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La présente invention se rapporte à un procédé d'isole- ment et plus particulièrement à un procédé perfectionné pour isoler l'acide gibbérellique de milieux de fermentation aqueux.
Il est connu d'isoler l'acide gibbérellique de ses solu- tions aqueuses, par exemple d'un milieu de fermentation, en l'adsor- bant du milieu de fermentation sur du charbon de bois, en l'éluant et en le séparant de l'éluat.
On a découvert à présent que l'acide gibbérellique peut être isolé d'une solution aqueuse de fermentation, en soumettant cet- te solution aqueuse de fermenta.tion'à une extraction à l'aide d'un solvant organique approprié, par exemple l'acétate d'éthyle, et en séparant ensuite l'acide gibbérellique de ce solvant.
Cela étant,, la présente invention a pour objet un procédé perfectionné pour isoler l'acide gibbérellique d'un milieu de fer-
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mentation aqueux de cet acide, procédé dans lequel on soumet ce mi- lieu de fermentation aqueux à une extraction à, T'aide d'un solvant organique approprié, immiscible à l'eau ou partiellement miscible à l'eau, choisi dans le groupe formé d'esters, de cétones, d'al- cools et d'éthers.
Ce milieu de fermentation aqueux qui contient l'acide gibbérellique et qui sert de matière première peut être obtenu par un procédé quelconque connu, par exemple il peut prendre la forme d'un filtrat aqueux provenant d'un milieu de fermentation contenant de l'acide gibbérellique et préparé par la culture de champignons produisant de l'acide gibbérellique sur un milieu aqueux nutritif approprié. Le champignon Gibberella fujikuroi convient à cet effet, mais on peut utiliser d'autres champignons ou leurs variantes produi- sant de l'acide gibbérellique.
A titre d'exemples de solvants organiques appropriés choisis dans le groupe consistant en esters, cétones, alcools et éthers qui peuvent être utilisés dans le procédé d'extraction de la présente invention, on citera l'acétate d'éthyle, l'acétate de n-butyle, l'acétate d'isoamyle, le carbonate d'éthyle, le propio- nate d'éthyle, le n-butyrate dthyle, le lactate de n-butyle, l' acétate d'isopropyle, l'acétate de p-éthoxyéthyle, l'acétate de méthoxybutyle, la méthyl-n-propylcétine, la cyclohexanone, la di- éthylcétone, la méthylisobutylcétone, la méthylcyclohexanone, la méthyléthylcétone, l'alcool benzylique, le butanol secondaire, le cyclohexanol, le butanol normal, l'éther éthylique et le 1-1-dimé- thoxy-éthane.
Il est évident que ce solvant peut êtreun mélange des solvants, par exemple un mélange composé de n-butanol et d'acé- tate de n-butyle, ou bien un mélange composé d'acétate d'isoamyle et d'acétate de n-amyle, comme c'est le cas pour l'acétate d'amyle industriel.
Les solvants préférés sont l'acétate d'éthyle, l'acétate d'isoamyle, la méthyl-n-propylcétone et la méthyl-iso-butylcétone.
Le milieu de fermentation aqueux filtré contenant l'acide gibbérellique utilisé comme matière première est de préférence réglé à un pH compris entre 1,5 et 4,0 avant l'extraction à l'aide d'un
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solvant organique approprié. L'acide gibbérellique peut être isolé de l'extrait au solvant organique ainsi obtenu par tout procédé con- nu, et, par exemple; cet extrait peut être concentré et le produit brut obtenu peut être purifié par des procédés connus pour donner l'acide gibbérellique.
Un procédé adéquat de purification de l'acide gibbérel- lique consiste à extraire l'acide gibbérellique du solvant organique en le versant dans une solution tampon au pH 6 à 8. L'extrait au tampon est ensuite acidifié au pH 3 à 4 et l'acide gibbérellique ainsi libéré est ensuite extrait à l'acétate d'éthyle. L'acétate d'éthyle est ensuite desséché à l'aide de sulfate de sodium et réduit à un petit volume, et l'acide gibbérellique presque pur se sépare par cristallisation. On peut ajouter une fraction légère du pétrole pour obtenir un meilleur rendement en matière recherchée.
