Beispiele derartiger Säuren sind u.a. Chlorwasserstoffsäure,
Phosphorsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, n-Buttersäure, Isobuttersäure,
Pentancarbonsäure und dergleichen. Essigsäure wird bevorzugt. Bei Verwendung von
Chlorwasserstoffsäure muß dem Elutionsmedium auch ein Konservierungsmittel, wie
Phenol, beigegeben werden.
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Es wird darauf hingewiesen, daß Essigsäure als Konservierungsmittel
wirkt. Der bevorzugte.pH-Wert ist etwa 2,5. Das besonders bevorzugte Elutionsmedium
besteht daher aus einer 0,5 n Essigsäurelösung.
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Das Elutionsmedium kann gewünschtenfalls bis zu etwa 0,02 Mol eines
anorganischen Salzes pro Liter enthalten, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumchlorid
und dergleichen. Bevorzugt wird eine Salzkonzentration von 0,01 Mol, und als Salz
wird vorzugsweise Natriumchlorid verwendet.
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Der Einsatz eines derartigen Salzes wird bevorzugt,-um eine Auftrennung
zu verbessern und eine Absorption basischer Substanzen durch das Gel zu verhindern.
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Die Elution der Säule kann bei Temperaturen im Bereich von etwa 5
bis etwa 30 OC vorgenommen werden. Vorzugsweise liegt diese Arbeitstemperatur bei
Umgebungstemperatur oder darunter.
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Der Verlauf der Elution wird in irgendeiner geeigneten Weise verfolgt.
Besonders eignet sich hierzu jedoch ein Verfahren, bei dem man die Ultraviolettabsorption
einer jeden Fraktion bei 280 m/u mißt. Diejenigen Fraktionen, die die gewünschte
gereinigte Insulinkomponente enthalten, werden vereinigt und normalerweise zu Zinkinsulin
umgesetzt.
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Wie bereits oben angegeben ist das Zinkinsulin die wichtigste Form
von Insulin. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene hochreine Alkali-
oder Ammoniuminsulin wird
daher normalerweise in Zinkinsulin umgewandelt.
Die Umwandlung zu Zinkinsulin erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,0 in
Gegenwart eines Ammoniumacetatpuffers.
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Eine Isolierung des Alkali- oder Ammoniuminsulins aus dem Elutionsmedium
oder eine Konzentrierung der Lösung des gereinigten Insulins vor der Kristallisation
mit Zink sind nicht erforderlich. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht
darin, daß das Insulin in Form der eluierten Lösung bereits derart konzentriert
ist, daß Salz- oder isoelektrische Ausfällungen nicht erforderlich sind, obwohl
derartige Verfahren gewünschtenfalls jedoch zusätzlich angewandt werden können.
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Das auf diese Weise erhaltene Zinkinsulin ist infolge des angewandten
Verfahrens reiner. Diese erhöhte Reinheit läßt sich durch mehrere Methoden zeigen.
Hierzu kann das Zinkinsulin beispielsweise direkt bezüglich seiner Nichtinsulinproteinkomponenten,
wie Proinsulin und Glucagon, analysiert werden, Die Gegenwart hochmolekularer Proteine,
wozu normalerweise auch das proteolytische Enzym Proaminase gehört, läßt sich ermitteln,
indem man die Stabilität einer Protamininsulinsuspension bei erhöhter Temperatur
mißt. Falls Protaminase vorhanden ist, dann dissoziiert der Protamin-Insulin-Komplex
infolge Protaminabbau. Es können ferner auch physikalische Eigenschaften, wie eine
Löslichkeit des Zinkinsulins bei neutralem pH-Wert und die Färbung der erhaltenen
Lösung, gemessen werden. Schließlich kann man auch die spezifische Wirksamkeit des
Insulins durch biologische und immunologische Versuche ermitteln.
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Wegen der besseren Reinheit ist das nach Durchführung des Verfahrens
erhaltene Zinkinsulin ein begehrtes Material zur Formulierung der verschiedenen
pharmazeutischen Formen von Insulin, wie normalem Insulin, Isophaninsulin, Protaminzinkinsulin,
Zinkinsulinsuspensionen, Globininsulin und dergleichen.
