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Perfectionnements à la production des sels d'ammonium de pénicilline.
Cette invention concerne la production et la purification des sels ammoniques des acides de pénicilline.
Les sels ammoniques purs de pénicilline ont une valeur clinique par eux-mêmes ou peuvent être utilisés comme produits intermédiaires dans la production, par des moyens connus, des sels de sodium, potassium, calcium et autres sels de pénicilline de va- leur clinique, d'un degré de pureté élevé.
Dans la préparation de sels ammoniques de pénicilline, on rencontre fréquemment des difficultés pour obtenir des rendements satisfaisants en un produit solide filtrable de pureté raisonnable.
On pourrait croire que les sels ammoniques de pénicilline peuvent être préparés et séparés de façon satisfaisante par simple addition d'ammoniaque, gazeuse ou liquide, ou en solution aqueuse ou dans des solvants organiques à des solutions de pénicilline sans se' placer dans des conditions particulières quelconques.
Il n'en est toutefois
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pas ainsi et, à moins de choisir très soigneusement les condi- tions, on risque d'obtenir de faibles rendements, et les pro- duits sonttrès difficiles à séparer et leur puretéainsi que leur séparabilité varient fortement de l'une à l'autre char- ge de la pénicilline traitée. C'est le cas notamment lorsque les solutions de pénicilline traitéesne sont que modérément pu- res, car plus elles contiennent d'impuretés, plus grande est la probabilité de formation de matières gommeuses.
T.Tn autre inconvé- nient de l'emploi d'ammoniaque gazeuse ou liquide pour la préci- pitation de pénicilline d'ammonium réside en ce que ces substances ne peuvent être aisément manipulées ou dosées sans faire usage d'un équipement spécial, relativement compliqué. Evidemment, 1''emploi d'une solution aqueuse concentrée d'ammoniaque ne donne paslieu aux mêmes inconvénients.
La présente invention a pour objet un procédé pour la préparation de pénicilline d'ammonium avec de bons rendements, tel qu'il n'y ait que peu de variation de la qualité du pro- duit d'une charge à l'autre et que, de plus, la pénicilline d'ammonium soit obtenue sou,. une forme soluble aisément filtra- ble.
Suivant ce procédé perfectionné de production des sels d'ammonium des acides de pénicilline, on ajoute lentement, en remuant,, une solution aqueuse d'ammoniaque d'une concentration supérieure à 20% en poids par poids d'ammoniaque, à à une solu- tion de pénicilline dans un solvant organique défini ci-dessous;
, contenant une petite proportion d'un alcool aliphatique infé- rieur, en Quantité ne dépassant pas environ 10% en volume par volume du solvant organique de la pénicilline, et on sépare le
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sel d'ammonium brut précipité de la solution résultante.,
La solution de pénicilline dans le solvant organique à partir de laquelle la pénicilline d'ammonium est précipitée, consiste en formes acides de pénicilline en solution dans un solvant organique dans lequel le sel d'ammonium de pénicilline est sensiblement insoluble, qui est sensiblement immiscible à l'eau et a un poids spécifique inférieur à celui de l'eau.
En disant que le 'sel d'ammonium de pénicilline est sensiblement in- soluble dans le solvant organique, il faut comprendre que le sel d'ammonium, préparé par l'addition d'ammoniaque à la solu- tion de pénicilline dans le solvant organique, est sensiblement complètement précipité de cette solution. Des savants particu- ' lièrement appropriés à ce but sont l'acétate de butyle, l'acétate d'amyle et la méthyl-isobutyl cétone.
Il est à remarquer que le chloroforme ne convient'pas comme solvant pour cette opération, car l'ammoniaque aqueuse et le précipité flottent à sa surface et sont difficiles à séparer, et que, de plus, la solubilité dé la pénicilline d'ammonium dans le,chloroforme est fortement accrue en présence d'alcools inférieure, et que par conséquent les rendements ne sont pas très élevés. Cette solution de péni- cilline dans le solvant organique peut être obtenue, par exemple, par extraction de la bouillie obtenue dans une opération de fermentation pour la-production de pénicilline, réglée à une valeur de pH convenable, par un solvant organique de la pénicil- line, puis l'extraction de la couche de solvant séparée conte- nant la pénicilline par une solution aqueuse d'un alcali.
La phase aqueuse séparée contenant le sel alcalin de pénicilline peut alors être réglée'à une valeur convenable du pH et être finalement extraite dans le solvant désiré.
Un autre procédé d'obtention de solution convenable de pénicilline comprend une série'd'opérations analogues à celle - décrite plus haut, mais dans :laquelle différents solvants organi-
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ques sont utilisés pour les deux traitements d'extraction. Par exemple, l'acétate de butyle normal peut être employé pour la première extraction et la méthyl-isobutyl cétone pour la seconde extraction.
Un procédé encore différent comprend un traitement d'extraction unique de la bouillie par un solvant organique pour donner une solution qui est évaporée ou concentrée d'autre façon par des moyens connus, pour donner une solution relative- ment concentrée de pénicilline dans un solvant organique. Chacun des traitements d'extraction peut être effectué, par exemple, dans un appareil d'agitation à étage unique ou d'une manière continue à contre-courant.
L'alcool aliphatique inférieur qui est ajouté à la solu- tion de pénicilline dans le solvant organique peut comprendre n'importe quel alcool monohydrique aliphatique saturé à moins de 5 atomes de carbone, et cet alcool est de préférence le métha- nol, l'éthanol ou le butanol. Le but de cette addition de l'alcool à la solution de pénicilline est de maintenir en solu- tion toute impureté de nature gommeuse ainsi que toute quantité d'eau pouvant se séparer au cours de l'addition de l'ammoniaque aqueuseconcentrée.