La présente invention est illustrée, sans y être limitée... par les exemples suivants : EXEMPLE 1.-
On règle au pH 3, 3 litres de filtrat de culture, dont la teneur en acide gibbérellique est estimée à 117 mg, et on les soumet à une triple extraction à l'acétate d'éthyle en utilisant chaque fois 1,5 litre. On combine les premier et deuxième extraits et on les évapore à 100 cm3 et on les extrait deux fois à l'aide d'une solution tampon de phosphate (136 g de phosphate monopotas- sique et 24 g d'hydroxyde de potassium.et eau distillée pour faire 1 litre ; pH 6,3) en utilisant 25 cm3 chaque fois. Les extraits au tampon sont combinés, réglés au pH 3,5 - 3,8 et extraits deux fois à l'acétate d'éthyle en utilisant chaque fois 70 cm3 d'acétate d' éthyle.
On réduit ensuite les extraits à l'acétate d'éthyle combinés à un petit volume et on y ajoute une fraction légère du pétrole, @ et l'acide gibbérellique cristallise. On obtient ainsi 72 mg d'acide gibbérellique, point de fusion 233-235 C, avec décomposition.
EXEMPLE 2.-
On règle au PH 3, 1 litre d'un filtrat de culture, dont la teneur en acide gibbérellique est estimée à 39 mg, et on l'ex-
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trait deux fois à l'acétate de butyle en utilisant chaque fois 1 litre. On évapore les extraits combinés et on purifie le produit brut comme dans l'exemple 1. On obtient ainsi 8 mg d'acide gibbérel- lique, point de fusion 233-235 C avec décomposition.
EXEMPLE 3.-
On règle au pH 3,2 litres d'un filtrat de culture, dont la teneur en acide gibbérellique est estimée à 378 mg et on les ex- trait deux fois à l'acétate d'éthyle en utilisant chaque fois deux litres. On évapore les extraits combinés et on purifie le produit brut comme dans l'exemple 1. On obtient ainsi 268 mg d'acide gibbé- rellique, point de fusion 233-235 C avec déconosition.
EXEMPLE 4.-
On règle au pH 3, 2 litres d'un filtrat de culture dont la teneur en acide gibbérellique est estimée entre 690 et 886 mg et on les extrait trois fois à l'acétate d'éthyle, en utilisant respectivement 1 litre, 2 litres et 1 litre d'acétate d'éthyle.
On combine les premier et deuxième extraits et on les évapore jusqu' un volume de 100 cm3 qu'on extrait deux fois à l'aide d'une solution tampon de phosphate (136 g de phosphate monopotassique et 24 g d' hydroxyde de potassium et eau distillée pour faire 1 litre; pH 6,3) en utilisant chaque fois 25 cm3. Ces extraits au tampon sont combi- nés, réglés au pH 3,5 - 3,8 et extraits deux fois à l'acétate d' éthyle, en utilisant chaque fois 70 cm3. Les extraits à l'acétate d'éthyle combinés sont alors réduits à un petit volume et une frac- tion légère du pétrole est ajoutée et l'acide gibbérellique se cris- tallise. On obtient ainsi 708 mg d'acide gibbérellique, point de fu- sion 233-235 C avec décomposition.
Le troisième extrait du filtrat de culture, purifié d'une façon semblable, donne encore 38 mg d'acide gibbérellique.
EXEMPLE 5.-
On extrait à l'aide de 2 litres d'éther éthylique, 2 litres d'un filtrat de culture dont la teneur en acide gibbérellique.est estimée entre 690 et 886 mg. On extrait ensuite l'extrait éthéré
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à l'aide de 280 cm3 d'une solution tampon de phosphate (136 g de phosphate monopotassique et 24 g d'hydroxyde de potassium et eau distillée pour faire llitre; pH 6,3). On extrait de nouveau le fil- trat de culture au même éther éthylique et on extrait de nouveau l' extrait éthéré à la même solution tampon. On répète quatre fois en tout ce procédé, L'extrait au tampon est ensuite réglé au pH 3,5- 3,8 et extrait deux fois à l'acétate d'éthyle en utilisant 350 cm3 d'acétate d'éthyle chaque fois.
