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L'invention est relative aux procédés pour obtenir certains anti- biotiques basiques; et elle concerne, plus particulièrement, l'obtention de certains antibiotiques contenant des groupements fortement basiques à l'ai- dé d'une série d'opérations faisant intervenir l'usage de résines échangeu- ses d'ions.
Diverses méthodes ont été utilisées pour obtenir des composés an- tibiotiques. Ces méthodes font intervenir généralement des procédés à opé- rations multiples en vue d'obtenir des matières fortement purifiées néces- saires pour permettre leur usage pour la thérapeutique de maladies infec- tieuses. La séparation de la matière active d'avec des impuretés de diffé- rents genres, tant organiques qu'inorganiques, qui a lieu dans les bouil- lons de fermentation nécessite souvent la préparation de dérivés ou de sels complexes, tels que des sels combinés avec certains colorants acides ou avec d'autres acides organiques. Plusieurs de ces procédés prévoient l'usage de solvants organiques pour l'extraction d'antibiotiques hors de la solution aqueuse.
Souvent les procédés d'extraction ont lieu dans des appareils très compliqués tels que les extracteurs de Podbielnak.
Des résines échangeuses d'ions ont été utilisées sur une grande échelle pour une opération faisant partie de procédés pour l'obtention d'an- tibiotiques basiques, plus particulièrement de composés tels que la strep- tomycine. Ces procédés sont décrits dans les brevets E.U.A. n 2.541.420 déposé le 8 janvier 1949, E.U.A. n 2.528.188 déposé le 12 avril 1949, E.U.A. n 2.528.022 déposé le 27 janvier 1945 et E.U.A, n 2.667.441 déposé le 2 août 1950.
Pour certaines de ces méthodes, on s'est servi de résines échan- geuses d'ions portant des groupements carboxyles comme groupements actifs principaux pour l'échange d'ions. Presque toujours, la préparation d'an- tibiotiques basiques purs, amorphes ou cristallisés ou de leurs sels, a né- cessité, toutefois, l'intervention d'opérations telles qu'une précipitation fractionnée sélective ou un fractionnement par extraction par des solvants ainsi que d'autres méthodes en plus de l'usage de résines échangeuses d'ions, en vue d'obtenir la formation de produits ayant une pureté élevée.
On a découvert maintenant que des antibiotiques basiques, y compris des composés tels que la streptomycine, la viomycine, la dihydrostreptomy- cine, l'hydroxystreptomycine, la streptothricine, la mannosidostreptomyoine et la néomycine, qui contiennent généralement des groupements fortement ba- siques tels que des groupements guanidino, peuvent être purifiés d'une ma- nière inattendue quand on a recours à une série d'opérations comprenant l'u- sage de plus d'une opération de purification à l'aide d'une résine acide échangeuse d'ions. Ces antibiotiques sont ceux qui forment, avec des aci- des minéraux, des sels simples, lesquels, en solution aqueuse, ont un pH voisin de la neutralité.
Ce procédé présente de nombreux avantages par rap- port aux procédés utilisés précédemment pour la purification des antibioti- ques basiques, En particulier, le procédé ne nécessite pas l'usage de sol- vants organiques, ni celui d'acides organiques complexes tels que certains colorants, l'acide picrique, l'acide de Reinecke et d'autres agents analo- gues, en vue d'obtenir un degré de purification élevé pour l'antibiotique.
Des appareils relativement simples, qui peuvent être utilisés pour plus d'un de ces antibiotiques, peuvent être utilisés pour la mise en oeuvre de l'in- vention. De plus, comme le même genre d'appareils est utilisé pour chacune des opérations envisagées, l'achat d'appareils de différents genres peut être supprimé et l'installation pour l'obtention de l'antibiotique peut avoir la forme la plus simple.
Un avantage très inattendu du procédé en question est que la for- mation de pyrogènes et de matières analogues à l'histamine, comme cela se
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produit souvent quand on veut obtenir des antibiotiques basiques, plus par- ticulièrement quand ces matières sont mises en contact avec des solvants et maintenues à des pH basiques pendant des périodes prolongées, semble être évitée d'une manière pratiquement complète par la méthode en question. Ce- ci constitue un avantage très utile du procédé car il est souvent nécessai- re de faire intervenir une opération séparée pour se débarrasser des pyro- gènes .
Pour la mise en oeuvre du procédé faisant l'objet de l'invention, on fait passer d'abord une solution antibiotique basique impure, telle qu'un bouillon d'antibiotique filtré, à un pH compris entre une valeur légè- rement acide et une valeur légèrement basique (par exemple entre 6,0 et 9,0), sur une résine échangeuse d'ions dont les groupements échangeurs prin- cipaux sont des groupements carboxyles, cette résine étant préparée par la polymérisation, sous forme de perles, d'acide méthacrylique ou , de préfé- rence, d'un méthacrylate et d'une quantité comprise entre environ 6% et en- viron 12% d'un composé aromatique divinylique, tel que le divinylbenzène, le divinyltoluène, le divinylnaphtalène, etc.., comme matière propre à for- mer des liaisons croisées.
Si l'on utilise un ester pour former la résine, les groupements esters dans la résine doivent évidemment être hydrolisés en groupements acides. Ces résines sont mises sur le marché par la Rohm & Haas Company sous la marque de fabrique "Amberlite IRC50". La résine est, tout au moins partiellement, à l'état de sel et son pH est, de préférence, réglé à une valeur d'équilibre comprise entre la valeur neutre et une valeur légèrement basique (environ 7 à 8) à l'aide d'un alcali, par exemple l'hydro- xyde de sodium ou de potassium, avant d'être mise en contact avec la solu- tion antibiotique. L'antibiotique adsorbé sur la résine est ensuite élue de la résine échangeuse d'ions à l'aide d'un acide dilué, de préférence un aci- de minéral tel que l'acide chlorhydrique ou sulfurique dilué.