Les résultats obtenus par le procédé de la présente in- irention varient suivant la nature et la concentration de la solution utilisée. de pénicilline dans le solvant organique, et avec l'alcool particulier employé et même avec la quantité de l'alcool particulier employé. On préfère cependant, lorsqu'on utilise une solution dans un solvant organique contenant de l'eau, employer 2% en volume par volume d'alcool méthylique ou éthylique ou 5% de butanol normal, et lorsqu'on utilise une solution de pénicilline dans un solvant organique anhydre, em- ployer 5% d'alcool méthylique ou éthylique ou 10% d'alcool buty- ligue normal.
L'utilisation de concentrations supérieures à 10% de ces alcools ne donne aucune amélioration des rendements obtenus, et peut môme donner lieu à des rendements moindres car
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l'augmentation de la quantité d'alcool utilisée peut provoquer une augmentation de la solubilité du sel d'ammonium dans le sol- vant organique employé. Par conséquent,l'emploi de l'alcool en quantité supérieure à 10% n'est pas nécessaire, ni désirable ni économique. Il faut cependant remarquer que, bien que l'emploi de quantités déterminées de méthanol, éthanol et butanol soit préféré plus haut, des résultats satisfaisants peuvent aussi être obtenus lorsqu'on emploie des quantités différentes de ces alcools et de propanol.
L'avantage résultant de la précipitation du sel d'ammonium en présence de ces alcools est très réel, car lorsque la précipitation est effectuée en l'absence de ces alcools, le précipité obtenu, d'ordinaire, a une couleur jaune foncé, est gommeux et très difficile à filtrer. Cet avantage est aussi re- présenté dans le tableau suivant:.
EMI5.1
Soi 0---C-one entra tion ombre de endemeni--NitûrF
EMI5.2
<tb> de <SEP> d'alcool <SEP> % <SEP> phases <SEP> après <SEP> de <SEP> récupe- <SEP> du
<tb> pénicilline <SEP> vol/vol <SEP> addition <SEP> de <SEP> ration <SEP> de <SEP> précipi-
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯l'ammoniaque <SEP> pénicilline <SEP> té
<tb>
<tb> Anhydre <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 95 <SEP> Jaune <SEP> foncé, <SEP> gom-
<tb>
EMI5.3
meux fil- rùêùx, film
EMI5.4
<tb> trant <SEP> mal
<tb>
<tb> id. <SEP> 5% <SEP> d'alcool <SEP> 1 <SEP> 90 <SEP> Jaune <SEP> paie
<tb> méthylique <SEP> facile <SEP> à
<tb> filtrer
<tb>
<tb> id. <SEP> 5% <SEP> alcool <SEP> 1 <SEP> 90 <SEP> id.
<tb> éthylique
<tb>
<tb> id. <SEP> 10% <SEP> alcool
<tb> butylique <SEP> 1 <SEP> 90 <SEP> id.
<tb>
<tb>
<tb>
Humide <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 80 <SEP> Jaune <SEP> fonce, <SEP> gommeux <SEP>
<tb> filtrant
<tb> mal.
<tb>
<tb> id. <SEP> 2% <SEP> d'alcool <SEP> Jaune <SEP> pale
<tb> méthylique <SEP> 1 <SEP> 65 <SEP> filtrant
<tb> bien
<tb>
<tb> id. <SEP> 5% <SEP> alcool
<tb> méthylique <SEP> 1 <SEP> 60 <SEP> id.
<tb>
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Les résultats dans chaque cas ont été obtenus par addition d'ammoniaque aqueuse de poids spécifique 0,880 à une solution de pénicilline dans 1-'acétate de butyle normal d'une concentra- tion de 10.000 unités Oxford par millilitre, les conditions d' addition d'ammoniaque étant les mêmes et la totalité de l'am- moniaque étantajoutée en une fois, lentement, en remuant.
Un voit que les meilleurs résultats sont obtenus lorsque la solution de pénicilline dans le solvant organique est anhy- dre et contient 5% d'alcool méthylique ou éthylique ou 10% d'alcool butylique. L'élimination de l'eau de la solution de pénicilline dans le solvant organique peut avoit lieu par distillation azéotropique ou par séchage de la solution au moyen de sulfate de sodium anhydre, bien que ce moyen soit moins efficace que la distillation azéotropique.
Il est à remarquer qu'il est essentiel d'ajouter l'ammo- niaque aqueuse à la solution de pénicilline lentement en remuant, car autrement l'ammoniaque peut se déposer dans le fond de l'ap- pareil et le risque de la formation de gommes est fortement accru, même en présence d'une certaine quantité d'un alcool aliphatique inférieur.
De plus, la concentration de l'ammonia- que aqueuse est nécessairement supérieure à 20% en poids, la con- centration maximum étant du reste de 35% en poids, car lorsqu'on utilise de 1' ammoniaque d'une concentration Inférieure à 20% en poids, le rendement en pénicilline d'ammonium est sensiblement moindre que celui obtenu avec de l'ammoniaque d'une concentration supérieure à 20% en poids. L'emploi d'ammoniaque anhydre gazeuse ou liquide donne lieu à de faibles rendements à cause des concen- trations locales élevées d'ammoniaque obtenues, et de l? absence de toute quantité d'eau pour aider à la répartition mécanique.
La. quantité d'ammoniaque ajoutée à la pénicilline est de préférence comprise entre, 1,0 et 1,3 fois celle équivalant aux acides de pénicilline dans la'solution lorsque la solution
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de pénicilline dans le solvant organique est raisonnablement pure. Cependant, lors du traitement de solutions impures de pé- nicilline, telles qu'obtenues par extraction unique d'une bouillie par un solvant organique, particulièrement lorsqu'un utilise une matière de composition variable telle que des li- queurs de trempage de blé, comme matière nutritive dans la bouillie, une quantité d'ammoniaque notablement plus élevée est nécessaire, car il est nécessaire de neutraliser les impuretés acidiques pouvant être présentes dans la solution.
Ainsi, dans certains cas, il est nécessaire d'ajouter jusqu'à 2,7 équivalents d'ammoniaque avant que la solution de pénicilline dans le sol- vant organique ne soit neutralisée. L'addition d'ammoniaque en excès sur celle nécessaire à la neutralisation de la solution, bien que pouvant donner lieu à un rendement de récupération plus élevée a également pour résultat d'augmenter le dépôt d'im- puretés colorées et autres.