On réduit les extraits combinés à un petit volume et on y ajoute une fraction légère du pétrole et de l'acide gibbérellique cristallise. On obtient ainsi 558 mg d'acide gibbérellique, point de fusion 233-235 C, avec décomposition.
En utilisant 2 litres d'éther/éthylique frais et 280 cm3 de solution tampon de phosphate fraîche, on reprend le procédé d'extraction et de purification précité à l'aide du filtrat de cul- ture. On obtient ainsi encore 226 mg d'acide gibbérellique, point de fusion 233-235 C, avec décomposition.
EXEMPLE 6.-
On règle au pH 2,5 par de l'acide phosphorique, 7,2 li- tres de filtrat de culture dont la teneur en acide gibbérellique est estimée à 450 mg par litre et on les extrait trois fois à l'acé- tate d'éthyle en utilisant chaque fois 3,6 litres de solvant. On concentre à 1 litre les extra.its combinés et on les extrait ensuite trois fois avec une solution aqueuse de bicarbonate de sodium de façon à obtenir un pH 7 dans la phase aqueuse, en utilisant respecti. vement 500 cm3, 150 cm3 et 150 cm3, On règle l'extrait aqueux au pH 3,5 et on l'extrait ensuite trois'fois à l'aide d'acétate d'éthyle.
On combine les extraits et on les concentre sous vide. L'acide gibbérellique qui cristallise est séparé par filtration, lavé avec de l'acétate d'éthyle et séché sous vide. On obtient ainsi 2,55 g d'acide gibbérellique, point de fusion 233-234 C avec décomposition
On reprend le procédé décrit ci-dessus excepté que tout au long du processus on remplace l'acétate d'éthyle par de l'acétate
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d'amyle comme solvant. On obtient ainsi d'une façon semblable, 2,33 g d'acide gibbérellique, point de fusion 233-234 C avec décomposition.
EXEMPLE 79-
1125 litres d'un filtrat de culture dont la teneur en acide gibbérellique est estimée à 400 mg par litre, sont soumis à une extraction à l'acétate d'éthyle à l'aide d'un extracteur Podbielniak au pH 2,8. On concentre à l'extrait (54 litres) sous vide jusqu'à un volume de 35 litres. On extrait le concentré ainsi obtenu à l'aide d'une solution aqueuse de tampon, on règle après mélange au pH 5,9 en utilisant successivement 10, 5 et 2 litres. Le premier extrait (10 litres) est extrait trois fois à l'aide d'acétate d'éthyle (en utilisant respectivement 5, 2,5 et 1,25 litres) après réglage au pH 3 après mélange au solvant. On combine le deuxième et le troisième extrait au tampon (total 5 litres) et on les extrait deux fois (2,5 et 1,5 litres) à l'aide d'acétate d'éthyle.
Tous les extraits d'acétate d'éthyle sont combinés et filtrés à travers un auxiliaire de filtration de terre d'infusoire et ils sont partielle- ment desséchés à l'aide de sulfate de sodium anhydre. On concentre sous vide les extraits combinés en deux parties. Quand le volume est tombé à 750 cm3, la cristallisation de l'acide gibbérellique commence et on arrête la concentration. On refroidit le mélange, on le filtre et on lave le résidu solide avec de l'acétate d'éthyle et on le laisse ensuite sécher à l'air. La concentration des liqueurs mères donne d'autres récoltes de matière solide. La quantité totale d'acide gibbérellique ainsi obtenu s'établit à 313,2 g, point de fusion 234- 235 C avec décomposition.
EXEMPLE 8.-
Le rendement de l'extraction de l'acide gibbérellique d'un milieu de fermentation aqueux par différents solvants est établi par le procédé décrit ci-après.
