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"Procède d'ext!'acrtion <3t de purification d!antibiotique3 tei< a aaR
La présente invention se rapporte à un perfectionnement apporté à l'isolement et à la récupération d'un antibiotique tetraène provenant de bières de fermentation, Plus par-
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ticulièx'ement, l'invention concerne un procède d'isolement et de récupération qui est réalisable économiqueinent et le te- traène, diversement connu sous la dénomination Pimaricin ou
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Tennecetin, est récup6ré avec un excellent nendem-ant.
Le nouvel antibiotique tetraène, auquel se rapporte en général la présente invention, est mentionné par Burns et
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iir.1'zna>1 de 2.'Université de ','Eâtil$t3 dans Antihiotics and :'s ct$ vala 9, p-àzos 398"405 (1959). Il est aaractéris" H3 !:es autours co:snû tstracne et est d6x'ivë de la '?4a.S.w:wisâxl.'' ..'V: \lu ::':t!'C1"'1tO%1.vcea Ch'ttD.no(1.nrdh organismo Uroixsant dans un ;il1til!J nutritif.. Les auteurs ont 4 rjGnâ.! Tennea..etin gaz antibiotique ;3n?iòngu<au>;, Le 1>rcvoG- ang;i.air :-1" !-1ltl. 289, publia le 10 aoclt 1,flJ, ...:i ,4,, v#. oï fI5P ww ,.:.4 l'antibiotiquo 4.n4.hss ri",é''s pimariain E':'. "v .. tli > t.:' ;:1.'6:: natlensi6 ter, e);\ta5","ns ?PopPi6té- .
"": -:;.:.'1\.1.'';\:; et ,>2."'.:.r;::l.q..ilOS '. Q!) études 3."'E..'ki',',i entreprisse en u.tif,i.c<xn# A.. "'11r'< les ., -1 ppesentenent applicables, ont contre '-iu"? le Tennec'3tin Cit le Pin3.ricin peuvent Stre identiques ou en '".:.:r :c'.'.'3't. s' w'2tis'G:ß,sc3 :.3.'s,'>$'::"'L?9û a.w o r^nt aux réfél:'encl3c de Burns et lioltnan, 'actiit6 antibiotique est cxtraito de bières do fermentation@ 'l;nf :!..c:qJl('.lQ\'.;,\ cl1c <3l"3t 63.abop6epap 1'o=-¯aniswe, par.' azn procédé c':tro twon au solvant au cours duquel lez bières clarifiées ou 'l,wxE:a=: (examptes de tissus cellulaires) sont mises en contact avec un alcanol'non miscible dans l'eau,, Conformément ces !?roc6âé 1> le butanol, qui est lou? alcanol pr6fér6, est utilise cornue oset:aot.nt en quantités de l'ordre de 25 à 90% du
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volume original des bières de. fermentation.
Ce grand volume
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de solvant est ensuite évapore pour oonc ntre;1 l'antibiotique '.*ü, peut 4tre purifié et récupéré sans inconvénient ;
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Puisque l'antibiotique est élaboré dans les bières
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sous dilution extrême, la fermentation conmercial.e implique des ccxitaine3 et des milliers de gallons de bières et par conséquent,
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conformément à la technique connue,, de très grandes quantités
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d'alcanol comme extractant, La marlinulation, 3.16vaporation et
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la récupération de ces volumes considérables de solvant extractant sont coateuses et augmentent considérablement le coût final de l'antibiotique pur.
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Le brevet anglais précité divulgue en outre la précipi- tation de l'activité antibiotique dans et sur le mycellia et
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l*extraction à partir de celui-ci avec du mthanol contenant jusqu'à 5'J de chlorure de calcium, Ce dernier est ajouté pour s.ucnter la solubilité de l'antibiotique dans le. méthanol.