La légère diminution du rendement de la récupération pro-' voquée par l'addition limitée d'ammoniaque peut être évitée par extraction des liqueurs mères obtenues après séparation du sel d'ammonium précipité par une petite quantité d'alcali aqueux, séparation de la phase aqueuse contenant le sel alcalin de pé- nicilline dissous, acidification de la phase aqueuse séparée. et extraction des acides de pénicilline libérés par une petite quantité d'un solvant approprié tel que cette solution puisse être retournée au premier¯étage du traitement.
Lorsqu'il est,fait ici mention d'équivalents d'ammonia- que, on se base sur la quantité d'ammoniaque équivalant aux aci- des de pénicilline présents dans la solution, qui peuvent être déterminés par des essais chimiques ou biologiques. Dans certains cas, malgré la présence d'alcool,.en particulier lorsqu'il existe une concentration anormalement élevée .d'impuretés dans la so- lution, l'addition de 1'ammoniaque aqueuse concentrée
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peut provoquer d'abord la précipitation de ces impuretés, d'abi- tude sous forme de gommes. Dans ce cas, le précipité gommeux doit être enlevé par filtration et une quantité plus grande d'am- moniaque gazeuse, équivalant approximativement aux acides de pénicilline restant en solution, doit être ajoutée.
Suivant une variante, la pénicilline d'ammonium est précipitée par fractions de la solution en ajoutant l'ammoniaque aqueuse par portions, et séparant le précipité formé après l'addition de chaque portion d'ammoniaque. Cependant, il a été trouvé que cette précipita- tion fractionnée, bien qu'elle puisse aider à la séparation de précipités impurs, foncés, gommeux après l'addition des premiè- res portions d'ammoniaque, ne permet pas de séparation réelle aisée des pénicillines individuelles.
Un procédé à suivre, don- nant des résultats très satisfaisants, consiste par conséquent à ajouter une première portion d'ammoniaque aqueuse pour effec- tuer une séparation préalable de précipité foncé, gommeux;, impur, dans le cas où cela se présente, puis à précipiter la masse de la pénicilline par de l'ammoniaque aqueuse concentrée.
Par conséquent, lorsqu'on applique le procédé sur une grande échelle, il est avantageux d'effectuer un essai prélimi- naire à petite échelle sur la solution particulière de pénicil- line à traiter pour déterminer si une séparation préalable d'un précipité gommeux est nécessaire, et si tel est le cas, pour déterminer la, quantité d'ammoniaque qui doit être ajoutée pour effectuer la séparation de ce précipité gommeux,en produisant en même temps une précipitation aussi minime que possible de la pénicilline sous forme du sel d'ammonium.
il n'est pas possible autrement d'estimer la quantité d'ammoniaque nécessaire dans chaque cas à l'exécution de cette séparation préliminaire car les impuretés présentes dans la solution de la bouillie varient d'une fermentation à l'autre, particulièrement dans le cas où des matières de compositions variables telles que des liqueurs de trempage de blé sont utilisées comme milieu de fermentation.
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La nature de la pénicilline d'ammonium précipitée dépend largement du procédé particulier appliqué; dans le cas où'des gommes ayant pu se former sont séparées au préalable, et où l'ammoniaque restante est ensuite ajoutéelentement en remuant, on obtient un précipité aisément filtrable, friable, qui est cristallin ou amorphe suivant les conditions exactes appliquées.
Il est connu d'âpres les travaux de WEIMARN et consorts que la concentration et la rapidité de mélange des réactifs jouent un rôle important dans la détermination de la dimension des particules des précipités. Ainsi, un mélange rapide de so- lutions concentrées tend à produire un précipité.colloïdal amor- phe, ou microcristallin, tandis qu'un mélange lent en solutions diluées tend à produire la formation de grands cristaux. En conséquence, il a été trouvé qu'en utilisant des solutions aussi diluées que possible sans réduction sensible de la production de précipité par suite de sa solubilité, la couleur et les di- mensions des cristaux du précipité obtenu dans ces conditions sont beaucoup meilleures que lorsqu'on emploie des solutions plus concentrées.
Le sel d'ammonium précipité est séparé du sol- vant, par exemple au moyen d'un filtre centrifuge, et peut être lavé par un peu de mélange de solvant frais et d'alcool..
La liqueur mère, après séparation du sel, contient une petite quantité de pénicilline, qui peut être récupérée en trai- tant la solution par un peu d'alcali aqueux, séparant la phase aqueuse contenant le sel alcalin de pénicilline dissous, acidi- fiant la phase aqueuse séparée et extrayant les acides de pé- nicilline libérés par une petite quantité d'un solvant appro- prié, et retournant cette solution à un étage antérieur de la fabrication.
Les solvants qui sont employés dans les opérations peu- vent être récupérés de toute façon connue. La séparation par distillation, par exemple, ne présente aucune difficulté.sé- rieuse lorsqu'on fait usage d'une solution de pénicilline dans
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de l'acétate de butyle normal, et de méthanol, thanol ou butanol en présence d'eau., malgré lexistence connue de certains mélanges binaires et ternaires à point d'ébullition constant.
Le state suivant de l'opération est la purification des sels d'ammonium de pénicilline ainsi obtenus, qui peut être réa.lisée par leur reprécipitation à partir d'acétone aqueuse par addition d'acétone anhydre. Ceci est possible parce que les sels purs sont très solubles dans l'acétone aqueuse contenant une quantité notable d'eau, mais que la solubilité diminue à mesure que la proportion d'eau est réduite, et est pratiquement nulle dans l'acétone anhydre. Le précipité est amorphe, si l'addition d'acétone anhydre est trop rapide, mais est cristallin si l'addi- ti.on s'effectue suffisamment lentement en remuant. L'addition d'une petite quantité de pénicilline d'ammonium cristalline comme germes peut être avantageuse, mais n'est en général pas nécessaire.
