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Procédé de préparation de matières thérapeutiques et plus particulièrement de la Vitamine BI2,
Cette invention concerne de façon générale la préparation de matières thérapeutiques et, plus particu- lièrement, la préparation de vitamine B 12à partir d'un concentré renfermant la mente .
L'invention se rapporte à un procédé de préparation de vitamine B 12 à partir d'un concentré, tel une prépara- tion de foie, en soumettant la dite préparation de foie à l'action d'une colonne de matière activée et en récupé- rant la dite vitamine sous une forme concentrée et purifiée.
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L'invention se rapporte également à un procédé de préparation de vitamine B 12 à partir d'un concentré, tel un concentré principalement composé d'un produit d'élabora- tion du streptomyces griseus, en soumettant ledit concentré à une extraction par un solvant, en effectuant un fraction- nement chromatographiuqe par le traitement de ladite solution obtenue avec le solvant dans une colonne de matière absorbante par le lavage de la colonne avec le solvant pour lessiver la substance active (hors) de la substance absorbante, et par la récupération à partir du lessivage (= lessive) de cristaux l'ou. ges ayant la composition approximative : 55,7% C, 6, 5% H, 13.9% N, 5,2% P, et4,4% Co .
La vitamine B 12 est un facteur actif puissant de croissance pour le micro-organisme Lactobacillus lactis Dorner et possède une action marquée et effective dans le trai. tement thérapeutique de l'anémie pernicieuse d'Addison.
C'est un objet de l'invention de préparer la vita- mine B 12 sous une forme pure en partant de préparations commerciales de foie.
C'est aussi un objet de l'invention de préparer la vitamine B 12 sous une forme pure en partant d'un concentré composé principalement d'un produit d'élaboration de Strep- tomyces griseus.
D'après cette invention, on a trouvé qu'il est possible de soumettre des préparations commerciales de foie à un procédé de purification par lequel la vitamine B 12 est récupérée, possèdant une haute activité physiologique, convenant particulièrement pour le traitement clinique de l'anémie humaine.
On a découvert que la vitamine B 12 peut être ob- tenue sous une forme concentrée etpurifiée à partir de préparations cornuerciales de foie par une technique chroma- tographique. La purification et la concentration sont effec-
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tuées sous des conditions étroitement contrôlées par lesquelles la possibilité de destruction ou de perte de l'activité de la vitamine est réduite à un minimum.
D'après le procédé de l'invention une fraction de foie d'au moins 1000 unités par mg* est utilisée comme ma- tière de départ et est préparée en partant de préparations disponibles dans le commerce telle la fraction soluble dans l'éthanol à 70% d'un extrait aqueux de foie par la méthode comme celle décrite par Dakin et West dans le Journ. Biol.
Chem. 109,489 (1935).
Le produit solide ainsi obtenu est chromatognaphié en solution aqueuse sur une colonne renfermant du charbon de bois et la matière active est lessivée avec un solvant orga- nique tel l'éthanol à 50%. D'autres produits de lavage peuvent aussi être utilisés pour le lessivage (ou extraction) tels l'acétone 50%, l'eau saturée de butanol, l'eau saturée d'alcool benzylique, et l'acide acétique glacial.
D'après le procédé, on peut aussi chromatographier la solution alcoolique préparée par extraction du produit solide avec un alcool aliphatique inférieur sur une colonne renfermant de l'alumine activée et lessiver la matière active avec du méthanol ou une solution aqueuse de méthanol.
Les lessives sont recueillies en -petites fractions.
L'activité (ou puissance) des fractions est déterminée par essai microbiologique avec le Lactobacillus lactis Dorner.
Les fractions de haute activité sont soit séchées, à partir de l'état solide (=gelé), ou concentrées à un petit volume.
La matière chromatorgrpahiee soit solide ou sous forme de lessive concentrée telle la matière obtenue à partir du chromatogramme d'alumine est soumise à une extraction avec de l'éthanol, et les produits solides insolubles dans l'étha- nol sont éliminés. La solution dans l'éthanol est concentrée
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à siccité, et après dissolution du résidu dans le méthanol, on ajoute de l'acétone ou de l'éther pour provoquer la pré- cipitation. Le liquide surnageant est alors éliminé, le précipité dissous dans de l'eau et la solution traitée avec de l'acétone. le précipité en résultant est dissous dans le méthanol eton ajoute plusieurs volumes d'acétone. Le liqui- de surnageant est éliminé et le résidu cristallisé par disso- lution dans l'eau et addition prudente d'acétone jusqu'à obtention d'un trouble.
Les cristaux résultants sont lavés avec de l'acétone et recristallisés en partant de mélanges eau-acétone .
D'autrB part, les concentrés de vitamine 12 peu- vent aussi, après les opérations de précipitation par solvant, subir une purification subséquente par la distribution à contre-courant entre de l'eau et un mélange de 75% toluène- 25% o-crésol, suivie de la cristallisation des meilleures fractions.
Si on le désire, les concentrés obtenus par le traitement au charbon actif peuvent être dissous dans un alcool aliphatique inférieur et la solution alcoolique résultante peut être chromatographiée sur une colonne d'alu- mine activée.
L'activité des produits est déterminée microbiolo- giquement au moyen d'une réaction de croissance avec le Lactobacillus lactis Dorner comme organisme de test. On a conféré une valeur de 1000 unités par mg. à un concentré de foie choisi arbitrairement.
D'après l'invention, le procédé comprend aussi l'extraction d'un concentré brut composé principalement d'un produit d'élaboration du Streptomyces griseus avec un solvant, le fractionnement chromatographique par addition de ladite solution dans le solvant sur une colonne de matière
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adsorbante, le lavage de la colonne avec un solvant pour retirer par lessivage fractionné la substance active de l'a- gent adsorbant et la récupération de vitamine B 12 cristalli- ne à partir de la lessive.
Pour préparer les composés chimiques nouveaux, on utilise comme matière de départ un concentré brut renfermant une substance active favorisant la croissance du Lactobacil- lus lactis Dorner. Le concentré brut peut être préparé par culture du micro-organisme Streptomyces grisens sur (ou dans) un milieu nutritif convenable, par adsorption de la matière active (hors) du bouillon de culture, par le lavage par dé- cantation de la substance adsorbée avec une solution aqueuse de pyridine ou de pyridine substituée par un groupe alkyle et par la récupération du concentré brut à partir de la sub- stance lavée par décantation.
Conformément à un autre principe, un concentré brut composé principalement d'un produit d'élaboration du Strepto- myces griseus est soumis à une extraction par l'eau ou un alcool aliphatique inférieur tel l'alcool méthylique. la sélection du liquide d'extraction est déterminée par la substance adsorbante à utiliser dans le fractionnement chromatographique.
Dans la pratique de cette invention, on peut utili- ser des adsorbants variés comprenant le charbon activé, l'alumine activée et les matières analogues; l'alumine acti- vée étant l'adsorbant préféré. Les extractions aqueuses sont traitées dans des colonnes renfermant du charbon actif et les extractions dans un alcool aliphatique inférieur sont utilisées dans des colonnes à alumine activée. La colonne est de préférence chargée (à l'état) humide, par remplissage avec l'adsorbant et le solvant utilisé et par drainage subséquent du solvant jusqu'à ce que son niveau
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atteigne le sommet de la matière adsorbante dans la colonne.
L'extrait alooolique est versé à la surface supé- rieure de m'adsorbant dans la colonne et on le laisse s'é- couler à travers l'adsorbant par gravité ou sous pression.
La colonne est ensuite développée ou lavée par un solvant frais et les fractions convenables du lessivage sont recueil- lies. Les fractions présentant une activité suffisante révé- lée par examen micro biologique ou en vertu de la couleur rose sont concentrées soit séparément ou en mélange. La solution concentrée est ensuite mélangée à un solvant miscible dans lequel la substance active est Insoluble, comme l'acétone, et on recueille un précipité rouge. Le précipité estdissous dans l'eau et on ajoute de l'acétone qui provoque la sépara- tion de cristaux rouges de vitamine B 12,
Le degré de purification obtenu par un simple frac- tionnement chromatographique peut ne pas être suffisant pour fournir un produit cristallin.