Une solution aqueuse d'acide gibbérellique préparée en dissolvant 0,5 g d'acide gibbérellique très divisé dans 250 cm3 d'eau distillée est filtrée pour éliminer la matière éventuellement non
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dissoute. On titre ensuite 25 cm3 de cette seiation avec une solu- tion aqueuse d'hydroxyde de sodium N/100, en utilisant comme indi- cateur la phénolpltaléine, et le volume de la solution d'hydroxyde de sodium requis est note. (X)
25 cm3 de la. solution diacide gibbérellique sont alors agités pendant environ 1 minute avec 25 cm3 de solvant à l'essai, dans un entonnoir séparateur bouché.
On déverse ensuite la phase aqueuse, on la titre avec une solution aqueuse d'hydroxyde de so- dium N/100 en utilisant comme indicateur la phénolphtaléine, et on note le titre (Y).On effectue alors une détermination à blanc à l'aide de 25 cm3 d'eau distillée et 25 cm3 de solvants On déverse encore une fois la phase aqueuse-et on la titre avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium N/100 et 'on note le 'titre du petit échantillon à blanc (B).
Le rendement en % de l'extraction est calculé d'après la formule:
Rendement % = [X-(Y-B)]X 100
X
Le % de rendement de l'extraction pour un certain nombre de solvants est donné ci-après:
EMI7.1
<tb> Solvant <SEP> utilisé <SEP> Rendement <SEP> de <SEP> l'extraction
<tb>
<tb>
<tb> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> éther <SEP> éthylique <SEP> 32
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> diéthylcétone <SEP> 74
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> méthyl <SEP> n-propyl <SEP> cétone <SEP> 79
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> méthyléthylcétone <SEP> 57
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> méthylisobutylcétone <SEP> 72
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1:
1-diméthoxyéthane <SEP> 19
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> carbonate <SEP> de <SEP> diéthyle <SEP> 39
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> alcool <SEP> benzylique <SEP> 86
<tb>
<tb>
<tb> sec. <SEP> -butanol <SEP> 85
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> alcool <SEP> n-amylique <SEP> 91
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cyclohexanone <SEP> 95
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> méthylcyclohexanone <SEP> 87
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cyclohexanol <SEP> 98
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> propionate <SEP> d'éthyle <SEP> 54
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> n-butyrate <SEP> d'éthyle <SEP> 39
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lactate <SEP> de <SEP> n-butyle <SEP> 89
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> d'éthyle <SEP> 71
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> d'isopropyle <SEP> 57
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> de <SEP> ss-éthoxyéthyle <SEP> 88
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> de <SEP> n-butyle <SEP> 54
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> de <SEP>
3-méthoxybutyle <SEP> 88
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> de <SEP> n-butyle <SEP> + <SEP> 10% <SEP> n-butanol <SEP> 73
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> d'amyle <SEP> 68
<tb>
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EXEMPLE 9.-
5350 litres d'un filtrat de culture provenant d'un fer- mentateur industriel, dont la teneur en acide gibbérellique est estimée à 1170 g, est soumis à une extraction à l'aide d'acétate d'éthyle au pH 2 à l'aide d'un extracteur Podbielniak. L'acétate d'éthyle séparé (4050 litres) est concentré sous pression réduite < jusqu'à 247 litres, On extrait ensuite 243 litres de ce concentré successivement avec 22,5, 18 et 18 litres d'eau contenant respecti- vement 1100, 100 et 25 g de bicarbonate de potassium, de façon que les extraits aqueux aient un pH 6,3.
La quantité de bicarbonate de potassium utilisée au cours de la première extraction est déterminée par le titrage d'une partie dé l'extrait concentré avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium N/10 en se servant comme indicateur de phénolphtaléine, ce qui montre que l'extrait concentré contient , des acides équivalents à 0,68 N/10 d'acide, La quantité de bicarbo- nate utilisée pour la première extraction est équivalente à deux tiers de la quantité calculée d'après le titrage. Les trois extraits au bicarbonate sont maintehus séparés et débarrassés de solvant à l'aide d'un séparateur centrifuge. Le troisième extrait est acidifié par de l'acide chlorhydrique aqueux et extrait deux fois à l'aide de 7,6 litres d'acétate d'éthyle, en réglant après mélange le pH à 3,3.
