COMPOSITION PHARMACEUTIQUE AYANT UNE ACTIVITE ANTITUMORALE
La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique formée par une liaison amide entre un anticorps,extrêmement pur, aux anti-
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La présente invention se rapporte plus particulièrement à une composition pharmaceutique qui ne provoque aucun effet secondaire, tel que pyrexie et choc anaphylactique lorsqu'elle est administrée.
La présente invention a encore pour objet un anticorps extrêmement pur aux antigènes tumoraux, qui peut être utilisé pour la préparation des compositions pharmaceutiques précitées.
Jusqu'à très récemment, différents types de compositions pharmaceutiques
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tinaux. Aussi, pour le moment, leur utilisation est-elle relativement restreinte.
Plus récemment, l'utilisation d'une substance obtenue par liaison chimique d'un anticorps aux antigènes tumoraux (que l'on appelle dans la présente'anticorps antitumoraux) avec une substance antitumorale telle qu'un agent antitumoral, a été tentée. Cependant, comme les anticorps antitumoraux utilisés pour la préparation de cette substance ne sont pas suffisamment purs
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rer en tant qu'anticorps antitumoraux purs.Aussi, dans le cas où une substance obtenue par liaison d'un anticorps antitumoral avec une substance antitumorale est administrée en tant qu'agent antitumoral, l'apparition de pyrexie et de
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tumoral précité est inévitable.
Les inventeurs ont pris en considération les inconvénients précités et ont cherché à éliminer les effets secondaires résultant de l'emploi d'anticorps antitumoraux et leurs recherches ont permis de constater qu'un anticorps antitumoral extrêmement pur est obtenu par purification de la fraction immunoglobuline de l'antisérum par une technique de chromatographie par affinité, et qu'une composition pharmaceutique obtenue par liaison de l'anticorps puri-
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xyle ou un groupe amino, ne donne pas lieu aux effets secondaires précités.
La présente invention a, par conséquent, pour objet une composition pharmaceutique ayant une cytotoxicité faible et présentant par ailleurs une activité antitumorale excellente. Elle se rapporte également à un anticorps antitumoral présentant une pureté élevée, et se rapporte à la méthode de préparation de cet anticorps antitumoral.
D'autres buts et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description suivante et des figures jointes, données à titre illustratif mais non limitatif.
La Figure 1 présente un spectre d'absorption infrararouge d'une composition obtenue par liaison d'un anticorps antisarcome-180 purifié d'une <EMI ID=6.1> La Figure 2 présente un spectre d'absorption infrarouge d'un anticorps purifié résultant de purification par chromatographie par affinité d'un antisérum d'un patient de sexe masculin ayant un cancer du rectum. La Figure 3 présente un spectre d'absorption ultra-violet de l'anticorps purifié précité. La Figure 4 présente un spectre d'absorption infrarouge d'une composition obtenue par liaison d'un anticorps antisarcome-180 purifié d'une souris à un chlorhydrate de doxorubicine, conformément à la présente invention. La Figure 5 présente un spectre d'absorption infrarouge d'une composition obtenue par liaison d'un anticorps antisarcome-180 purifié d'un rat au chlorambucil, conformément à la présente invention.
La Figure 6 présente un spectre d'absorption infrarouge d'une composition obtenue par liaison d'un anticorps antisarcome-180 purifié d'un rat à 1'uramustine, conformément à la présente invention. La Figure 7 présente un spectre d'absorption infrarouge d'une composition obtenue par liaison d'un anticorps antisarcome-180 purifié d'un lapin à la cytarabine, conformément à la présente invention. La Figure 8 présente un spectre d'absorption infrarouge d'une composition obtenue par liaison d'un anticorps antisarcome-180 purifié d'une souris <EMI ID=7.1>
La caractéristique principale de la présente invention réside dans ce que la composition pharmaceutique obtenue par liaison d'un anticorps antitumoral purifié, obtenu par purification par chromatographie par affinité d'une substance antitumorale ayant au moins un groupe amino carboxyle, peut être utilisée en tant que constituant actif de la composition pharmaceutique selon la présente invention.
L'anticorps antitumoral conforme à la présente invention est obtenu par
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meurs de types Sarcome-180, cancer des poumons de Sato, leucémie L-1210, leucémie P-388, cancer d'Ehrlich, sarcomie d'Yoshida, leucémie lymphatique aiguë, tumeur médullaire, ou autres cancers humains, par une technique de chromatographie par affinité.
La préparation de l'anticorps aux antigènes tumoraux précités lui-même peut être effectuée par les méthodes décrites dans "Proceedings of theVIthAnnual Meeting of Japan Society of Immunology", page 198 (1975), ou par la
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Dans la première méthode, on utilise l'adjuvant complet de Freund, et injecte par voie sous-cutanée les cellules tumorales à des animaux expérimentaux afin de les immuniser, et l'anticorps est obtenu à partir des animaux immunisés. Dans la deuxième méthode, un antigène tumoral est injecté,par voie intrapêritonéale,â 3 ou 4 reprises à un animal aux fins de l'immuniser, et l'anticorps est obtenu a partir de l'animal immunisé.
En outre, on peut utiliser conformément à la présente invention aussi bien les alloanticorps que les génoanticorps; cependant, l'emploi de l'alloanticorps est préférable.
Jusqu'à présent, aux fins de purifier un anticorps, la méthode a consisté
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chromatographie par échange ionique avec une colonne de cellulose DEAE, de façon à obtenir la fraction d'immunoglobuline G d'un antisérum.
Selon la présente invention, une procédure de purification spécifique est mise en oeuvre par emploi de la méthode de chromatographie par affinité aux fins d'obtenir par voie sélective uniquement l'anticorps spécifique des
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leur séparation.
La chromatographie par affinité utilisée dans la présente invention comprend:
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tumorales,sont liées par une liaison covalente à un support tel qu'un gel
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d'une colonne à l'aide du support, on fait passer une solution d'anticorps dans la colonne pour que l'anticorps soit lié à l'antigène et, enfin, on fait passer une quantité suffisante du solvant dans la colonne aux fins de le laver de toute trace d'anticorps non-lié, puis on y fait passer une solution tampon à un pH inférieur aux fins de défaire toute liaison entre l'anticorps et l'antigène et d'éluer l'anticorps qui se sépare;
(2) une méthode dans laquelle, sans que l'on emploie une colonne, l'anticorps
est amené à une .liaison'avec l'antigène par mélange du support auquel. l'antigène est lié, ainsi qu'il est décrit ci-dessus et d'une solution de l'anticorps puis, après lavage des particules de support aux fins d'éliminer les anticorps non-lies, l'anticorps est dissout; et
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sées au lieu d'employer le support auquel l'antigène est lié.
Ainsi, l'anticorps purifié obtenu selon la présente invention par la méthode de chromatographie par affinité est une immunoglobuline antitumorale ayant une pureté supérieure à celle des fractions d'immunoglobuline obtenues
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Les substances antitumorales qui sont amenées à être liées par une liaison amido avec les anticorps antitumoraux purifiés obtenus ainsi qu'il est décrit ci-dessus, consistent en les substances antibiotiques, telles,que mytocine C, chlorhydrate de doxorubicine, bléomycine, daunorubicine, actinomycine D et sarcomycine. Les substances antimétabolitiques telles que cytarabine, 8-azaguanine, 5-fluorouracile, méthotrexate et aminoptérine de sodium,
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et quoiqu'elles soient désignées par leur nom commun, leurs structures.sont bien connues et sont notamment décrites dans les articles suivants:
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Ed. par Y. Ueno et al.
Les substances antitumorales précitées sont liées aux anticorps antitumoraux précités par liaison du groupe amino ou du groupe carboxyle de la substance avec, soit le groupe carboxyle ou le groupe amino de l'anticorps, grâce à une mise en réaction de la substance avec l'anticorps dans des conditions douces.
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des groupes amino- ou carboxyles est de préférence misé en oeuvre par mise . en réaction de la substance antitumorale elle-même, ou de son sel de sodium,de potassium ou d'argent, avec un composé présentant la formule générale:
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10 et 40[deg.]C, durant 10 mn à 72 heures.
Par recristallisation du produit de la réaction ainsi obtenu �ans un solvant tel que eau, alcool, chloroforme et dioxane, un dérivé de la substance antitumorale auquel un ou plus groupes amino ou carboxyles sont fixés peut être
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l'acide chloroacétique.
La liaison de l'anticorps antitumoral purifié et de la substance antitumorale comportant au moins un groupe amino ou carboxyle est mise en oeuvre par dissolution des deux réactifs dans un solvant soluble dans l'eau et addition de carbodiimide agissant en tant que catalyseur, la réaction se déroulant à une température comprise entre 0 et 50[deg.]C, de préférence 10 et 40[deg.]C, durant
10 mn à 8 heures, de préférence 30 mn à 5 heures, la réaction étant ensuite arrêtée-par addition d'une solution tampon, telle qu'une solution d'acétate de sodium et d'acide acétique.
Ensuite, afin d'éliminer la substance antitumorale n'ayant pas réagi
le catalyseur et les constituants de la solution tampon et les sels du mélange réactionnel, le mélange réactionnel est soumis à un traitement de.dialyse, de filtration de gel, d'ultrafiltration ou de plusieurs de ces traitements.
Le carbodiimide utilisé dans la réaction précitée en tant que catalyseur
peut être l'un ou l'autre des produits consistant en:
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Dans la composition pharmaceutique obtenue par la réaction précitée, l'anticorps et la substance antitumorale sont liés par une liaison amidique;
le rapport moléculaire anticorps/substance antitumorale est de l'ordre de
1/2 à 5/1 dans le cas où la substance antitumorale est d'origine antibiotique et de 1/1 à 10/1 dans le cas où elle est d'origine antimétabolique ou alkylante.
On trouve ci-dessous des explications du caractère toxicologique, de l'action pharmacologique et de la préparation des substances de liaison, de la composition pharmaceutique du composé selon la présente invention ayant
une liaison amidique entre l'anticorps antitumoral et la substance antitumorale.
La toxicité aiguë est déterminée par l'administration intraveineuse de
300 mg d'une composition pharmaceutique par kg d'une souris à titre d'animaltest. Etant donné qu'aucun décès n'est observé dans le groupe de souris traitées une semaine après traitement, on peut en déduire que la composition pharmacologique peut être utilisée à titre de médicament.
La composition pharmacologique, ainsi que le montrent les Exemples qui suivent, est efficace vis-à-vis d'un grand nombre de cancers, tels que leucémie aiguë, lymphome malin, carcinome, sarcome, épithéliome cilié malin, leucémie myelogène aiguë, mélanome, leucémie lymphatique aiguë, myelome, etc.
Pour la préparation des composés pharmacologiques destinés à être utilisés en tant que médicaments antitumoraux et les méthodes de leur administration, les méthodes généralement utilisées peuvent être employées.
Ainsi, ces médicaments peuvent être administrés par voie orale, par injection ou par voie rectale, et leurs formes d'administration peuvent être quelconques,
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l'administration par injection est effectuée de préférence.
Pour la préparation d'une solution destinée à être injectée, les solvants solubles dans l'eau tels que des solutions de sérum physiologique, d'eau sté-
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des agents isotoniques, des agents analgésiques, des agents de stabilisation, des agents antiseptiques, des agents de suspension, des agents tampon, des agents. émulsifiants, etc., peuvent être utilisés le cas échéant.
Ainsi, par exemple 10 mg de la composition pharmaceutique, et 50 mg de mannitol sont dissouts dans de l'eau distillée-,on obtient 10 ml d'une solution aqueuse, et après stérilisation de la solution par une méthode classique,
la solution stérilisée est introduite dans un appareil pour injection, ou encore, elle est directement séchée par lyophilisation et, avant injection,est diluée à l'aide d'une solution aqueuse de sérum physiologique.
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Quoique la quantité de composition pharmaceutique administrée dépend de Tétât de la maladie, elle est généralement de l'ordre de 0,11 à 9g par jour
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En outre, conformément à la présente invention, comme l'activité antitumorale et tumortrope de l'anticorps et l'activité antitumoralc de la substance antitumorale qui est liée à l'anticorps sont conservées dans la com-
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lorsqu'elles sont administrées; elles arriva: aux sites cibles de la tumeur en donnant lieu à une activité antitumorale efficace.
Aussi, lorsque l'en considère la composition pharmaceutique en tant que base, l'administration de la composition pharmaceutique contenant une quantité
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de a même substance antitumorale donne lieu au même taux d'inhibition quant à la prolifération de la tumeur que l'administration de la substance tumorale elle-même, et le taux d'effets secondaires dus à la substance antitumorale contenue dans la composition pharmaceutique en tant que consti-
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ration comprenant cette substance antitumorale. Ces effets peuvent être considérés comme donnant lieu à une action synergique à propriétés favorables des deux constituants de la composition pharmacologique.
L'invention sera d'ailleurs mieux comprise à la lecture de la description des exemples suivants,et notamment des résultats des tests pharmacologiques de l'agent antitumoral selon la présente invention, donnés à titre illustratif mais non limitatif.
EXEMPLE 1
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méthode de chromatographie par affinité(3).
Après culture des cellules de sarcome-180 de type ascite, obtenues sur
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C à une concentration de 50 microgramme/ml durant 30 mn, à une température de l'ordre de 37[deg.]C, le liquide surnageant est éliminé par centrifugation, et les cellules qui prolifèrent sont lavées, à trois reprises, à l'aide d'une solution
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L'adjuvant complet de Freund (appelé FCA) est additionné aux cellules de sarcome-180 ainsi traitées auxquelles on a enlevé l'activité prolifératrice,' et le ange est injecté par voie sous-cutanée dans 'la voûte plantaire d'un
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Le lapin est immunisé par injection répétée des cellules 2 semaines après la première injection, puis le même nombre de cellules est injecté par voie intraveineuse au même lapin.
Une semaine après la dernière injection, l'ensemble du sang du lapin est recueilli par une canule insérée dans l'artère carotide et l'on prépare un antisérum a partir de ce sang, que l'on purifie alors de la façon suivante:
La fraction relarguée, formée par addition de sulfate d'ammonium, dans
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10 mM aqueuse (appelée dans la présente PBS), à un pH de 7,0, durant 72h.
à une température de l'ordre de 4[deg.]C. (Durant ce traitement, le liquide de dialyse externe a été changé toutes les 24 heures).
Une quantité égale de cellules de sang d'une souris ICR normale, lavée à 3 reprises à l'aide d'une solution aqueuse de chlorure de sodium est mélangée à la solution dessalée, et le mélange est maintenu au repos, durant 30 mn,
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centrifugation aux fins d'obtenir un liquide surnageant.
Le processus précité est répété à 4 reprises, le nombre total d'absorptions étant de 5. L'anticorps ainsi obtenu est appelé l'anticorps de pré-purification (en général "IgG").
Ensuite, on poursuit la purification suivant les méthodes connues :
A la solution surnageante soumise à l'absorption, la même quantité de cellules de sarcome-180 est ajoutée, puis le mélange est amené au repos durant
30 mn, à une température de 4[deg.]C, pour que l'anticorps du sarcome-180 soit lié aux cellules de sarcome-180, et la solution surnageante est éliminée par centrifugation. Une solution aqueuse d'un tampon à base de chlorhydrate de glycine, ayant un pH de 3,0, est ajoutée au précipitât en vue de libérer l'anticorps. Le mélange est centrifugé aux fins de recueillir la solution surnageante contenant l'anticorps. Après ajustement du pH de la solution surnageante proche de son point de neutralité par addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de
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PBS, à une température de l'ordre de 4[deg.]C, durant 24h (le liquide de dialyse externe étant échangé toutes les 8h).