Cette opéra- tion, ainsi que les opérations subséquentes du procédé, peuvent se faire au cours d'un traitement dit "à deux tours" décrit dans le brevet E.U.A.
2.528.188 dont question plus haut. Le pH de l'éluat de la résine est réglé, de préférence immédiatement, à une valeur légèrement basique, c'est-à-dire ' entre environ 6,0 et environ 9,0, de préférence entre 7,0 et 8,0. Ceci peut se faire en enlevant l'acide en excès, comme décrit plus loin, ou par l'ad-; dition d'un agent alcalin, par exemple de l'hydroxyde de sodium ou de potas- sium. La solution obtenue de cette manière, bien qu'elle soit beaucoup plus pure, à l'état sec, que ne l'est une solution non purifiée telle qu'un bouil- lon de fermentation, peut convenir à certains usages, par exemple pour la , médecine vétérinaire ou l'agriculture. La solution est ensuite mise en con- tact avec une deuxième résine échangeuse d'ions.
La deuxième résine échangeuse d'ions, utilisée pour effectuer l'o- pération de purification suivante du procédé selon l'invention , est égale- ment une résine échangeuse de cations synthétique. Elle est constituée par une résine ayant une porosité considérable, c'est-à-dire qu'elle est capa- ble d'adsorber une proportion élevée de bases organiques ayant un poids mo- léculaire élevé (supérieur à environ 150), Ces résines sont caractérisées par un accroissement relativement grand de leur volume quand la résine sè- che est mise en contact avec de l'eau ou quand on convertit la forme saline de la résine en la forme acide. Les résines ayant une porosité réduite ne subissent qu'un faible changement de volume.
Ces résines, à porosité éle- vée, peuvent être préparées par la copolymérisation d'un acrylate avec une quantité moindre (entre environ 1% et environ 15%) d'un composé aromatique divinylique, tel que le divinylbenzène. Suivant une variante, un copoly- mère d'un méthacrylate et d'une proport ion réduite (environ 1 à 4%) d'un composé aromatique divinylique peut être utilisé. La saponification des produits obtenus, qui sont préparés sous la forme de perles, procure des ré-
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sines échangeuses de cations poreuses d'acides carboxyliques. L'Amberlite
XE89, fabriquée par la Rohm & Haas Company, constitue une matière ayant une forme particulièrement avantageuse.
On a constaté que ces résines adsor- bent, après une période de contact relativement.courte, un antibiotique ba- sique, tel que la viomycine, la néomycine ou la streptomycine, suivant une proportion de 50% ou davantage de la capacité théorique de la résine. Il n'en est pas de même avec le genre de résine utilisée pour la première opé- ration du procédé en question, c'est-à-dire la résine du genre Amberlite
IRC50 qui adsorbe seulement ces composés pendant une période de contact suivant une proportion correspondant à environ 10 à 20 % de sa capacité to- tale.
Pour réaliser la deuxième opération du procédé en question, la ré- sine échangeuse d'ions est généralement convertie d'abord partiellement en un sel d'un cation d'un métal alcalin, tel que le sodium par exemple, en la lavant avec une solution aqueuse diluée d'hydroxyde de sodium jusqu'à ce que le pH d'équilibre soit compris entre une valeur neutre et une valeur lé- gèrement basique, c'est-à-dire entre 6 et 9. La solution antibiotique, obtenue à l'aide de la première colonne d'échange d'ions par élution avec un acide minéral dilué, est traitée par l'enlèvement des sels.
Elle peut, par exemple, être neutralisée et, en vue de réduire au minimum l'introduc- tion du sel, l'acide éluant peut être de l'acide sulfurique dilué et l'a- gent neutralisant de l'hydroxyde de baryum et, dans ce cas, le sulfate de baryum se sépare et est enlevé. Suivant une variante, l'acide en excès peut être enlevé avec une résine échangeuse d'anions ou l'eau peut "être en- levée par exemple par séchage à partir de l'état de cong élation après neu- tralisation avec une amine organique qui forme un sel soluble dans le sol- vant avec l'acide utilisé pour l'élution de la résine. Le remplacement de l'eau par un solvant approprié permet la séparation du sel antibiotique. Un procédé de ce genre est décrit dans le brevet E.U.A. n 2.560.891, déposé le 16 décembre 1948.
D'autres combinaisons d'un acide et d'une base, qui forment un sel insoluble, peuvent être utilisées.
La solution antibiotique, partiellement purifiée, obtenue par l'é- lution de la première résine, est mise en contact avec la deuxième résine échangeuse d'ions, de préférence dans une colonne, et ceci est continu jus- qu'à ce que la résine choisie ait atteint l'équilibre avec l'antibiotique.
Il en résulte qu'une grande partie des cations, présents dans la solution admise dans la colonne passent dans cette colonne sans être adsorbés. Il est relativement aisé d'examiner des échantillons de la solution antibioti- que sortant de la colonne et de déterminer quand cette solution a une con- centration en antibiotique approximativement égale à celle qui pénètre dans la colonne. A ce moment on cesse d'alimenter la colonne et l'antibiotique est élue avec de l'acide minéral dilué. Si l'on utilise de l'acide sulfuri- que, l'acide en excès peut être enlevé par précipitation avec de l'hydroxy- de de baryum ou par les autres méthodes indiquées plus haut. La solution peut ensuite être utilisée pour divers usages.
Souvent, le produit obtenu à la suite du contact avec la deuxième résine a une pureté tellement élevée que la matière peut être séchée et uti- lisée directement pour des usages thérapeutiques, sans autre purification..
On peut remédier à la présence de quantités minimes de matières co- lorantes par leur adsorption sur du charbon de bois, si on le désire, mais ceci ne constitue pas une opération essentielle du procédé. Il est à noter que, si l'on utilise une résine du genre XE89 avant la résine du genre IRC50, de grandes quantités d'impuretés colorées et des matières à poids moléculai- re plus élevé sont adsorbées sur la résine en même temps que l'antibiotique au cours de la première opération.