Dans ces conditions la ma- tière amorphe peut tre purifiée à nouveau par la dissolu- tion dans un alcool aliphatique inférieur. La solution est alors ajoutée à (introduite dans) une seconde colonne de ma- tière adsorbante et les fractions les plus actives de la lessive décelées comme dit ci-dessus sont recueillies et concentrées à siccité. Le résidu sec est dissous dans l'al- cool méthylique et de l'acétone ajoutée à la solution pour provoquer un précipité rouge de vitamine B 12 qui est séparé.
Ce précipité est dissous dans l'eau et de l'acétone ajoutée à la solution provoque la séparation de cristaux rouges.
La vitamine B 12, obtenue conformément à cette in- vention, est un composé rouge ayant la composition approxi- mative de 55,7% C, 6,5% H, 13.9 % N, 5,2% P et 4,4% Co et est essentiellement soluble dans l'eau, l'alcool méthylique,* l'alcool éthylique et le phénol et essentiellement insoluble
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dans l'acétone, l'éther et le chloroforme. La vitamine B 12 a un coefficient apparent de partage d'environ 1,46 dans le système : 75% toluène- 25% ortho-crésol; eau. la vitamine B 12 cristallise à partir de solutions convenables telle l'acétone aqueuse en cristaux rouges ayant les propriétés cristallographiques suivantes :
EMI7.1
indice de réfra,ction 1616; 1,65; 1, 664.
La vitamine B 12 cristallisée est d'autre part caractérisée par les di- mensions de cellule unitaire approximatives 16 sur 19 sur 21 A, comme déterminé à partir des données de diffraction aux rayons X.
Les cristaux de vitamine B 12 n'ont pas de point de ftlsion défini mais noircissent à (s'assombrissent) environ
EMI7.2
210 - 20 .
La vitamine B 12 en solution aqueuse donne le spectre d'absorption suivant dans le visible et l'ultra-violet, (séchée 2 heures à 100 ) :
EMI7.3
<tb> max. <SEP> 1%
<tb> o <SEP> E
<tb> A <SEP> 1 <SEP> cm. <SEP>
<tb>
<tb>
2780 <SEP> 119
<tb> 3050 <SEP> 68
<tb> 3230 <SEP> 59
<tb> 3610 <SEP> 187
<tb> 4080 <SEP> 28
<tb> 5200 <SEP> 56
<tb> 5480 <SEP> 59
<tb>
Le spectre d'absorption infra- rouge a été déterminé avec un spectromètre Perkin-Elmer 12A soigneusement calibré.
Les maxima d'absorption ont été les suivants :
EMI7.4
Longueur d'onde en Mu ( 10 -4 cm.)
EMI7.5
<tb> 3,05 <SEP> S <SEP> (large)
<tb>
<tb> 4.62 <SEP> W <SEP>
<tb>
<tb> 5,98S
<tb>
<tb> 6.13 <SEP> M
<tb>
<tb> 6.70 <SEP> S
<tb>
<tb> 7.14 <SEP> S <SEP>
<tb>
<tb> 7.35 <SEP> S
<tb>
<tb> 7.60 <SEP> W
<tb>
<tb> 8.15 <SEP> S
<tb>
<tb> 8.67 <SEP> S
<tb>
<tb> 9.36 <SEP> S
<tb>
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EMI8.1
<tb> Longueur <SEP> d'onde <SEP> en <SEP> Mu <SEP> (10- <SEP> cm. <SEP> )
<tb>
<tb>
<tb> 10. <SEP> 00 <SEP> S <SEP> (large)
<tb>
<tb> 10. <SEP> 80 <SEP> W
<tb>
<tb> 11,10W
<tb>
<tb> 11.81 <SEP> M
<tb>
<tb> 12.35 <SEP> M <SEP>
<tb>
S.M et W désignent des intensités d'absorption fortes, moyen- nes etfaibles.
On a trouvé que la vitamine B 12 obtenue conformémen' à l'inventionpossède une activité biologique telle que 0,000013 Ó par ml. de milieu de culture est suffisant pour engendrer une croissance égale à la moitié du maximum du Lactobacillus lactis Dorner sous les candi tiens employées.
La vitamine B 12 possède une haute valeur thérapeutique dans le traitement de l'anémie pernicieuse d'Addison, ainsi, le produit cristallin a produit une réaction hématologique posi- tive chez trois patients par injections intramusculaires res- pectivement de 150, 6 et 3 . Quatre patients ayant reçu chacun des injections de concentrés amorphes renfermant 20.000 à 40. 000 unités L.L.D. donnèrent des réactions hémato- logiques fortes ou maxima. Un mg. de la substance cristalli- ne est équivalent à environ 11x10 unités L.L.D. et un à environ 11.000 unités.
TABLE I
EMI8.2
<tb> Concentrés <SEP> amorphes. <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Cas <SEP> -- <SEP> A
<tb>
<tb>
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 14 <SEP> 23 <SEP> 29 <SEP> 42 <SEP> 119
<tb>
<tb> RBCx106 <SEP> 1. <SEP> 7 <SEP> 2.4 <SEP> 2,6 <SEP> 2.8 <SEP> 3.3 <SEP> 4. <SEP> 5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 6.8 <SEP> 7. <SEP> 8 <SEP> 9.5 <SEP> 9.8 <SEP> 11.0 <SEP> 14.0
<tb>
<tb>
<tb> Retics. <SEP> % <SEP> 2. <SEP> 4 <SEP> 20. <SEP> 0 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 1. <SEP> 0 <SEP> 13. <SEP> 6 <SEP> 121 <SEP> -
<tb>
<tb> Unités <SEP> L.L.D. <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> l.8x106
<tb>
Le patient rentra à la maison le 4Sème jour et n'a pas subi d'autre traitement que celui signalé.
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TABLE il
EMI9.1
Vîtamîne B 12 recristallisée.
EMI9.2
<tb>
Cas <SEP> B <SEP> C
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 14 <SEP> 23 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 14
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> RBC <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 2. <SEP> 6 <SEP> 3.4 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 2. <SEP> 6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> .Hgb.gm. <SEP> 4,5 <SEP> 7.0 <SEP> 9. <SEP> 0 <SEP> 7. <SEP> 8 <SEP> 10. <SEP> 0
<tb>
EMI9.3
Raties. l% 0.5 27.0 2.0 0.5 2.8 26.0 3.1 Hct. % .4;
0 25.0 29.017.0 31
EMI9.4
<tb> WBC <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> 9. <SEP> 0 <SEP> 26.0 <SEP> 9.0 <SEP> 2,3 <SEP> 5.8
<tb>
EMI9.5
Vitamine B12 150 6 L.L.D.
EMI9.6
<tb> Unités <SEP> 1,6 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 6.6 <SEP> x <SEP> 104
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cas <SEP> D
<tb>
<tb>
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 9 <SEP> 15
<tb>
<tb>
<tb> RBC <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1. <SEP> 4 <SEP> 2.6
<tb>
<tb>
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 6. <SEP> 8 <SEP> 9.8
<tb>
<tb>
<tb> Retics. <SEP> % <SEP> 2.8 <SEP> 10. <SEP> 14. <SEP> 0 <SEP> 2,6
<tb>
<tb>
<tb> Hct.% <SEP> 17 <SEP> 31
<tb>
EMI9.7
V.#C x 103 4.2 8 .1
EMI9.8
<tb> Vitamine <SEP> B12 <SEP> 3 <SEP> 50
<tb>
EMI9.9
L.I,.D .
EMI9.10
<tb> Unités <SEP> 3. <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 5.5 <SEP> x <SEP> 105
<tb>
La vitamine B 12 est aussi capable d'augmenter la vitesse de croissance des poussins.