La solution de dialyse ainsi obtenue est une solution aqueuse contenant l'anticorps d'anti-sarcome 180 du lapin.
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tumorales.
Les modifications dues aux anticorps anti-sarcome-180 du lapin obtenus ainsi qu'il est décrit ci-dessus vis-à-vis des cellules sont déterminées en présence d'un complément (sérum de cobaye) de la façon suivante:
Chaque 100 ml de la solution aqueuse de l'anticorps précité et des trois solutions de l'anticorps diluées 10 fois; 100 fois et 1000 fois, respectivemert, sont mélangés à 100 microlitres de la suspension aqueuse de cellules de
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15 mn à température ambiante. Ensuite, une partie aliquote de 100 microlitres d'un sérum dilué 2 fois de cobaye dans le milieu essentiel minimum de Eagle
(appelé ci-dessous MEM) (le sérum dilué étant considéré comme un complément) est ajoutée à chacun des mélanges précités, et les mélanges finaux sont maintenus à l'incubation durant 30 mn, à une température de l'ordre de 37[deg.]C. Apres incubation, le milieu incubé subit une centrifugation aux fins de recueillir les particules de cellules et, après lavage de ces particules,
à nouveau à l'aide de MEM, on ajoute une solution aqueuse de bleu-trypan
à ces particules et on les examine sous microscope aux fins de déterminer
le taux de mortalité des cellules.
Les résultats obtenus sont consignés dans le TabLeau I. ci-après. -
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et on constate très aisément que, quoique l'anticorps repris après purification de l'antisérum par la méthode précitée, présente une toxicité vis-àvis des cellules de sarcome-180 relativement peu différente de la toxicité de l'anticorps repris par purification de l'antisérum, la toxicité du premier vis-à-vis des cellules spléniques des souris normales est suffisamment faible pour que celles-ci ne soient pas tuées.
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la présente invention.
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11 faut remarquer que les' cellules splêniques des souris ICR normales. utilisées à titre représentatif des cellules normales sont obtenues tout d'abord, après extirpation de la rate, éminçage de la rate avec une paire de couteaux dans MEM de Eagle pour qu'elle passe dans ur. grillage en acier inoxydable de 200 mesh, lavage du filtrat une fois à l'aide de MEM, addition de
3 ml d'une solution de chlorure d'ammonium à 0,75% tamponnée par le tris-(hy-
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Comme dans la méthode (3) de chromatographie par affinité utilisée dans
le point 1-1 ci-dessus se sont produits des problèmes dans la séparation des anticorps purs qui montrent que la divergence est encore reconnue sur les cellules spléniques de souris, la méthode de purification ci-dessus de l'anticorps est mise en oeuvre sur une colonne dans laquelle l'antigène tumoral est lié. Tout d'abord, la purification est effectuée sur l'antigène lui-même.
Des cellules tumorales de sarcome-180 de type ascitess qui ont été obtenues sur des souricières sont séchées par lyophilisation et, après addition d'une solution tampon de phosphate de potassium 5 mM, ayant un pH de 7,4, l'antigène est extrait des cellules durant 20 heures.
On obtient ainsi une solution surnageante après centrifugation du mélange durant 10 mn à 65 OOOG. La solution surnageante subit une nouvelle centrifugation durant 30 mn à 180 OOOG et le surnageant ainsi obtenu est dialyse à l'encontre d'eau distillée, durant 70 heures, à une température de Tordre de 4[deg.]C. (durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes 'les 24 heures). Le dialysat est à nouveau centrifugé à 65 OOOG pour éliminer le précipité et, après addition de sulfate d'ammonium dans la solution surnageante ainsi obtenue pour que la concentration atteigne 2M, la solution est centrifugée durant 10 mn
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distillée durant 72 heures (durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
L'antigène de sarcome-180 ainsi obtenu est utilisé pour la préparation de
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Ltd), qu'on a laissé gonflerdans de l'eau jusqu'à atteindre 20 ml, on ajoute le même volume d'une solution aqueuse de bromocyane à 1 g/ml et, après réaction durant 8 mn, tout en maintenant le pH du mélange réactionnel à 11,0,
le mélange est filtre dans un filtre de verre; on recueille le précipité que 1'on lave sur le filtre à T'aide d'eau distillée refroidie par de la glace et une solution de carbonate acide de sodium 0,5M refroidie à l'aide de glace. Après lavage, le précipité est suspendu dans une solution de carbonate acide
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fasse. Le produit est filtré à l'aide d'un filtre de verre, puis lave avec, tout d'abord, une solution de carbonate acide de sodium 0,1m, puis à l'aide d'eau distillée et, enfin, l'aide d'un tampon phosphatique aqueux de chlorure de sodium (0,85%, "à pH 7,0). Le produit réactionnel ainsi lavé'est mis dans un tube de verre de 13 mm de diamètre interne et 15 cm de long, destiné à former la colonne de chromatographie par affinité.
3 ml de la solution d'anticorps (IgG) préparés par le procédé mentionné dans le point 1-1 précité, si ce n'est que l'on n'effectue pas l'étape de liaison avec les cellules de sarcome-180, sont versés dans la colonne, puis une solution aqueuse d'un tampon de phosphate 5 mM de chlorure de sodium (0,85%, à pH 7,0) est versée dans la colonne jusqu'à ce que, 1 .on ne constate plus la présence de protéines dans l'effluent, et on ajoute alors une solution de chlorure de sodium 0,5M et une solution tampon de chlorhydrate de glycine 50 mM dans la colonne aux fins de recueillir la fraction en tant qu'éluat.
L'éluat obtenu est rapidement neutralisé à l'aide de carbonate acide de sodium et le neutralisat est dialysé à nouveau à l'encontre d'une solution aqueuse
de tampon de phosphate de chlorure de sodium (0,85%, à pH 7,0) durant 72h
(le liquide externe étant échangé toutes les 24h).
Le dialysat ainsi obtenu est une solution aqueuse d'un anticorps purifié vis-à-vis du sarcome-180 par chromatographie par affinité sur colonne.
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tumorales.
La cytotoxicité due à l'anticorps antisarcome-180 du lapin obtenu. dans le point 1-3 est examinée par la méthode décrite dans le point 1-2 sur les cellules tumorales et les cellules normales.
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Les résultats du Tableau II montrent la réduction de toxicité des cellules spléniques et l'accentuation de l'activité des cellules de sarcome-?.80 de l'anticorps dues à la purification de l'anticorps par chromatographie par affinité (1). c'est-à-dire montrent l'excellente purification de 1'anticorps par chromatographie par affinité (1).
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points 1-1 et 1-3 mentionnés ci-dessus et purifié par chacune des méthodes de purification mentionnées ci-dessus, est amené à réagir avec chacune dès
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actinomycine D, sarcomycine et chlorhydrate de doxorubicine aux fins de produire chaque substance correspondante.
A titre d'exemple, la réaction de l'anticorps préparé dans le point 1-1 et
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aux fins d'effectuer la réaction pendant la période indiquée dans le Tableau III. ci-avant, puis on stoppe la réaction par addition de 2 ml d'une solution tampon d'acétate de sodium d'acide acétique en solution aqueuse, ayant un pH de 4,70.
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température de 4[deg.]C, durant 72 heures (durant la dialyse, le liquide externe est renouvelé à 3 reprises), le liquide de dialysat interne est condensé et envoyé dans une colonne de 1,5 cm de diamètre et 55 cm de haut, garnie de
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les substances de bas poids moléculaire du mélange réactionnel soient complèrement absorbées dans la colonne; ensuite, l'éluat est séché par lyophilisation à une température de -20[deg.]C aux fins d'obtenir le produit recherché..
La quantité de mitomycine C liée à l'anticorps est déterminée en fonction du temps par spectroscopie de l'absorption ultraviolette.
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L'une des compositions pharmaceutiques est une protéine modifiée d'un poids moléculaire d'environ 150 000, soluble dans l'eau et insoluble dans les solvants organiques, telle que benzène, acétone, méthanol, etc.
Ce composé présente un spectre d'absorption infrarouge ainsi que le montre la Figure 1. Dans un spectre d'absorption ultraviolet des pics d'absorption <EMI ID=61.1>
En opérant selon la méthode précitée, 1'antigène anti-sarcome-180 du lapin
(10 mg) purifié, est amené à réagir avec chacun des composés suivants:
chlorhydrate de doxorubicine, daunorubicine et actinomycine D aux fins d'obtenir les composés liés en un poids d'environ 7 mg. Les quantités de chlorhydrate de doxorubicine liées à 1 mg de protéines anticorps sont de 4,1 microgrammes et de 9,0 microgrammes, respectivement, pour des durées réactionnelles de 10 et 30 mn. Les mêmes résultats sont obtenus lorsque l'on emploi l'anti- corps IgG.
Ensuite, "anticorps anti-sarcome-180 purifié du lapin est amené à réagir
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ci-dessus aux fins d'obtenir un composé ayant pratiquement les mêmes propriétés physicochimiques que celles qui sont décrites ci-dessus.
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mycine D, la sarcomycine et au chlorhydrate de doxorubicine sont préparés par synthèse selon la méthode précitée.
EXEMPLE 2
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cet anticorps.
Les cellules de sarcome-180 de type ascites sont successivement obtenues par culture sur des souris de race ICR et dépourvues de leur activité prolifêratrice par de la mitomycine C; le composé obtenu est injecté par voie intrapéritonéale sur une souris de race ICR une fois par semaine, selon un taux de 107 cellules/animal, durant 4 semaines, et au 7ème jour de la dernière injection, on recueille le sang d'une large veine abdominale de la souris par laparotomie sous anesthésie, et prépare un antisërum à partir du sang à raison
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purification de l'anticorps sont effectuées ainsi qu'il est indiqué dans le point 1-1 de l'Exemple 1 et le procédé est interrompu après absorption
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A 30g de cellules de sarcome-180 du type ascites, séchées par lyophilisation, obtenues par culture sur des souris de race ICR, on ajoute une solution aqueuse
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ayant un pH de 7,4 afin d'extraire l'antigène en 20 heures.
L'extrait est centrifugé durant 10 mn à 65 OOOG; on client ainsi un liquide surnageant auquel on fait subir une centrifugation ultérieure durant 30 mn à
180 OOOG. Le liquide surnageant est recueilli et on dialyse à l'encontre d'eau
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(Durant .la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
La chromatographie par affinité de l'antigène de sarcome-180 ainsi obtenu est effectuée de la façon suivante:
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à une concentration de 1 g/ml, tout en maintenant le pH du mélange à 11,0 durant 8 mn, avant de l'amener en réaction, puis on filtre le mélange réactionnel dans un filtre en verre. Le filtrat séparé est lavé à l'aide d'eau distillée refroidie avec de la glace et d'une solution de carbonate acide de sodium Û,5M refroidie à la glace,' ce lavage étant effectué sur le filtre, puis on met le filtrat en suspension dans une solution de carbonate acide de sodium O,1M et ajoute ia solution d'antigène purifié obtenue ci-dessus à la suspension, tout en agitant durant la durée d'une nuit à température ambiante
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tampon phosphate de chlorure de sodium (0,85M, à pH 7,0).
Le produit lavé est utilisé pour former le garnissage d'un tube de verre de
13 mm de diamètre interne et 15 cm de haut qui est utilisé à titre de colonne de chromatographie par affinité.
3 ml d'antisérum obtenus par le procédé selon la méthode du point 2-1 .précité (impliquant un anticorps) sont injectés dans la colonne de chromatographie par affinité, puis ensuite on y fait passer une solution aqueuse de tampon de phosphate 5 mM de chlorure de sodium (0,85%, à pH 7,0), jusqu'à ce que l'on ne constate plus la présence de protéines dans les effluents, puis on ajoute une solution de chlorure de sodium 0,5M avec une solution de tampon de chlorhydrate de glycine 5 mM (à pH 4,0) aux fins de recueillir la
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(durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
La solution aqueuse de l'anticorps de sarcome-180 purifié par chromatographie par affinité est ainsi obtenue.
<EMI ID=73.1>
mates.
La cytotoxicité due à 1.'anticorps du sarcome-180 de la souris est déterminée par une méthode telle que décrite dans l'Exemple 1.
<EMI ID=74.1>
Ainsi que cela est montré dans ce Tableau IV. l'activité des cellules de sarcome-180 est notablement améliorée par chromatographie par affinité, ainsi qu'il est indiqué ci-après.
<EMI ID=75.1>
<EMI ID=76.1>
<EMI ID=77.1>
stance antitumorale.
Des anticorps anti-sarcome-180 de la souris, obtenus selon la méthode des points 2-1 et 2-2, respectivement, sont liés à la mytomycine C par la méthodedécrite dans le point 1-5 de l'Exemple 1. Les deux substances sont liées par une liaison amido. Par la même méthode, on lie à un anticorps par une liaison
<EMI ID=78.1>
Le cornposé pharmaceutique ainsi obtenu montre pratiquement les mêmes propriétés physicochimiques que le composé correspondant obtenu dans le point 1-5.
<EMI ID=79.1>
1'Exemple 1. et 2-4 de l'Exemple 2. respectivement, sont examinés pour ce qui concerne leur activité antitumorale.
EXEMPLE 3
<EMI ID=80.1>
sarcome-180 de type solide -
Des cellules de sarcome-180 de souris, obtenues par culture sur des sou-
<EMI ID=81.1>
chacun des groupes ICR; ce groupe est formé de 10 animaux, et la transplantation est faite à raison de 1 Il 106 cellules/animal. A partir de 24h après la transplantation, on effectue une injection par voie intrapéritonéale de chacun des agents suivants, tous les deux jours, et au total à 10 reprises, et puis, 5 jours après la dernière injection, toutes les souris sont sacrifiées en vue d'extirper la tumeur. Le poids moyen de la tumeur (T) est comparé à celui (C) de 10 souris auxquelles on a administré une solution saline physiologique aqueuse au lieu de l'agent dans la formule suivante; on obtient le taux d'inhibition de prolifération de la tumeur (sarcome-180) par l'agent:
<EMI ID=82.1>
<EMI ID=83.1>
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
<EMI ID=89.1>
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
<EMI ID=92.1>
<EMI ID=93.1>
<EMI ID=94.1>
Les agents mentionnés ci-avant sont:
(1) anticorps,
(2) médicament antitumoral du commerce,
<EMI ID=95.1>
chacun des médicaments antitumoraux du commerce, et
(4) composition pharmaceutique d'anticorps anti-sarcome-180 de la souris liés
à chacun des médicaments anti-tumoraux du commerce..
<EMI ID=96.1> <EMI ID=97.1> synthèse avec de la doxorubicine, et
- Le Tableau VIII, ci-avant, montre les résultats de l'administration des anticorps.
Ainsi que le montrent les Tableaux V à VII, le taux d'inhibition de la prolifération du sarcome-180 des compositions pharmaceutiques est, dans l'état, actuel, pratiquement le même que celui des agents antitumoraux du commerce lorsqu'on les utilise à des taux de l'ordre de 5 à 10 fois les doses d'agents antitumoraux du commerce. Ce fait montre que l'activité antitumorale de l'anticorps lui-même n'apparaît pratiquement pas et est véritablement naturelle.