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Das vorliegende reinere Zinkinsulin erlaubt ferner die Herstellung
eines neutralen Insulins, das stabiler ist als saures Insulin, da die bisher in
Zinkinsulin vorhandenen Verunreinigungen bei neutralem pH-Wert oft teilweise ausfielen.
Zu solchen Verunreinigungen gehören oft Insulin abbauende Enzyme, wie Trypsin und
Chymotrypsin, die die Stärke der Insulinpräparation vermindern. Das reinere Zinkinsulin
erlaubt ferner die Formulierung von länger wirksamen Schweine- und Rinderinsulinzubereitungen,
ohne daß wie.bisher eine weitere Reinigung erforderlich ist. Die Herstellung von
Isophaninsulin aus dem reineren Zinkinsulin erfordert darüberhinaus weniger Protamin,
da durch das Fehlen der sauren Proteinverunreinigungen nur diejenige Protaminmenge
verwenden muß, die zur Ausfällung des Insulins benötigt wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann gewunschtenfalls auch mit anderen
Reinigungsverfahren kombiniert werden. So kann man die Alkali- oder Ammoniuminsulinlösung
vor Durchführung der Gelfiltration beispielsweise einem oder mehreren Filtrationsverfahren
unterwerfen. Ferner kann das eluierte Insulin vor seiner Umwandlung zu Zinkinsulin
auch einem oder mehreren Filtrationsverfahren unterzogen werden.
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Beispiel 1 Ein vernetztes Dextrangel mit einer Wasserrückaufnahme
von 5 % und einer TeilchengröRe von 20 bis 80 /u wird mit 0,5 n Essigsäure äquilibriert.
Eine K100/100-Laborator-Säule (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) mit einem Querschnitt
von 10 cm und einer Länge von 100 cm wird mit dem geauollenen Gel bis auf ein Bettvolumen
von 7 Liter (Bettiefe 89 cm) bepackt. Hierauf löst man 17,5 g eines aus Rinderpankreas
erhaltenen und nach dem Verfahren von US-PS 3 719 655 hergestellten Natriuminsulins,
das über eine Stärke von 23,8 Einheiten/mg und einen Proinsulingehalt von 4,21 Gewichtsprozent
verfügt, in 400 ml 0,5 n Essigsäure. Die Insulinlösung wird auf die Säule gegeben
und dann von dieser bei einem Druck 2 von 0,35 kg/cm , was einer Fließgeschwindigkeit
von 900 ml pro Stunde (linerare Fließgeschwindigkeit 0,19 ml/cm2/Minute) entspricht,
mit 0,5 n Essigsäure eluiert. Nach Elution des Hohlraumvolumens (1725 ml) werden
Fraktionen von jeweils etwa 23,5 ml aufgefangen, worauf man deren Proteingehalt
durch Messen der Ultraviolettabsorption bei 280 m/u bestimmt. Es werden ferner auch
die Feststoffkonzentrationen in mg pro ml ermittelt. Insgesamt werden 240 Fraktionen
gesammelt. Die erhaltenen Fraktionen werden zu den folgenden vier Gruppen vereinigt:
Prozent Volumen an a) Gruppe ml ' Fraktionen Feststoffen Identifizierung A 1405
10- 69 1,4 hochmolekulare Proteine und Enzyme B-1 1193 70-119 2,4 vorwiegend Proinsulin
B-2 978 120-160 9,7 Proinsulin und Insulinzwischenprodukte C 1520 161-225 86,4 Insulin
a)prozentuale Menge der gesamten eluierten Feststoffe
Die Gruppe
C wird mit 3,0 ml einer 20-prozentigen Zinkchloridlösung versetzt, und die erhaltene
Lösung verdünnt man mit 0,5 n Ammoniumhydroxid auf ein Volumen von 3025 ml. Der
pH-Wert der Endlösung wird mit verdünntem Ammoniumhydroxid auf pH 6,0 eingestellt.
Das ausgefallene Zinkinsulin wird abzentrifugiert, der Reihe nach mit Wasser, absolutem
Alkohol und Äther gewaschen und schließlich im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an
Zinkinsulin beträgt 13,9 g. Das erhaltene Insulin hat eine Stärke von 25,6 Einheiten
pro mg und einen Proinsulingehalt von 0,44 %.