L'utilisation de l'Amberlite IR50 pour la deuxième opération ne produit alors plus de purification appréciable. Par ailleurs, l'application
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du traitement répété avec un seul genre de ces résines ne permettrait pas d'obtenir le même degré élevé de purification d'une manière aussi simple.
En général, les impuretés inorganiques sont réduites plus aisément par le procédé en question qui.procure une sélectivité plus grande pour l'obten- tion des antibiotiques.
Les deux polymères, du genre de ceux utilisés pour la première et la deuxième opérations du procédé, sont, de préférence, préparés sous la - forme de perles et la polymérisation sous cette forme peut être obtenue par le traitement du mélange des monomères dans une suspension aqueuse avec un peroxyde. Les polymères résineux utilisés pour la deuxième opération ont des liaisons croisées lâches et sont poreux et on a constaté qu'ils sont extrémement efficaces pour adsorber une proportion très élevée des antibio- tiques basiques. Ceci donne lieu à l'adsorption d'une quantité de l'anti- biotique qui s'approche du pouvoir d'échange théorique de la résine dans des conditions d'équilibre.
Il n'en est pas de même pour le genre de rési- ne échangeuse d'ions, utilisé pour la première opération du procédé qui, dans les conditions normalement utilisées pour l'obtention des antibioti- ques, ne s'approche pas, en ce qui concerne son pouvoir adsorbant, de la va- leur d'équilibre.
Quand un bouillon de -streptomycine est utilisé comme matière ini- tiale pour les deux opérations décrites plus haut, la solution, obtenue par élution à partir du deuxième genre de résine échangeuse d'ions, peut avoir une activité aussi élevée que 20 à 30 mg de l'antibiotique (base) par ml, et elle peut, à l'état sec, avoir une pureté de 70% ou davantage en poids.
Si on le désire, on peut même atteindre un degré de pureté plus élevé en effectuant une opération de purification supplémentaire qui peut se faire avant ou après la deuxième purification à l'aide de la résine du genre acide carboxylique. Ceci implique le contact avec une résine échangeu- se d'ions du genre acide sulfonique, ayant une faible porosité et possédant une proportion élevée de constituants formateurs de liaisons croisées. Cet- te opération a lieu avec la résine échangeuse d'ions sous la forme acide, c'est-à-dire comme acide sulfonique libre. Des résines, qui sont copolymè- res de polystyrènes sulfonés et de composés aromatiques divinyliques, tels que le divinylbenzène sont particulièrement avantageuses. Ces résines se trouvent dans le commerce sous la marque de fabrique 'tDowex 50".
Elles contiennent des proportions variables de divinylbenzène comme constituant formateur de liaisons croisées. Une proportion d'environ 16% de divinyl- benzène est très avantageuse. Des proportions un peu plus élevées ou plus basses, c'est-à-dire comprises entre environ 10 et 25% peuvent être utili- sées à cet effet.
Une résine de ce genre, quand elle est utilisée sous sa forme aci-; de ou avec un pH réduit, ne retient que très peu ou pas d'antibiotique ba- - sique dans une solution mise en contact avec cette résine. Toutefois, elle retient des cations inorganiques et diverses impuretés organiques à un degré tel qu'une solution de ce genre, après un contact relativement court avec de la résine, à un faible pH, c'est-à-dire entre environ 1,0 et environ 2,5, a une très grande pureté. Cette opération du traitement a lieu, de préfé- rence, quand la résine se trouve dans une tour. L'acide libre, qui reste dans la solution effluente est ensuite neutralisé.
On utilise, de préféren- ce, de l'acide sulfurique au cours de l'opération précédente et, après le contact avec la résine, l'acide en excès, qui n'est pas nécessaire pour la combinaison avec l'antibiotique basique pour former un sel, est enlevé par précipitation avec un réactif tel que l'hydroxyde de baryum. La solution, qui reste après l'enlèvement du sel précipité, est une forme très fortement purifiée de l'antibiotique. Cette matière peut être filtrée pour former une solution qui peut être utilisée directement pour la thérapeutique, pour
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l'alimentation des animaux ou d'autres usages. Elle peut être séchée, par exemple par lyophilisation pour former un produit convenant très bien à l'incorporation dans des produits pharmaceutiques.
Elle est pratiquement exempte de pyrogènes et ne possède que peu ou pas de matières histaminiques.
La solution peut être stérilisée; elle peut être combinée avec des stabili- sateurs ou d'autres substances utiles
Quand ce procédé (à trois opérations) est utilisé pour la purifica- tion de la streptomycine, on constate que le produit a une pureté s'appro- chant de 95 %. Il est à noter que le procédé ne provoque pas de séparation de la streptomycine B qui n'est pas nuisible mais a une activité plus fai- ble que la streptomycine.Si l'on désire obtenir un produit contenant une proportion particulièrement faible de cette matière, un bouillon de fermen- tation approprié doit être choisi.Il est également à noter que le procédé en question enlève, d'une manière très efficace, un contaminant commun et indésirable des produits commerciaux à base de streptomycine,
c'est-à-dire la matière inactive qu'est la streptidine*
Dans de nombreux cas, il est possible de cristalliser l'antibioti- que basique sous une forme très purifiée en concentrant l'effluent aqueux provenant de la deuxième résine et en ajoutant un solvant organique miscible à l'eau, tel que le méthanol ou l'éthanol.