La caractéristique de la composition pharmaceutique devient claire lorsque
la quantité administrée des agents antitumoraux du commerce est comparée à
la quantité d'agents antitumoraux du commerce formant l'un des constituants
de la composition pharmaceutique. Cela veut dire que, quoique la quantité
<EMI ID=98.1>
est pratiquement le même dans les deux cas. Le fait mentionné ci-dessus permet de constater que l'anticorps qui est l'un des constituants de la composition pharmaceutique apporte une petite quantité d'agent antitumoral du commerce, qui est également l'un des constituants de la composition pharmaceutique par rapport au site tumoral; c'est ce fait qui est à la base de l'idée de la présente invention.
La composition pharmaceutique présentant la fonction précitée, tout en réduisant la quantité à administrer de l'agent antitumoral du commerce qui a,
<EMI ID=99.1>
la quantité généralement administrée, donne lieu au même taux d'activité inhibitrice de la tumeur.
Il faut noter, en outre, quoique, à l'origine, l'anticorps n'a pas de relation avec le taux d'inhibition de la prolifération des tumeurs, lorsque le composé produit par liaison de l'anticorps, préparé à partir d'un lapin et généralement purifié, une substance antitumorale du commerce, est administré à 10 souris, on constate qu'environ 3 animaux témoignent d'un spasme général et d'un raidissement, un des signes d'un choc anaphylactique, tandis que l'administration de la composition pharmaceutique produite par liaison de l'anticorps purifie par chromatographie par affinité sur la substance antitumorale donne lieu à la constatation d'un choc anaphylactique extrêmement réduit. En fait , le composé préparé: par liaison de
<EMI ID=100.1>
choc anaphylactique, mais lorsque l'anticorps subit une nouvelle purification par chromatographie par affinité, ce choc anaphylactique n'est jamais observé.
EXEMPLE 4
9 4-1 : Préparation d'un anticorps et sa purification par chromatographie
par affinité.
Des cellules du sarcome de Yoshida, obtenues par culture sur des rats
de race Donryu, sont mises en suspension dans une solution saline physiologique et, après addition de mitomycine C (50 microgramme/ml) à la suspension, le mélange est maintenu sous incubation durant 30 mn, à une température de 37[deg.]C, et centrifugé aux fins de.récupérer la solution surnageante.
Les cellules sont lavées à trois reprises à l'aide d'une solution saline physiologique (0,85%). On ajoute alors l'adjuvant complet de Freund (appelé FCA) aux cellules du sarcome de Yoshida, que l'on a dépourvu de toute activité prolifératrice, et le mélange est injecté par voie sous-cutanée dans .la voûte plantaire d'un lapin pesant 2,9 kg, à un taux de 108'cellules/animal.
Deux semaines après la première injection, on effectue une deuxième injection de cellules sur le même lapin, avec la même méthode, aux fins d'immuniser le lapin, puis deux semaines après cette deuxième injection, on effectue encore une injection intraveineuse de ces cellules à ce-lapin. Une semaine après
<EMI ID=101.1>
d'une canule insérée dans l'artère carotide. L'antisérum préparé à partir du sang est purifié de la façon suivante:
A 100 ml d'antisérum, on ajoute une quantité de sulfate d'ammonium correspondant à 20 à 30% en poids de la saturation pour effectuer un relargage.
<EMI ID=102.1>
l'ordre de 4[deg.]C, durant 72 heures (durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
<EMI ID=103.1>
3 reprises avec une solution aqueuse de chlorure de sodium, est mélangée au
<EMI ID=104.1>
du mélange destiné à être absorbé, on procède à une centrifugation et recueille le liquide surnageant. Le procédé d'absorption précité est répété à 4 reprises, le nombre total d'absorptions étant de 5.
L'anticorps ainsi obtenu est appelé anticorps de pré-purification (dénommé couramment IgG).
<EMI ID=105.1>
méthode suivante: Au liquide surnageant ayant subi 5 absorptions, on ajoute une quantité égale de cellules du sarcome de Yoshida, et maintient le mélange au repos durant 30 mn: à une température de l'ordre de 4[deg.]C, pour lier l'anticorps du sarcome de Yoshida aux cellules du sarcome de Yoshida, et le mélange est alors centrifugé aux fins de séparer le liquide surnageant.
On ajoute au précipité une solution tampon de chlorhydrate de glycine, ayant un pH de 3, aux fins de libérer j'anticorps. Le mélange est alors centrifugé pour recueillir le liquide surnageant contenu dans l'anticorps, et le liquide
<EMI ID=106.1>
obtention de la neutralité, et dialysé à l'encontre de PBS durant 24 heures, à une température de 4[deg.]C (le liquide de dialyse externe est échangé toutes les 8 heures).
Le dialysat ainsi obtenu est une solution aqueuse d'immuno-anticorps d'an-
-ti-sarcome de Yoshida du lapin.
<EMI ID=107.1>
normales.
<EMI ID=108.1>
vis-à-vis de cellules en présence d'un complément sérum de cobaye, est déterminée de la façon suivante: La solution aqueuse précitée de l'anticorps,
sa solution diluée 10 fois, sa solution diluée 100 fois et sa solution diluée
1000 fois, sont respectivement mélangées à une suspension de cellules de sarcome de Yoshida ou à' une suspension de cellules spléniques d'un rat de race Donryu normale (deux suspensions utilisent MEM de Eagle en tant que milieu et la concentration des cellules est de 5 x 106 cellules/ml), à un taux de 100 microlitres.
<EMI ID=109.1>
les cellules absorbent l'anticorps. Ensuite, 100 microlitres du sérum de cobaye, dilués à 2 volumes par MEM de Eagle (le sérum dilué est appelé complément), sont ajoutés au mélange précité, et le mélange final est maintenu à incubation durant 30 mn, à une température de l'ordre de 37[deg.]C, puis centrifugé. Le précipité ainsi obtenu est lavé à nouveau à l'aide de MEM de Eagle et, après addition d'une solution de bleu trypane,' la mortalité des cellules dans le précipité lavé et net est observée par voie microscopique
Les résultats des tests sont consignés dans le Tableau IX. ci-après.
<EMI ID=110.1>
++ et +++ (le cas où aucun décès ne s'est produit est indiqué par "-"), on observe que, quoique la toxicité de l'anticorps.pris après purification de
<EMI ID=111.1>
la toxicité du premier vis-à-vis des cellules spléniques du rat de race.Donryu normale est extrêmement faible et n'est pas suffisante pour tuer les rats.
Ce fait indique que la purification de l'antisérum convient aux fins de la présente invention.
Ensuite, des cellules spléniques de rat de race Donryu utilisées à titre représentatif des cellules normales, sont obtenues après extirpation de la rate, broyage fin de la rate avec une paire de ciseaux dans MEM de Eagle, et passage des fragments sur un tamis de 20 mesh, lavage des fragments passés à l'aide de MEM de Eagle, puis mélange avec 30 ml d'une solution de chlorure d'ammonium
<EMI ID=112.1>
pour détruire les érythrocytes dans 1 'échantillon et lavage des fragments à 3 reprises à l'aide de MEM de Eagle.
<EMI ID=113.1>
La purification suivante d'un anticorps est effectuée par chromatographie par affinité sur une colonne comportant un support sur lequel l'antigène . tumoral est lié. Tout d'abord,. l'antigène lui-même est purifié de la façon suivante: Les cellules tumorales du sarcome dé Yoshida, obtenues par culture sur des rats de race Donryu, sont tout d'abord séchées par lyophilisation,
<EMI ID=114.1>
par une solution d'un tampon de phosphate de potassium 5 mM (à pH.7,4), aux fins d'extraire l'antigène durant 20 heures, et le liquide extrait est cen-
<EMI ID=115.1>
centrifuger durant 30 mn à 180 OOOG.- On recueille le liquide surnageant
<EMI ID=116.1>
<EMI ID=117.1>
<EMI ID=118.1>
le liquide externe est échangé toutes les 24.heures)., Le dialysat est alors centrifugé à 65 OOOG pour éliminer le précipité et, après addition de sulfate d'ammonium au liquide surnageant, afin de porter sa concentration à 2M, le
<EMI ID=119.1>
précipité que l'on dissout alors dans de l'eau distillée. La solution ainsi obtenue est dialysée à l'encontre de l'eau distillée durant 72 heures
(durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
A partir de l'antigène du sarcome de Yoshida ainsi obtenu, on prépare la colonne de chromatographie par affinité de la façon suivante:
<EMI ID=120.1>
Pharmacia Japan Co., Ltd), on ajoute 20 ml d'une solution aqueuse de bromocyane à une concentration de 1 g/ml et, tout en maintenant le' pH à 11,0, le mélange est maintenu au repos durant 8 mn afin que les produits réagissent entre eux,
et le mélange réactionnel résultant est alors filtré sur un filtre de verre.
Le précipité restant sur le filtre est lavé à l'aide d'eau distillée refroidie avec de la. glace, puis à l'aide d'une solution de carbonate acide de sodium
0,5M refroidie avec de la glace, et enfin, le précipité est lavé et dispersé
<EMI ID=121.1>
Puis l.a solution aqueuse précitée de l'antigène purifié est ajoutée à la dispersion et pour que les deux constituants réagissent on effectue une agitation
<EMI ID=122.1>
l'aide d'une solution d'un tampon phosphate de chlorure de sodium (0,85%,
à pH 7,0).
Le produit réactionnel ainsi lavé forme le garnissage d'un tube de verre de 13 mm de diamètre et 15 cm de haut qui constitue une colonne pour la chromatographie par affinité. Dans cette colonne, 3 ml de la solution 'd'anticorps (IgG) sont préparés par le procédé du point 4-1 ci-dessus (à l'exception de l'étape de liaison avec les cellules du sarcome de Yoshida) et sont introduits dans le tube, puis on y fait passer une solution dans un tampon phosphate
<EMI ID=123.1>
fraction effluente, que l'on neutralise à l'aide d'un carbonate acide de sodium; le neutralisat est alors dialyse à nouveau à l'encontre d'une solution tampon dans l'acide phosphorique de chlorure de sodium (0,85%, à pH 7,0), durant 72 heures (durant la dialyse, le liquide externe-est échangé toutes les 24 heures). Ensuite, la solution aqueuse de l'anticorps purifié par chromatographie par affinité sur colonne contre un sarcome de Yoshida est obtenue.
<EMI ID=124.1>
normales.
<EMI ID=125.1>
dans le point 4-3 décrit ci-dessus est examinée par la même méthode que dans le point 4-2. Les résultats obtenus sont consignés dans le Tableau X. ci-après..
Les résultats de ce Tableau X montrent que l'activité de l'anticorps vis-à-vis des cellules du sarcome de Yoshida est fortement améliorée; cependant, celle de l'anticorps des cellules spléniques du rat est réduite par purification dans une colonne de chromatographie par affinité et, par ailleurs, la purification par chromatographie par affinité s'est révélée excellente.
<EMI ID=126.1>
<EMI ID=127.1>
à réagir sur l'un des agents antitumoraux du commerce, tels que chlorambucyle, melphalan (moutarde de phényl alanine), ACNU, urasmustine et cyclophosphamide, afin d'obtenir par synthèse chacun des composés liés.
Les exemples ci-dessous sont des exemples obtenus par synthèses:
EXEMPLE DE SYNTHESE 1
<EMI ID=128.1>
A 10 ml d'une solution aqueuse contenant l'anticorps du lapin purifié contre le sarcome de Yoshida obtenu dans le point 4-1 de 1'Exemple 4, à un débit de 10,0 mg/ml, on ajoute 40 mg de chlorambucile et, sous agitation, tout en ajustant le pH de la solution à 4,75 par de l'acide chlorhydrique,
<EMI ID=129.1>
<EMI ID=130.1>
<EMI ID=131.1>
et distillé durant 72 heures à une température de 4[deg.]C (durant la dialyse, le liquide externe est échangé à trois reprises).
<EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1>
Après condensation du liquide de dialyse interne, le condensat est passé sur une colonne de 3 cm de diamètre et 65 cm de haut, garni d'un dérive de dextrine (Sephadex G-200 , fabriqué par Pharmacie Japan Co., Ltd.) pour séparer complètement les substances de poids moléculaire élevé et les substances de poids moléculaire faible contenues dans la solution. L'effluent de la colonne subit une ultracentrifugation durant 60 mn, à 40 OOOG, et le liquide surnageant est séché par lyophilisation à -20[deg.]C, pour conduire à la substance faisant l'objet de la présente invention.
Le contenu en protéines du produit est déterminé par la méthode de Copper-Folin utilisant de l'albumine en tant que témoin, et la quantité liée de l'agent d'alkylation est déterminée par la méthode d'Epstein (Epstein, J. Anal. Chem.,
27, 1423 (1955 . Les résultats montrent que dans la compositions pharmaceutique obtenue, 10 microgrammes de chlorambucile sont liés à 1 mg d'anticorps.
EXEMPLE DE SYNTHESE 2
<EMI ID=134.1>
De la même façon que décrit dans l'Exemple de Synthèse 1, mais en utilisant toutefois la même quantité de melphalan que de chlorambucile et en
<EMI ID=135.1>
purifié du lapin est lié au melphalan aux fins d'obtenir la composition pharmaceutique dans laquelle 10 microgrammes de melphalan sont liés à 1 mg d'anticorps.
EXEMPLE DE SYNTHESE 3
<EMI ID=136.1>
De la même façon que décrit dans l'Exemple de Synthèse 1. mais en utilisant toutefois 40 mg d'uramustine au lieu de chlorambucine, l'anticorps de
<EMI ID=137.1>
Ensuite, on fait réagir de l'acide chloroacétique pour faire réagir l'uramustine et augmenter sa réactivité de la façon suivante:
A 10 ml de méthanol, on ajoute 500 mg d'uramustine et 139 mg de mêthoxyde de potassium de façon à obtenir une dissolution, puis 188 mg d'acide chloro-
<EMI ID=138.1>
la réaction est achevée, le mélange réactionnel est condensé sous pression réduite. Le résidu est recristallisé dans le méthanol et le chloroforme. On obtient ainsi 215 mg (rendement: 35%) de cristaux, ayant la structure du dérivé d'uramustine suivante, qui est confirmée par les analyses:
<EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
l'anticorps du lapin vis-à-vis du sarcome de Yoshida obtenu dans le point 4-1 de l'Exemple 4. de la même façon que dans l'Exemple de Synthèse 1.
On obtient une composition pharmaceutique dans laquelle 10 microgrammes d'uramustine sont liés à 1 mg de l'anticorps.
EXEMPLE DE SYNTHESE 4
<EMI ID=141.1>
Tout d'abord, un dérivé de melphalan est préparé par synthèse, à partir du melphalan de la façon suivante:
Dans 10 ml de diméthylsulfoxyde, 200 mg de sel d'argent de melphalan sont dissouts, et 100 mg d'acide chloroacétique sont ajoutés à la solution que l'on agite alors durant 64h dans une lumière non-directe.
Après élimination du précipité formé dans le mélange réactionnel, on sépare par distillation sous pression réduite, sur un bain d'eau, à une température
<EMI ID=142.1>
Après addition d'eau au résidu et refroidissement du mélange, on constate la formation de cristaux blancs. Les cristaux déposés sont séchés sous pression réduite. Le dérivé ainsi obtenu du melphalan (rendement: 40%) est utilisé dans la réaction avec l'anticorps obtenu dans le point 4-1 de l'Exemple 4, par le même procédé que celui décrit dans l'ExempLe de Synthèse 2; on obtient'ainsi une composition pharmaceutique dans laquelle 16 microgrammes du dérivé de melphalan sont liés à 1 mg de l'anticorps.
EXEMPLE DE SYNTHÈSE 5
L'anticorps de lapin du sarcome de Yoshida, obtenu et purifié dans le
<EMI ID=143.1>
de la même façon que celle qui est décote dans l'Exemple de Synthèse 1,
<EMI ID=144.1>
Synthèse 4) et un dérivé d'uramustine (cf. l'Exemple de Synthèse 3).