Par exemple, dans une expérience, l'addition de 30 parties par billion de vitamine B 12 à une nourriture de base renfermant de la caséine puri- fiée (dite exempte de vitamines) comme source de protéine provoque une augmentation de la vitesse de croissance telle que le poids moyen des poussins après 16 jours de nourriture avec la nourriture de base avec complément était de 127 grammes, tandis que celui des poussins recevant la nourriture sans le complément n'était que de 99 grammes.
Les exemples suivants illustrent les méthodes d'ap- plication de la présente invention, mais il doit être enten- du que ces exemples sont donnés dans leur principe à titre d'illustration et non à titre limitatif.
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Exemple 1 Un!gramme d'un concentré ayant une activité micro- biologique de 3200 unités par mg. fut dissous dans 10 ml d'eau et chromatographié sur une colonne renfermant lOgr. de charbon actif, de préférence lavé à l'acide. La colonne a été lavée parfaitement avec de l'eau et la matière active soumise à un lessivage avec de l'éthanol à 50%. La lessive a été recueillie en ane série de fractions d'environ 10 ml. chacune. Les fractions (Inactivité la plus grande, d'après mesure par essai microbiologique, ont été réunies et séchées à l'état congelé. La produit séché (115 mg. avait une ac- tivité microbiologique d'environ 10. 000 unités par mg., re- présentant un rendement d'environ 50% Exemple 2
Un concentré de 6.000 unités/mg.
(14,6g.) renfermant un total de 8 millions d'unités a été extrait trois fois par agitation pendant environ 30 minutes avec 200 ml. de méthanol. Les extraits réunis ont été passés au travers d'une colonne d'environ 7,5 cm. de diamètre renfermant 600g. d'alumine activée. Lorsque la dernière fraction de cette so- lution eut pénétré dans l'alumine, on a ajouté du méthanol qu'on a laissé filtrer à travers la colonne pour le dévelop- pement du chromatogramme. Pendant cette opération, une bande rose s'est déplacée vers le bas à travers la colonne, lais- sant essentiellement la totalité de la couleur brun-jaiine de la solution primitive au sommet de la colonne.
Le fil- fiât a été recueilli en une série de fractions, parmi les- quelles on a choisi celles montrant l'activité microbiologi- que la plus prononcée et/ou la couleur rose la plus prononcée et on les a réunies pour les opérations subséquentes .
Cette solution, qui renfermait suivant essai microbiologique
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environ 65 millions d'unités, a été évaporée dans le vide à une température en-dessous de 25 jusqu'à consistance légèrement sirupeuse. Pendant l'évaporation, le pH de la solution, qui tend à croître, était maintenu àenviron 6 à 7 par l'addition d'acide chlorhydrique dilué (2,5N) suivant le besoin. Le résidu a été finalement séché sous une faible pression (1 mm. de mercure) à la température ambiante.
Exemple 3
245 mg. de résidu rouge du chromatogramme d'alumine ont été extraits avec 15 ml. d'éthanol absolu, donnant 34mg de résidu incolore insoluble et une solution rouge. La solution rouge fournit 218 mg. d'une huile rouge. L'huile et rouge a été dissoute dans 0,5 ml. de méthanol/25 ml. d'acé- tone fdrent ajoutés, lorsque furent obtenus un précipité rouge et un liquide surnageant jaune.
Ce précipité (31 mg. ) a donné une valeur d'essai de 1 à7 millions d'unités mg* et un maximum d'absorption à 3600A.E %= 26,9.
Ila été précipité 'hors de l'eau (0,75ml.) par l'acétone (13 ml.). L'huile rouge en résultant, 1,8 mg, a été de nouveau précipitée d'une solution dans le méthanol avec de l'acétone, sans )nouvelle perte de poids. Le produit montre un maximum d'absorption à 3600 A, E % =51,1.
On a dissous environ 12 mg. de cette matière dans 0,7 ml. d'eau et ajouté de l'acétone (3-4 ml.( jusqu'à apparition d'un trouble. la solution déposa des amas de cristaux d'un rouge foncé, en aiguilles, après repos d'une nuit. Après deux jours la liqueur mère fut enlevée et les cristaux lavés avec de l'acétone et séchés; on a obtenu 2.0mg Un complément de 1,4 mg. de cristaux fut obtenu à partir de la liqueur mère.
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Exemple 4.
Une portion de 6,0 mg. du concentré de vitamine B 12 de l'exemple 3 avec une activité d'environ 1 à2 x 10 u/mg. a été fractionnée dans un distributeur à dux plateaux à contre-courant avec de l'eau et un mélange de 75% de toluène 25% p-crésol saturé dans les deux phases non miscibles.
Deux millilitres de chaque phase furent utilisés par tube et les phases inférieures (aqueuses) furent transvasées.
Après remplissage du distributeur, les produits ont été déplacés vers les phases aqueuses par addition de 8 ml. de chloroforme par tube. Les phases aqueuses des tubes numéro- tés de 2 à 5 (le tube 0 représentant la matière non transfé- rée) ont été réunies, lavées avec du chloroforme et lyophi- liées, donnant 1,1 mg. de concentré de vitamine B 12 rouge amorphe d'une activité microbioiogique de 7 x 106 u/mg.
Ce produit fut aisément cristallisé par solution dans l'eau et addition d'acétone. La vitamine cristalline B L2 ainsi obtenue pesait environ 0,6 mg.
Exemple 5.
Une portion de 3,2 mg. de vitamine B 12 cristallisée une fois dérivant de foie a été dissoute dans du méthanol, filtrée et le filtatochentré à siccité dans le vide.
Le résidu fut dissous dans 0,15 ml. d'eau et on a ajouté de l'acétone (environ 1 ml.) jusqu'à ce que la solution devienne trouble; la solution fut ensemencée et laissée au repos pour la nuit à la température ambiante. Les cris- taux qui s'étaient déposés furent séparés de la liqueur mère, lavés avec de l'acétone, et séchés. Le rendement fut d'en- viron 2mg.
La vitamine B 12 recristallisée présentait, après séchage dans le vide à 100 pendant deux heures, un spectre
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d'absorption dans l'ultra-violetdans l'eau caractérisé comme suit :
EMI13.1
<tb> Max. <SEP> E1%
<tb>
<tb>
<tb> 2780 <SEP> 119
<tb>
<tb> 3050 <SEP> 68
<tb>
<tb> 3230 <SEP> 59
<tb>
<tb> 3610 <SEP> 187
<tb>
<tb> 4080 <SEP> 28
<tb>
<tb> 5200 <SEP> 56
<tb>
<tb> 5480 <SEP> 59
<tb>
Les cristaux en aiguilles, biréfringents (signe d'élongationpositif) ont après séchage les indices de ré- fraction : Ó 1,616; ss, 1.652 ; et , 1. 664.
Dans l'essai L.L.D., un échantillon de vitamine B 12 recristallisée donnait une valeur.(corrigée pour perte de 6 20,6x106 u/mg. poids au séchage) de 11,2 x 10 u/mg/ Ceci correspond à une croissance du demi maximum du L. lactis Dorner en pré- sence de 0,000013 ml. de milieu de culture dans les conditions utilisées.
Dans le micro-essai de chauffage, la vitamine re- cristallisée B 12 prend une couleur sombre allant jusqu'au noir à environ 210-220 , mais ne se liquéfie pas en-dessous de 300 .
Les concentrés de vitamine B 12 obtenus conformément à cette invention possèdent une grande valeur thérapeutique dans le traitement de certains types d'anémie humaine comme l'anémie pernicieuse d'Addison et analogues, ainsi le pro- duit cristallin a produit une réaction hematologique positive chez trois patients recevant chacun des injections intra- musculaires respectivement de 150,6 et 8, Quatre patients recevant chacun des injections des concentrés amorphes ren- fermant 20.000 à 40. 000 unités L.L.D. donnèrent des réactions hématologiques fortes ou maxima. Un mg. du produit cristal*!
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lin est équivalent a environ 11 x 106 L.L.D. unités et un a environ il.000 unités .