Dans certains cas, quand l'an- tibiotique impur, par exemple le bouillon de fermentation antibiotique, utilisé comme matière initiale, est de qualité particulièrement pauvre ou a des teneurs particulièrement élevées en impuretés inorganiques et organiques, il est désirable d'effectuer la purification d'une telle solution en mettant la matière brute en contact successivement avec trois genres différents de résines échangeuses d'ions. Dans ce cas, l' ordre préféré est la séquence susindiquée pour les opérations concernant l'échange d'ions, c'est-à-dire qu'on se sert d'abord de l'Amberlite IRd5O qui est la résine du genre acide méthacrylique-divinylbenzène à faible pouvoir adsorbant, cette résine étant utilisée sous une forme partiellement neutralisée.
Pour la deuxième opéra- tion, on utilise le produit de saponification acrylate-divinylbenzène plus poreux et, finalement, la solution partiellement purifiée est soumise à une purification supplémentaire par sa mise en contact avec la résine Dowex 50 qui est du genre acide sulfonique à liaisons fortement croisées en vue d'ob- tenir une solution ayant un degré de pureté très élevé. Si l'ordre des opé- rations deux et trois de ce procédé à trois opérations est inversé, le de- gré de purification obtenu est remarquablement élevé mais n'atteint pas ce- lui que l'on obtient quand on adopte la séquence préférée indiquée plus haut.
Il est à noter qu'avec chacune des résines carboxyliques les antibiotiques forment des sels définis, la résine agissant comme un acide polybasique ma- cromoléculaire. Les sels des antibiotiques avec des résines sont utilisés pour des usages tels que l'enrichissement de la nourriture..
On a découvert également que, même si l'une des opérations susdites pour la purification à l'acide carboxylique est supprimée, on obtient néan- moins un degré remarquable de purification des antibiotiques bruts, du mo- ment que la seule opération de purification à l'acide carboxylique est sui- vie d'une purification à l'acide sulfonique. La mise en contact d'une so- lution aqueuse impure d'un antibiotique basique avec une résine comprenant, comme groupements actifs principaux pour l'échange, des radicaux carboxyli- ques, l'élution de l'antibiotique d'avec la résine à l'aide d'un acide et la mise en contact de la solution de l'antibiotique avec une résine échan- geuse d'ions du genre acide sulfonique sous la forme acide,
procurent un de- gré de purification remarquable de l'antibiotique.
L'éluat obtenu par la séparation de l'antibiotique d'avec la rési- ne du premier genre, c'est-à-dire la résine du genre carboxylique, à l'aide
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d'une solution diluée d'un acide minéral, convient particulièrement bien à la purification supplémentaire par la mise en contact avec une résine échangeuse d'ions dont les groupements principaux pour l'échange sont for- més par le radical acide sulfonique. La première opération du procédé est efficace pour séparer l'antibiotique d'avec certaines des impuretés présen- tes dans les solutions initiales, plus particulièrement des impuretés orga- niques qui se trouvent généralement, à un degré très élevé, dans des bouil- lons de fermentation filtrés contenant des antibiotiques basiques.
Toute- fois, il subsiste dans l'antibiotique brut, élue de la résine du premier genre, des quantités appréciables de diverses impuretés, plus particulière- ment des matières inorganiques, mais également certaines substances organi- ques. L'éluat acide, provenant de la résine échangeuse d'ions du genre acide carboxylique, peut être purifié, d'une manière des plus efficaces, par une mise en contact, à l'état acide, d'une résine du genre acide sulfo- nique.
Quand l'antibiotique, dans la solution acide, vient en contact avec la forme acide de la résine du genre acide sulfonique, il n'est pas 'adsorbé sur celle-ci à un degré appréciable. Toutefois, diverses impuretés, plus particulièrement des substances inorganiques mais également des matiè- res organiques, sont sélectivement enlevées de la solution acide par la ré- sine du genre acide sulfonique, de sorte qu'on obtient une solution très purifiée de l'antibiotique basique. Dans de nombreux cas, la pureté de la solution est tellement élevée que l'antibiotique peut être cristallisé di- rectement hors de la solution, en concentrant celle-ci soigneusement, par exemple sous vide à une basse température ou en concentrant celle-ci et en y ajoutant un solvant approprié, miscible à l'eau, mais qui ne dissout pas le sel antibiotique.
Dans certains cas, il est nécessaire de régler le pH de la solution avant la concentration car il peut y avoir une tendance à la décomposition d'une partie du produit si la concentration a lieu dans des conditions fortement acides. Pour la mise en oeuvre du procédé en question et comme indiqué plus haut, on peut se servir d'acide sulfurique pour l'élu- tion de l'antibiotique adsorbé d'avec la résine du premier genre, c'est-à- dire la résine du genre acide carboxylique, que l'on utilise. Suivant une variante, on peut se servir d'autres acides, tels que l'acide chlorhydrique, bromhydrique, etc... L'acide en excès peut être séparé d'avec la solution obtenue après sa mise en contact avec la deuxième échangeuse d'ions par la formation d'une substance légèrement soluble.
Par exemple, si l'acide sul- furique a été utilisé, de l'hydroxyde ou du carbonate de baryum peut être ajouté, à un pH approprié, et le sulfate de baryum précipité peut ensuite être séparé d'avec la solution avant de la concentrer et avant d'isoler le sel antibiotique purifié ou cristallisé. Si l'on utilise l'acide chlorhydri- que pour éluer la première résine, l'acide en excès peut être séparé par l'ad- dition d'un agent tel que le carbonate d'argent. Suivant une variante, cer- taines résines échangeuses d'anions peuvent être utilisées pour le réglage du pH de la solution aqueuse par enlèvement de l'acide en excès.
Après que la résine a été séparée d'avec la solution aqueuse, la solution antibiotique peut être concentrée pour obtenir l'antibiotique purifié ou cristallisé.En général, les sels acides des antibiotiques basiques ont un pH, en solution aqueuse, compris entre environ 4,0 à environ 6,5.