L'addition d'acétone est de préférence continuée jusqu'à ce que la concentration de la solution ait atteint 95% d'acétone et 5% d'eau en volume, après quoi le précipité est séparé, par exemple au moyen d'un filtre centrifuge, puis est lavé par un mélange d'acétone-eau contenant 95% d'acétone. Il a été trouvé que les meilleurs résultats, tels qu'indiqués plus haut, sont obtenus à cet étage du procédé lorsque l'addition d'acétone anhydre à la solution acétoniaue aqueuse de la pénicilline d'ammonium est continuée jusqu'à ce que la concentration finale en acétone at- teigne 95% d'acétone.
L'arrêt de l'addition d'acétone anhydre à une concentration finale plus basse donne lieu à des pertes appréciables lors de la précipitation de la pénicilline d'ammo- nium par suite de sa solubilité dans le mélange acétone-eau, tandis que, d'autre pa.rt, l'addition d'acétone jusqu'à une con- centration supérieure à 95%, bien qu'ayant pour résultat d'obte- nir une précipitation plus importante, donne des produits plus fortement colorés et moins purs.
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Ce procédé de reprécipitation peut être répété une ou plusieurs fois suivant le degré de pureté désiré, mais il a été trouvé qu'en général une précipitation suffit pour donner un produit cristallisé blanc de grande pureté donnant .une solution incolore ou à peu près incolore par dissolution dans l'eau.
Les exemples qui suivent illustrent des modes de réalisa- tion de l'invention, toutes les opérations étant effectuées à la température ordinaire.
EXEMPLE 1.-
250 ml..d'alcool méthylique sont ajoutés à 5 litres d'ex- traits obtenus par l'acétate de.butyle normal anhydre, provenant de bouillies brutes produites par fermentation et contenant 8,000 unités Oxford de pénicilline par millilitre de bouillie et 750 unités Oxford de pénicilline par milligramme de matières solides totales. De l'ammoniaque aque de poids spécifique 0,880 est ajout lentement en remuant, en quantité équivalente à, la pénicilline présente. Un précipité jaune pâle, aisément filtrable et friable est obtenu, qui est séparé dans un filtre centrifuge et lavé avec un peu de mélange d'alcool méthylique- acétate de butyle contenant 5% d'alcool méthylique en volume.
Ce précipité est trouvé contenir 1.100 unités Oxford de pénicil- line par milligramme de matières solides totales, ce qui présente un rendement de récupération de pénicilline, à cet étage, de plus de 88%. Il est redissou: pour donner une solution à peu près saturée dans un mélange d'acétone-eau contenant 80% d'acéto- ne en volume, et on ajoute de l'acétone anhydre lentement en re- muant pour amorcer la reprécipitation à une concentration mini- mum en acétone, l'addition étant arrêtée lorsque la teneur en acétone du mélange atteint 95% en volume. Un précipité blanc, cristallisé, aisément filtrable.est obtenu et séparé au moyen d'un filtre centrifuge.
Il est lavé par un mélange d'eau- acétone contenant 95% d'acétone en volume, séché à l'air et contient 1.600 unités Oxford de pénicilline par milligramme de
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matières solides totales, ce qui représente un rendement d'obten- tion de pénicilline à ce stade de l'opération de 55%. Une nou- velle précipitation similaire à partir d'acétone donne un pro- duit renfermant 1650 unités Oxford par milligramme, qui repré- sente un rendement d'obtention de pénicilline à ce stade de 85%.
EXEMPLE 8.-
500 ml. d'alcool butylique normal sont ajoutés à 5 litres d'extrait par l'acétate de butyle normal anhydre, provenant de bouillies brutes produites par fermentation et contenant 8.000 unités Oxford de pénicilline par millilitre de bouillie et 750 unités Oxford de pénicilline par milligramme de matières soli- des totales. De l'ammoniaque aqueuse de poids spécifique 0,92 est a joutes lentement en remuant en quantité équivalente à la pénicil- line présente. On obtient un précipité jaune pâle, friable, ai- sément filtrable, qu'on sépare dans un filtre centrifuge et lave avec un peu de mélange d'acétate de butyle-alcool butylique contenant 10% d'alcool butylique en volume. Le rendement de la récupération de pénicilline à cette opération est de 90%.
Le précipitéestredissous pour donner une solution à peu près saturée, dans un mélange acétone-eau contenant 85% d'acétone en volume, et on ajoute lentement de l'acétone anhydre en remuant pour amorcer la reprécipitation à une concentration minimum en acétone, et arrête l'addition d'acétone lorsque la teneur en acétone du mélange atteint 95% en volume. Un précipité blanc cristallin, aisément filtrable, est obtenu et séparé dans un filtre à vide, et lavé avec un mélange d'acétone-eau contenant
95% d'acétone en volume,puis séché à l'air.
EXEMPLE 3. -
200 ml. d'alcool méthylique sont ajoutés à 4 litres de solution dans l'acétate de butyle normal anhydre, de pénicilli- ne contenant 12,900 unités Oxford par millilitre de solution, déterminées par essai biologique.. De l'ammoniaque aqueuse de den- sité 0,880 est ajoutée en petites parties aliquotes à cette solu-
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tion, le précipité formé après chaque addition est séparé de la solution restante dans un filtre à vide, chaque précipité étant ensuite lavé par un peu de mélange d'acétate de butyle-alcool -.méthylique contenant 5% d'alcool méthylique en volume.