En raison du caractère oellulaire et cellulosique du mycellia# un temps conzict6rable et une quantité êlevee de solvant sont n.csssairss à l'sxtraotion propre de toute l'activité d'un sub- atrat de @@ type.,
Un but de la présente invention est de simplifier les procèdes d'isolement et de purification aboutissant à la récup6ration de Inactivité antibiotique avec un bon rendement.
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Un autre but encore de l'invention consinte a pr6voir un procédé pour la concentration de l'antibiotique provenant de bières, exigeant une quantité minimum de solvant et un temps réduit,
Un autre but de l'invention est de prévoir un procédé pour la récupération et la purification avec un bon rondement de l'antibiotique tetraène mentionné ci-avant, en utilisant des solvants économiques qui peuvent être récupérés aisément,
Les buts Mentionnes ci-dessus sent a.tteinta par la présente invention, dont les différents stades consistent à re-@
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larguer l'antibiotique de la solution acidifiée de bièrese à ré-, cupérer l'antibiotique précipite sous une forme solide concentrée;, 5. :
purifier' l'antibiotique par le lavage de l'antibiotique préci-
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avec des solutiomde bicarbonate et des solvants qui' ne dissolvent pas l'an-4ibiotique, à dissoudre le concentrat antî- biotiqua dans un alcanoi inférieur pour le débarrasser du sel, et einaiercnt à récupérer l'antibiotique purifie da sa solution d'alcanol inf''i'3UX' La fornentation de ses antibiotiques est puatiaës dans d<3? solutions nutritives contenant des souy-oes de cè1t'hcmes assi-
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fle pn6f61%ci;c<ù dao, hydratée if dus sources d'azote Qrzaniqu ou .inorganique, c* des sels sunuraux sous forme de traces.
Le taux de croissance de l'organisme et le
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rendement de l'activité antibiotique, oast-5.-dire le Tennecetin, ou le Pimarioint peuvent Être contrôlas en variant les propor- j tions des !'mtieres mentionnées ci-avant, ainsi que la temrra- ! ture, l'agitation et l'aération du milieu lui-Maffia au cours de la période de croissance.
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Les 1cres entièrement ferments contiennent en gênerai approximativement 600 à 750 d'antibiotique
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par millilitre.
Il est souvent plus t.'çonom.4--ue de rëcupcrey les bières lorsque la concentration antibiotique est à un niveau inférieur; puisque les temps de fermentation nécessites pour l'obtention de niveaux plus élevés augmentent les charges sur l'appareillage, qui ne sont pas en proportion avec les rendements ! augmentes.
Les bières de fermentation d'un pH 6,5-7,5 sont fil- tressa En raison de la nature mucilagineuse du mycellia, la filtration est accéléréo par l'addition de jusqu'à 1% d'un
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agent de filtration aw.:ÎI44aÎrc, Le mat de mycallia est lavé avee une petite =luantit4 d'eau et cl-aire et les Isvages sont <?mbl-n6s> tJn sel nincral :jou--,ee à ce n61ange, de pr6fêpensa du ohlorurs de sodiun.< j.iL#juà ce que la solution contienne g5 ± 3S'';. Bn poiJs dg oa zclr.
'La haute concentration en sel assure le "re3artuagal, an substance de toute l'activit6 .antibiotique Cette solution de se?, est >6ziô.z à un pi# de :2 t 5.. 0 avec un acide minéral.
L'acide ehlorhydrique est préfér, mais d'autres acides, comme l'acide phosphorique, peuvent être utilises. L'acent de filtra-
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tion-auxiliaire résultant, l'antibiotique et la pâte de sel sont filtres. Le gâteau humide est recueilli et le filtrat est éliminé.