TABLE I
EMI14.1
g2±±È2¯±±h1
EMI14.2
<tb> Cas <SEP> A
<tb>
<tb>
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 14 <SEP> 23 <SEP> 9 <SEP> 42 <SEP> 119
<tb>
<tb>
<tb> RBC <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1.7 <SEP> 2.4 <SEP> 2.6 <SEP> 2. <SEP> 8 <SEP> 3. <SEP> 3 <SEP> 4.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 6 <SEP> .8 <SEP> 7,8 <SEP> 9.5 <SEP> 9 <SEP> .8 <SEP> 11. <SEP> 0 <SEP> 14.0
<tb>
EMI14.3
l1etics. % 2.4 20.0 1.5 1.0 13.6 1.1
EMI14.4
<tb> Unités <SEP> L.L.D. <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 1.8 <SEP> x106
<tb>
Le patient rentra à la maison le 45ème jour et n'a pas subi d'autre traitement que celui signalé.
TABLE il
EMI14.5
Vitamine . 2 recristallisée.
EMI14.6
<tb>
Cas <SEP> B <SEP> C
<tb>
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 14 <SEP> 23 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 14
<tb>
<tb>
<tb> RBC <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1.5 <SEP> 2.6 <SEP> 3. <SEP> 4 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 2.6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 4. <SEP> 5 <SEP> 7.0 <SEP> 9.0 <SEP> 7.8 <SEP> 10. <SEP> 0
<tb>
EMI14.7
Retics. % 0.5 27.0 4.0 0.5 a.8 26.0 3.1
EMI14.8
<tb> Hct. <SEP> %. <SEP> 14. <SEP> 0 <SEP> 25. <SEP> 0 <SEP> 29.0 <SEP> 17. <SEP> 0 <SEP> 31
<tb>
EMI14.9
WBC x 103 9.0 25.0 9.0 2.3 5.8 Vitamine B joz 150 6
EMI14.10
<tb> L.L.D.
<tb>
<tb>
Unités <SEP> 1.6 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 6. <SEP> 6 <SEP> x <SEP> 104
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Cas <SEP> D
<tb>
<tb>
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 9 <SEP> 15
<tb>
<tb>
<tb> RBC <SEP> x106 <SEP> 1.4 <SEP> 2,6
<tb>
<tb>
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 6. <SEP> 8 <SEP> 9. <SEP> 8
<tb>
<tb>
<tb> Ratios. <SEP> % <SEP> 2. <SEP> 8 <SEP> 10.2 <SEP> 4. <SEP> 0 <SEP> 2.6
<tb>
<tb>
<tb> Hct. <SEP> % <SEP> 17 <SEP> 31
<tb>
<tb>
<tb> WBC <SEP> x <SEP> 103 <SEP> 4.2 <SEP> 8. <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb> Vitamine <SEP> B12 <SEP> 3 <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb> L.L.D.
<tb>
<tb>
<tb>
Unités <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 5. <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 105
<tb>
<Desc/Clms Page number 15>
La vitamine B 12 est également capable d'augmenter la vitesse de croissance des poussins avec une nourriture debase renfermant tous les agents nutritifs connus. Par exem- ple. dans une expérience, une teneur de 0,000003 % de la vi- tamine cristalline dans la nourriture approduit une réaction telle que le poids moyen des poussins après une période d'ali- mentation de 16 jours était de 124 g., comparé avec un poids moyen de 110 g. pour le groupe de contrôle, dont la ration n'était pas additionnée de vitamine B 12.
Exemple 6
Environ 750 grammes d'un concentré sec sont obtenus par culture d'un filtrat du micro-organisme Streptomyces griseus sur un agent de nutrition convenable et récupération de la matière active hors du bouillon de culture par aesporp- tion de la matière active ,hors. du bouillon de culture, pur -le lessivage de l'adsorbé avec une solution aqueuse de pyridi- ou une pyridine ne/substituée par un groupe alkyle, et par la récupération du concentré brut de la lessive. Ce concentré séché a une activité microbiologique d'environ 1500 à 2000 unités /mg.
(L'activité des produits à laquelle on se réfère est détermi- née par une méthode d'essai de réaction de croissance micro- biologique utilisant le Lactobacillus lactis Dorner comme organisme de test, en prenant comme standard (étalon) une pré- paration de foie choisie arbitrairement, représentant une activité de 1000 unités Lactobacillus lactis Dorner par mg.).
Ce concentré aêché est ajouté à environ 2,5 litres d'alcool méthylique sec (anhydre). Le mélange est agité pendant en- viron 30 minutes et ensuite filtré. On ajoute ensuite envi- ron 2,5 litres d'alcool méthylique sec au résidu solide etle mélange est agité et filtré. Ce processus est répété avec deux portions successives de 2,5 litres d'alcool méthylique
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sec.. les filtrats réunis ont une activité micro biologique d'environ 1,2 billion d'unités.
Les filtrats réunis sont fractionnés chromatogra- phiquement par adsorption sur de l'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique. De l'alcool méthylique est en* suite introduit dans la colonne et on recueille un certain nombre de fractions de lessive. Ces fractions présentant une activité suffisante (généralement au moins 10. 000 unités /ml.) déterminée microbiologiquement et indiquée habituelle- ment par une coloration rose sont réunies et concentrées à une température inférieure à 30 C, et sous une pression moindre que la pression atmosphérique à environ un dixième du volume initial. S'il se forme une petite quantité de matière blanche insoluble, le mélange concentré est filtré. Le fil- trat est ensuite concentré dans le vide en un sirop épais.
On ajoute à ce sirop de l'alcool éthylique absolu et le pré- cipité blanc insoluble qui apparaît est séparé de la solu- tion. On ajoute alors un volume égal d'acétone à la solution rouge clair dans l'alcool éthylique, ce qui provoque un pré- cipité floconneux rouge de séparant de la solution.
La matière active précipitée de l'alcool éthylique par l'addition d'acétone est dissoute dans environ 2 ml. d'eau et précipitée à nouveau sous la forme d'une huile rouge par l'addition d'environ 12 volumes d'acétone. L'huile est séparée, dissoute dans environ 1 ml. d'eau, et la solution traitée avec de l'acétone jusqu'à apparition d'un trouble.
Après repos, la vitamine B 12 se sépare de la solution sous forme d'amas de petits cristaux rouges en aiguilles.
EMI16.1
!12¯7.
Comme autre exemple, on prépare cornue dans l'exemple 1 un précipité rouge floconneux obtenu par l'addi.tion d'acé- tone à la solution rouge clair dans l'alcool éthylique.
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Par lavage du précipité avec de l'acétone et séchage, on ob- tient une substance ayant une activité microbiologique d'en- viron 4 millions d'unités.mg. Une seconde portion de même actinité est récupérée par addition à la liqueur mère d'un second volume d'acétone. La nouvelle addition d'acétone à la liqueur mère entraîne la précipitation d'une huile rouge qui est recueillie. L'huile est traitée avec unmélange d'al- cool éthylique et d'acétone et une matière solide rouge amor- phe ayant une activité microbiologique d'environ 1, 5 millions d'unités/mg. précipite et est séparée.
Les différentes fractions insolubles dans l'acétone séchées sontéunies, dissoutes dans environ 4 ml. d'alcool méthylique et la solution est adsorbée sur environ 10 gram- mes d'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique dans une colonne chromatographique,La colonne est ensuite développée avec de l'alcool méthylique et une bande rouge foncé traversala colonne. A l"apparition de la couleur rou- ge dans la lessive, on prélève des fractions successives de 10 ml jusqu'à ce que le liquide sorte réellement incolore.
Les trois premières fractions renfermant la plus grande partie de la couleur rouge, sont réunies et évaporées à siccité à une pression inférieure à la pression atmosphérique et une température inférieure à 25 . le résidu sec est dissous dans environ 2 ml. d'alcool méthylique et la solution traitée avec environ 8 volumes d'a- cétone provoquant un précipité rouge amorphe se séparant de la solution. Ce précipité est récupéré par centrifigation et reprécipité sous unrocessus similaire à partir d'un mé- lange d'alcool méthylique et d'acétone. Une portion de cette matière ( 5 mg. sur un total de 27,8 mg. ) est dissoute dans environ 0,5 ml. d'eau et la solution traitée avec environ 5 ml. d'acétone.