Les préci- pités individuels sont ensuite pesés et examinés au point de vue de leur teneur totale en pénicilline et de leur teneur en péni- cilline G par la méthode de MERCK à la N-éthyl-pipéridine. Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau suivant:
EMI13.1
Equivalents " Pénicilline %'eni-
EMI13.2
<tb> Fraction <SEP> d'ammonia- <SEP> Précipite <SEP> totale <SEP> dans <SEP> cilline;
<tb> que <SEP> ajoutés <SEP> grs. <SEP> Nature <SEP> le <SEP> précipité <SEP> G <SEP> dans
<tb> % <SEP> poids/poids <SEP> la <SEP> pénicilline
<tb>
EMI13.3
¯¯¯¯¯. ,¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯.¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯totale <'J
EMI13.4
<tb> 1 <SEP> 0.23 <SEP> - <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> 2 <SEP> 0.46 <SEP> 3.66 <SEP> jaune-brun) <SEP> 88 <SEP> 77-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 0. <SEP> 69 <SEP> 6.82 <SEP> jaune <SEP> aisé- <SEP> 93 <SEP> 85. <SEP> 8
<tb>
<tb> ment
<tb>
<tb>
<tb> 4 <SEP> .0.92 <SEP> 4.18¯ <SEP> jaune <SEP> 87 <SEP> 89.4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> 1.15 <SEP> 6.83 <SEP> .jaune <SEP> tra- <SEP> 85.2 <SEP> 69.2 <SEP> ' <SEP>
<tb>
<tb> ble.
<tb>
<tb>
6 <SEP> 1.38 <SEP> .4.44 <SEP> jaune <SEP> 75.2 <SEP> 68. <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> 1.60 <SEP> 1. <SEP> 50 <SEP> brun <SEP> 61.0 <SEP> 50.0 <SEP> .' <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8 <SEP> 1.83 <SEP> traces <SEP> gommes <SEP> rouges <SEP> - <SEP> -
<tb>
On remarque d'âpres ce tableau, qu'en réunissant les fractions 2-6,on obtient de la pénicilline d'ammonium de bonnes pureté et couleur. La pénicilline d'ammonium totale ainsi ob- tenue peut être ensuite précipitée comme décrit dans les exem- ples précédents.
EXEMPLE 4. - ,
Une solution de pénicilline dans l'acétate de butyle normal anhydre est obtenue par extraction de pénicilline d'une bouillie de fermentation dans un solvant organique, suivie d'extraction de la pénicilline de cette solution dans ce sol- vant organique dans une solution alcaline aqueuse, acidifica- tion puis extraction'de cette solution aqueuse par de l'acétate
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de butyle normal. La. solution ainsi obtenue est déshydratée par distillation azéotropique dans un évaporateur de verre à pelli- cule tombante, est ainsi concentrée à la moitié de son volume;, et la solution concentrée est finalement portée à son volume d'origine par de l'acétate de butyle normal anhydre.
A 10 litres de cette solution de pénicilline dans l'acétate de butyle normal anhydre, on ajoute 500 ml. d'alcool éthylique, puis 0,2 équiva- lent d'ammoniaque aqueuse de poids spécifique 0.882 est ajou- té à cette solution et le précipité brut de couleur foncée qui se forme est séparé. Une nouvelle quantité de 1,3 équivalent d'ammoniaque aqueuse de la même concentration est alors ajoutée lentement en remuant à la solution.,, et le précipité jaune formé est filtré. Le précipité séparé est alors purifié par deux pré- cipitations à partir d'acétone, effectuées exactement de la même manière que dans l'exemple 1, et donne une pénicilline d'ammo- nium blanche cristalline avec un rendement total de 40%.
Les liqueurs mères de la solution dans l'acétate de bu- tyle normal, après la précipitation du sel d'ammonium, sont extrai- tes par une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium pour enlever tou te pénicilline restant dans la solution, et cette solution aqueu- se est acidifiée et extraite dans de l'acétate de butyle normale cette solution faisant retour au premier stade de l'opération, avec la charge suivante.
Les liaueurs mères d'acétone sont évaporées sous vide- en présence d'un tampon de phosphate,la pénicilline est extraite dans du butanol normal au pH 6 puis est réextraite dans de l'eau; la solution aqueuse obtenue est réglée au pH 2 et extraite dans l'acétate de butyle. Cette solution dans l'acétate de bu,tyle,, après déshydratation et traitement au carbone, si on le désire, peut aussi être retournée au premier stade du procédé avec la charge suivante.
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Improvements in the production of ammonium salts of penicillin.
This invention relates to the production and purification of ammonium salts of penicillin acids.
The pure ammonium salts of penicillin have clinical value on their own or can be used as intermediates in the production, by known means, of sodium, potassium, calcium and other salts of clinically valuable penicillin, d 'a high degree of purity.
In the preparation of ammonium salts of penicillin, difficulties are frequently encountered in obtaining satisfactory yields of a filterable solid product of reasonable purity.
It might be thought that the ammonium salts of penicillin can be prepared and separated satisfactorily by simple addition of ammonia, gaseous or liquid, or in aqueous solution or in organic solvents to solutions of penicillin without placing themselves under special conditions. any.
However, it is not
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not so and unless the conditions are chosen very carefully, low yields are likely to be obtained, and the products are very difficult to separate and their purity and separability vary greatly from one to another char - age of the penicillin treated. This is particularly the case when the treated penicillin solutions are only moderately pure, since the more impurities they contain, the greater the probability of formation of gummy matter.
T. Another disadvantage of the use of gaseous or liquid ammonia for the precipitation of ammonium penicillin is that these substances cannot be easily handled or dosed without the use of special, relatively complicated. Obviously, the use of a concentrated aqueous ammonia solution does not give rise to the same disadvantages.
The present invention relates to a process for the preparation of ammonium penicillin with good yields, such that there is little variation in the quality of the product from one batch to another and that , moreover, ammonium penicillin is obtained by. an easily filterable soluble form.
In accordance with this improved process for the production of the ammonium salts of penicillin acids, an aqueous ammonia solution of greater than 20% by weight by weight ammonia is added slowly with stirring to a solution. - tion of penicillin in an organic solvent defined below;
, containing a small proportion of a lower aliphatic alcohol, in an amount not exceeding about 10% by volume by volume of the organic solvent for the penicillin, and the
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crude ammonium salt precipitated from the resulting solution.,
The solution of penicillin in the organic solvent from which ammonium penicillin is precipitated consists of acidic forms of penicillin in solution in an organic solvent in which the ammonium salt of penicillin is substantially insoluble, which is substantially immiscible in water and has a lower specific gravity than water.