Le gâteau humide peut être lave avec de petites quanti-
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tl>#, -.lv snlu%io:i5 :xcncùnt=<ies ou :>atur4cc de bicarbonate de ::.(";r'H1J! (\'.t u-ecc de l' a(l6tone ou encore avec cec doux composés pour éliminer les impuretés et les colorants non actifs, Le est ensuite extrait (il est acidifia en premier lieu si un lavage au bicarbonate est utilisé) avec du méthanol
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0=-u de l'ëthanol ou encore avec un mélange de ceux-si,
en agi" tant le 3t?au avec 1 alaanol et en éliminant ensuite par fil- tration la solution alcoolique de l'activité antibiotique Cotte solution est concentrer et séchée par pulvérisation pour
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donner un produit d'une pureté de 85 à 95t La r6cui)6ration est de l'ordre de 40 à 70@ de l'activité antibiotique Présente dans les biàros brutes par essai microbiologique. L'antibiotique
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r<Jciàpé 6 ert d'une pureté d'environ 950 iiicrograniries par mini" ; gramme.
Le procède conforme à la présents invention est décrit dans les exemples ci-après, Ses exemples sont donnes uniquement titre explicatif et ne limitent en aucune façon la portée de la présenta invontion. Il est bien évident que chacune des variantes rantrant dans le cadre de l'invention présente cer-
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teins avantages nour e-%Crta4ne buts spécifiques et que l'intentics', n'ûst :;M d'indiqué? une m6hode r=emnercl-ale proférés.
EXEMPLE ùt;s biEmes blutes titx'ant 590 mic ognanunes ?an milliU2 Dr-CS bliute-âc -tîtra%t SIO m1cogvaromes par 11tre sont m6'anG4-#s avec 2fi en poids dfIngen,à t-e fîltration nuxs,liùi,r<: llijrìc) e.t filtrées, L- bièro clairs est traitée avec ,5. >upp14=r;>-i;tnije d'aset rie filtration lu;;i1îaiT? et une qus.ntitc de sel Qtst ajoutée !,ou!' donner une solution de sel à J2 en poids dans la bière claira, Au cours du mélange,. le pli est r4glé 9-es avec de l'acide chlorhydrique.
Le mélange est ensuite filtré et le gâteau de filtration est pressé. Le gâteau brut est réduit en une pâte épaisse avec de l'eau dis- tillée et du bicarbonate de sodium (NaHCO3)est ajouté jusqu'à
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une concentration de 36% (en poids) de la pâte aqueuse. Cette
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patç est réglée au nil 7,5-7,8 avec une solution d'hydroxyde de sodium et est filtrée, Le gâteau @@c est lave avec 7% en poids d'une solution de bicarbonate de sodium, ensuite avec de l'acé-
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tone et est finalement 35ché Le gâteau sec est réduit avec 'de 1 alcool 3A ('thanoi- dénatura pas'' du rôtô?anol) à une ooncen" trsticn de ?;O'l 9!'1 poids du gâteau dans 1'alcool.
Cette. poste est ensuite rsglêe ê un ni! de 2,8-3,o avec de Taeide chlorhy- drique, et filtrée. Le gâteau est lave.avec d'autres quantités d'alcool, Le filtrat contenant Inactivité antibiotique est con-
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centré à un dixi%tn du volume original et Ileirll est règle à ' 7O702. Le eoncentrat est séclii6 par pulv2risation jusqu'à l'obtention d'une poudre 16gèreroent jaune. L'antibiotique est récupéré à une pureté de 900 micrograrmes par milligramme.
EXEMPLE 2
Dès bières brutes titrant 675 microgrammes par millilitre sont mélangeas avec 2% en poids d'un agent de filtration auxiliaire (Dicalite) et filtrées. Les bières claires résultan- tes sont traitées avec 0,5% supplémentaire d'agent de filtration auxiliaire et du sel est ajoute en suffisance pour prévoir une solution de sel à 30% en poids dans la bière claire. Le pH de ce mélange sel-bière est régis à 2,5 avec de l'acide chlorhy- drique, Le mélange est filtre et le gâteau est presse. Le gâteau est lavé avec de petites parties successives d'acétone
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et la gâteau brut contenant appnoximativement 'V0'ô d'eau.est réduit dans deux parties en poids d'alcool 3A.