Le second extrait est ensuite extrait successivement à l'aide des deux extraits à l'acétate d'éthyle ci-dessus, en acidifiant de la même façon, et puis à l'aide d'un troisième lot d'acétate d'éthyle (4,5 litres). Le premier extrait au bicarbonate est ensuite extrait successivement avec les trois extraits à l'acétate d'éthyle utilisés précédemment et puis à l'aide d'encore 4,5 litres d'acétate d'éthyle, la phase aqueuse étant de nouveau réglée au pH 3,3. Les extraits à l'acétate d'éthyle combinés (36 litres y compris les liquides de lava- ge) ont une couleur brune et ils sont concentrés sous pression ré- duite jusqu'au moment où l'acide gibbérellique se sépare par cristal- lisation.
L'acide gibbérellique est séparé par filtration après l'a-
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voir laissé reposer pendant plusieurs heures et le solvant est concentré davantage pour donner encore de l'acide gibbérellique.
L'acide gibbérellique est soigneusement lavé avec de l'acétate d'éthyle pour le décolorer; il est obtenu sous la forme d'une matière solide cristalline blanche, point de fusion 234-235 C.
Son poids après séchage sous vide à 40 C s'établit à 947 g ou 81% de la matière présente dans la solution initiale.
REVENDICATIONS
1.- Procédé perfectionné pour isoler de l'acide gibbé- rellique d'un milieu de fermentation aqueux qui le contient, carac- térisé en ce qu'on extrait ce milieu de fermentation aqueux à l'aide d'un solvant organique approprié immiscible à l'eau ou partiellement miscible à l'eau choisi dans le groupe esters, cétones, alcools et éthers.
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The present invention relates to an isolation process and more particularly to an improved process for isolating gibberellic acid from aqueous fermentation media.
It is known to isolate gibberellic acid from its aqueous solutions, for example from a fermentation medium, by adsorbing the fermentation medium onto charcoal, eluting it and separating it. of the elected representative.
It has now been found that gibberellic acid can be isolated from an aqueous fermentation solution, by subjecting this aqueous fermentation solution to extraction with a suitable organic solvent, for example. ethyl acetate, and then separating the gibberellic acid from this solvent.
However, the present invention relates to an improved process for isolating gibberellic acid from an iron medium.
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aqueous fermentation of this acid, process in which this aqueous fermentation medium is subjected to extraction with the aid of a suitable organic solvent, immiscible with water or partially miscible with water, chosen from the group formed from esters, ketones, alcohols and ethers.
This aqueous fermentation medium which contains gibberellic acid and which serves as a raw material can be obtained by any known method, for example it can take the form of an aqueous filtrate from a fermentation medium containing acid. gibberellic and prepared by culturing gibberellic acid producing fungi on a suitable nutrient aqueous medium. Gibberella fujikuroi fungus is suitable for this purpose, but other fungi or their variants which produce gibberellic acid can be used.
As examples of suitable organic solvents selected from the group consisting of esters, ketones, alcohols and ethers which can be used in the extraction process of the present invention, there will be mentioned ethyl acetate, ethyl acetate. n-butyl, isoamyl acetate, ethyl carbonate, ethyl propionate, ethyl n-butyrate, n-butyl lactate, isopropyl acetate, p acetate -ethoxyethyl, methoxybutyl acetate, methyl-n-propylketin, cyclohexanone, di-ethyl ketone, methylisobutyl ketone, methylcyclohexanone, methyl ethyl ketone, benzyl alcohol, secondary butanol, normal cycloanolanol, l ethyl ether and 1-1-dimethoxy-ethane.
Obviously, this solvent can be a mixture of solvents, for example a mixture composed of n-butanol and n-butyl acetate, or a mixture composed of isoamyl acetate and n-acetate. amyl, as is the case with industrial amyl acetate.