Après repos, des amas de cristaux rouges en
<Desc/Clms Page number 18>
aiguilles de vitamine B 18, ayant une activité mdcroblogi- que d'environ 11 millions d'unités mg se séparent de la solution et sont recueillies Exemple 8
Environ 1388 grammes d'un concentré séché composé d'un produit d'élaboration du Streptomyces griseus et ayant une activité microbiologique d'environ 2000 unités/mg. sont ajoutés à environ 16 litres d'alcool méthylique sec. Le mélange est agité pendant environ 30 minutes et filtré.
Le filtrat est adsorbé sur environ 15 kg. d'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique dans une colonne chromatographique, La colonne est alors développée avec de l'alcool méthylique etun certain nombre de fractions de la lessive sont recueillies.
Les fractions chromatographiques ayant l'activité microbiologique la plus prononcée sont réunies et concen- trées dans le vide à environ un dixième du volume initial.
Le mélange concentré est filtré et le filtrat à nouveau con- centré dans le vide en un épais sirop. On ajoute à ce sirop de l'alcool éthylique et le mélange est filtré. Le filtrat est ensuite traité avec une quantité suffisante d'acétone avec agitation pour provoquer la complète précipitation de la substance rouge y contenue. te précipité rouge est ree cueilli et redissous dans environ 100 ml. d'alcool méthylique.
La solution est ensuite versée lentement sous agitation dans environ 1 litre d'acétone. Une substance légèrement rouge floconneuse précipite de la sotion et est recueillie. Par lavage et séchage du précipité, on recueille 7,8 g. d'une poudre rouge, ayant une activité microbiologique d'environ
65.000 unités/mg.
10.0 grammes de concentré ayant une activité moyen- ne de 80.000 unités/mg. sont dissous dans l'alcool .méthyli-
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que et la solution absorbée sur environ 500 grammes d'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique dans une colon- ne chromatographdque. La colonne est ensuite développée avec de l'alcool méthylique et on recueille des fractions séparées de la lessive. Les fractions ayant une activité microbiolo- gique prononcée sont sélectionnées, réunies et évaporées à siccité sous une pression inférieure à la pression atmosphé- rique. Le résidu est extrait avec de l'alcool éthylique absolu et la substance blanche qui ne se dissou.t pas est enlevée.
La solution rouge dans l'alcool éthylique est traitée avec un excès d'acétone, provoquant la séparation d'une huile rouge insoluble. L'huile est recueillie et dissoute dans environ 10 ml. d'eau, La matière active, avec un peu de matière Inerte incluse, est de nouveau précipitée sous forme d'huile par addition d'un excès d'acétone. La substance hautement active rouge est dissoute à nouveau dans environ 3 ml. d'eau et la solution traitée avec de l'acétone jusqu'à ceque l'on observe un léger trouble. A.près repos, des cristaux rouges, en aiguilles, de vitamine B 12 se séparent de la solution.
Des modifications peuvent être apportées dans le pro- cessus de l'application de la présente invention sans se de- partir de l'esprit et de la portée de celle-ci et l'invention se trouve limitée seulement par les revendications annexées.
<Desc / Clms Page number 1>
Process for preparing therapeutic materials and more particularly Vitamin BI2,
This invention relates generally to the preparation of therapeutic materials and, more particularly, to the preparation of vitamin B 12 from a concentrate containing mint.
The invention relates to a process for the preparation of vitamin B 12 from a concentrate, such as a liver preparation, by subjecting said liver preparation to the action of a column of activated material and recovering it. - rant said vitamin in a concentrated and purified form.
<Desc / Clms Page number 2>
The invention also relates to a process for the preparation of vitamin B 12 from a concentrate, such as a concentrate mainly composed of a streptomyces griseus product, by subjecting said concentrate to extraction with a solvent. , by carrying out a chromatographic fractionation by treating said solution obtained with the solvent in a column of absorbent material by washing the column with the solvent to leach the active substance (out) of the absorbent substance, and by recovering from leaching (= lye) of crystals or. ges having the approximate composition: 55.7% C, 6.5% H, 13.9% N, 5.2% P, and 4.4% Co.
Vitamin B 12 is a powerful active growth factor for the microorganism Lactobacillus lactis Dorner and has a marked and effective action in the milk. Treatment of pernicious Addison's anemia.
It is an object of the invention to prepare vitamin B 12 in pure form starting from commercial liver preparations.
It is also an object of the invention to prepare vitamin B 12 in pure form starting from a concentrate composed mainly of a construct of Streptomyces griseus.
According to this invention, it has been found that it is possible to subject commercial liver preparations to a purification process by which vitamin B 12 is recovered, possessing high physiological activity, particularly suitable for the clinical treatment of liver disease. human anemia.
It has been found that vitamin B 12 can be obtained in a concentrated and purified form from commercial liver preparations by a chromatographic technique. Purification and concentration are carried out
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killed under tightly controlled conditions whereby the possibility of destruction or loss of activity of the vitamin is reduced to a minimum.
According to the process of the invention a fraction of liver of at least 1000 units per mg * is used as starting material and is prepared starting from commercially available preparations such as the fraction soluble in ethanol at 70% of an aqueous extract of liver by the method such as that described by Dakin and West in Journ. Biol.
Chem. 109,489 (1935).
The solid product thus obtained is chromatographed in aqueous solution on a column containing charcoal and the active material is leached with an organic solvent such as 50% ethanol. Other detergents can also be used for leaching (or extraction) such as 50% acetone, water saturated with butanol, water saturated with benzyl alcohol, and glacial acetic acid.
According to the method, one can also chromatograph the alcoholic solution prepared by extracting the solid product with a lower aliphatic alcohol on a column containing activated alumina and leaching the active material with methanol or an aqueous solution of methanol.
The detergents are collected in small fractions.
The activity (or potency) of the fractions is determined by microbiological test with Lactobacillus lactis Dorner.
The high activity fractions are either dried, from the solid state (= frozen), or concentrated to a small volume.
The chromatographed material either solid or in the form of a concentrated lye such as the material obtained from the alumina chromatogram is extracted with ethanol, and the solid products insoluble in ethanol are removed. The solution in ethanol is concentrated
<Desc / Clms Page number 4>
to dryness, and after dissolving the residue in methanol, acetone or ether is added to induce precipitation. The supernatant liquid is then removed, the precipitate dissolved in water and the solution treated with acetone. the resulting precipitate is dissolved in methanol and several volumes of acetone are added. The supernatant liquid is removed and the residue crystallized by dissolving in water and carefully adding acetone until cloudiness is obtained.
The resulting crystals are washed with acetone and recrystallized from water-acetone mixtures.
On the other hand, the concentrates of vitamin 12 can also, after the operations of precipitation by solvent, undergo a subsequent purification by the distribution against the current between water and a mixture of 75% toluene-25% o -resol, followed by crystallization of the best fractions.
If desired, the concentrates obtained by the activated carbon treatment can be dissolved in a lower aliphatic alcohol and the resulting alcoholic solution can be chromatographed on an activated alumina column.
The activity of the products is determined microbiologically by means of a growth reaction with Lactobacillus lactis Dorner as the test organism. A value of 1000 units per mg was given. to an arbitrarily chosen liver concentrate.
According to the invention, the process also comprises the extraction of a crude concentrate composed mainly of a production product of Streptomyces griseus with a solvent, the chromatographic fractionation by adding said solution in the solvent to a column of matter
<Desc / Clms Page number 5>
adsorbent, washing the column with a solvent to fractionally leach the active substance from the adsorbent and recovering crystalline vitamin B 12 from the lye.
To prepare the new chemical compounds, a crude concentrate containing an active substance which promotes the growth of Lactobacillus lactis Dorner is used as the starting material. The crude concentrate can be prepared by culturing the microorganism Streptomyces grisens on (or in) a suitable nutrient medium, by adsorption of the active material (outside) of the culture broth, by washing by decantation of the adsorbed substance with an aqueous solution of pyridine or pyridine substituted by an alkyl group and by recovering the crude concentrate from the substance washed by decantation.