La pâte est i mé3.angée, filtz-6e et avec de petites parties successives Ct'alcool SA. Le filtrat est ensuite concen+-r6 l un dixième du volume oX'iginal et le P19. ef!t rég16 :t 7 ,0.."1 2 Le concentrat est ensuite s6cÊé par pulvérisation jurzqu'h l'obtention d'une poudre légèrement jaune, titrant 900 mic=oL=aù=<: p3.r r4Àl,ig#n>.ù;no# dé pureté.
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EXEMPLE 3. '
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Des bières brutes titrant 700 microgrammes par me.iii- litre sont filtrées en présence d'une petite quantité d'agent de filtration auxiliaire, La bière claire est traitée avec une quantité supplémentaire d'agent de filtration auxiliaire et 30% en poids de sel sont ajoutés à la bière claire qui est réglée à un pll de 2,5 avec de l'acide chlorhydrique, Le mélange sel-bière est filtré et le gâteau est pressé.
Le gâteau est lavé' avec quatre parties successives d'une solution de bicarbonate de sodium à 7% et est ensuite pressa après le lavage final.
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Ultf'-4-ieurem,ent, il est lavé avec deux parties d'acétone. Le gâteau est éliminé du filtre, réduit dans de l'alcool 3A pour former une pâte à 40t en poids de gâteau dans l'alcool et le pH de la. pâte est règle à 2,8. Cette pâte est ensuite filtrée,
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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"Proceeds of ext! 'Acrtion <3t of purification of antibiotic3 tei <a aaR
The present invention relates to an improvement in the isolation and recovery of a tetraene antibiotic from fermentation beers, More par-
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Particularly, the invention relates to a process of isolation and recovery which is economically feasible and tetraene, variously known under the name Pimaricin or
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Tennecetin, is recovered with excellent management.
The novel tetraene antibiotic, to which the present invention generally relates, is mentioned by Burns and
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iir.1'zna> 1 of 2.'Université de ',' Eâtil $ t3 in Antihiotics and: 's ct $ vala 9, p-àzos 398 "405 (1959). It is aaractéris" H3!: es around co : snû tstracne and is d6x'ivë of the '? 4a.Sw: wisâxl.' '..' V: \ lu :: ': t!' C1 "'1tO% 1.vcea Ch'ttD.no (1. nrdh organismo Uroixsant in a; il1til! J nutritious .. Authors have 4 rjGnâ.! Tennea..etin antibiotic gas; 3n? iòngu <au>;, Le 1> rcvoG- ang; i.air: -1 "! - 1ltl. 289, published on August 10 1, flJ, ...: i, 4 ,, v #. Oï fI5P ww,.:. 4 the antibiotic 4.n4.hss ri ", é''s pimariain E ' : '. "v .. tli> t .:';: 1.'6 :: natlensi6 ter, e); \ ta5", "ns? PopPi6té-.
"": -:;.:. '1 \ .1.' '; \ :; and,> 2. "'.:. r; :: lq.ilOS'. Q!) studies 3." 'E ..' ki ',', i undertake in u.tif, ic <xn # A .. "'11r' <les., -1 ppesentenent applicable, have against '-iu"? the Tennec'3tin Cit the Pin3.ricin can be identical or in '".:.: r: c'. '.' 3't. s' w'2tis'G: ß, sc3: .3.'s, '> $' :: "'L? 9û aw or ^ nt to refél:' encl3c of Burns and Lioltnan, 'antibiotic activity is cxtraito of fermentation beers @' l; nf:! .. c: qJl ('. LQ \ '.;, \ cl1c <3l "3t 63.abop6epap 1'o = -¯aniswe, by.' azn process c ': tro twon with solvent during which lez clarified beers or' l, wxE: a =: ( cell tissue exams) are contacted with a water-immiscible alkanol. In accordance with these conditions, butanol, which is the preferred alkanol, is used in retort in amounts of the same. '' around 25 to 90% of
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original volume of beers. fermentation.