The preferred solvents are ethyl acetate, isoamyl acetate, methyl-n-propyl ketone and methyl-iso-butyl ketone.
The filtered aqueous fermentation medium containing gibberellic acid used as a raw material is preferably adjusted to a pH of between 1.5 and 4.0 before extraction using a
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suitable organic solvent. Gibberellic acid can be isolated from the organic solvent extract thus obtained by any known method, and, for example; this extract can be concentrated and the crude product obtained can be purified by known methods to give gibberellic acid.
A suitable method of purifying gibberellic acid is to extract gibberellic acid from the organic solvent by pouring it into a buffer solution at pH 6 to 8. The buffered extract is then acidified to pH 3 to 4 and 1. Gibberellic acid thus released is then extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate is then dried with sodium sulfate and reduced to a small volume, and the almost pure gibberellic acid crystallizes out. A light fraction of the oil can be added to obtain a better yield of the desired material.
The present invention is illustrated, without being limited thereto ... by the following examples: EXAMPLE 1.-
3 liters of culture filtrate, the gibberellic acid content of which is estimated at 117 mg, are adjusted to pH 3.3 and subjected to a triple extraction with ethyl acetate, using 1.5 liters each time. The first and second extracts were combined and evaporated to 100 cm3 and extracted twice with a phosphate buffer solution (136 g of monopotassium phosphate and 24 g of potassium hydroxide and water. distilled to make 1 liter; pH 6.3) using 25 cm3 each time. The buffer extracts are combined, adjusted to pH 3.5-3.8 and extracted twice with ethyl acetate using 70 cm3 of ethyl acetate each time.
The combined ethyl acetate extracts are then reduced to a small volume and a light petroleum fraction is added thereto, and the gibberellic acid crystallizes. This gives 72 mg of gibberellic acid, melting point 233-235 C, with decomposition.
EXAMPLE 2.-
Is adjusted to pH 3, 1 liter of a culture filtrate, the content of gibberellic acid is estimated at 39 mg, and ex-
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milk twice with butyl acetate using 1 liter each time. The combined extracts are evaporated and the crude product is purified as in Example 1. In this way 8 mg of gibberellic acid, mp 233-235 C, with decomposition are obtained.
EXAMPLE 3.-
A culture filtrate with an estimated gibberellic acid content of 378 mg is adjusted to pH 3.2 liters and extracted twice with ethyl acetate, using two liters each time. The combined extracts are evaporated and the crude product is purified as in Example 1. This gives 268 mg of gibberellic acid, mp 233-235 C with deconosition.
EXAMPLE 4.-
2 liters of a culture filtrate with an estimated gibberellic acid content of between 690 and 886 mg are adjusted to pH 3.2 and extracted three times with ethyl acetate, using respectively 1 liter, 2 liters and 1 liter of ethyl acetate.
The first and second extracts are combined and evaporated to a volume of 100 cm3 which is extracted twice with a phosphate buffer solution (136 g of monopotassium phosphate and 24 g of potassium hydroxide and water. distilled to make 1 liter; pH 6.3) using 25 cm3 each time. These buffer extracts are combined, adjusted to pH 3.5-3.8 and extracted twice with ethyl acetate, using 70 cc each time. The combined ethyl acetate extracts are then reduced to a small volume and a light fraction of the petroleum is added and the gibberellic acid crystallizes. This gives 708 mg of gibberellic acid, melting point 233-235 C with decomposition.
The third extract of the culture filtrate, purified in a similar fashion, gave a further 38 mg of gibberellic acid.
EXAMPLE 5.-
Is extracted with 2 liters of ethyl ether, 2 liters of a culture filtrate whose content of gibberellic acid. Is estimated between 690 and 886 mg. The ethereal extract is then extracted
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using 280 cm3 of a phosphate buffer solution (136 g of monopotassium phosphate and 24 g of potassium hydroxide and distilled water to make the liter; pH 6.3). The culture filter is extracted again with the same ethyl ether and the ethereal extract is extracted again with the same buffer solution. This process was repeated four times throughout. The buffer extract was then adjusted to pH 3.5-3.8 and extracted twice with ethyl acetate using 350 cm3 of ethyl acetate each time.