In saying that the ammonium salt of penicillin is substantially insoluble in the organic solvent, it should be understood that the ammonium salt, prepared by the addition of ammonia to the solution of penicillin in the organic solvent , is substantially completely precipitated from this solution. Scientists particularly suitable for this purpose are butyl acetate, amyl acetate and methyl isobutyl ketone.
It should be noted that chloroform is not suitable as a solvent for this operation, since aqueous ammonia and the precipitate float on its surface and are difficult to separate, and furthermore, the solubility of ammonium penicillin in the, chloroform is greatly increased in the presence of lower alcohols, and therefore the yields are not very high. This solution of penicillin in the organic solvent can be obtained, for example, by extracting the slurry obtained in a fermentation operation for the production of penicillin, adjusted to a suitable pH value, with an organic solvent for penicillin. - line, then the extraction of the separated solvent layer containing the penicillin with an aqueous solution of an alkali.
The separated aqueous phase containing the alkaline salt of penicillin can then be adjusted to a suitable pH value and finally extracted into the desired solvent.
Another method of obtaining a suitable solution of penicillin comprises a series of operations analogous to that described above, but in which different organic solvents
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ques are used for both extraction treatments. For example, normal butyl acetate can be used for the first extraction and methyl isobutyl ketone for the second extraction.
A still different process comprises a single extraction treatment of the slurry with an organic solvent to give a solution which is evaporated or otherwise concentrated by known means, to give a relatively concentrated solution of penicillin in an organic solvent. . Each of the extraction treatments can be performed, for example, in a single stage agitation apparatus or in a continuous countercurrent manner.
The lower aliphatic alcohol which is added to the solution of penicillin in the organic solvent can include any saturated aliphatic monohydric alcohol of less than 5 carbon atoms, and such alcohol is preferably methanol,. ethanol or butanol. The purpose of this addition of the alcohol to the penicillin solution is to maintain in solution any impurity of a gummy nature as well as any amount of water which may separate during the addition of the concentrated aqueous ammonia.
The results obtained by the process of the present invention vary depending on the nature and the concentration of the solution used. of penicillin in the organic solvent, and with the particular alcohol employed and even with the amount of the particular alcohol employed. It is preferred, however, when using a solution in an organic solvent containing water, employing 2% by volume by volume of methyl or ethyl alcohol or 5% normal butanol, and when using a solution of penicillin in an anhydrous organic solvent, use 5% methyl or ethyl alcohol or 10% normal butyl alcohol.
The use of concentrations greater than 10% of these alcohols does not give any improvement in the yields obtained, and may even give rise to lower yields because
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increasing the amount of alcohol used may cause an increase in the solubility of the ammonium salt in the organic solvent employed. Therefore, the use of alcohol in an amount greater than 10% is not necessary, desirable or economical. It should be noted, however, that although the use of specified amounts of methanol, ethanol and butanol is preferred above, satisfactory results can also be obtained when different amounts of these alcohols and propanol are employed.
The advantage resulting from the precipitation of the ammonium salt in the presence of these alcohols is very real, since when the precipitation is carried out in the absence of these alcohols, the resulting precipitate, usually has a dark yellow color, is gummy and very difficult to filter. This advantage is also shown in the following table :.
EMI5.1
Self 0 --- C-one entrainment ombre de endemeni - NitûrF
EMI5.2
<tb> from <SEP> of alcohol <SEP>% <SEP> phases <SEP> after <SEP> from <SEP> recovers- <SEP> from
<tb> penicillin <SEP> vol / vol <SEP> addition <SEP> of <SEP> ration <SEP> of <SEP> precipi-
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ammonia <SEP> penicillin <SEP> t
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EMI5.3
meux fil- rùêùx, film
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<tb>
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<tb>
<tb> id. <SEP> 5% <SEP> alcohol
<tb> methyl <SEP> 1 <SEP> 60 <SEP> id.
<tb>
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The results in each case were obtained by adding aqueous ammonia of specific gravity 0.880 to a solution of penicillin in normal butyl acetate at a concentration of 10,000 Oxford units per milliliter, the addition conditions of the ammonia being the same and all of the ammonia being added all at once, slowly, with stirring.
One sees that the best results are obtained when the solution of penicillin in the organic solvent is anhydrous and contains 5% methyl or ethyl alcohol or 10% butyl alcohol. Removal of water from the solution of penicillin in the organic solvent can be accomplished by azeotropic distillation or by drying the solution with anhydrous sodium sulfate, although this means is less efficient than azeotropic distillation.
It should be noted that it is essential to add the aqueous ammonia to the penicillin solution slowly while stirring, otherwise ammonia may settle to the bottom of the apparatus and the risk of formation of gums is greatly increased even in the presence of a certain amount of a lower aliphatic alcohol.
In addition, the concentration of aqueous ammonia is necessarily greater than 20% by weight, the maximum concentration remaining 35% by weight, since when ammonia of a concentration less than 20% by weight, the yield of ammonium penicillin is significantly less than that obtained with ammonia of a concentration greater than 20% by weight. The use of gaseous or liquid anhydrous ammonia gives rise to low yields because of the high local concentrations of ammonia obtained, and of the? absence of any amount of water to aid in mechanical distribution.
The amount of ammonia added to the penicillin is preferably between 1.0 and 1.3 times that equivalent to the acids of penicillin in the solution when the solution.
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of penicillin in the organic solvent is reasonably pure. However, when treating impure solutions of penicillin, such as obtained by single extraction of a slurry with an organic solvent, particularly when using a material of varying composition such as wheat steep liquors, as a nutrient in the slurry a significantly higher amount of ammonia is required, since it is necessary to neutralize any acidic impurities which may be present in the solution.