La composition pharmaceutique ainsi obtenue par synthèse est pratiquement la même que la composition -pharmaceutique obtenue dans les Exemples de Synthèses ci-dessus.
EXEMPLE 5
<EMI ID=145.1>
Des. cellules de sarcome de Yoshida de type ascites, obtenues par culture sur des rats de race Donryu, sont transplantées durant 4 semaines, à raison d'une fois par semaine, sur la cavité abdominale d'un rat de race Donryu;
7 jours après la quatrième transplantation, on recueille le sang à partir d'une large veine abdominale du rat, soumis à laparatomie sous anesthésie. L'antisérum contenant l'anticorps est préparé à partir du sang; la quantité est de 70 ml pour 100 rats. La préparation de l'anticorps à partir de
<EMI ID=146.1>
décrite dans le point 4-1 de l'Exemple 4; le procédé est cependant stoppé après absorption par des érythrocytes du rat.
<EMI ID=147.1>
Dans 30g de cellules séchées par lyophilisation du sarcome de Yoshida, obtenues par culture sur des rats de race Donryu, on ajoute une solution aqueuse de KC1 3M tamponnée par une solution tampon de phosphate de potassium 5 mM, à pH de 7,4, aux fins d'effectuer l'extraction de l'antigène durant 20h. Le liquide extrait est centrifugé pendant 10 mn à 65 OOOG; on recueille alors le liquide surnageant auquel on fait subir une centrifugation durant 30 mn
à 180 OOOG. Le liquide surnageant alors recueilli est dialysé à une température de 4[deg.]C durant 72 heures à rencontre d'eau distillée (durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
Le procédé de chromatographie par affinité est effectué sur l'antigène
<EMI ID=148.1>
<EMI ID=149.1>
<EMI ID=150.1>
<EMI ID=151.1>
<EMI ID=152.1>
Les troubles dus à l'anticorps du rat du sarcome de Yoshida sont examinés par la même méthode que celle de l'Exemple 4.
Les résultats obtenus sont consignés dans le Tableau XI. ci-avant.
<EMI ID=153.1>
des cellules du sarcome de Yoshida est remarquablement augmentée par chromatographie par affinité ainsi que cela est le cas dans les exemples précédents.
<EMI ID=154.1>
antitumorales.
L'anticorps de rat du sarcome de Yoshida obtenu par le procédé des points 5-1 et 5-2 de l'Exemple 5. est lié respectivement au chlorambucile par une méthode pratiquement similaire à celle qui est décrite dans le point 4-5 de l'Exemple 4. On obtient ainsi des compositions pharmaceutiques ayant une liaison amido entre les deux constituants.
Par application de la même méthode au melphalan, au dérivé de melphalan et au dérivé d'uramustine, respectivement, on obtient des produits ayant une liaison entre l'anticorps et chacune des compositions pharmaceutiques précitées.
Chacune des compositions pharmaceutiques ainsi obtenues montre pratiquement les mêmes propriétés physicochimiques que celles des compositions pharmaceutiques obtenues par le procédé du point 4-5 de l'Exemple 4.
EXEMPLE 6
<EMI ID=155.1>
Des cellules du sarcome de Yoshida, obtenues par culture sur des rats de race Donryu, sont transplantées sur la cavité abdominale de 10 rats de chaque
<EMI ID=156.1>
après la transplantation, chacun des agents suivants est injecté par voie intrapéritonéale sur chacun des rats du groupe, tous les deux jours, durant
20 jours. Après observation du taux de mortalité des rats, le taux d'allongement de la vie de l'agent est obtenu par calcul de la valeur obtenue par division du nombre de jours moyen de survie des rats traités sur un groupe
<EMI ID=157.1>
ambucile et la chlorambucile + l'anticorps (Tableau XII), le melphalan et le melphalan + l'anticorps (Tableau XIII), un dérivé d'uramustine et un dérivé
<EMI ID=158.1>
<EMI ID=159.1>
<EMI ID=160.1>
<EMI ID=161.1>
<EMI ID=162.1>
<EMI ID=163.1>
<EMI ID=164.1>
<EMI ID=165.1>
<EMI ID=166.1>
<EMI ID=167.1>
<EMI ID=168.1>
<EMI ID=169.1>
<EMI ID=170.1>
<EMI ID=171.1>
<EMI ID=172.1>
administrées à des doses de l'ordre de 5 à 10 fois supérieures. Ce fait naturel montre que l'activité inhibitrice vis â vis de la tumeur n'apparaît pas pour l'anticorps aux doses généralement appliquées (cf. le Tableau XVI).
Les caractéristiques de la composition pharmacologique apparaissent clai-
<EMI ID=173.1>
formant le constituant de la composition pharmacolcgique est comparée à la quantité administrée de la. substance antitumorale constituant elle-même l'agent.
<EMI ID=174.1>
antitumorale du commerce sur le site de la tumeur grâce à l'anticorps qui est un autre constituant efficace de la composition pharmacologique; ce fait constitue la réalisation de l'idée de la présente invention.
<EMI ID=175.1>
même taux d'activité inhibitrice vis-à-vis de la tumeur malgré la réduction à 1/10e à 1/20e de la quantité de substance antitumorale du commerce à employer,
<EMI ID=176.1>
ment élevés.
En outre, il faut particulièrement noter que la possible apparition de choc anaphylactique,que l'on constate dans le cas où l'anticorps préparé
à partir de lapins et purifié par la méthode classique est lié à une substance antitumorale du commerce et que la substance liée est administrée aux rats, est bien réduite lorsque l'anticorps est purifié par le procédé de chromatbgraphie d'affinité selon la présente invention.
Une telle réduction de la possibilité de production de chocs anaphylactiques
a été constatée dans le cas de l'anticorps du sarcome-180 dans l'Exemple 3. et les avantages de la méthode de chromatographie par affinité sont encore constatés dans le cas du sarcome de Yoshida.
Dans le cas de l'anticorps préparé à partir de souris, purifiée par chromatographie par affinité, l'administration de la composition pharmacologiqûe produite à partir de l'anticorps ne donne pas lieu à un choc anaphylactique sur des rats.
EXEMPLE 7
Q 7-1 : Préparation et purification d'un anticorps des cellules tumorales.
50 ml de sang sont recueillis sur un patient, de sexe mâle, âgé de 50 ans, souffrant d'un cancer du rectum, et 22 ml d'un antisérum contenant un anticorps sont obtenus à partir du sang.
<EMI ID=177.1>
A la tumeur sèches par:lyophylisation, retirée du patient précité par opération, on ajoute 50 ml d'une solution de chlorure de potassium 3M
<EMI ID=178.1>
<EMI ID=179.1>
Après centrifugation du liquide extrait durant 10 mn à 65 OOOG, le liquide surnageant est recueilli et dialysé à l'encontre d'eau distillée durant 72h, à une température de 4[deg.]C (durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24h). La chromatographie par affinité de l'antigène ainsi obtenu sur la tumeur du patient est effectuée pratiquement de la même façon que
<EMI ID=180.1>
de l' anti sérum contenant l'anticorps obtenu dans le point 7-1 précité du patient, au lieu d'utiliser l'anticorps obtenu d'une souris.
L'anticorps ainsi obtenu est également soluble dans l'eau, mais insoluble dans les solvants organiques tels que méthanol, éthanol, acétone et benzène, et présente un spectre d'absorption ultraviolette et infrarouge donné sur les Figures 2 et 3; son poids moléculaire est d'environ 150 000 et
Rf est de 0 à 0,1 dans le diagramme d'électrophorèse sur disque.
EXEMPLE 8
<EMI ID=181.1>
chromatographie par affinité (3),
La mytomycine C (50 microgramme/ml) est ajoutée aux cellules d'une tumeur.
P-338de type ascites, produites par culture sur des souris DBA/2, suspendues dans une solution saline physiologique et, après incubation du mélange durant
30 mn, à une température de l'ordre de 37[deg.]C, les surnageantes sont éliminées par centrifugation; les cellules sont lavées à 3 reprises à l'aide d'une solution saline physiologique à 0,85%.
On procède à l'inoculation des cellules ainsi traitées de tumeurs P-388 dépourvues d'activité prclifératrice, à des lapins, et on prépare des solutions aqueuses d'anticorps de tumeurs anti-P-388 du lapin par la même méthode que celle qui est décrite dans le-point 1-1 de l'Exemple 1.
<EMI ID=182.1>
normales.
La cytotoxicité due aux anticorps de tumeur P-388 de lapins sur les cellules est examinée en présence de complément (sérum de cobaye) par la méthode déjà décrite dans le point 1-2 de l'Exempte 1.
Les résultats obtenus sont consignés dans le Tableau XVII. ci-après. -
En outre, les cellules spléniques de souris DBA/2 utilisées à titre représentatif des cellules normales, sont traitées par la même méthode que celle qui est décrite dans le point 1-2 de l'Exemple 1.
<EMI ID=183.1>
L'anticorps de tumeur anti-P-388 de souris,purifié : sur une colonne comportant un support sur lequel des tumeurs d'antigène P-388 ont été liées. Le procédé employé est pratiquement celui qui est utilisé dans le point 1-3 de l'Exemple 1. si ce n'est que Ton utilise des cellules de tumeur P-388 produites par culture sur des souris DBA/2 au lieu de cellules de sarcome-180 de type ascites, produites par culture sur des souris ICR.
<EMI ID=184.1>
normales.
La cytotoxicité due à l'immuno-anticorps de tumeur P-388 du lapin est examinée par la même méthode que dans le point 8-2 précité.
Les résultats obtenus sont consignés dans le Tableau XVIII. ci-après.
Les résultats de ce Tableau XVIII montrent que l'activité de l'anticorps des cellules de tumeur P-388 est remarquablement augmentée et que la toxicité de l'anticorps vis-à-vis des cellules spléniques est réduite par purification par chromatographie par affinité, ainsi qu'il a déjà été montré pour les anticorps précités; ceci montre l'action efficace de la purification par
<EMI ID=185.1>
antitumoraux.
Les anticorps anti-P-388 du lapin, préparés par la méthode des points 8-1 et 8-3 et -purifiés par ces méthodes, sont amenés à réagir chacun avec la cytarabine, la méthotrexate et la 5-fluorouracile, aux fins de produire par synthèse des composés ayant une liaison amide entre l'anticorps et
<EMI ID=186.1>
Les exemples qui suivent sont des exemples de telles liaisons.
<EMI ID=187.1>
<EMI ID=188.1>
<EMI ID=189.1>
<EMI ID=190.1>
<EMI ID=191.1>
P-388 du lapin purifiés dans 1 ml, on ajoute 20,0 mg de cytarabine, puis
30 mg de l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide, puis on fait réagir pendant la période indiquée ci-dessous, et ajoute alors 2 ml d'une solution d'un tampon acétate de sodium acide acétique aux fins de stopper
<EMI ID=192.1>
distillée durant 72h, à une température de l'ordre de 4[deg.]C (durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24h).
Après condensation du liquide interne, on le passe sur une colonne de 1,5 cm de diamètre et de 55 cm de hauteur, garnie d'un dérivé de dextrine (Sephadex
<EMI ID=193.1>
stance de faible poids moléculaire,dans le mélange réactionnel.complètement; . 1\effluent est séché par liophylisation à une température de -20[deg.]C pour conduire au produit recherché.
La quantité liée de cytarabine en tant que fonction de la période de réaction présumée par les résultats obtenus séparément dans l'essai de recherche est consignée dans le Tableau XIX, ci-après.
EXEMPLE DE SYNTHESE 7
Dans une solution aqueuse contenant 10 mg d'anticorps de tumeur P-388 du lapin, préparés et purifiés selon la méthode du point 8-1 de l'Exempte 8 dans 1 ml, on ajoute 6,0 mg de méthotrexate et, tout en ajustant le pH de la solution à 4,75 par addition d'acide chlorhydrique, sous agitation, on
<EMI ID=194.1>
imide pendant une période de réaction indiquée ci-dessous. La réaction est alors arrêtée par addition de 2 ml d'une solution d'un tampon acétate de sodium acide acétique. Le mélange réactionnel subit une dialyse à l'encontre
<EMI ID=195.1>
(durant la dialyse, le liquide externe est échangé toutes les 24 heures).
Le liquide interne de la dialyse est traité selon la méthode de l'Exemple de Synthèse 6 précité, aux fins d'obtenir la composition pharmacologique -recherche.
La quantité de mëthotrexate liée est indiquée dans le Tableau XX. également ci-après, en tant que fonction de la période réactionnelle.
<EMI ID=196.1>
<EMI ID=197.1>
<EMI ID=198.1>
<EMI ID=199.1>
EXEMPLE DE SYNTHESE 8
<EMI ID=200.1>
une réaction semblable à celle qui est décrite dans l'Exemple de Synthèse 7, dans laquelle cependant le produit obtenu ne contenait.aucun 5-fluorouracile. Après introduction d'un groupe carboxyle sur le 5-fluorouracile par le procédé suivant, la réaction de liaison est effectuée selon la même méthode que celle décrite dans le point 8-1 de l'Exemple 8.
<EMI ID=201.1>
Le 5-fluorouracile carboxylé est préparé par synthèse de la façon suivante:
A 10 ml de m'éthanol, on ajoute 500 mg de 5-fluorouracile et 86 mg d'hydroxyde de potassium,et 3 ml d'eau distillée sont alors ajoutés.
Au liquide transparent ainsi formé, on ajoute, en une fois, 145 mg d'acide chlorhydrique, puis agite le mélange durant 60 heures à température ambiante. Une fois la réaction achevée, le mélange réactionnel est condensé sous pression réduite et le résidu est recristallisé dans l'éthanol et le chloroforme;
<EMI ID=202.1>
<EMI ID=203.1>
rouge et analyse élémentaire
<EMI ID=204.1>
EXEMPLE DE SYNTHESE 9
<EMI ID=205.1>
méthode du point 8-3 de l'Exemple 8 est amené à réagir avec chacun des composés suivants: cytarabine, 8-azaguar,ine, méthothrexate, aminoputérine
<EMI ID=206.1>
similaires aux compositions pharmacologiques obtenues dans les Exemptes de Synthèses 6 à 8.
EXEMPLE 9
<EMI ID=207.1>
Les cellules de tumeur P-388 de type ascites, obtenues par culture sur des souris de race DSA/2 et dépourvues de toute activité prolifératrice par la mitomycine C sont inoculées par voie intrapéritonéale sur des souris de race DBA/2 une fois par semaine, selon un taux de 106 cellules/animal;
7 jours après la quatrième inoculation, le sang est recueilli par une large veine abdominale par laparatomie sous anesthésie, et le sérum contenant l'anticorps est préparé à partir du sang. La quantité totale . d'antisérum est de 53 ml pour 100 souris. La préparation et la purification d'anticorps à partir d'antisérum sont effectuées selon la même méthode que celle qui est décrite dans le point 8-1 de 1 1 Exemple 8.
<EMI ID=208.1>
Les cellules séchées par lyophilisation de tumeur P-388 de type ascites, sont traitées selon la même méthode que celle des cellules du sarcome de Yoshida décrite dans le point 4-3 de l'Exemple 4, en omettant cependant le relargage par le sulfate d'ammonium et la centrifugation ultérieure. Ensuite, une solution aqueuse d'anticorps de tumeur P-388 de type ascites purifié par chromatographie par affinité est obtenue.
<EMI ID=209.1>
normales.