Pendant la mise en oeuvre du procédé en question, il est avantageux de maintenir les solutions des antibiotiques à des pH faibles, c'est-à-dire en dessous d'environ 2,5 pendant une durée minimum. Par conséquent, après l'élution de l'antibiotique d'avec la résine utilisée pour la première opé- ration, la mise en contact avec la deuxième résine doit se faire avec une rapidité raisonnable et l'effluent de la deuxième résine doit alors être ré- glé pour un pH approprié, c 'est-à-dire à au moins 4,5 environ, sans perte
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de temps excessive.
Comme dit plus haut, les solutions antibiotiques, ob- tenues par le procédé en question, ont un degré de pureté extraordinaire, et il est possible, dans de nombreux cas, d'utiliser directement l'effluent réglé, provenant de la deuxième résine, sans faire intervenir un traitement supplémentaire tel qu'une cristallisation. Des solutions de ce genre peu- vent être utilisées, par exemple, pour la médecine vétérinaire. Il peut être avantageux de concentrer ces solutions et d'ajouter des agents stabi- lisateurs avant que le produit soit utilisé. Souvent , la stérilisation peut se faire en filtrant la solution dans un appareil approprié.
Il est à noter que les produits, obtenus selon l'invention, sont exempts, d'une ma- nière remarquable, de pyrogènes et qu'ils ne contiennent que peu ou pas- de matières histaminiques qui souvent causent des difficultés dans le cas d'antibiotiques purifiés par d'autres procédés, à moins que des opérations détaillées, bien définies n'interviennent pour enlever ces matières.
On a découvert que le traitement de solutions aqueuses impures d'antibiotiques basiques par des résines à l'acide carboxylique, du genre décrit plus haut (c'est-à-dire une résine du genre Amberlite IRC50), peut être répété en vue d'obtenir une solution purifiée de l'antibiotique, cette solution ayant alors une pureté encore plus élevée et se prêtant d'elle-mê- me, d'une manière des plus aisées à une purification supplémentaire par sa mise en contact avec les résines du genre acide sulfonique, décrites plus haut.
Un traitement supplémentaire avec une résine du genre acide carboxy- lique ou avec une résine du genre acide sulfonique ne tend pas à augmenter la pureté de l'antibiotique à un degré appréciable et, comme dit plus haut, le produit obtenu par le traitement avec la résine du genre acide sulfoni- que peut souvent être cristallisé sans qu'on fasse intervenir des opérations de purification spécifiques supplémentaires. L'usage de la résine du gen- re Amberlite XE-89, suivi de l'usage d'une résine du genre acide sulfonique, ne procure pas un degré de purification aussi élevé.
Parmi les antibiotiques qui peuvent être purifiés par le procédé en question, on peut citer la streptomycine, la viomycine, la dihydrostrep- tomycine, l'hydroxystreptomycine, la streptothricine, la mannosidostrepto- mycine, la néomycine et d'autres de ce genre. Ils contiennent tous les groupements fortement basiques, tels que des groupements guanidino et ils peuvent être purifiés d'une manière particulièrement aisée par le procédé faisant l'objet de l'invention.
Les exemples ci-dessous sont donnés à titre illustratif et ne doi- vent pas être considérés comme les seuls modes de réalisation possibles de l'invention .
EXEMPLE I.
Une colonne est remplie d'une résine échangeuse de cations à l'aci- de carboxylique (genre Amberlite IRC50). Cette résine est équilibrée avec de l'hydroxyde de sodium dilué jusqu'à ce qu'on ait atteint un pH de 7,5.
Un bouillon de fermentation de streptomycine, filtré dans des conditions acides, est réglé, de manière à être approximativement neutre, à l'aide d'hydroxyde de sodium et la solution d'antibiotique traverse la colonne pour l'échange d'ions. Des échantillons de l'effluent de la colonne sont analy- sés périodiquement jusqu'à ce qu'on constate que la concentration de la strep- tomycine dans le bouillon, à la sortie de la colonne, est en substance la même que celle du bouillon admis dans la colonne. L'introduction de la so- lution est arrêtée et la résine est lavée avec plusieurs volumes d'eau.
L'antibiotique est ensuite élue ou séparé d'avec la résine à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique 0,35 N. Quand l'éluat quitte la colonne, 'il est neutralisé avec de l'hydroxyde de sodium. On constate, par l'analy- se de la quantité totale de la streptomycine dans l'éluat, qu'environ 15% '
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de la capacité totale de la résine ont été utilisés pour l'adsorption de l'antibiotique. Peu d'impuretés organiques du bouillon initial ont été re- tenues dans la colonne mais l'éluat, qui contenait 10 mg de streptomycine par ml, contenait également environ 20 mg de sels inorganiques par ml de solution; cette teneur en sels étant déterminée par évaporation d'un échan- tillon mesuré et par incinération en présence d'acide sulfurique.
La solu- tion contenait également environ 4 mg par ml, d'impuretés organiques colo- rées et non identifiées .
On prépare une deuxième colonne contenant 115 ml de résine échan- geuse de cations à l'acide carboxylique (genre Amberlite XE 89). La résine est équilibrée avec de l'hydroxyde de sodium pour un pH de 7,8. L'éluat neutralisé, provenant de la colonne précédente, est introduit dans la deu- xième colonne. A des intervalles périodiques, l'effluent de la deuxième co- lonne est analysé pour déterminer sa teneur en streptomycine. Après qu'au total 3 litres de la solution de streptomycine partiellement purifiée ont été introduits dans la colonne, on constate qu'on ne peut pas extraire da- vantage d'antibiotique hors de la solution, c'est-à-dire que la concentra- tion de l'antibiotique dans la solution à l'entrée est la même que celle de la solution de sortie.