In accordance with another principle, a crude concentrate composed mainly of a derivative of Streptomyces griseus is subjected to extraction with water or a lower aliphatic alcohol such as methyl alcohol. the selection of the extraction liquid is determined by the adsorbent substance to be used in the chromatographic fractionation.
In the practice of this invention, a variety of adsorbents can be used including activated carbon, activated alumina and the like; the activated alumina being the preferred adsorbent. Aqueous extractions are processed in columns containing activated carbon and extractions in lower aliphatic alcohol are used in columns with activated alumina. The column is preferably loaded (in the state) wet, by filling with the adsorbent and the solvent used and by subsequent draining of the solvent until its level.
<Desc / Clms Page number 6>
reaches the top of the adsorbent in the column.
The alcoholic extract is poured onto the top surface of the adsorbent in the column and allowed to flow through the adsorbent by gravity or under pressure.
The column is then developed or washed with fresh solvent and the appropriate leach fractions are collected. Fractions showing sufficient activity revealed by microbiological examination or by virtue of pink color are concentrated either separately or as a mixture. The concentrated solution is then mixed with a miscible solvent in which the active substance is insoluble, such as acetone, and a red precipitate is collected. The precipitate is dissolved in water and acetone is added which causes the separation of red crystals of vitamin B 12,
The degree of purification obtained by simple chromatographic fractionation may not be sufficient to provide a crystalline product.
Under these conditions, the amorphous material can be purified again by dissolving it in a lower aliphatic alcohol. The solution is then added to (introduced into) a second column of adsorbent material and the most active fractions of the lye detected as said above are collected and concentrated to dryness. The dry residue is dissolved in methyl alcohol and acetone added to the solution to cause a red precipitate of vitamin B 12 which is separated.
This precipitate is dissolved in water and acetone added to the solution causes the separation of red crystals.
Vitamin B 12, obtained in accordance with this invention, is a red compound having the approximate composition of 55.7% C, 6.5% H, 13.9% N, 5.2% P and 4.4%. Co and is essentially soluble in water, methyl alcohol, * ethyl alcohol and phenol and essentially insoluble
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in acetone, ether and chloroform. Vitamin B 12 has an apparent partition coefficient of about 1.46 in the system: 75% toluene-25% ortho-cresol; water. vitamin B 12 crystallizes from suitable solutions such as aqueous acetone in red crystals having the following crystallographic properties:
EMI7.1
reference index, ction 1616; 1.65; 1, 664.
Crystallized vitamin B 12 on the other hand is characterized by approximate unit cell dimensions 16 by 19 by 21 A, as determined from x-ray diffraction data.
Vitamin B 12 crystals do not have a defined ftlsion point but darken to approximately (darken)
EMI7.2
210 - 20.
Vitamin B 12 in aqueous solution gives the following absorption spectrum in the visible and ultraviolet, (dried 2 hours at 100):
EMI7.3
<tb> max. <SEP> 1%
<tb> o <SEP> E
<tb> A <SEP> 1 <SEP> cm. <SEP>
<tb>
<tb>
2780 <SEP> 119
<tb> 3050 <SEP> 68
<tb> 3230 <SEP> 59
<tb> 3610 <SEP> 187
<tb> 4080 <SEP> 28
<tb> 5200 <SEP> 56
<tb> 5480 <SEP> 59
<tb>
The infrared absorption spectrum was determined with a carefully calibrated Perkin-Elmer 12A spectrometer.
The absorption maxima were as follows:
EMI7.4
Wavelength in Mu (10 -4 cm.)
EMI7.5
<tb> 3.05 <SEP> S <SEP> (large)
<tb>
<tb> 4.62 <SEP> W <SEP>
<tb>
<tb> 5.98S
<tb>
<tb> 6.13 <SEP> M
<tb>
<tb> 6.70 <SEP> S
<tb>
<tb> 7.14 <SEP> S <SEP>
<tb>
<tb> 7.35 <SEP> S
<tb>
<tb> 7.60 <SEP> W
<tb>
<tb> 8.15 <SEP> S
<tb>
<tb> 8.67 <SEP> S
<tb>
<tb> 9.36 <SEP> S
<tb>
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
<tb> Wave length <SEP> <SEP> in <SEP> Mu <SEP> (10- <SEP> cm. <SEP>)
<tb>
<tb>
<tb> 10. <SEP> 00 <SEP> S <SEP> (large)
<tb>
<tb> 10. <SEP> 80 <SEP> W
<tb>
<tb> 11.10W
<tb>
<tb> 11.81 <SEP> M
<tb>
<tb> 12.35 <SEP> M <SEP>
<tb>
S.M and W denote strong, medium and weak absorption intensities.
It has been found that the vitamin B 12 obtained according to the invention has a biological activity such as 0.000013% per ml. of culture medium is sufficient to generate a growth equal to half of the maximum of Lactobacillus lactis Dorner under the candidates employed.
Vitamin B 12 has high therapeutic value in the treatment of pernicious Addison's anemia, thus, the crystalline product produced a positive hematologic reaction in three patients by intramuscular injections of 150, 6 and 3, respectively. Four patients who each received injections of amorphous concentrates containing 20,000 to 40,000 L.L.D. gave strong or maximum blood reactions. One mg. of the crystalline substance is equivalent to about 11x10 L.L.D. and one at about 11,000 units.
TABLE I
EMI8.2
<tb> Amorphous <SEP> concentrates. <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
Case <SEP> - <SEP> A
<tb>
<tb>
<tb> Day <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 14 <SEP> 23 <SEP> 29 <SEP> 42 <SEP> 119
<tb>
<tb> RBCx106 <SEP> 1. <SEP> 7 <SEP> 2.4 <SEP> 2.6 <SEP> 2.8 <SEP> 3.3 <SEP> 4. <SEP> 5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 6.8 <SEP> 7. <SEP> 8 <SEP> 9.5 <SEP> 9.8 <SEP> 11.0 <SEP> 14.0
<tb>
<tb>
<tb> Retics. <SEP>% <SEP> 2. <SEP> 4 <SEP> 20. <SEP> 0 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 1. <SEP> 0 <SEP> 13. <SEP> 6 < SEP> 121 <SEP> -
<tb>
<tb> Units <SEP> L.L.D. <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> l.8x106
<tb>
The patient returned home on day 4 and received no treatment other than that reported.
<Desc / Clms Page number 9>
TABLE it
EMI9.1
Vitamin B 12 recrystallized.
EMI9.2
<tb>
Case <SEP> B <SEP> C
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Day <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 14 <SEP> 23 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 14
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> RBC <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 2. <SEP> 6 <SEP> 3.4 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 2. <SEP > 6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> .Hgb.gm. <SEP> 4,5 <SEP> 7.0 <SEP> 9. <SEP> 0 <SEP> 7. <SEP> 8 <SEP> 10. <SEP> 0
<tb>
EMI9.3
Failed. l% 0.5 27.0 2.0 0.5 2.8 26.0 3.1 Hct. % .4;
0 25.0 29.017.0 31
EMI9.4
<tb> WBC <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> 9. <SEP> 0 <SEP> 26.0 <SEP> 9.0 <SEP> 2,3 <SEP> 5.8
<tb>
EMI9.5
Vitamin B12 150 6 L.L.D.
EMI9.6
<tb> Units <SEP> 1.6 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 6.6 <SEP> x <SEP> 104
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Case <SEP> D
<tb>
<tb>
<tb> Day <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 9 <SEP> 15
<tb>
<tb>
<tb> RBC <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1. <SEP> 4 <SEP> 2.6
<tb>
<tb>
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 6. <SEP> 8 <SEP> 9.8
<tb>
<tb>
<tb> Retics. <SEP>% <SEP> 2.8 <SEP> 10. <SEP> 14. <SEP> 0 <SEP> 2.6
<tb>
<tb>
<tb> Hct.% <SEP> 17 <SEP> 31
<tb>
EMI9.7
V. # C x 103 4.2 8 .1
EMI9.8
<tb> Vitamin <SEP> B12 <SEP> 3 <SEP> 50
<tb>
EMI9.9
L.I, .D.