Des troubles provoqués sur les souris par les anticorps de tumeur P-388 de type ascites, obtenus par la méthode décrite dans le point 9-2 précité, sont examinés par la même méthode que celle qui est décrite dans l'Exemple 1.
<EMI ID=210.1>
<EMI ID=211.1>
<EMI ID=212.1>
Comme le montre le Tableau XXI.. ci-avant, l'activité de l'anticorps des cellules de tumeur P-388 est remarquablement augmentée grâce à la méthode de traitement par chromatographie par affinité, ainsi que cela est le cas dans les Exemples précédents.
<EMI ID=213.1>
Les anticorps de tumeur P-388 de souris, obtenus par le procédé des méthodes des points 9-1 et 9-2 de l'Exemple 9. sont respectivement liés à chacun des antimétabolites suivants, à savoir, cytarabine, méthotrexate, aminoputêrine de sodium, 8-azaguanine et 5-fluorouracile par la même méthode que celle qui est décrite dans le point 8-5 de l'Exemple 8, aux fins d'obtenir les compositions pharmacologiques dans lesquelles l'anticorps est lié
<EMI ID=214.1>
présentent pratiquement les mêmes propriétés physiochimiques que celles des compositions pharmacologiques correspondantes obtenues en opérant selon la méthode du point 8-5 de l'Exemple 5.
EXEMPLE 10
<EMI ID=215.1>
tumeur P-388 -
Des cellules de cellules de tumeur P-388, obtenues par culture sur des souris de race DBA/2 sont transplantées sur la cavité abdominale de 10 souris
<EMI ID=216.1>
24h après transplantation, une solution aqueuse de chacun des agents antitumoraux est administrée par voie intrapéritonéale aux souris une fois par jour durant 5 jours, et on observe ensuite le taux de mortalité des souris par détermination du nombre de jours moyen de survie des groupes de souris
<EMI ID=217.1>
<EMI ID=218.1>
Les résultats sont consignés dans les Tableaux XXII à XXVI, ci-après,
le Tableau XXVI montrant les résultats obtenus lorsqu'on administre uniquement l'anticorps.
<EMI ID=219.1>
<EMI ID=220.1>
<EMI ID=221.1>
<EMI ID=222.1>
<EMI ID=223.1>
<EMI ID=224.1>
<EMI ID=225.1>
<EMI ID=226.1>
<EMI ID=227.1>
<EMI ID=228.1>
<EMI ID=229.1>
Les agents antitumoraux utilisés dans cet exemple sont:
<EMI ID=230.1>
aminoputérine de sodium et dérivé de 5-fluorouracile.
(2) Composition pharmacologique de l'anticorps du lapin non-purifié
obtenu par chromatographie par affinité, liée à l'un des agents antitumoraux antimétaboliques précités.
(3) Composition pharmacologique d'anticorps purifié par chromatographie
<EMI ID=231.1>
précités.
(4) .Composition pharmacologique d'anticorps de souris non-purifié par
<EMI ID=232.1>
antimétaboliques précités, et
(5) Composition pharmacologique d'anticorps purifié par chromatographie
par affinité (1), liée à l'un des agents antitumoraux antimétaboliques précités.
La caractéristique essentielle des compositions pharmacologiques n'apparaît pas tout d'abord lorsque la quantité administrée de l'agent antitumoral du commerce lui-même est comparée à la quantité administrée du même agent antitumoral en tant que constituant de la composition pharmacologique. En fait, malgré que.ce dernier ne forme que de 1/10e ou 1/20e du précédent,
la durée d'allongement de la vie conférée par ce dernier est presque égale à celle du premier, Ce fait résulte du phénomène que l'anticorps transfère d'une façon favorable l'agent antitumoral du commerce au site de la tumeur sur le corps animal et constitue la confirmation de l'idée de la présente invention. Les compositions pharmacologiques dues aux fonctions précitées présentent une activité anti tumorale du même degré que l'agent anti tumoral
du commerce, qui eux présentent des effets secondaires extrêmement élevés et qui conduisent à la réduction de leur emploi de 1/10e à 1/20e.
En. outre, il faut notamment remarquer que, dans le cas où l'anticorps. préparé à partir du lapin est lié à chacun des agents antitumoraux et
<EMI ID=233.1>
raidissements n'apparaissent que sur 3 souris sur 10, alors que la composition pharmacologique produite par liaison de l'agent antitumoral avec l'anticorps préparé à partir du lapin et purifiée par chromatographie
par affinité, ne donne pratiquement pas lieu à ce choc.
La composition pharmacologique produite par liaison de l'anticorps préparé à partir de souris et purifié par chromatographie par affinité avec le même agent antitumoral du commerce ne donne jamais lieu a des chocs anaphylactiques.
Ces constatations ont été consignées déjà dans les Exemples 3 et 6. et ceci est la raison pour laquelle l'efficacité de la chromatographie par affinité pour éliminer les causes de tels chocs anaphylactiques est d'un grand intérêt.
Bien entendu, la présente invention n'est nullement 1 imitée aux exemples
<EMI ID=234.1>
envisagées et sans que l'an ne s'écarte de l'esprit de l'invention.
REVENDICATIONS
1.- Composition pharmacologique ayant une activité antitumorale sans donner lieu à des effets secondaires de type pyrexie ou anaphylaxie, qui consiste en une substance antitumorale ayant au moins un groupe amino ou
<EMI ID=235.1>
par chromatographie par affinité.
PHARMACEUTICAL COMPOSITION HAVING ANTI-TUMOR ACTIVITY
The present invention relates to a pharmaceutical composition formed by an amide bond between an extremely pure antibody to
<EMI ID = 1.1>
The present invention relates more particularly to a pharmaceutical composition which does not cause any side effect, such as pyrexia and anaphylactic shock when administered.
The present invention also relates to an extremely pure antibody to tumor antigens, which can be used for the preparation of the abovementioned pharmaceutical compositions.
Until very recently, different types of pharmaceutical compositions
<EMI ID = 2.1>
tinals. So, for the moment, their use is relatively restricted.
More recently, the use of a substance obtained by chemical bonding of an antibody to tumor antigens (which is referred to herein as anti-tumor antibodies) with an anti-tumor substance such as an anti-tumor agent has been attempted. However, as the anti-tumor antibodies used for the preparation of this substance are not sufficiently pure
<EMI ID = 3.1>
rer as pure anti-tumor antibodies. Also, in the case where a substance obtained by binding of an anti-tumor antibody with an anti-tumor substance is administered as an anti-tumor agent, the appearance of pyrexia and
<EMI ID = 4.1>
aforementioned tumor is inevitable.
The inventors have taken into account the aforementioned drawbacks and have sought to eliminate the side effects resulting from the use of anti-tumor antibodies and their research has shown that an extremely pure anti-tumor antibody is obtained by purification of the immunoglobulin fraction of l antiserum by an affinity chromatography technique, and that a pharmaceutical composition obtained by binding of the purified antibody
<EMI ID = 5.1>
xyl or an amino group, does not give rise to the abovementioned side effects.
The present invention therefore relates to a pharmaceutical composition having a low cytotoxicity and moreover exhibiting excellent anti-tumor activity. It also relates to an anti-tumor antibody having a high purity, and relates to the method of preparation of this anti-tumor antibody.
Other objects and advantages of the present invention will appear on reading the following description and the appended figures, given by way of illustration but not limitation.
Figure 1 shows an infrared absorption spectrum of a composition obtained by binding of an antisarcoma-180 antibody purified from a <EMI ID = 6.1> Figure 2 shows an infrared absorption spectrum of a purified antibody resulting from purification by affinity chromatography of an antiserum from a male patient with rectal cancer. Figure 3 shows an ultraviolet absorption spectrum of the above purified antibody. Figure 4 shows an infrared absorption spectrum of a composition obtained by binding of a purified anti-sarcoma-180 antibody from a mouse to doxorubicin hydrochloride, in accordance with the present invention. Figure 5 shows an infrared absorption spectrum of a composition obtained by binding of a purified anti-sarcoma-180 antibody of a rat to chlorambucil, in accordance with the present invention.
Figure 6 shows an infrared absorption spectrum of a composition obtained by binding of a purified anti-sarcoma-180 antibody from a rat to uramustine, in accordance with the present invention. Figure 7 shows an infrared absorption spectrum of a composition obtained by binding of a purified anti-sarcoma-180 antibody from a rabbit to cytarabine, in accordance with the present invention. Figure 8 shows an infrared absorption spectrum of a composition obtained by binding of a purified anti-sarcoma-180 antibody from a mouse <EMI ID = 7.1>
The main characteristic of the present invention resides in that the pharmaceutical composition obtained by binding of a purified antitumor antibody, obtained by purification by affinity chromatography of an antitumor substance having at least one amino carboxyl group, can be used as active constituent of the pharmaceutical composition according to the present invention.
The anti-tumor antibody in accordance with the present invention is obtained by
<EMI ID = 8.1>
Sarcoma-180 type dying, Sato lung cancer, L-1210 leukemia, P-388 leukemia, Ehrlich cancer, Yoshida sarcoma, acute lymphatic leukemia, spinal cord tumor, or other human cancers, by a chromatographic technique by affinity.
The preparation of the antibody to the above-mentioned tumor antigens itself can be carried out by the methods described in "Proceedings of theVIthAnnual Meeting of Japan Society of Immunology", page 198 (1975), or by
<EMI ID = 9.1>
In the first method, complete Freund's adjuvant is used, and tumor cells are injected subcutaneously into experimental animals to immunize them, and the antibody is obtained from the immunized animals. In the second method, a tumor antigen is injected intraperitoneally 3 or 4 times into an animal for the purpose of immunizing it, and the antibody is obtained from the immunized animal.
Furthermore, both the alloantibodies and the genoantibodies can be used in accordance with the present invention; however, the use of the alloantibody is preferable.
So far, for the purpose of purifying an antibody, the method has consisted
<EMI ID = 10.1>
ion exchange chromatography with a DEAE cellulose column, so as to obtain the immunoglobulin G fraction of an antiserum.
According to the present invention, a specific purification procedure is implemented by using the affinity chromatography method in order to selectively obtain only the antibody specific for
<EMI ID = 11.1>
their separation.
The affinity chromatography used in the present invention comprises:
<EMI ID = 12.1>
tumors, are linked by a covalent bond to a support such as a gel
/ <EMI ID = 13.1>
from a column using the support, an antibody solution is passed through the column so that the antibody is bound to the antigen and, finally, a sufficient quantity of the solvent is passed through the column for the purposes to wash it of any trace of unbound antibody, then a buffer solution is passed thereto at a lower pH in order to undo any bond between the antibody and the antigen and to elute the antibody which separates;
(2) a method in which, without the use of a column, the antibody
is brought to a link with the antigen by mixing the support to which. the antigen is bound, as described above and with a solution of the antibody, then, after washing the support particles in order to remove the unbound antibodies, the antibody is dissolved; and
<EMI ID = 14.1>
instead of using the support to which the antigen is bound.
Thus, the purified antibody obtained according to the present invention by the affinity chromatography method is an anti-tumor immunoglobulin having a purity greater than that of the immunoglobulin fractions obtained
<EMI ID = 15.1>
The anti-tumor substances which are caused to be linked by an amido bond with the purified anti-tumor antibodies obtained as described above, consist of the antibiotic substances, such as mytocin C, doxorubicin hydrochloride, bleomycin, daunorubicin, actinomycin D and sarcomycin. Antimetabolite substances such as cytarabine, 8-azaguanine, 5-fluorouracil, methotrexate and sodium aminopterin,
<EMI ID = 16.1>
and although they are designated by their common name, their structures are well known and are described in particular in the following articles:
<EMI ID = 17.1>
Ed. By Y. Ueno et al.
The aforementioned anti-tumor substances are linked to the aforementioned anti-tumor antibodies by binding of the amino group or the carboxyl group of the substance with either the carboxyl group or the amino group of the antibody, by reacting the substance with the antibody. in mild conditions.
<EMI ID = 18.1>
amino- or carboxyl groups is preferably used by implementation. in reaction of the antitumor substance itself, or its sodium, potassium or silver salt, with a compound having the general formula:
<EMI ID = 19.1>
<EMI ID = 20.1>
10 and 40 [deg.] C, for 10 min to 72 hours.
By recrystallization of the reaction product thus obtained, in a solvent such as water, alcohol, chloroform and dioxane, a derivative of the anti-tumor substance to which one or more amino or carboxyl groups can be attached
<EMI ID = 21.1>
chloroacetic acid.
The binding of the purified anti-tumor antibody and the anti-tumor substance comprising at least one amino or carboxyl group is carried out by dissolving the two reagents in a water-soluble solvent and addition of carbodiimide acting as catalyst, the reaction taking place at a temperature between 0 and 50 [deg.] C, preferably 10 and 40 [deg.] C, during
10 min to 8 hours, preferably 30 min to 5 hours, the reaction then being stopped by adding a buffer solution, such as a solution of sodium acetate and acetic acid.
Then to remove the unreacted antitumor substance
the catalyst and the constituents of the buffer solution and the salts of the reaction mixture, the reaction mixture is subjected to a treatment of dialysis, gel filtration, ultrafiltration or more of these treatments.
The carbodiimide used in the above reaction as a catalyst
can be any of the products consisting of:
<EMI ID = 22.1>
In the pharmaceutical composition obtained by the above reaction, the antibody and the antitumor substance are linked by an amide bond;
the antibody / antitumor substance molecular ratio is of the order of
1/2 to 5/1 in the case where the anti-tumor substance is of antibiotic origin and from 1/1 to 10/1 in the case where it is of antimetabolic or alkylating origin.
Below are explanations of the toxicological nature, the pharmacological action and the preparation of the binding substances, the pharmaceutical composition of the compound according to the present invention having
an amide bond between the anti-tumor antibody and the anti-tumor substance.
Acute toxicity is determined by intravenous administration of
300 mg of a pharmaceutical composition per kg of a mouse as an animal test. Since no death is observed in the group of mice treated one week after treatment, it can be deduced therefrom that the pharmacological composition can be used as a medicament.
The pharmacological composition, as shown in the Examples which follow, is effective with regard to a large number of cancers, such as acute leukemia, malignant lymphoma, carcinoma, sarcoma, malignant ciliated epithelioma, acute myelogenic leukemia, melanoma, acute lymphatic leukemia, myeloma, etc.
For the preparation of pharmacological compounds for use as antitumor drugs and methods of their administration, the methods generally used can be employed.
Thus, these drugs can be administered orally, by injection or rectally, and their forms of administration can be any,
<EMI ID = 23.1>
administration by injection is preferably carried out.
For the preparation of a solution intended for injection, water-soluble solvents such as solutions of physiological saline, sterile water
<EMI ID = 24.1>
isotonic agents, analgesic agents, stabilizing agents, antiseptic agents, suspending agents, buffering agents, agents. emulsifiers, etc. can be used if necessary.
Thus, for example 10 mg of the pharmaceutical composition, and 50 mg of mannitol are dissolved in distilled water, 10 ml of an aqueous solution are obtained, and after sterilization of the solution by a conventional method,
the sterilized solution is introduced into an injection device, or it is directly dried by lyophilization and, before injection, is diluted with an aqueous solution of physiological saline.
<EMI ID = 25.1>
Although the amount of pharmaceutical composition administered depends on the state of the disease, it is generally in the range of 0.11 to 9 g per day
<EMI ID = 26.1>
Furthermore, in accordance with the present invention, as the antitumor and tumortropic activity of the antibody and the antitumor activity of the antitumor substance which is bound to the antibody are retained in the composition.