The combined extracts are reduced to a small volume and a light fraction of the petroleum and gibberellic acid crystallizes are added thereto. 558 mg of gibberellic acid, melting point 233-235 C, are thus obtained with decomposition.
Using 2 liters of fresh ether / ethyl and 280 cm3 of fresh phosphate buffer solution, the above extraction and purification process is repeated using the culture filtrate. This gives a further 226 mg of gibberellic acid, melting point 233-235 C, with decomposition.
EXAMPLE 6.-
7.2 liters of cultured filtrate, the gibberellic acid content of which is estimated at 450 mg per liter, are adjusted to pH 2.5 with phosphoric acid and extracted three times with acetate. ethyl, each time using 3.6 liters of solvent. The combined extracts were concentrated to 1 liter and then extracted three times with an aqueous solution of sodium bicarbonate so as to obtain a pH of 7 in the aqueous phase, using respectively. After 500 cm3, 150 cm3 and 150 cm3, the aqueous extract is adjusted to pH 3.5 and then extracted three times with ethyl acetate.
The extracts are combined and concentrated in vacuo. The gibberellic acid which crystallizes is separated by filtration, washed with ethyl acetate and dried in vacuo. We thus obtain 2.55 g of gibberellic acid, melting point 233-234 C with decomposition
The process described above is repeated except that throughout the process, ethyl acetate is replaced by acetate.
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amyl as a solvent. There is thus obtained in a similar manner, 2.33 g of gibberellic acid, melting point 233-234 C with decomposition.
EXAMPLE 79-
1125 liters of a culture filtrate, the gibberellic acid content of which is estimated at 400 mg per liter, are subjected to extraction with ethyl acetate using a Podbielniak extractor at pH 2.8. Concentrate to the extract (54 liters) in vacuo to a volume of 35 liters. The concentrate thus obtained is extracted with an aqueous buffer solution, after mixing it is adjusted to pH 5.9 using successively 10, 5 and 2 liters. The first extract (10 liters) is extracted three times with ethyl acetate (using 5, 2.5 and 1.25 liters respectively) after adjustment to pH 3 after mixing with the solvent. The second and third buffer extracts (total 5 liters) were combined and extracted twice (2.5 and 1.5 liters) with ethyl acetate.
All of the ethyl acetate extracts are combined and filtered through a diatomaceous earth filter aid and partially dried with anhydrous sodium sulfate. The combined two part extracts are concentrated in vacuo. When the volume has fallen to 750 cm3, crystallization of gibberellic acid begins and the concentration is stopped. The mixture is cooled, filtered and the solid residue washed with ethyl acetate and then allowed to air dry. Concentration of mother liquors results in further solid yields. The total amount of gibberellic acid thus obtained is 313.2 g, melting point 234-235 C with decomposition.
EXAMPLE 8.-
The efficiency of extracting gibberellic acid from an aqueous fermentation medium by various solvents is established by the method described below.
An aqueous solution of gibberellic acid prepared by dissolving 0.5 g of highly divided gibberellic acid in 250 cm3 of distilled water is filtered to remove any material which may not be
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dissolved. 25 cc of this seiation was then titrated with N / 100 aqueous sodium hydroxide solution, using phenolplthalein as an indicator, and the volume of sodium hydroxide solution required was noted. (X)
25 cm3 of the. Gibberellic acid solution are then stirred for about 1 minute with 25 cm3 of test solvent, in a stoppered separating funnel.
The aqueous phase is then poured in, titrated with an aqueous solution of sodium hydroxide N / 100 using phenolphthalein as an indicator, and the titer (Y) is noted. A blank determination is then carried out with using 25 cm3 of distilled water and 25 cm3 of solvents The aqueous phase is poured in again and it is titrated with an aqueous solution of N / 100 sodium hydroxide and the titer of the small blank sample is noted. (B).