EMI9.10
<tb> Units <SEP> 3. <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 5.5 <SEP> x <SEP> 105
<tb>
Vitamin B 12 is also able to increase the growth rate of chicks.
For example, in one experiment, adding 30 parts per trillion of vitamin B 12 to a staple food containing purified (so-called vitamin-free) casein as a source of protein caused such an increase in growth rate. that the average weight of the chicks after 16 days of feeding with the basic supplemented feed was 127 grams, while that of the chicks receiving the feed without the supplement was only 99 grams.
The following examples illustrate the methods of applying the present invention, but it should be understood that these examples are given in principle by way of illustration and not by way of limitation.
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Example 1 One gram of a concentrate having a microbiological activity of 3200 units per mg. was dissolved in 10 ml of water and chromatographed on a column containing 10 g. of activated carbon, preferably acid washed. The column was washed thoroughly with water and the active material leached with 50% ethanol. The lye was collected in a series of fractions of about 10 ml. each. Fractions (Largest inactivity, as measured by microbiological test, were combined and dried frozen. The dried product (115 mg. Had a microbiological activity of about 10,000 units per mg. , showing a yield of about 50% Example 2
A concentrate of 6,000 units / mg.
(14.6g.) Containing a total of 8 million units was extracted three times by stirring for about 30 minutes with 200 ml. of methanol. The combined extracts were passed through a column of about 7.5 cm. diameter containing 600g. activated alumina. When the last fraction of this solution had entered the alumina, methanol was added which was allowed to filter through the column for the development of the chromatogram. During this operation, a pink band moved downward through the column, leaving essentially all of the yellow-brown color of the original solution at the top of the column.
The filtrate was collected in a series of fractions, from which those showing the most pronounced microbiological activity and / or the most pronounced pink color were selected and pooled for subsequent operations.
This solution, which contained according to microbiological test
<Desc / Clms Page number 11>
approximately 65 million units, was evaporated in vacuum at a temperature below 25 to a slightly syrupy consistency. During evaporation, the pH of the solution, which tends to increase, was maintained at about 6 to 7 by the addition of dilute hydrochloric acid (2.5N) as needed. The residue was finally dried under low pressure (1 mm. Of mercury) at room temperature.
Example 3
245 mg. of red residue from the alumina chromatogram were extracted with 15 ml. of absolute ethanol, giving 34 mg of insoluble colorless residue and a red solution. The red solution provides 218 mg. of a red oil. The oil and red was dissolved in 0.5 ml. of methanol / 25 ml. of acetone added, when a red precipitate and a yellow supernatant liquid were obtained.
This precipitate (31 mg.) Gave a test value of 1 to 7 million mg * units and an absorption maximum at 3600 A.E% = 26.9.
It was precipitated out of the water (0.75 ml.) By acetone (13 ml.). The resulting red oil, 1.8 mg, was again precipitated from a solution in methanol with acetone without further weight loss. The product shows an absorption maximum at 3600 A, E% = 51.1.
About 12 mg was dissolved. of this material in 0.7 ml. of water and added acetone (3-4 ml. (until cloudiness appeared. The solution deposited clumps of dark red crystals, in needles, after standing overnight. After two Days the mother liquor was removed and the crystals washed with acetone and dried to obtain 2.0 mg. An additional 1.4 mg of crystals was obtained from the mother liquor.
<Desc / Clms Page number 12>
Example 4.
One serving of 6.0 mg. vitamin B 12 concentrate from Example 3 with an activity of about 1 to 2 x 10 u / mg. was fractionated in a countercurrent dual tray distributor with water and a mixture of 75% toluene 25% p-cresol saturated in the two immiscible phases.
Two milliliters of each phase were used per tube and the lower (aqueous) phases were poured out.
After filling the dispenser, the products were moved to the aqueous phases by adding 8 ml. of chloroform per tube. The aqueous phases of tubes numbered 2 to 5 (tube 0 representing non-transferred material) were combined, washed with chloroform and lyophilized, yielding 1.1 mg. of amorphous red vitamin B 12 concentrate with a microbiological activity of 7 x 106 u / mg.
This product was readily crystallized by solution in water and the addition of acetone. The crystalline vitamin B L2 thus obtained weighed about 0.6 mg.
Example 5.
One serving of 3.2 mg. of vitamin B 12 crystallized once derived from liver was dissolved in methanol, filtered and the filtatochentricated to dryness in vacuum.
The residue was dissolved in 0.15 ml. of water and acetone (about 1 ml.) was added until the solution became cloudy; the solution was seeded and left to stand overnight at room temperature. The crystals which had settled were separated from the mother liquor, washed with acetone, and dried. The yield was about 2 mg.
The recrystallized vitamin B 12 exhibited, after drying in vacuum at 100 for two hours, a spectrum
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absorption in ultra-violet in water characterized as follows:
EMI13.1
<tb> Max. <SEP> E1%
<tb>
<tb>
<tb> 2780 <SEP> 119
<tb>
<tb> 3050 <SEP> 68
<tb>
<tb> 3230 <SEP> 59
<tb>
<tb> 3610 <SEP> 187
<tb>
<tb> 4080 <SEP> 28
<tb>
<tb> 5200 <SEP> 56
<tb>
<tb> 5480 <SEP> 59
<tb>
The needle crystals, birefringent (positive sign of elongation) have, after drying, the refractive indices: Ó 1.616; ss, 1,652; and, 1,664.
In the LLD test, a sample of recrystallized vitamin B 12 gave a value (corrected for loss of 6 20.6x106 u / mg. Weight on drying) of 11.2 x 10 u / mg / This corresponds to a growth of half maximum of L. lactis Dorner in the presence of 0.000013 ml. of culture medium under the conditions used.
In the micro heating test, the recrystallized vitamin B 12 turns dark to black at about 210-220, but does not liquefy below 300.
Vitamin B 12 concentrates obtained in accordance with this invention have great therapeutic value in the treatment of certain types of human anemia such as pernicious Addison's anemia and the like, thus the crystalline product produced a positive hematologic reaction in patients. three patients each receiving intramuscular injections of 150, 6 and 8, respectively, Four patients each receiving injections of amorphous concentrates containing 20,000 to 40,000 LLD units gave strong or maximal haematological reactions. One mg. of the crystal product *!
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flax is equivalent to approximately 11 x 106 L.L.D. units and one has about 11,000 units.
TABLE I
EMI14.1
g2 ± ± È2¯ ± ± h1
EMI14.2
<tb> Case <SEP> A
<tb>
<tb>
<tb> Day <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 14 <SEP> 23 <SEP> 9 <SEP> 42 <SEP> 119
<tb>
<tb>
<tb> RBC <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1.7 <SEP> 2.4 <SEP> 2.6 <SEP> 2. <SEP> 8 <SEP> 3. <SEP> 3 <SEP> 4.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 6 <SEP> .8 <SEP> 7,8 <SEP> 9.5 <SEP> 9 <SEP> .8 <SEP> 11. <SEP> 0 <SEP> 14.0
<tb>
EMI14.3
l1etics. % 2.4 20.0 1.5 1.0 13.6 1.1
EMI14.4
<tb> Units <SEP> L.L.D. <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 1.8 <SEP> x106
<tb>
The patient returned home on the 45th day and received no treatment other than that reported.
TABLE it
EMI14.5
Vitamin. 2 recrystallized.