<EMI ID = 27.1>
when administered; they arrived: at the target sites of the tumor, giving rise to effective anti-tumor activity.
Also, when considering the pharmaceutical composition as a base, the administration of the pharmaceutical composition containing an amount
<EMI ID = 28.1>
of the same antitumor substance gives rise to the same rate of inhibition as regards the proliferation of the tumor as the administration of the tumor substance itself, and the rate of side effects due to the antitumor substance contained in the pharmaceutical composition. as long as
<EMI ID = 29.1>
ration comprising this anti-tumor substance. These effects can be considered to give rise to a synergistic action with favorable properties of the two constituents of the pharmacological composition.
The invention will moreover be better understood on reading the description of the following examples, and in particular the results of the pharmacological tests of the anti-tumor agent according to the present invention, given by way of illustration but not limitation.
EXAMPLE 1
<EMI ID = 30.1>
affinity chromatography method (3).
After culturing ascites-type sarcoma-180 cells, obtained from
<EMI ID = 31.1>
C at a concentration of 50 micrograms / ml for 30 min, at a temperature of the order of 37 [deg.] C, the supernatant is removed by centrifugation, and the proliferating cells are washed three times with water. using a solution
<EMI ID = 32.1>
The complete Freund's adjuvant (called FCA) is added to the thus treated sarcoma-180 cells from which the proliferative activity has been removed, 'and the angel is injected subcutaneously into' the arch of a
<EMI ID = 33.1>
The rabbit is immunized by repeated injection of the cells 2 weeks after the first injection, then the same number of cells is injected intravenously into the same rabbit.
One week after the last injection, all of the rabbit's blood is collected by a cannula inserted into the carotid artery and an antiserum is prepared from this blood, which is then purified as follows:
The released fraction, formed by addition of ammonium sulfate, in
<EMI ID = 34.1>
10 mM aqueous (called in this PBS), at a pH of 7.0, for 72 hours.
at a temperature of the order of 4 [deg.] C. (During this treatment, the external dialysis fluid was changed every 24 hours).
An equal quantity of blood cells from a normal ICR mouse, washed 3 times with an aqueous solution of sodium chloride is mixed with the desalted solution, and the mixture is kept at rest, for 30 min,
<EMI ID = 35.1>
centrifugation to obtain a supernatant.
The above process is repeated 4 times, the total number of absorptions being 5. The antibody thus obtained is called the pre-purification antibody (in general "IgG").
Then, the purification is continued according to known methods:
To the supernatant solution subjected to absorption, the same quantity of sarcoma-180 cells is added, then the mixture is brought to rest for
30 min, at a temperature of 4 [deg.] C, so that the sarcoma-180 antibody is bound to the sarcoma-180 cells, and the supernatant solution is removed by centrifugation. An aqueous solution of a glycine hydrochloride buffer, pH 3.0, is added to the precipitate to release the antibody. The mixture is centrifuged in order to collect the supernatant solution containing the antibody. After adjusting the pH of the supernatant solution close to its point of neutrality by adding an aqueous solution of hydroxide
<EMI ID = 36.1>
PBS, at a temperature of the order of 4 [deg.] C, for 24 hours (the external dialysis liquid being exchanged every 8 hours).
The dialysis solution thus obtained is an aqueous solution containing the rabbit anti-sarcoma 180 antibody.
<EMI ID = 37.1>
tumor.
The modifications due to the rabbit anti-sarcoma-180 antibodies obtained as described above with respect to the cells are determined in the presence of a complement (guinea pig serum) in the following manner:
Each 100 ml of the aqueous solution of the abovementioned antibody and of the three solutions of the antibody diluted 10 times; 100 times and 1000 times, respectively, are mixed with 100 microliters of the aqueous suspension of
<EMI ID = 38.1>
15 min at room temperature. Then, an aliquot of 100 microliters of a serum diluted 2 times of guinea pig in the minimum essential medium of Eagle
(called MEM below) (the diluted serum being considered as a supplement) is added to each of the aforementioned mixtures, and the final mixtures are kept in the incubation for 30 min, at a temperature of the order of 37 [deg .]VS. After incubation, the incubated medium undergoes centrifugation in order to collect the cell particles and, after washing these particles,
again using MEM, an aqueous solution of blue-trypan is added
to these particles and they are examined under a microscope to determine
the cell death rate.
The results obtained are recorded in TabLeau I. below. -
<EMI ID = 39.1>
<EMI ID = 40.1>
and it is very easily observed that, although the antibody taken up after purification of the antiserum by the aforementioned method, has a toxicity with respect to sarcoma-180 cells relatively little different from the toxicity of the antibody taken up by purification of the 'antiserum, the toxicity of the first vis-a-vis the spleen cells of the normal mice is sufficiently weak so that these are not killed.
<EMI ID = 41.1>
the present invention.
<EMI ID = 42.1>
<EMI ID = 43.1>
It should be noted that the spleen cells of normal ICR mice. used as a representative of the normal cells are obtained firstly, after extirpation of the spleen, mincing of the spleen with a pair of knives in MEM of Eagle so that it passes into ur. 200 mesh stainless steel mesh, wash the filtrate once using MEM, add
3 ml of a 0.75% ammonium chloride solution buffered with tris- (hy-
<EMI ID = 44.1>
As in method (3) of affinity chromatography used in
point 1-1 above, problems have occurred in the separation of pure antibodies which show that the divergence is still recognized on spleen cells of mice, the above method of purification of the antibody is carried out on a column in which the tumor antigen is linked. First of all, the purification is carried out on the antigen itself.
Ascitess-type sarcoma-180 tumor cells which have been obtained on mousetraps are dried by lyophilization and, after addition of a 5 mM potassium phosphate buffer solution, having a pH of 7.4, the antigen is extracted. cells for 20 hours.
A supernatant solution is thus obtained after centrifugation of the mixture for 10 min at 65 OOOG. The supernatant solution is again centrifuged for 30 min at 180 OOOG and the supernatant thus obtained is dialyzed against distilled water, for 70 hours, at a temperature of the order of 4 [deg.] C. (during dialysis, the external fluid is exchanged every '24 hours). The dialysate is again centrifuged at 65 OOOG to remove the precipitate and, after addition of ammonium sulfate in the supernatant solution thus obtained so that the concentration reaches 2M, the solution is centrifuged for 10 min
<EMI ID = 45.1>
<EMI ID = 46.1>
distilled for 72 hours (during dialysis, the external liquid is exchanged every 24 hours).
The sarcoma-180 antigen thus obtained is used for the preparation of
<EMI ID = 47.1>
Ltd), which has been allowed to swell in water until it reaches 20 ml, the same volume of an aqueous bromocyane solution at 1 g / ml is added and, after reaction for 8 min, while maintaining the pH of the reaction mixture at 11.0,
the mixture is filtered in a glass filter; the precipitate is collected which is washed on the filter with the aid of distilled water cooled by ice and a 0.5M sodium carbonate solution cooled with the aid of ice. After washing, the precipitate is suspended in an acid carbonate solution
<EMI ID = 48.1>
do. The product is filtered using a glass filter, then washed with, first of all, a 0.1 m sodium carbonate solution, then with distilled water and, finally, the using an aqueous phosphate buffer of sodium chloride (0.85%, "at pH 7.0). The reaction product thus washed is put in a glass tube of 13 mm internal diameter and 15 cm long, intended to form the affinity chromatography column.
3 ml of the antibody solution (IgG) prepared by the method mentioned in point 1-1 above, except that the step of binding with the sarcoma-180 cells is not carried out, are poured into the column, then an aqueous solution of a 5 mM phosphate buffer of sodium chloride (0.85%, at pH 7.0) is poured into the column until 1. plus the presence of proteins in the effluent, and then a 0.5M sodium chloride solution and a 50 mM glycine hydrochloride buffer solution are added to the column in order to collect the fraction as eluate.
The eluate obtained is quickly neutralized using sodium hydrogen carbonate and the neutralizer is dialyzed again against an aqueous solution.
sodium chloride phosphate buffer (0.85%, pH 7.0) for 72 hours
(the external liquid being exchanged every 24 hours).
The dialysate thus obtained is an aqueous solution of an antibody purified against sarcoma-180 by column affinity chromatography.
<EMI ID = 49.1>
tumor.
Cytotoxicity due to the rabbit anti-180 antibody obtained. in point 1-3 is examined by the method described in point 1-2 on tumor cells and normal cells.
<EMI ID = 50.1>
The results of Table II show the reduction in toxicity of the spleen cells and the enhancement of the activity of the sarcoma cells - ?? 80 of the antibody due to the purification of the antibody by affinity chromatography (1). that is, show the excellent purification of the antibody by affinity chromatography (1).
<EMI ID = 51.1>
<EMI ID = 52.1>
<EMI ID = 53.1>
<EMI ID = 54.1>
<EMI ID = 55.1>
points 1-1 and 1-3 mentioned above and purified by each of the purification methods mentioned above, is brought to react with each one from
<EMI ID = 56.1>
actinomycin D, sarcomycin and doxorubicin hydrochloride for the purpose of producing each corresponding substance.
As an example, the reaction of the antibody prepared in point 1-1 and
<EMI ID = 57.1>
for the purpose of carrying out the reaction during the period indicated in Table III. above, then the reaction is stopped by adding 2 ml of a sodium acetate buffer solution of acetic acid in aqueous solution, having a pH of 4.70.
<EMI ID = 58.1>
temperature of 4 [deg.] C, for 72 hours (during dialysis, the external liquid is renewed 3 times), the internal dialysate liquid is condensed and sent in a column 1.5 cm in diameter and 55 cm in high, topped with
<EMI ID = 59.1>
the low molecular weight substances of the reaction mixture are completely absorbed in the column; then the eluate is dried by lyophilization at a temperature of -20 [deg.] C in order to obtain the desired product.
The amount of mitomycin C bound to the antibody is determined as a function of time by ultraviolet absorption spectroscopy.
<EMI ID = 60.1>
One of the pharmaceutical compositions is a modified protein with a molecular weight of approximately 150,000, soluble in water and insoluble in organic solvents, such as benzene, acetone, methanol, etc.
This compound has an infrared absorption spectrum as shown in Figure 1. In an ultraviolet absorption spectrum of the absorption peaks <EMI ID = 61.1>
By operating according to the above method, the rabbit anti-sarcoma-180 antigen
(10 mg) purified, is reacted with each of the following compounds:
doxorubicin hydrochloride, daunorubicin and actinomycin D for the purpose of obtaining the bound compounds in a weight of about 7 mg. The amounts of doxorubicin hydrochloride linked to 1 mg of antibody proteins are 4.1 micrograms and 9.0 micrograms, respectively, for reaction times of 10 and 30 min. The same results are obtained when the IgG antibody is used.
Then "purified rabbit anti-sarcoma-180 antibody is reacted
<EMI ID = 62.1>
above for the purpose of obtaining a compound having substantially the same physicochemical properties as those described above.
<EMI ID = 63.1>
mycine D, sarcomycin and doxorubicin hydrochloride are prepared by synthesis according to the above method.
EXAMPLE 2
<EMI ID = 64.1>
this antibody.
The sarcoma-180 cells of the ascites type are successively obtained by culture on mice of the ICR race and devoid of their proliferative activity by mitomycin C; the compound obtained is injected intraperitoneally into an ICR breed mouse once a week, at a rate of 107 cells / animal, for 4 weeks, and on the 7th day of the last injection, the blood is collected from a large vein abdominal mouse by laparotomy under anesthesia, and prepares an antiserum from the blood
<EMI ID = 65.1>
purification of the antibody are carried out as indicated in point 1-1 of Example 1 and the process is stopped after absorption
<EMI ID = 66.1>
<EMI ID = 67.1>
An aqueous solution is added to 30 g of sarcoma-180 cells of the ascites type, dried by lyophilization, obtained by culture on mice of ICR breed.
<EMI ID = 68.1>
having a pH of 7.4 in order to extract the antigen in 20 hours.
The extract is centrifuged for 10 min at 65 OOOG; this gives a supernatant liquid to which it is subjected to a subsequent centrifugation for 30 min at
180 OOOG. The supernatant is collected and dialyzed against water
<EMI ID = 69.1>
(During dialysis, the external liquid is exchanged every 24 hours).
The affinity chromatography of the sarcoma-180 antigen thus obtained is carried out as follows:
<EMI ID = 70.1>
at a concentration of 1 g / ml, while maintaining the pH of the mixture at 11.0 for 8 min, before bringing it into reaction, then the reaction mixture is filtered in a glass filter. The separated filtrate is washed with distilled water cooled with ice and an ice-cooled solution of sodium hydrogen carbonate 0.5 M, this washing being carried out on the filter, then the filtrate is placed suspended in a 0.1M sodium hydrogen carbonate solution and added the purified antigen solution obtained above to the suspension, while stirring overnight during room temperature
<EMI ID = 71.1>
sodium chloride phosphate buffer (0.85M, pH 7.0).
The washed product is used to form the lining of a glass tube of
13 mm internal diameter and 15 cm high which is used as an affinity chromatography column.
3 ml of antiserum obtained by the method according to the method of point 2-1 above mentioned (involving an antibody) are injected into the affinity chromatography column, then thereafter an aqueous solution of phosphate buffer 5 mM of sodium chloride (0.85%, pH 7.0), until no more protein is present in the effluents, then a 0.5M sodium chloride solution is added with a solution 5 mM glycine hydrochloride buffer (pH 4.0) to collect the
<EMI ID = 72.1>
(during dialysis, the external fluid is changed every 24 hours).
The aqueous solution of the sarcoma-180 antibody purified by affinity chromatography is thus obtained.
<EMI ID = 73.1>
mates.
The cytotoxicity due to the mouse sarcoma-180 antibody is determined by a method as described in Example 1.
<EMI ID = 74.1>
As shown in this Table IV. the activity of sarcoma-180 cells is markedly improved by affinity chromatography, as indicated below.
<EMI ID = 75.1>
<EMI ID = 76.1>
<EMI ID = 77.1>
antitumor stance.
Anti-sarcoma-180 antibodies of the mouse, obtained according to the method of points 2-1 and 2-2, respectively, are linked to mytomycin C by the method described in point 1-5 of Example 1. The two substances are linked by an amido bond. By the same method, we bind to an antibody by a bond
<EMI ID = 78.1>
The pharmaceutical compound thus obtained shows practically the same physicochemical properties as the corresponding compound obtained in point 1-5.
<EMI ID = 79.1>
Examples 1. and 2-4 of Example 2. respectively, are examined for their anti-tumor activity.
EXAMPLE 3
<EMI ID = 80.1>
sarcoma-180 solid type -
Mouse sarcoma-180 cells, obtained by culture on supports
<EMI ID = 81.1>
each of the ICR groups; this group is made up of 10 animals, and the transplantation is carried out at the rate of 1116 cells / animal. From 24 hours after transplantation, an intraperitoneal injection of each of the following agents is carried out, every two days, and in total 10 times, and then, 5 days after the last injection, all the mice are sacrificed in view to extirpate the tumor. The average tumor weight (T) is compared with that (C) of 10 mice administered physiological aqueous saline instead of the agent in the following formula; the rate of inhibition of proliferation of the tumor (sarcoma-180) is obtained by the agent:
<EMI ID = 82.1>
<EMI ID = 83.1>
<EMI ID = 84.1>
<EMI ID = 85.1>
<EMI ID = 86.1>
<EMI ID = 87.1>
<EMI ID = 88.1>
<EMI ID = 89.1>
<EMI ID = 90.1>
<EMI ID = 91.1>
<EMI ID = 92.1>
<EMI ID = 93.1>
<EMI ID = 94.1>
The agents mentioned above are:
(1) antibody,
(2) commercial antitumor drug,
<EMI ID = 95.1>
each of the commercially available anti-tumor drugs, and
(4) pharmaceutical composition of bound mouse sarcoma-180 antibodies
each of the commercial anti-tumor drugs.