On interrompt donc l'alimentation de la colonne et on lave la résine avec de l'eau. L'antibiotique est ensuite élué avec une solution d'acide sulfurique 0,36N. L'acide en excès dans l'éluat est neu- tralisé immédiatement avec une solution d'hydroxyde de baryum. Le sulfate de baryum précipité est enlevé par filtration et la solution aqueuse est analysée en ce qui concerne la streptomycine. On trouve qu'environ 50 % de la capacité totale de la résine a été utilisée pour l'adsorption de la strep- tomycine. L'éluat contient environ 30 mg d'antibiotique, en tant que base, par ml d'éluat et environ 6 mg, par ml, de sels inorganiques, déterminés sous la forme de cendres sulfatées. Environ un tiers des impuretés colorées, présentes dans l'éluat fourni à la deuxième colonne, est retenu dans l'é- luat.
On prépare une troisième colonne contenant 30 ml d'un copolymère sulfoné de polystyrène et d'environ 16% en poids de divinylbenzène (connu sous le nom de Dowex 50-X16). La résine est traitée avec de l'acide sul- furique dilué pour la convertir complètement à l'état acide et est ensuite lavée avec de l'eau pour enlever l'acide en excès. L'éluat neutralisé,pro- venant de la colonne précédente, est fourni à la colonne, contenant le Do- wex 50-X16, jusqu'à ce que le pH de l'effluent de la colonne manifeste une tendance..bien définie à monter. Environ 660 ml de l'effluent sont recueil- lis jusqu'à ce moment. Il est neutralisé immédiatement avec de l'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum précipité est séparé par filtration.
On obtient une récupération pratiquement quantitative de la strep- tomycine à la sortie de cette colonne. La solution a une concentration de 25 mg par ml en tant que streptomycine basique et seulement 0,62 mg, par ml, de sels inorganiques (comme cendres sulfatées).
La concentration de la solution sous vide, le traitement avec une petite quantité de carbone activé et l'addition de plusieur s volumes de mé- thanol, permettent d'obtenir un précipité de sulfate de streptomycine ayant' une grande pureté. Cette matière est filtrée et séchée 'sous vide. On cons- tate qu'elle contient 1,64% de cendres et que l'activité du produit, quand celui-ci a été débarrassé des matières volatiles, correspond à environ 790 . mcg/mg comparativement à l'activité théorique de 798 mcg/mg du sulfate de streptomycine.
EXEMPLE II.
Un bouillon de fermentation filtré est réglé à un pH de 7,5. L'ana- lyse montre qu'il contient 300 mcg de l'antibiotique -par ml de solution.-1
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Cette matière est introduite dans une colonne contenant de la résine Amber- lite IRC50 équilibrée pour un pH = 7, 5 à l'aide d'hydroxyde de sodium. La solution antibiotique est ajoutée à la colonne jusqu'à ce que la concentra- tion de l'antibiotique dans la- colonne soit- devenue' très voisine 'de celle de la solution admise dans l'effluent.
La colonne est ensuite lavée avec de l'eau et l'antibiotique est élue ou séparé d'avec la résine à l'aide d'une solution d'acide sulfurique 0,35N. L'éluat de la colonne est neutra- lisé immédiatement avec de l'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum précipité est séparé par filtration. L'éluat neutralisé contient environ
8 mg de viomycine par ml, en tant que base, et 7 mg, par ml, de cendres sulfatées. Environ 12% de la capacité totale de la résine ont été utilisés pour l'adsorption de l'antibiotique.
Une partie de l'éluat (190 litres), provenant de la colonne ci- dessus, est introduite à un pH de 7,5 dans une colonne contenant 3750 ml de résine du type Amberlite XE89 qui avait, au préalable, été équilibrée avec de l'hydroxyde de sodium dilué de manière à avoir un pH= 7,5. La ré- sine adsorbe la viomycine antibiotique à un degré correspondant à environ
80% de sa capacité d'échange totale. L'addition de la solution de viomyci- ne partiellement purifiée, est continuée jusqu'à ce que l'effluent de la co- lonne ait approximativement la même teneur en antibiotique que la solution que l'on a introduite dans la colonne. On interrompt alors l'addition de l'effluent et on lave la colonne avec de l'eau.
L'antibiotique est élué avec de l'acide sulfurique 0,35 N et l'éluat est neutralisé immédiatement avec de l'hydroxyde de baryum. Le sulfate de baryum précipité est enlevé par filtration et l'éluat est concentré sous vide, à une température modéré- ment élevée, jusqu'à avoir un volume de 11 litres. L'analyse d'un échan- tillon montre que le concentrât contient 102 mg de viomycine, en tant que base, par ml et seulement 5 mg de cendres (sulfatées) par ml. Le traitement de l'éluat avec du carbone activé enlève une petite partie de la couleur résiduelle. L'addition de 2 volumes de méthanol à la solution aqueuse don- ne lieu à la cristallisation du sulfate de viomyoine. Cette matière pèse 1275 g quand elle est séchée sous vide. Elle contient 1% de cendres et 9.3% de matières volatiles.
Quand elle est débarrassée des matières volatiles présentes, on trouve que l'activité est d'environ 805 mcg/mg. L'activité théorique du sulfate de viomycine pure est de 820 mcg/mg. On obtient donc une pureté extrêmement élevée par le procédé simple décrit.
EXEMPLE III.
Un bouillon de fermentation de néomycine est acidifié et filtré, après quoi il est neutralisé. Cette matière contient approximativement 730 mcg/ml de néomycine. 140 litres de la solution sont fournis à une colonne contenant 1 litre de la résine échangeuse d'ions à l'acide carboxylique (gen- re Amberlite IRC50) qui a été réglée de manière à peu près neutre à l'aide d'hydroxyde de sodium. On obtient presque une adsorption quantitative de l'antibiotique sur la résine. La résine est lavée avec de l'eau et est en- suite éluée avec une solution à 1% d'acide sulfurique. L'éluat est neutra- lisé immédiatement avec de l'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum pré- cipité est séparé par filtration.
La solution filtrée est analysée et on constate qu'elle contient 10 mg de néomycine (en tant que base) par ml et environ 8 mg de cendres sulfatées par ml.