This large volume
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of solvent is then evaporated to make it possible to purify and recover the antibiotic without inconvenience;
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Since the antibiotic is made in beers
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under extreme dilution, commercial fermentation involves ccxitaine3 and thousands of gallons of beers and consequently,
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in accordance with the known technique, very large quantities
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of alkanol as an extractant, Marlinulation, 3.16vaporation and
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recovering these considerable volumes of extractant solvent is expensive and considerably increases the final cost of the pure antibiotic.
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The aforementioned English patent further discloses the precipitation of antibiotic activity in and on mycellia and
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l * extraction therefrom with methanol containing up to 5% of calcium chloride. The latter is added to s.ucnter the solubility of the antibiotic in the. methanol.
Due to the cellulosic and cellulosic character of mycellia, a conzictable time and a high amount of solvent are necessary to the inherent extraction of all the activity of a substrate of type.
An object of the present invention is to simplify the isolation and purification procedures resulting in the recovery of antibiotic inactivity with a good yield.
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Yet another object of the invention is to provide a process for the concentration of the antibiotic from beers, requiring a minimum amount of solvent and a reduced time.
Another object of the invention is to provide a process for the recovery and purification with good flow of the tetraene antibiotic mentioned above, using economical solvents which can be easily recovered,
The above-mentioned aims are achieved by the present invention, the various stages of which consist in re @
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drop the antibiotic from the acidified solution of beer to be recovered, recover the antibiotic precipitates in a concentrated solid form ;, 5.:
to purify the antibiotic by washing the precise antibiotic
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with bicarbonate solutions and solvents which do not dissolve the antibiotic, dissolving the anti-biotic concentrate in a lower alkanol to rid it of salt, and then recovering the antibiotic purified from its inferior alkanol solution. '' i'3UX 'The fornentation of its antibiotics is puatiaës in d <3? nutrient solutions containing assimilated seafood souy-oes
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fle pn6f61% ci; c <ù dao, hydrated if due to sources of Qrzaniqu or .inorganic nitrogen, c * sunural salts in trace amounts.
The growth rate of the organism and the
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yield of antibiotic activity, ie Tennecetin, or Pimarioint can be controlled by varying the proportions of the materials mentioned above, as well as the temperature! ture, agitation and aeration of the him-Maffia medium during the growing period.
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Fully fermented 1cres usually contain approximately 600 to 750 antibiotic
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per milliliter.
It is often more t.'çonom.4 - ue to recupcrey beers when the antibiotic concentration is at a lower level; since the fermentation times required to obtain higher levels increase the loads on the apparatus, which are not in proportion to the yields! increases.
Fermentation beers with a pH of 6.5-7.5 are fil- tressa Due to the mucilaginous nature of mycellia, filtration is accelerated by the addition of up to 1% of a
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filter agent aw.:ÎI44aÎrc, The mycallia mat is washed with a small amount of water and clear and the Isvages are <? mbl-n6s> tJn nincral salt: day -, ee to this mixture, of Preferred sodium hydroxide solution. <j.iL # until the solution contains g5 ± 3S '' ;. Bn poiJs dg oa zclr.
The high salt concentration assures the re3artuagal, the substance of all the antibiotic activity. This solution of sodium is> 60% at a pi # of: 2 t 5 .. 0 with mineral acid.
Hydrochloric acid is preferred, but other acids, such as phosphoric acid, can be used. The act of filtering
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resulting auxiliary-tion, the antibiotic and the salt paste are filters. The wet cake is collected and the filtrate is removed.
The wet cake can be washed with small amounts.
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tl> #, -.lv snlu% io: i5: xcncùnt = <ies or:> atur4cc of bicarbonate of ::. ("; r'H1J! (\ '. t u-ecc of l' a (l6tone or with these mild compounds to remove impurities and non-active dyes, The is then extracted (it is acidified first if a bicarbonate wash is used) with methanol
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0 = -u ethanol or with a mixture of these,
by reacting the 3t? al with the alaanol and then filtering off the alcoholic solution of the antibiotic activity. The solution is concentrated and spray dried to
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give a product with a purity of 85 to 95% The recovery is of the order of 40 to 70% of the antibiotic activity present in crude biars by microbiological test. The antibiotic
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R <Jciàpé 6 has a purity of about 950 micrograniries per mini "; gram.