<EMI ID = 96.1> <EMI ID = 97.1> synthesis with doxorubicin, and
- Table VIII, above, shows the results of the administration of the antibodies.
As shown in Tables V to VII, the rate of inhibition of the proliferation of sarcoma-180 in pharmaceutical compositions is, as it stands, practically the same as that of commercial antitumor agents when used at rates of the order of 5 to 10 times the doses of commercial anti-tumor agents. This fact shows that the anti-tumor activity of the antibody itself practically does not appear and is truly natural.
The characteristic of the pharmaceutical composition becomes clear when
the administered amount of commercial anti-tumor agents is compared to
the quantity of commercial anti-tumor agents forming one of the constituents
of the pharmaceutical composition. This means that, although the quantity
<EMI ID = 98.1>
is practically the same in both cases. The fact mentioned above shows that the antibody which is one of the constituents of the pharmaceutical composition provides a small amount of commercial antitumor agent, which is also one of the constituents of the pharmaceutical composition compared to the tumor site; it is this fact which is the basis of the idea of the present invention.
The pharmaceutical composition having the above-mentioned function, while reducing the quantity to be administered of the commercial antitumor agent which has,
<EMI ID = 99.1>
the quantity generally administered gives rise to the same rate of tumor inhibitory activity.
It should be noted, moreover, although at the origin, the antibody has no relation with the rate of inhibition of the proliferation of tumors, when the compound produced by binding of the antibody, prepared from a rabbit and generally purified, a commercial antitumor substance, is administered to 10 mice, it is found that about 3 animals show a general spasm and stiffness, one of the signs of anaphylactic shock, while l administration of the pharmaceutical composition produced by binding of the purified antibody by affinity chromatography on the antitumor substance gives rise to the observation of an extremely reduced anaphylactic shock. In fact, the compound prepared: by binding of
<EMI ID = 100.1>
anaphylactic shock, but when the antibody is further purified by affinity chromatography, this anaphylactic shock is never observed.
EXAMPLE 4
9 4-1: Preparation of an antibody and its purification by chromatography
by affinity.
Yoshida sarcoma cells, cultured in rats
Donryu breed, are suspended in physiological saline solution and, after addition of mitomycin C (50 micrograms / ml) to the suspension, the mixture is kept under incubation for 30 min, at a temperature of 37 [deg.] C , and centrifuged in order to recover the supernatant solution.
The cells are washed three times with physiological saline solution (0.85%). Freund's complete adjuvant (called FCA) is then added to the cells of Yoshida's sarcoma, which have been devoid of any proliferative activity, and the mixture is injected subcutaneously into the arch of a rabbit. weighing 2.9 kg, at a rate of 108 'cells / animal.
Two weeks after the first injection, a second injection of cells is carried out on the same rabbit, with the same method, for the purpose of immunizing the rabbit, then two weeks after this second injection, an intravenous injection of these cells is again carried out. this-rabbit. A week after
<EMI ID = 101.1>
a cannula inserted into the carotid artery. The antiserum prepared from the blood is purified as follows:
To 100 ml of antiserum, an amount of ammonium sulphate corresponding to 20 to 30% by weight of the saturation is added to effect salting out.
<EMI ID = 102.1>
around 4 [deg.] C, for 72 hours (during dialysis, the external fluid is exchanged every 24 hours).
<EMI ID = 103.1>
3 times with an aqueous solution of sodium chloride, is mixed with
<EMI ID = 104.1>
of the mixture intended to be absorbed, centrifugation is carried out and the supernatant liquid is collected. The abovementioned absorption process is repeated 4 times, the total number of absorptions being 5.
The antibody thus obtained is called a pre-purification antibody (commonly called IgG).
<EMI ID = 105.1>
following method: To the supernatant liquid having undergone 5 absorptions, an equal quantity of Yoshida sarcoma cells is added, and the mixture is kept at rest for 30 minutes: at a temperature of the order of 4 [deg.] C, to bind Yoshida sarcoma antibody to Yoshida sarcoma cells, and the mixture is then centrifuged to separate the supernatant.
To the precipitate is added a glycine hydrochloride buffer solution, having a pH of 3, in order to release the antibody. The mixture is then centrifuged to collect the supernatant liquid contained in the antibody, and the liquid
<EMI ID = 106.1>
obtaining neutrality, and dialyzed against PBS for 24 hours, at a temperature of 4 [deg.] C (the external dialysis liquid is exchanged every 8 hours).
The dialysate thus obtained is an aqueous solution of anti-antibody
- rabbit Yoshida anti-sarcoma.
<EMI ID = 107.1>
normal.
<EMI ID = 108.1>
vis-à-vis cells in the presence of a guinea pig serum supplement, is determined as follows: The abovementioned aqueous solution of the antibody,
its solution diluted 10 times, its solution diluted 100 times and its diluted solution
1000 times are respectively mixed with a suspension of Yoshida sarcoma cells or a suspension of spleen cells from a normal Donryu rat (two suspensions use MEM of Eagle as medium and the cell concentration is 5 x 106 cells / ml), at a rate of 100 microliters.
<EMI ID = 109.1>
the cells absorb the antibody. Then, 100 microliters of the guinea-pig serum, diluted to 2 volumes by MEM of Eagle (the diluted serum is called complement), are added to the above-mentioned mixture, and the final mixture is kept at incubation for 30 min, at a temperature of order of 37 [deg.] C, then centrifuged. The precipitate thus obtained is washed again using MEM from Eagle and, after addition of a solution of trypane blue, the mortality of the cells in the washed and clear precipitate is observed microscopically.
The test results are reported in Table IX. below.
<EMI ID = 110.1>
++ and +++ (the case where no death has occurred is indicated by "-"), it is observed that, although the toxicity of the antibody. taken after purification of
<EMI ID = 111.1>
the toxicity of the first towards the spleen cells of the normal rat. Donryu rat is extremely low and is not sufficient to kill the rats.
This fact indicates that the purification of the antiserum is suitable for the purposes of the present invention.
Then, spleen cells of the Donryu breed rat, used as a representative of normal cells, are obtained after extirpation of the spleen, fine grinding of the spleen with a pair of scissors in MEM of Eagle, and passage of the fragments over a sieve of 20 mesh, washing of the fragments passed using MEM of Eagle, then mixing with 30 ml of an ammonium chloride solution
<EMI ID = 112.1>
to destroy the erythrocytes in the sample and wash the fragments 3 times using MEM from Eagle.
<EMI ID = 113.1>
The following purification of an antibody is carried out by affinity chromatography on a column comprising a support on which the antigen. tumor is linked. First of all,. the antigen itself is purified in the following way: The tumor cells of Yoshida sarcoma, obtained by culture on Donryu rats, are first of all dried by lyophilization,
<EMI ID = 114.1>
with a solution of 5 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4), in order to extract the antigen for 20 hours, and the extracted liquid is centered
<EMI ID = 115.1>
centrifuge for 30 min at 180 OOOG.- The supernatant liquid is collected
<EMI ID = 116.1>
<EMI ID = 117.1>
<EMI ID = 118.1>
the external liquid is exchanged every 24 hours)., The dialysate is then centrifuged at 65 OOOG to remove the precipitate and, after addition of ammonium sulphate to the supernatant, in order to bring its concentration to 2M, the
<EMI ID = 119.1>
precipitate which is then dissolved in distilled water. The solution thus obtained is dialyzed against distilled water for 72 hours
(during dialysis, the external fluid is changed every 24 hours).
From the Yoshida sarcoma antigen thus obtained, the affinity chromatography column is prepared as follows:
<EMI ID = 120.1>
Pharmacia Japan Co., Ltd), 20 ml of an aqueous bromocyane solution at a concentration of 1 g / ml are added and, while maintaining the pH at 11.0, the mixture is kept standing for 8 min in order to that the products react to each other,
and the resulting reaction mixture is then filtered through a glass filter.
The precipitate remaining on the filter is washed with distilled water cooled with. ice, then using a solution of sodium hydrogen carbonate
0.5M cooled with ice, and finally, the precipitate is washed and dispersed
<EMI ID = 121.1>
Then the above-mentioned aqueous solution of the purified antigen is added to the dispersion and for the two constituents to react, stirring is carried out.
<EMI ID = 122.1>
using a solution of sodium chloride phosphate buffer (0.85%,
at pH 7.0).
The reaction product thus washed forms the lining of a glass tube 13 mm in diameter and 15 cm high which constitutes a column for affinity chromatography. In this column, 3 ml of the antibody solution (IgG) are prepared by the method of point 4-1 above (except the step of binding with Yoshida sarcoma cells) and are introduced into the tube, then a solution is passed through it in a phosphate buffer
<EMI ID = 123.1>
effluent fraction, which is neutralized using an acidic sodium carbonate; the neutralizer is then dialyzed again against a buffer solution in phosphoric acid of sodium chloride (0.85%, at pH 7.0), for 72 hours (during dialysis, the external liquid- is exchanged every 24 hours). Then, the aqueous solution of the antibody purified by column affinity chromatography against Yoshida sarcoma is obtained.
<EMI ID = 124.1>
normal.
<EMI ID = 125.1>
in point 4-3 described above is examined by the same method as in point 4-2. The results obtained are recorded in Table X. below.
The results of this Table X show that the activity of the antibody vis-à-vis Yoshida sarcoma cells is greatly improved; however, that of the rat spleen cell antibody is reduced by purification in an affinity chromatography column and, moreover, purification by affinity chromatography has been shown to be excellent.
<EMI ID = 126.1>
<EMI ID = 127.1>
to react with one of the commercial anti-tumor agents, such as chlorambucyl, melphalan (phenyl alanine mustard), ACNU, urasmustine and cyclophosphamide, in order to obtain, by synthesis, each of the linked compounds.
The examples below are examples obtained by syntheses:
EXAMPLE OF SYNTHESIS 1
<EMI ID = 128.1>
To 10 ml of an aqueous solution containing the rabbit antibody purified against Yoshida sarcoma obtained in point 4-1 of Example 4, at a flow rate of 10.0 mg / ml, 40 mg of chlorambucile is added and, with stirring, while adjusting the pH of the solution to 4.75 with hydrochloric acid,
<EMI ID = 129.1>
<EMI ID = 130.1>
<EMI ID = 131.1>
and distilled for 72 hours at a temperature of 4 [deg.] C (during dialysis, the external liquid is exchanged three times).
<EMI ID = 132.1>
<EMI ID = 133.1>
After condensation of the internal dialysis liquid, the condensate is passed through a column 3 cm in diameter and 65 cm high, packed with a dextrin derivative (Sephadex G-200, manufactured by Pharmacy Japan Co., Ltd.) to completely separate the high molecular weight substances and the low molecular weight substances contained in the solution. The column effluent undergoes ultracentrifugation for 60 min, at 40 OOOG, and the supernatant is dried by lyophilization at -20 [deg.] C, to yield the substance which is the subject of the present invention.
The protein content of the product is determined by the Copper-Folin method using albumin as a control, and the bound amount of the alkylating agent is determined by the Epstein method (Epstein, J. Anal Chem.,
27, 1423 (1955. The results show that in the pharmaceutical composition obtained, 10 micrograms of chlorambucile are linked to 1 mg of antibody.
EXAMPLE OF SYNTHESIS 2
<EMI ID = 134.1>
In the same way as described in Synthesis Example 1, but using the same amount of melphalan as chlorambucile and in
<EMI ID = 135.1>
purified rabbit is bound to melphalan for the purpose of obtaining the pharmaceutical composition in which 10 micrograms of melphalan is bound to 1 mg of antibody.
EXAMPLE OF SYNTHESIS 3
<EMI ID = 136.1>
In the same way as described in Synthesis Example 1. but using 40 mg of uramustine instead of chlorambucin, the antibody of
<EMI ID = 137.1>
Then, chloroacetic acid is reacted to react the uramustine and increase its reactivity as follows:
To 10 ml of methanol, 500 mg of uramustine and 139 mg of potassium methoxide are added so as to obtain a dissolution, then 188 mg of chloro-
<EMI ID = 138.1>
the reaction is complete, the reaction mixture is condensed under reduced pressure. The residue is recrystallized from methanol and chloroform. 215 mg (yield: 35%) of crystals are thus obtained, having the structure of the following uramustine derivative, which is confirmed by the analyzes:
<EMI ID = 139.1>
<EMI ID = 140.1>
the rabbit antibody against Yoshida's sarcoma obtained in point 4-1 of Example 4. in the same way as in Synthesis Example 1.
A pharmaceutical composition is obtained in which 10 micrograms of uramustine are linked to 1 mg of the antibody.
EXAMPLE OF SYNTHESIS 4
<EMI ID = 141.1>
First of all, a melphalan derivative is prepared by synthesis, from melphalan in the following way:
In 10 ml of dimethyl sulfoxide, 200 mg of silver salt of melphalan are dissolved, and 100 mg of chloroacetic acid are added to the solution which is then stirred for 64 h in non-direct light.
After elimination of the precipitate formed in the reaction mixture, it is separated by distillation under reduced pressure, on a water bath, at a temperature
<EMI ID = 142.1>
After adding water to the residue and cooling the mixture, the formation of white crystals is observed. The deposited crystals are dried under reduced pressure. The derivative thus obtained from melphalan (yield: 40%) is used in the reaction with the antibody obtained in point 4-1 of Example 4, by the same method as that described in Synthesis Example 2; a pharmaceutical composition is thus obtained in which 16 micrograms of the melphalan derivative are linked to 1 mg of the antibody.
EXAMPLE SUMMARY 5
Rabbit antibody from Yoshida sarcoma, obtained and purified in the
<EMI ID = 143.1>
in the same way as that which is discounted in Synthesis Example 1,
<EMI ID = 144.1>
Synthesis 4) and a uramustine derivative (cf. Example of Synthesis 3).
The pharmaceutical composition thus obtained by synthesis is practically the same as the pharmaceutical composition obtained in the Examples of Syntheses above.
EXAMPLE 5
<EMI ID = 145.1>
Des. ascites-type Yoshida sarcoma cells, obtained by culture on Donryu rats, are transplanted for 4 weeks, once a week, into the abdominal cavity of a Donryu rat;
7 days after the fourth transplant, the blood is collected from a large abdominal vein of the rat, subjected to laparatomy under anesthesia. The antiserum containing the antibody is prepared from the blood; the amount is 70 ml per 100 rats. The preparation of the antibody from
<EMI ID = 146.1>
described in point 4-1 of Example 4; the process is however stopped after absorption by rat erythrocytes.
<EMI ID = 147.1>
In 30 g of cells dried by lyophilization of Yoshida sarcoma, obtained by culture on Donryu rats, an aqueous solution of 3M KC1 buffered with a 5 mM potassium phosphate buffer solution, pH 7.4, is added to the ends of the antigen extraction for 20h. The extracted liquid is centrifuged for 10 min at 65 OOOG; the supernatant liquid is then collected and subjected to centrifugation for 30 min.
at 180 OOOG. The supernatant liquid then collected is dialyzed at a temperature of 4 [deg.] C for 72 hours to meet distilled water (during dialysis, the external liquid is exchanged every 24 hours).