Une partie de la solution de néomycine neutralisée et partiellement purifiées obtenue à l'aide de la colonne d'Amberlite IRC50, est fournie à une colonne d'Amberlite XE89 qui a été équilibrée avec de l'hydroxyde de so- dium dilué jusqu'à avoir un pH égal à environ 7,0. La solution est introdui- te dans la colonne jusqu'à ce que des quantités appréciables d'antibiotique soient détectées dans l'effluent. La colonne est lavée avec de l'eau et est
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ensuite éluée avec une solution à 1% d'acide sulfurique. L'acide en excès dans l'effluent est neutralisé avec de l'hydroxyde de baryum, après quoi le sulfate de baryum précipité est enlevé par filtration. L'éluat contient environ 20 mg de néomycine par ml et 5 mg de cendres sulfatées par ml.
On fait passer l'éluat dans une colonne contenant de la résine Dowex-50X16 sous la forme acide. Pratiquement, toutes les cendres sont enlevées de la matière avec une perte faible ou nulle en néomycine. L'effluent de la co- lonne est neutralisé avec de l'hydroxyde de baryum. Le précipité est sépa- ré par filtration et la couleur résiduelle est enlevée avec une quantité minime de carbone activé. La solution purifiée est versée dans plusieurs volumes de méthanol et la néomycine précipitée est séparée par filtration.
Le produit contient 1% de cendres sulfatées et 3,2% de matières volatiles.
Après la séparation des matières volatiles, l'analyse donne une activité d'environ 650 mcg/mg, comparativement à l'activité de 670 mcg/mg du sulfate de néomycine pure. On constate que ce produit, obtenue par ce procédé re- lativement simple, convient très bien à l'usage thérapeutique.
EXEMPLE IV.
On fait passer un bouillon de fermentation de streptomycine filtré, ayant une activité antibiotique de 800 mcg/ml, sur une colonne contenant une résine du genre Amberlite IRC50 à un pH de 7,5. L'antibiotique est élue de la résine à l'aide d'acide chlorhydrique 0,35 N et l'éluat est neu- tralisé avec de l'hydroxyde de sodium. Par l'adsorption de l'antibiotique, environ 15% de la capacité de la résine est utilisée. L'éluat contient en- viron 7 mg/ml de l'antibiotique. On fait passer une partie de cette matiè- re dans une colonne contenant 100 ml d'une résine du genre Amberlite XE 89 à un pH de 7,5.L'antibiotique est élue d'avec la résine à l'aide d'acide sulfurique dilué. L'éluat contient environ 18 g de streptomycine et envi- ron 2 g de cendres .
Environ 50% de la capacité totale de la résine genre Amberlite XE 89 ont été utilisés pour l'adsorption de l'antibiotique. L'é- luat est neutralisé avec de l'hydroxyde de sodium et traverse ensuite une colonne contenant 30 ml de résine du genre Dowex 50-X16 sous la forme acide.
L'effluent, sortant de la colonne, est neutralisé immédiatement avec une sc- lution d'hydroxyde de baryum. Le précipité de sulfate de baryum est enlevé, par filtration. Le filtrat est concentré sous vide et est décoloré à l'ai- de de carbone activé. La solution obtenue de cette manière est ajoutée à plusieurs volumes de méthanol pour précipiter le sulfate de streptomycine.
Le produit est filtré et séché. Il donne à l'essai une activité de 775 mcg/ ml et contient seulement 0,7 % de cendres. Une proportion élevée d'anti- biotique, contenu dans le bouillon initial est obtenue de cette manière.
EXEMPLE V.
Du bouillon de fermentation de néomycine filtré est fourni, à un pH de 7,5, à une colonne contenant 33 litres de résine Amberlite IRC50,préa- lablement équilibrée à un pH = 7,5 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium. Quand la résine cesse d'adsorber de la néomycine, l'alimentation est interrompue et la colonne est lavée avec de l'eau, puis éluée avec une solution à 1% d'acide sulfurique. On recueille la fraction de coeur de l'é- luat (c'est-à-dire la partie de celui-ci ayant une teneur maximum en anti- biotique); environ 170 litres avec un pH = 2,1. Elle contient la néomycine à une concentration de 12,0 mg/ml ainsi qu'un total de 31 mg/ml de matières solides et 7 mh/ml de cendres sulfatées.
Ceci représente une purification considérable quand on compare le produit au bouillon de fermentation. La solution antibiotique est neutralisée avec de l'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum est séparé par filtration. Le filtrat est fourni à une colonne contenant de la résine Amberlite XE89 qui a été préalablement équi-
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livrée avec de l'hydroxyde de sodium de manière à avoir un-pH = 7,5. Après que la colonne a été saturée avec de la néomycine, elle est éluée avec une solution à 1% d'acide sulfurique et l'acide en excès est neutralisé avec de l'hydroxyde de baryum. L'éluat contient 19,5 mg/ml de néomycine, 40 mg/ml de matières solides au total et 7 mg/ml de cendres sulfatées.
On fait passer cette solution sur une résine Dowex 50-X16 ayant un pH acide.
L'effluent de la colonne est neutralisé avec de l'hydroxyde de sodium. On constate qu'il contient 15 mg/ml de néomycine, un total de 23 mg/ml de ma- tières solides et 0,1 mg/ml de cendres sulfatées. La solution aqueuse est soigneusement concentrée sous vide à basse température et le sulfate de néo- mycine est isolé par précipitation avec de l'éthanol. On constate que le produit séché a une activité de 660 mog/mg et une teneur de 1,0 % en cen- dres. On obtient donc un produit ayant une pureté élevée et convenant très bien à un usage pharmaceutique.
EXEMPLE VI.