The process according to the present invention is described in the examples below. Its examples are given only for explanatory purposes and do not in any way limit the scope of the present invention. It is obvious that each of the variants rantrant within the framework of the invention has certain
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tins advantages nour e-% Crta4ne specific goals and that the intention is:; M indicated? a method r = emnercl-ale uttered.
EXAMPLE ùt; s blutes titx'ant 590 mic ognanunes? An milliU2 Dr-CS bliute-âc -tîtra% t SIO m1cogvaromes per 11tre are m6'anG4- # s with 2fi by weight dfIngen, with nuxs filtration, lii, r <: llijrìc) and filtered, L- clear beer is treated with, 5. > upp14 = r;> - i; tnije aset rie filtration lu ;; i1îaiT? and a Qtst salt qus.ntitc added!, or! ' give a salt solution at D2 by weight in clear beer, During mixing ,. the fold is adjusted 9-es with hydrochloric acid.
The mixture is then filtered and the filter cake is pressed. The raw cake is reduced to a thick paste with distilled water and sodium bicarbonate (NaHCO3) is added until
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a concentration of 36% (by weight) of the aqueous paste. This
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patç is adjusted to 7.5-7.8 with sodium hydroxide solution and is filtered. The cake is washed with 7% by weight of sodium bicarbonate solution, then with ace-
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tone and is finally dried. The dry cake is reduced with 3A alcohol ('thanoi- denatura pas'' from roast? anol) to a very small amount of?; 9! '1 weight of the cake in 1' alcohol.
This. extension is then set to one! 2.8-3.0 with hydrochloric acid, and filtered. The cake is washed with further quantities of alcohol. The filtrate containing antibiotic inactivity is con-
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centered at one tenth% tn of the original volume and Ileirll is set at '70702. The concentrate is dried by spraying until a slightly yellow powder is obtained. The antibiotic is recovered at a purity of 900 micrograrms per milligram.
EXAMPLE 2
From raw beers containing 675 micrograms per milliliter are mixed with 2% by weight of an auxiliary filtering agent (Dicalite) and filtered. The resulting clear beers are treated with an additional 0.5% auxiliary filter agent and sufficient salt is added to provide a 30% by weight salt solution in the clear beer. The pH of this salt-beer mixture is controlled at 2.5 with hydrochloric acid. The mixture is filtered and the cake is pressed. The cake is washed with successive small parts of acetone
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and the crude cake containing approximately 80% of water is reduced in two parts by weight of 3A alcohol.
The dough is mixed, filtered and with successive small parts Ct'alcool SA. The filtrate is then concentrated + -r6 to one tenth of the original volume and the P19. ef! t reg16: t 7, 0 .. "1 2 The concentrate is then dried by spraying until a slightly yellow powder is obtained, titrating 900 mic = oL = aù = <: p3.r r4Àl, ig #n> .ù; no # de purity.
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EXAMPLE 3. '
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Raw beers of 700 micrograms per meiii- liter are filtered in the presence of a small amount of auxiliary filter agent, Clear beer is treated with an additional amount of auxiliary filter agent and 30% by weight of salt are added to the clear beer which is set to a pll of 2.5 with hydrochloric acid, The salt-beer mixture is filtered and the cake is pressed.
The cake is washed with four successive parts of a 7% sodium bicarbonate solution and is then pressed after the final wash.
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Ultf'-4-ieurem, ent, it is washed with two parts of acetone. The cake is removed from the filter, reduced in 3A alcohol to form a paste at 40% by weight of cake in alcohol and pH. dough is rule at 2.8. This paste is then filtered,
** ATTENTION ** end of DESC field can contain start of CLMS **.