EMI14.6
<tb>
Case <SEP> B <SEP> C
<tb>
<tb> Day <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 14 <SEP> 23 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 14
<tb>
<tb>
<tb> RBC <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1.5 <SEP> 2.6 <SEP> 3. <SEP> 4 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 2.6
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 4. <SEP> 5 <SEP> 7.0 <SEP> 9.0 <SEP> 7.8 <SEP> 10. <SEP> 0
<tb>
EMI14.7
Retics. % 0.5 27.0 4.0 0.5 a.8 26.0 3.1
EMI14.8
<tb> Hct. <SEP>%. <SEP> 14. <SEP> 0 <SEP> 25. <SEP> 0 <SEP> 29.0 <SEP> 17. <SEP> 0 <SEP> 31
<tb>
EMI14.9
WBC x 103 9.0 25.0 9.0 2.3 5.8 Vitamin B joz 150 6
EMI14.10
<tb> L.L.D.
<tb>
<tb>
Units <SEP> 1.6 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 6. <SEP> 6 <SEP> x <SEP> 104
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Case <SEP> D
<tb>
<tb>
<tb> Day <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 9 <SEP> 15
<tb>
<tb>
<tb> RBC <SEP> x106 <SEP> 1.4 <SEP> 2.6
<tb>
<tb>
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 6. <SEP> 8 <SEP> 9. <SEP> 8
<tb>
<tb>
<tb> Ratios. <SEP>% <SEP> 2. <SEP> 8 <SEP> 10.2 <SEP> 4. <SEP> 0 <SEP> 2.6
<tb>
<tb>
<tb> Hct. <SEP>% <SEP> 17 <SEP> 31
<tb>
<tb>
<tb> WBC <SEP> x <SEP> 103 <SEP> 4.2 <SEP> 8. <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb> Vitamin <SEP> B12 <SEP> 3 <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb> L.L.D.
<tb>
<tb>
<tb>
Units <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 5. <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 105
<tb>
<Desc / Clms Page number 15>
Vitamin B 12 is also able to increase the growth rate of chicks with basic food containing all known nutrients. For example. in one experiment, a content of 0.000003% of the crystalline vitamin in the feed produced a reaction such that the average weight of the chicks after a feeding period of 16 days was 124 g., compared with one. average weight of 110 g. for the control group, whose ration was not supplemented with vitamin B 12.
Example 6
About 750 grams of a dry concentrate are obtained by culturing a filtrate of the microorganism Streptomyces griseus on a suitable nutrient and recovering the active material from the culture broth by aesporting the active material out. of culture broth, pure -leaching of the adsorbent with an aqueous solution of pyridi- or a pyridine ne / substituted by an alkyl group, and by recovering the crude concentrate from the lye. This dried concentrate has a microbiological activity of about 1500 to 2000 units / mg.
(The activity of the products referred to is determined by a microbiological growth reaction test method using Lactobacillus lactis Dorner as the test organism, taking as a standard (standard) a preparation of liver chosen arbitrarily, representing an activity of 1000 Lactobacillus lactis Dorner units per mg.).
This dried concentrate is added to about 2.5 liters of dry methyl alcohol (anhydrous). The mixture is stirred for about 30 minutes and then filtered. About 2.5 liters of dry methyl alcohol are then added to the solid residue and the mixture is stirred and filtered. This process is repeated with two successive 2.5 liter portions of methyl alcohol.
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sec .. the combined filtrates have a microbiological activity of about 1.2 trillion units.
The combined filtrates are fractionated chromatographically by adsorption on activated alumina moistened with methyl alcohol. Methyl alcohol is then introduced into the column and a number of lye fractions are collected. These fractions exhibiting sufficient activity (generally at least 10,000 units / ml.) Determined microbiologically and usually indicated by a pink color are combined and concentrated at a temperature below 30 ° C., and at a pressure less than atmospheric pressure. at about a tenth of the original volume. If a small amount of insoluble white material forms, the concentrated mixture is filtered. The filtrate is then concentrated in vacuum to a thick syrup.
Absolute ethyl alcohol is added to this syrup and the insoluble white precipitate which appears is separated from the solution. An equal volume of acetone is then added to the clear red solution in ethyl alcohol, causing a red fluffy precipitate of separating from the solution.
The active material precipitated from ethyl alcohol by the addition of acetone is dissolved in about 2 ml. of water and precipitated again as a red oil by the addition of about 12 volumes of acetone. The oil is separated, dissolved in about 1 ml. of water, and the solution treated with acetone until cloudiness appears.
After standing, vitamin B 12 separates from the solution in the form of clusters of small red crystals in needles.
EMI16.1
! 12¯7.
As a further example, a fluffy red precipitate obtained by adding acetone to the light red solution in ethyl alcohol is prepared in Example 1 as a retort.
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By washing the precipitate with acetone and drying, a substance is obtained having a microbiological activity of about 4 million units.mg. A second portion of the same actinity is recovered by adding to the mother liquor a second volume of acetone. The further addition of acetone to the mother liquor results in the precipitation of a red oil which is collected. The oil is treated with a mixture of ethyl alcohol and acetone and an amorphous red solid having a microbiological activity of about 1.5 million units / mg. precipitates and is separated.
The various fractions insoluble in dried acetone are united, dissolved in about 4 ml. of methyl alcohol and the solution is adsorbed on about 10 grams of activated alumina moistened with methyl alcohol in a chromatographic column. The column is then developed with methyl alcohol and a dark red band running through the column. When the red color appears in the lye, successive 10 ml fractions are taken until the liquid comes out really colorless.
The first three fractions containing most of the red color are combined and evaporated to dryness at a pressure below atmospheric pressure and a temperature below 25. the dry residue is dissolved in about 2 ml. of methyl alcohol and the solution treated with about 8 volumes of acetone causing an amorphous red precipitate to separate from the solution. This precipitate is recovered by centrifigation and reprecipitated under a similar process from a mixture of methyl alcohol and acetone. A portion of this material (5 mg. Out of a total of 27.8 mg.) Is dissolved in about 0.5 ml. of water and the solution treated with about 5 ml. acetone.
After resting, clusters of red crystals
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Vitamin B 18 needles, having a metabolic activity of about 11 million mg units separate from solution and are collected Example 8
Approximately 1388 grams of a dried concentrate composed of a Streptomyces griseus construct and having a microbiological activity of approximately 2000 units / mg. are added to about 16 liters of dry methyl alcohol. The mixture is stirred for about 30 minutes and filtered.
The filtrate is adsorbed on about 15 kg. of activated alumina moistened with methyl alcohol in a chromatographic column. The column is then developed with methyl alcohol and a number of lye fractions are collected.
The chromatographic fractions with the most pronounced microbiological activity are combined and concentrated in vacuo to about one tenth of the original volume.
The concentrated mixture is filtered and the filtrate again concentrated in vacuo to a thick syrup. Ethyl alcohol is added to this syrup and the mixture is filtered. The filtrate is then treated with a sufficient quantity of acetone with stirring to cause complete precipitation of the red substance contained therein. The red precipitate is collected and redissolved in about 100 ml. methyl alcohol.
The solution is then poured slowly with stirring into approximately 1 liter of acetone. A slightly red fluffy substance precipitates from the sotion and is collected. By washing and drying the precipitate, 7.8 g are collected. of a red powder, having a microbiological activity of approximately
65,000 units / mg.
10.0 grams of concentrate having an average activity of 80,000 units / mg. are dissolved in methyl alcohol
<Desc / Clms Page number 19>
that and the solution absorbed onto about 500 grams of activated alumina moistened with methyl alcohol in a chromatographic column. The column is then developed with methyl alcohol and separate fractions of the lye are collected. The fractions having a pronounced microbiological activity are selected, combined and evaporated to dryness under a pressure below atmospheric pressure. The residue is extracted with absolute ethyl alcohol and the white substance which does not dissolve is removed.
The red solution in ethyl alcohol is treated with an excess of acetone, causing the separation of an insoluble red oil. The oil is collected and dissolved in about 10 ml. of water. The active material, with some inert material included, is again precipitated as an oil by the addition of excess acetone. The highly active red substance is dissolved again in approximately 3 ml. of water and the solution treated with acetone until a slight cloudiness is observed. A. After standing, red, needle-like crystals of vitamin B 12 separate from the solution.
Modifications may be made in the process of applying the present invention without departing from the spirit and scope thereof, and the invention is limited only by the appended claims.