Un bouillon de fermentation de streptomycine, ayant une activité d'environ 750 unités par millilitre, est filtré après un réglage du pH à environ 2,5. On fait passer la solution filtrée sur une colonne de résine Amberlite IRC50 à un pH = 7,5 environ, c'est-à-dire que le pH du bouillon de fermentation est réglé à 7,5 avec de l'hydroxyde de sodi um, la résine étant équilibrée à ce pH par contact avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium. Après adsorption de l'antibiotique par la résine, la colonne de résine est lavée avec un petit volume d'eau et cette eau est écartée.
L'an- tibiotique est alors élue à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique 0,35N. Après que tout l'antibiotique a été séparé de la colonne de résine, l'éluat est neutralisé avec une solution d'hydroxyde de sodium. L'éluat contient environ 7 mg d'antibiotique par millilitre de solution. On fait passer cette solution dans une deuxième colonne contenant de la résine Am- berlite IRC50, équilibrée à un pH = 7,5. Quand la résine n'adsorbe plus de streptomycine supplémentaire, l'alimentation est interrompue et la résine est éluée à l'aide d'acide sulfurique 0,35 N. L'acide sulfurique en excès est enlevé de la solution acide à l'aide d'hydroxyde de baryum. La solution impure contient environ 6% en poids d'impuretés basés sur le poids total du produit brut dans la solution.
On fait passer celle-ci sur une colonne con- tenant de la résine du genre Dowex 50-X16, à l'état acide. L'effluent est neutralisé avec de l'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum obtenu est séparé par filtration. Après avoir concentré soigneusement la solution aqueuse sous vide, on la traite avec une petite quantité de carbone décolo- rant, on la filtre et on la verse dans du méthanol. Le sulfate de strepto- mycine précipité est filtré et séché. Le produit séché contient, à l'essai, 745 mcg/mg de streptomycine et 0,6% de cendres.
EXEMPLE VII.
On règle le pH d'un bouillon de fermentation de néomycine filtré, contenant 500 mcg/ml de néomycine, à 7,5 et on fournit ce bouillon à une co- lonne contenant 33 litres d'Amberlite IRC50, équilibrée préalablement à un pH= 7e5 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium. On continue l'ali- mentation jusqu'à ce que la colonne cesse d'adsorber la néomycine. La co- lonne est lavée avec de l'eau pour enlever le bouillon résiduel et l'anti- biotique est ensuite élué à l'aide d'une solution à 1% d'acide sulfurique.
La première partie de l'éluat contenant peu d'antibiotique, est séparée.
La partie suivante de l'éluat, qui contient un proportion élevée d'antibioti- que , est recueillie. Elle a un volume de 170 litres et un pH=2,1. La so- lution contient 12,5 mg/ml de néomycine, 33 mg/ml au total de matières soli- des et 5 mg/ml de cendres (sous la forme de cendres sulfatées). La solution partiellement purifiée est ensuite fournie à une colonne contenant 35 litres
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de résine Dowex 50-X16 à l'état acide. L'effluent de la colonne, contenant l'antibiotique, est neutralisé avec une solution d'hydroxyde de baryum et le sulfate de baryum est séparé par filtration. La solution purifiée est trai- tée avec une petite quantité de carbone décolorant et est ensuite filtrée.
Cette solution contient seulement 0,04 mg/ml de cendres (sous la forme de cendres sulfatées). Un. produit solide est isolé par concentration de la so- lution à une température basse sous vide et en versant la solution concen- trée dans du méthanol. Les matières solides précipitées sont filtrées, la- vées avec un petit volume de méthanol et séchées. Le sulfate de néomycine ainsi obtenu a une activité, à l'essai, de 670 mcg/mg et contient seulement 0,55% de cendres.
EXEMPLE VIII.
On règle le pH d'un bouillon de fermentation de viomycine filtré à 7,5. Cette solution contient approximativement 300 mcg/ml de viomycineo Elle est fournie à une colonne contenant de la résine Amberlite IRC50 dont le pH a été préalablement équilibré à 7,5 à l'aide d'une solution d'hydro- xyde de sodium. La solution est fournie à la colonne jusqu'à ce qu'une quantité appréciable de l'antibiotique commence à apparaître dans l'effluent de la colonne. La colonne de résine avec l'antibiotique adsorbée est lavée avec un petit volume d'eau et l'antibiotique est ensuite élue avec une solu- tion d'acide sulfurique 0,35N. L'acide en excès dans l'éluat est neutrali- sé avec de l'hydroxyde de baryum. On fait passer 15,6 litres de cette so- lution sur une colonne contenant 1350 ml de résine Dowex-X16.
L'effluent acide de la colonne est neutralisé avec de l'hydroxyde de baryum et le sul- fate de baryum est enlevé par filtration. La solution aqueuse est ensuite soigneusement concentrée sous vide et la solution aqueuse concentrée est décolotée avec du carbone activé. Le sulfate de viomycine est cristallisé hors de la solution, par addition de 2 1/2 volumes de méthanol. On obtient 147 g de sulfate de viomycine cristallisé qui, à l'essai, a une activité de 790 mcg/mg. Ce produit contient 0,2% de cendres et 4% de matières vola- tiles. Quand il est débarrassé de ces impuretés, le produit a une activité de 824 mcg/mg ce qui est très voisin de l'activité théorique du sulfate de, viomycine pur.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de purification d'un antibiotique basique, caractérisé' en ce qu'on met une solution aqueuse impure de l'antibiotique en contact avec une résine échangeuse d'ions du genre acide carboxylique, qui est au moins partiellement neutralisée et à une porosité limitée, on sépare l'an- tibiotique par élution d'avec la résine à l'aide d'un acide dilué et on met ensuite l'éluat de ladite résine en contact, ou bien avec une résine échan- geuse d'ions du genre acide carboxylique, qui est au moins partiellement neutralisée et a une porosité élevée, ou bien avec une résine échangeuse d'ions du genre acide sulfonique.