Thus, in some cases it is necessary to add up to 2.7 equivalents of ammonia before the solution of penicillin in the organic solvent is neutralized. Addition of ammonia in excess of that required for neutralization of the solution, although which may result in a higher recovery yield also results in increased deposition of colored and other impurities.
The slight decrease in the recovery yield caused by the limited addition of ammonia can be avoided by extracting the mother liquors obtained after separation of the ammonium salt precipitated by a small amount of aqueous alkali, separation of the phase. aqueous containing the alkaline salt of penicillin dissolved, acidifying the separated aqueous phase. and extracting the liberated penicillin acids with a small amount of a suitable solvent such that this solution can be returned to the first stage of processing.
Where ammonia equivalents are mentioned herein, this is based on the amount of ammonia equivalent to the penicillin acids present in the solution, which can be determined by chemical or biological tests. In some cases, despite the presence of alcohol, particularly when there is an abnormally high concentration of impurities in the solution, the addition of the concentrated aqueous ammonia
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may first precipitate these impurities, usually in the form of gums. In this case, the gummy precipitate must be removed by filtration and a larger amount of ammonia gas, approximately equivalent to the penicillin acids remaining in solution, must be added.
According to a variant, the ammonium penicillin is precipitated by fractions of the solution by adding the aqueous ammonia in portions, and separating the precipitate formed after the addition of each portion of ammonia. However, it has been found that this fractional precipitation, although it may aid in the separation of impure, dark, gummy precipitates after the addition of the first portions of ammonia, does not allow easy actual separation of the ammonia. individual penicillins.
A procedure to be followed, giving very satisfactory results, therefore consists in adding a first portion of aqueous ammonia to effect a preliminary separation of dark, gummy precipitate ;, impure, if this occurs, then in precipitating the mass of the penicillin with concentrated aqueous ammonia.
Therefore, when applying the method on a large scale, it is advantageous to perform a preliminary small scale test on the particular penicillin solution to be treated to determine whether a prior separation of a gummy precipitate is. necessary, and if so, to determine the amount of ammonia which must be added to effect the separation of this gummy precipitate, at the same time producing as little precipitation as possible of the penicillin as the salt of ammonium.
it is not possible otherwise to estimate the quantity of ammonia necessary in each case to carry out this preliminary separation because the impurities present in the solution of the slurry vary from one fermentation to another, particularly in the where materials of varying composition such as wheat steep liquors are used as the fermentation medium.
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The nature of the precipitated ammonium penicillin depends largely on the particular process applied; in the case where gums which may have formed are separated beforehand, and where the remaining ammonia is then added slowly with stirring, an easily filterable, friable precipitate is obtained which is crystalline or amorphous depending on the exact conditions applied.
It is known from the work of WEIMARN et al. That the concentration and the speed of mixing of the reactants play an important role in determining the particle size of the precipitates. Thus, rapid mixing of concentrated solutions tends to produce an amorphous, or microcrystalline, colloidal precipitate, while slow mixing of dilute solutions tends to produce the formation of large crystals. Accordingly, it has been found that by using solutions as dilute as possible without appreciable reduction in the production of precipitate due to its solubility, the color and dimensions of the crystals of the precipitate obtained under these conditions are much better than. when more concentrated solutions are used.
The precipitated ammonium salt is separated from the solvent, for example by means of a centrifugal filter, and can be washed with a little mixture of fresh solvent and alcohol.
The mother liquor, after separation of the salt, contains a small amount of penicillin, which can be recovered by treating the solution with a little aqueous alkali, separating the aqueous phase containing the dissolved alkali salt of penicillin, acidifying the solution. aqueous phase separated and extracting the released penicillin acids with a small amount of a suitable solvent, and returning this solution to an earlier stage of manufacture.
The solvents which are employed in the operations can be recovered in any known manner. Separation by distillation, for example, presents no serious difficulty when using a solution of penicillin in
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of normal butyl acetate, and of methanol, thanol or butanol in the presence of water., despite the known existence of certain binary and ternary mixtures at constant boiling point.
The next stage of the operation is the purification of the ammonium salts of penicillin thus obtained, which can be carried out by their reprecipitation from aqueous acetone by addition of anhydrous acetone. This is possible because the pure salts are very soluble in aqueous acetone containing a significant amount of water, but the solubility decreases as the proportion of water is reduced, and is practically zero in anhydrous acetone. The precipitate is amorphous if the addition of anhydrous acetone is too rapid, but is crystalline if the addition is made slowly enough with stirring. The addition of a small amount of crystalline ammonium penicillin as seeds can be advantageous, but is generally not necessary.
The addition of acetone is preferably continued until the concentration of the solution has reached 95% acetone and 5% water by volume, after which the precipitate is separated, for example by means of a centrifugal filter, then washed with an acetone-water mixture containing 95% acetone. It has been found that the best results, as indicated above, are obtained at this stage of the process when the addition of anhydrous acetone to the aqueous acetone solution of the ammonium penicillin is continued until the addition of anhydrous acetone to the aqueous acetone solution of the ammonium penicillin. The final acetone concentration is 95% acetone.
Stopping the addition of anhydrous acetone at a lower final concentration results in appreciable losses in precipitation of ammonium penicillin due to its solubility in acetone-water mixture, while, on the other hand, the addition of acetone up to a concentration greater than 95%, although having the result of obtaining a greater precipitation, gives more strongly colored and less pure products. .
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This reprecipitation process can be repeated one or more times depending on the degree of purity desired, but it has been found that in general a precipitation is sufficient to give a white crystalline product of high purity giving a colorless or nearly colorless solution by dissolving in water.
The following examples illustrate embodiments of the invention, all operations being carried out at room temperature.
EXAMPLE 1.-
250 ml of methyl alcohol are added to 5 liters of extracts obtained by normal anhydrous butyl acetate, obtained from crude slurries produced by fermentation and containing 8,000 Oxford units of penicillin per milliliter of slurry and 750 units Oxford penicillin per milligram total solids. Aque ammonia of specific gravity 0.880 is added slowly with stirring, in an amount equivalent to, the penicillin present. A pale yellow, easily filterable and friable precipitate is obtained which is separated in a centrifugal filter and washed with a little mixture of methyl alcohol-butyl acetate containing 5% methyl alcohol by volume.