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Nachdem der Feststoffgehalt der Gruppe C 86,4 % der gesamten eluierten
Feststoffe beträgt, müßte die maximale Feststoffausbeute aus Gruppe C 86,4 % von
17,5 g oder 15,1 g ausmachen.
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Auf Einheitsbasis bezogen sollte die maximale Ausbeute etwa 360 000
Einheiten betragen. Die Ausbeute an Zinkinsulin aus Gruppe C entspricht somit einer
91,9-prozentigen Ausbeute auf das Gewicht bezogen, und einer 98,9-prozentigen Ausbeute
auf Einheiten bezogen. Bezogen auf das eingesetzte Ausgangsmaterial betragen Gewichtsausbeute
bzw. Einheitsausbeute 79,4 % bzw. 85,4 %.
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Die Gruppe B-2 wird mit überschüssigen Zinkionen in der oben für Gruppe
C beschriebenen Weise ausgefällt, worauf man den Niederschlag in 0,5 n Essigsäure
löst und auf einer kleineren Säule refiltriert. Der Insulinpeak wird in der für
Gruppe C beschriebenen Weise umkristallisiert, wodurch man weitere 1,0 g Zinkinsulin
mit einer Stärke von 26,7 Einheiten pro Milligramm erhält. Bezogen auf das verwendete
Ausgangsmaterial beträgt die Gesamtausbeute an Zinkinsulin somit 85,1 % auf Gewichtsbasis
und 91,8 % auf Einheitenbasis.
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Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren läßt sich unter Bezug auf
die Zeichnung bessser verstehen. Die Zeichnung stellt ein Elutionsdiagramm für Beispiel
1 dar, d. h. eine Auftragung der optischen Dichte bei 280 m/u für verschiedene Fraktionen
gegenüber der Fraktionsanzahl. Das Diagramm gibt somit den
Proteingehalt
der während der Elution gesammelten Fraktionen an. Die Zusammenfassung verschiedener
Fraktionen in die in Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Gruppen ist durch die gestrichelten
senkrechten Linien angegeben. Aus dem Diagramm ergibt sich deutlich, daß das Ausgangsmaterial
praktisch aus Insulin besteht und daß sich die Insulinkomponente wirksam von Proinsulin
und ähnlichen Proteinen abtrennen läßt.
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Beispiel 2 Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt,
wobei man anstelle von Rindernatriuminsulin jedoch 30 g Schweinenatriuminsulin verwendet,
und die Menge an 0,5 n Essigsäure, in der das Insulin gelöst wird, auf 600 ml erhöht.
Das Schweinenatriuminsulin hat eine Stärke von 23,3 Einheiten pro mg und einen Proinsulingehalt
von 2,42 Gewichtsprozent. Man erhält folgende Ergebnisse: Gruppe Volumen, ml Fraktionen
Prozent Feststoffea) A 1410 10- 69 1,3 B-1 1200 - 70-119 2,7 B-2 820 120-154 6,0
C 1920 155-235 90,0 a) prozentuale Menge der gesamten eluierten Feststoffe Die Gruppe
C ergibt 26,5 g Zinkinsulin mit einer Stärke von 25,3 Einheiten pro Milligramm und
einem Proinsulingehalt von 0,57 %. Die Ausbeute an Zinkinsulin entspricht somit
einer Gewinnung von 98,1 % auf das Gewicht bezogen, oder von 95,9 % auf Einheitenbasis.
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Stellt man aus dem gleichen Pankreasansatz ein Zinkinsulin her, wobei
man anstelle der alkalischen Kristallisation und der Gelfiltration jedoch mit einer
herkömmlichen isoelektrischen Ausfällung aus wässrigen Lösungsmitteln oder aus Wasser-Alkohol-Lösungsmitteln
arbeitet, dann erhält man die gleiche Ausbeute pro Kilogramm Pankreas. Die Stärke
dieses Zinkinsulins beträgt jedoch nur 24,3 Einheiten pro Milligramm, und sein Proinsulingehalt
liegt bei 13,8 %.