The yield in% of the extraction is calculated according to the formula:
Yield% = [X- (Y-B)] X 100
X
The% extraction yield for a certain number of solvents is given below:
EMI7.1
<tb> Solvent <SEP> used <SEP> Yield <SEP> of <SEP> extraction
<tb>
<tb>
<tb>%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ether <SEP> ethyl <SEP> 32
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> diethyl ketone <SEP> 74
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> methyl <SEP> n-propyl <SEP> ketone <SEP> 79
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> methyl ethyl ketone <SEP> 57
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> methyl isobutyl ketone <SEP> 72
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1:
1-Dimethoxyethane <SEP> 19
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> diethyl <SEP> carbonate <SEP> 39
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> benzyl alcohol <SEP> <SEP> 86
<tb>
<tb>
<tb> sec. <SEP> -butanol <SEP> 85
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> alcohol <SEP> n-amyl <SEP> 91
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cyclohexanone <SEP> 95
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> methylcyclohexanone <SEP> 87
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> cyclohexanol <SEP> 98
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ethyl <SEP> propionate <SEP> 54
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ethyl n-butyrate <SEP> <SEP> 39
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> n-butyl <SEP> lactate <SEP> 89
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ethyl acetate <SEP> <SEP> 71
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> isopropyl <SEP> acetate <SEP> 57
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ss-ethoxyethyl <SEP> <SEP> acetate <SEP> 88
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> n-butyl <SEP> acetate <SEP> 54
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acetate <SEP> of <SEP>
3-methoxybutyl <SEP> 88
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> n-butyl <SEP> acetate <SEP> + <SEP> 10% <SEP> n-butanol <SEP> 73
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> amyl acetate <SEP> <SEP> 68
<tb>
<Desc / Clms Page number 8>
EXAMPLE 9.-
5350 liters of a culture filtrate from an industrial fer- mentator, the gibberellic acid content of which is estimated at 1170 g, is subjected to extraction with ethyl acetate at pH 2 at using a Podbielniak extractor. The separated ethyl acetate (4050 liters) is concentrated under reduced pressure <to 247 liters. 243 liters of this concentrate are then extracted successively with 22.5, 18 and 18 liters of water containing respectively 1100, 100 and 25 g of potassium bicarbonate, so that the aqueous extracts have a pH 6.3.
The amount of potassium bicarbonate used during the first extraction is determined by titration of a portion of the concentrated extract with an N / 10 aqueous sodium hydroxide solution using phenolphthalein as an indicator, which shows that the concentrated extract contains acids equivalent to 0.68 N / 10 acid, The quantity of bicarbonate used for the first extraction is equivalent to two thirds of the quantity calculated according to the titration. The three bicarbonate extracts are maintehus separated and freed from solvent using a centrifugal separator. The third extract is acidified with aqueous hydrochloric acid and extracted twice with 7.6 liters of ethyl acetate, adjusting the pH to 3.3 after mixing.
The second extract is then extracted successively using the two ethyl acetate extracts above, acidifying in the same way, and then using a third batch of ethyl acetate ( 4.5 liters). The first bicarbonate extract is then extracted successively with the three ethyl acetate extracts used previously and then using a further 4.5 liters of ethyl acetate, the aqueous phase being again adjusted to pH 3.3. The combined ethyl acetate extracts (36 liters including the washings) have a brown color and are concentrated under reduced pressure until the gibberellic acid crystallizes out. .
Gibberellic acid is separated by filtration after a-
<Desc / Clms Page number 9>
Let stand for several hours and the solvent is further concentrated to give more gibberellic acid.
Gibberellic acid is washed thoroughly with ethyl acetate to decolorize it; it is obtained as a white crystalline solid, melting point 234-235 C.
Its weight after drying under vacuum at 40 ° C. is established at 947 g or 81% of the material present in the initial solution.
CLAIMS
1.- An improved process for isolating gibberellic acid from an aqueous fermentation medium which contains it, characterized in that this aqueous fermentation medium is extracted with the aid of a suitable immiscible organic solvent with water or partially miscible with water selected from the group of esters, ketones, alcohols and ethers.