The affinity chromatography process is performed on the antigen
<EMI ID = 148.1>
<EMI ID = 149.1>
<EMI ID = 150.1>
<EMI ID = 151.1>
<EMI ID = 152.1>
The disorders due to the antibody of the rat of Yoshida sarcoma are examined by the same method as that of Example 4.
The results obtained are recorded in Table XI. above.
<EMI ID = 153.1>
Yoshida sarcoma cells is remarkably increased by affinity chromatography as is the case in the previous examples.
<EMI ID = 154.1>
antitumor.
The rat antibody of Yoshida sarcoma obtained by the method of points 5-1 and 5-2 of Example 5. is respectively bound to chlorambucile by a method practically similar to that which is described in point 4-5 of Example 4. Pharmaceutical compositions are thus obtained having an amido bond between the two constituents.
By applying the same method to melphalan, the melphalan derivative and the uramustine derivative, respectively, products are obtained having a bond between the antibody and each of the abovementioned pharmaceutical compositions.
Each of the pharmaceutical compositions thus obtained shows practically the same physicochemical properties as those of the pharmaceutical compositions obtained by the process of point 4-5 of Example 4.
EXAMPLE 6
<EMI ID = 155.1>
Yoshida sarcoma cells, obtained by culture on Donryu rats, are transplanted into the abdominal cavity of 10 rats of each
<EMI ID = 156.1>
after the transplant, each of the following agents is injected intraperitoneally into each of the rats of the group, every two days, for
20 days. After observing the mortality rate of the rats, the rate of extension of the agent's life is obtained by calculating the value obtained by dividing the average number of days of survival of the rats treated in a group.
<EMI ID = 157.1>
ambucile and chlorambucile + antibody (Table XII), melphalan and melphalan + antibody (Table XIII), a uramustine derivative and a derivative
<EMI ID = 158.1>
<EMI ID = 159.1>
<EMI ID = 160.1>
<EMI ID = 161.1>
<EMI ID = 162.1>
<EMI ID = 163.1>
<EMI ID = 164.1>
<EMI ID = 165.1>
<EMI ID = 166.1>
<EMI ID = 167.1>
<EMI ID = 168.1>
<EMI ID = 169.1>
<EMI ID = 170.1>
<EMI ID = 171.1>
<EMI ID = 172.1>
administered at doses of the order of 5 to 10 times higher. This natural fact shows that the inhibitory activity with respect to the tumor does not appear for the antibody at the doses generally applied (cf. Table XVI).
The characteristics of the pharmacological composition appear clear.
<EMI ID = 173.1>
forming the constituent of the pharmacological composition is compared to the administered amount of the. antitumor substance itself constituting the agent.
<EMI ID = 174.1>
commercial antitumor at the tumor site thanks to the antibody which is another effective constituent of the pharmacological composition; this fact constitutes the realization of the idea of the present invention.
<EMI ID = 175.1>
same rate of inhibitory activity vis-à-vis the tumor despite the reduction to 1/10 to 1/20 of the amount of commercial antitumor substance to be used,
<EMI ID = 176.1>
mentally high.
In addition, it should be particularly noted that the possible appearance of anaphylactic shock, which is observed in the case where the antibody prepared
from rabbits and purified by the conventional method is linked to a commercial antitumor substance and the bound substance is administered to rats, is well reduced when the antibody is purified by the affinity chromatography method according to the present invention.
Such a reduction in the possibility of producing anaphylactic shock
was found in the case of the sarcoma-180 antibody in Example 3. and the advantages of the affinity chromatography method are still seen in the case of Yoshida sarcoma.
In the case of the antibody prepared from mice, purified by affinity chromatography, the administration of the pharmacological composition produced from the antibody does not give rise to an anaphylactic shock on rats.
EXAMPLE 7
Q 7-1: Preparation and purification of an antibody to tumor cells.
50 ml of blood are collected from a 50-year-old male patient suffering from rectal cancer, and 22 ml of an antiserum containing an antibody are obtained from the blood.
<EMI ID = 177.1>
To the dry tumor by: lyophylization, removed from the abovementioned patient by operation, 50 ml of a solution of 3M potassium chloride are added
<EMI ID = 178.1>
<EMI ID = 179.1>
After centrifugation of the extracted liquid for 10 min at 65 OOOG, the supernatant liquid is collected and dialyzed against distilled water for 72 h, at a temperature of 4 [deg.] C (during dialysis, the external liquid is exchanged every 24 hours). The affinity chromatography of the antigen thus obtained on the patient's tumor is carried out practically in the same way as
<EMI ID = 180.1>
anti serum containing the antibody obtained in point 7-1 above from the patient, instead of using the antibody obtained from a mouse.
The antibody thus obtained is also soluble in water, but insoluble in organic solvents such as methanol, ethanol, acetone and benzene, and has an ultraviolet and infrared absorption spectrum given in Figures 2 and 3; its molecular weight is around 150,000 and
Rf is 0 to 0.1 in the disk electrophoresis diagram.
EXAMPLE 8
<EMI ID = 181.1>
affinity chromatography (3),
Mytomycin C (50 micrograms / ml) is added to the cells of a tumor.
P-338 of ascites type, produced by culture on DBA / 2 mice, suspended in physiological saline solution and, after incubation of the mixture for
30 min, at a temperature of about 37 [deg.] C, the supernatants are removed by centrifugation; the cells are washed 3 times using a physiological saline solution at 0.85%.
Rabbit-treated P-388 tumors lacking precursor activity are inoculated into the thus treated cells and aqueous solutions of rabbit anti-P-388 tumor antibodies are prepared by the same method as that is described in point 1-1 of Example 1.
<EMI ID = 182.1>
normal.
The cytotoxicity due to rabbit P-388 tumor antibodies on the cells is examined in the presence of complement (guinea pig serum) by the method already described in point 1-2 of Example 1.
The results obtained are recorded in Table XVII. below. -
In addition, the spleen cells of DBA / 2 mice, used as representative of the normal cells, are treated by the same method as that which is described in point 1-2 of Example 1.
<EMI ID = 183.1>
The anti-mouse P-388 tumor antibody, purified: on a column comprising a support on which P-388 antigen tumors have been linked. The method used is practically that used in point 1-3 of Example 1. except that P-388 tumor cells produced by culture in DBA / 2 mice are used instead of cells from sarcoma-180 of the ascites type, produced by culture on ICR mice.
<EMI ID = 184.1>
normal.
The cytotoxicity due to the rabbit P-388 tumor immunoantibody is examined by the same method as in point 8-2 above.
The results obtained are reported in Table XVIII. below.
The results of this Table XVIII show that the activity of the antibody of tumor cells P-388 is remarkably increased and that the toxicity of the antibody with respect to spleen cells is reduced by purification by affinity chromatography, as has already been shown for the abovementioned antibodies; this shows the effective action of purification by
<EMI ID = 185.1>
anti-tumor.
The rabbit anti-P-388 antibodies, prepared by the method of points 8-1 and 8-3 and -purified by these methods, are each reacted with cytarabine, methotrexate and 5-fluorouracil, for the purpose of synthesize compounds with an amide bond between the antibody and
<EMI ID = 186.1>
The following examples are examples of such links.
<EMI ID = 187.1>
<EMI ID = 188.1>
<EMI ID = 189.1>
<EMI ID = 190.1>
<EMI ID = 191.1>
P-388 of rabbit purified in 1 ml, 20.0 mg of cytarabine are added, then
30 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, then reacted for the period indicated below, and then added 2 ml of a solution of acetic acid sodium acetate buffer for the purpose of stop
<EMI ID = 192.1>
distilled for 72 hours, at a temperature of the order of 4 [deg.] C (during dialysis, the external liquid is exchanged every 24 hours).
After condensation of the internal liquid, it is passed over a column 1.5 cm in diameter and 55 cm high, packed with a dextrin derivative (Sephadex
<EMI ID = 193.1>
stance of low molecular weight, in the reaction mixture. completely; . 1 \ effluent is dried by freeze-drying at a temperature of -20 [deg.] C to yield the desired product.
The bound amount of cytarabine as a function of the reaction period assumed by the results obtained separately in the research trial is shown in Table XIX, below.
EXAMPLE OF SYNTHESIS 7
In an aqueous solution containing 10 mg of rabbit P-388 tumor antibodies, prepared and purified according to the method of point 8-1 of Example 8 in 1 ml, 6.0 mg of methotrexate are added and, while adjusting the pH of the solution to 4.75 by addition of hydrochloric acid, with stirring,
<EMI ID = 194.1>
imide during a reaction period shown below. The reaction is then stopped by adding 2 ml of a solution of a sodium acetate buffer, acetic acid. The reaction mixture undergoes reverse dialysis
<EMI ID = 195.1>
(during dialysis, the external fluid is changed every 24 hours).
The internal liquid of the dialysis is treated according to the method of the above Synthesis Example 6, in order to obtain the pharmacological -research composition.
The amount of bound methotrexate is shown in Table XX. also below, as a function of the reaction period.
<EMI ID = 196.1>
<EMI ID = 197.1>
<EMI ID = 198.1>
<EMI ID = 199.1>
EXAMPLE OF SYNTHESIS 8
<EMI ID = 200.1>
a reaction similar to that described in Synthesis Example 7, in which however the product obtained did not contain any 5-fluorouracil. After introduction of a carboxyl group on 5-fluorouracil by the following method, the binding reaction is carried out according to the same method as that described in point 8-1 of Example 8.
<EMI ID = 201.1>
The carboxylated 5-fluorouracil is prepared by synthesis as follows:
To 10 ml of ethanol, 500 mg of 5-fluorouracil and 86 mg of potassium hydroxide are added, and 3 ml of distilled water are then added.
To the transparent liquid thus formed, 145 mg of hydrochloric acid are added all at once, then the mixture is stirred for 60 hours at room temperature. Once the reaction is complete, the reaction mixture is condensed under reduced pressure and the residue is recrystallized from ethanol and chloroform;
<EMI ID = 202.1>
<EMI ID = 203.1>
red and elementary analysis
<EMI ID = 204.1>
EXAMPLE OF SYNTHESIS 9
<EMI ID = 205.1>
method of point 8-3 of Example 8 is reacted with each of the following compounds: cytarabine, 8-azaguar, ine, methothrexate, aminoputerine
<EMI ID = 206.1>
similar to the pharmacological compositions obtained in the Exemptes from Syntheses 6 to 8.
EXAMPLE 9
<EMI ID = 207.1>
P-388 tumor cells of the ascites type, obtained by culture in mice of race DSA / 2 and devoid of any proliferative activity by mitomycin C are inoculated intraperitoneally on mice of race DBA / 2 once a week, at a rate of 106 cells / animal;
7 days after the fourth inoculation, the blood is collected by a large abdominal vein by laparatomy under anesthesia, and the serum containing the antibody is prepared from the blood. The total amount. of antiserum is 53 ml per 100 mice. The preparation and purification of antibodies from antiserum are carried out according to the same method as that described in point 8-1 of 1 1 Example 8.
<EMI ID = 208.1>
The cells dried by lyophilization of P-388 tumor of the ascites type are treated according to the same method as that of the Yoshida sarcoma cells described in point 4-3 of Example 4, omitting however the salting out by sulphate d ammonium and subsequent centrifugation. Next, an aqueous solution of ascites-like tumor antibodies P-388 purified by affinity chromatography is obtained.
<EMI ID = 209.1>
normal.
Disorders caused in mice by the P-388 ascites-type tumor antibodies obtained by the method described in point 9-2 above, are examined by the same method as that described in Example 1.
<EMI ID = 210.1>
<EMI ID = 211.1>
<EMI ID = 212.1>
As shown in Table XXI .. above, the antibody activity of P-388 tumor cells is remarkably increased by the method of treatment by affinity chromatography, as is the case in the previous Examples .
<EMI ID = 213.1>
The mouse tumor antibodies P-388, obtained by the method of the methods of points 9-1 and 9-2 of Example 9. are respectively linked to each of the following antimetabolites, namely, cytarabine, methotrexate, sodium aminoputerine , 8-azaguanine and 5-fluorouracil by the same method as that described in point 8-5 of Example 8, in order to obtain the pharmacological compositions in which the antibody is linked
<EMI ID = 214.1>
have practically the same physiochemical properties as those of the corresponding pharmacological compositions obtained by operating according to the method of point 8-5 of Example 5.
EXAMPLE 10
<EMI ID = 215.1>
P-388 tumor -
P-388 tumor cell cells, cultured in DBA / 2 mice, are transplanted into the abdominal cavity of 10 mice
<EMI ID = 216.1>
24 hours after transplantation, an aqueous solution of each of the antitumor agents is administered intraperitoneally to the mice once a day for 5 days, and the rate of mortality of the mice is then observed by determining the average number of days of survival of the groups of mice
<EMI ID = 217.1>
<EMI ID = 218.1>
The results are recorded in Tables XXII to XXVI, below,
Table XXVI showing the results obtained when the antibody is administered only.
<EMI ID = 219.1>
<EMI ID = 220.1>
<EMI ID = 221.1>
<EMI ID = 222.1>
<EMI ID = 223.1>
<EMI ID = 224.1>
<EMI ID = 225.1>
<EMI ID = 226.1>
<EMI ID = 227.1>
<EMI ID = 228.1>
<EMI ID = 229.1>
The anti-tumor agents used in this example are:
<EMI ID = 230.1>
sodium aminoputerine and 5-fluorouracil derivative.
(2) Pharmacological composition of the unpurified rabbit antibody
obtained by affinity chromatography, linked to one of the aforementioned antimetabolic anti-tumor agents.
(3) Pharmacological composition of antibodies purified by chromatography
<EMI ID = 231.1>
cited above.
(4). Pharmacological composition of mouse antibody not purified by
<EMI ID = 232.1>
aforementioned antimetabolics, and
(5) Pharmacological composition of antibodies purified by chromatography
by affinity (1), linked to one of the above-mentioned antimetabolic anti-tumor agents.
The essential characteristic of the pharmacological compositions does not appear first of all when the quantity administered of the commercial antitumor agent itself is compared with the quantity administered of the same antitumor agent as a constituent of the pharmacological composition. In fact, despite the fact that the latter is only 1 / 10th or 1 / 20th of the previous one,
the lengthening of life conferred by the latter is almost equal to that of the former, This fact results from the phenomenon that the antibody transfers in a favorable way the commercial antitumor agent to the site of the tumor on the animal body and constitutes confirmation of the idea of the present invention. The pharmacological compositions due to the abovementioned functions exhibit an anti-tumor activity of the same degree as the anti-tumor agent.
commercial, which have extremely high side effects and which lead to a reduction in their use from 1 / 10th to 1 / 20th.
In. In addition, it should be noted in particular that, in the case where the antibody. prepared from the rabbit is linked to each of the antitumor agents and
<EMI ID = 233.1>
stiffness only appears in 3 out of 10 mice, while the pharmacological composition produced by binding of the antitumor agent with the antibody prepared from rabbit and purified by chromatography
by affinity, practically does not give rise to this shock.
The pharmacological composition produced by binding of the antibody prepared from mice and purified by affinity chromatography with the same commercial antitumor agent never gives rise to anaphylactic shocks.
These findings were already recorded in Examples 3 and 6. and this is the reason why the efficiency of affinity chromatography to eliminate the causes of such anaphylactic shock is of great interest.
Of course, the present invention is in no way imitated by the examples
<EMI ID = 234.1>
envisaged and without the year departing from the spirit of the invention.
CLAIMS
1.- Pharmacological composition having an anti-tumor activity without giving rise to side effects of the pyrexia or anaphylaxis type, which consists of an anti-tumor substance having at least one amino group or
<EMI ID = 235.1>
by affinity chromatography.