This precipitate is found to contain 1,100 Oxford units of penicillin per milligram of total solids, which exhibits a penicillin recovery yield at this stage of over 88%. It is redissolved to give an approximately saturated solution in an acetone-water mixture containing 80% acetone by volume, and anhydrous acetone is added slowly with stirring to initiate reprecipitation at a temperature. minimum acetone concentration, the addition being stopped when the acetone content of the mixture reaches 95% by volume. A white, crystalline, easily filterable precipitate is obtained and separated by means of a centrifugal filter.
It is washed with a water-acetone mixture containing 95% acetone by volume, air dried and contains 1,600 Oxford units of penicillin per milligram of
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total solids, which represents a penicillin yield at this stage of the operation of 55%. Similar further precipitation from acetone gives a product containing 1650 Oxford units per milligram, which represents a yield of penicillin at this point of 85%.
EXAMPLE 8.-
500 ml. of normal butyl alcohol are added to 5 liters of anhydrous normal butyl acetate extract from crude slurries produced by fermentation and containing 8,000 Oxford units of penicillin per milliliter of slurry and 750 Oxford units of penicillin per milligram of material total solids. Aqueous ammonia of specific gravity 0.92 is added slowly with stirring in an amount equivalent to the penicillin present. A pale yellow, friable, easily filterable precipitate is obtained which is separated in a centrifugal filter and washed with a little mixture of butyl acetate-butyl alcohol containing 10% butyl alcohol by volume. The yield of penicillin recovery in this operation is 90%.
The precipitate is dissolved to give a roughly saturated solution in an acetone-water mixture containing 85% acetone by volume, and anhydrous acetone is slowly added with stirring to initiate reprecipitation to a minimum acetone concentration, and stop the addition of acetone when the acetone content of the mixture reaches 95% by volume. A crystalline white precipitate, easily filterable, is obtained and separated in a vacuum filter, and washed with an acetone-water mixture containing
95% acetone by volume, then air dried.
EXAMPLE 3. -
200 ml. of methyl alcohol are added to 4 liters of solution in normal anhydrous butyl acetate, of penicillin containing 12,900 Oxford units per milliliter of solution, determined by biological test. Aqueous ammonia of density 0.880 is added in small aliquots to this solution.
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tion, the precipitate formed after each addition is separated from the remaining solution in a vacuum filter, each precipitate then being washed with a little mixture of butyl acetate-methyl alcohol containing 5% methyl alcohol by volume.
The individual precipitates are then weighed and examined for their total penicillin content and penicillin G content by the MERCK method with N-ethyl-piperidine. The results obtained are given in the following table:
EMI13.1
Equivalents "Penicillin% 'eni-
EMI13.2
<tb> Ammonia <SEP> fraction- <SEP> Total <SEP> precipitate <SEP> in <SEP> cillin;
<tb> that <SEP> added <SEP> grs. <SEP> Nature <SEP> the <SEP> precipitated <SEP> G <SEP> in
<tb>% <SEP> weight / weight <SEP> the <SEP> penicillin
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¯¯¯¯¯. , ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯total <'J
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<tb> 1 <SEP> 0.23 <SEP> - <SEP> -
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<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb> lying
<tb>
<tb>
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> 1.15 <SEP> 6.83 <SEP> .jaune <SEP> tra- <SEP> 85.2 <SEP> 69.2 <SEP> '<SEP>
<tb>
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<tb>
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<tb>
<tb>
<tb> 7 <SEP> 1.60 <SEP> 1. <SEP> 50 <SEP> brown <SEP> 61.0 <SEP> 50.0 <SEP>. ' <SEP>
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<tb>
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<tb>
<tb> 8 <SEP> 1.83 <SEP> traces <SEP> red erasers <SEP> <SEP> - <SEP> -
<tb>
It can be seen from this table that by combining fractions 2-6, ammonium penicillin of good purity and color is obtained. The total ammonium penicillin thus obtained can then be precipitated as described in the preceding examples.
EXAMPLE 4. -,
A solution of penicillin in anhydrous normal butyl acetate is obtained by extracting penicillin from a fermentation slurry in an organic solvent, followed by extracting the penicillin from this solution in this organic solvent into an aqueous alkaline solution. , acidification and then extraction of this aqueous solution with acetate
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of normal butyl. The solution thus obtained is dehydrated by azeotropic distillation in a falling film glass evaporator, is thus concentrated to half of its volume ;, and the concentrated solution is finally brought to its original volume with acetate. of normal anhydrous butyl.
To 10 liters of this solution of penicillin in normal anhydrous butyl acetate, 500 ml are added. of ethyl alcohol, then 0.2 equivalent of aqueous ammonia of specific gravity 0.882 is added to this solution and the dark colored crude precipitate which forms is separated. A further quantity of 1.3 equivalents of aqueous ammonia of the same concentration is then added slowly with stirring to the solution. ,, and the yellow precipitate formed is filtered. The separated precipitate is then purified by two precipitations from acetone, carried out in exactly the same manner as in Example 1, and gives a white crystalline ammonium penicillin in a total yield of 40%.
The mother liquors of the solution in normal butyl acetate, after precipitation of the ammonium salt, are extracted with an aqueous solution of sodium hydroxide to remove any penicillin remaining in the solution, and this aqueous solution is acidified and extracted into normal butyl acetate, this solution returning to the first stage of the operation, with the following charge.
The mother binders of acetone are evaporated in vacuo in the presence of a phosphate buffer, the penicillin is extracted in normal butanol at pH 6 then is re-extracted in water; the aqueous solution obtained is adjusted to pH 2 and extracted into butyl acetate. This solution in bu, tyl acetate after dehydration and carbon treatment, if desired, can also be returned to the first stage of the process with the next charge.