BE488271A - - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Procédé de préparation de matières thérapeutiques et plus particulièrement de la Vitamine BI2, 
Cette invention concerne de façon générale la préparation de matières thérapeutiques et, plus particu- lièrement, la préparation de vitamine B 12à partir d'un concentré renfermant la   mente .   



   L'invention se rapporte à un procédé de préparation de vitamine B 12 à partir d'un concentré, tel une prépara- tion de foie, en soumettant la dite préparation de foie à l'action d'une colonne de matière activée et en récupé- rant la dite vitamine sous une forme concentrée et purifiée. 

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   L'invention se rapporte également à un procédé de préparation de vitamine B 12 à partir d'un concentré, tel un concentré principalement composé d'un produit d'élabora- tion du streptomyces griseus, en soumettant ledit concentré à une extraction par un solvant, en effectuant un fraction- nement chromatographiuqe par le traitement de ladite solution obtenue avec le solvant dans une colonne de matière absorbante par le lavage de la colonne avec le solvant pour lessiver la substance active (hors) de la substance absorbante, et par la récupération à partir du lessivage (= lessive) de cristaux   l'ou.   ges ayant la composition approximative : 55,7% C,   6,   5% H, 13.9% N, 5,2% P, et4,4% Co . 



   La   vitamine   B 12 est un facteur actif puissant de croissance pour le micro-organisme Lactobacillus lactis Dorner et possède une action marquée et effective dans le   trai.   tement thérapeutique de l'anémie pernicieuse d'Addison. 



   C'est un objet de l'invention de préparer la vita- mine B 12 sous une forme pure en partant de préparations commerciales de foie. 



   C'est aussi un objet de l'invention de préparer la vitamine B 12 sous une forme pure en partant d'un concentré composé principalement d'un produit d'élaboration de Strep- tomyces griseus. 



   D'après cette invention, on a trouvé qu'il est possible de soumettre des préparations commerciales de foie à un procédé de purification par lequel la vitamine B 12 est récupérée, possèdant une haute activité physiologique, convenant particulièrement pour le traitement clinique de l'anémie humaine. 



   On a découvert que la vitamine B 12 peut être ob- tenue sous une forme concentrée etpurifiée à partir de préparations cornuerciales de foie par une technique chroma- tographique. La purification et la concentration sont effec- 

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 tuées sous des conditions étroitement contrôlées par lesquelles la possibilité de destruction ou de perte de l'activité de la vitamine est réduite à un minimum. 



   D'après le procédé de l'invention une fraction de foie d'au moins 1000 unités par mg* est utilisée comme ma-   tière  de départ et est préparée en partant de préparations disponibles dans le commerce telle la fraction soluble dans l'éthanol à 70% d'un extrait aqueux de foie par la méthode comme celle décrite par Dakin et West dans le Journ. Biol. 



  Chem. 109,489 (1935). 



   Le produit solide ainsi obtenu est chromatognaphié en solution aqueuse sur une colonne renfermant du charbon de bois et la matière active est lessivée avec un solvant orga- nique tel l'éthanol à   50%.   D'autres produits de lavage peuvent aussi être utilisés pour le lessivage (ou extraction) tels l'acétone 50%, l'eau saturée de butanol, l'eau saturée d'alcool benzylique, et l'acide acétique glacial. 



   D'après le procédé, on peut aussi chromatographier la solution alcoolique préparée par extraction du produit solide avec un alcool aliphatique inférieur sur une colonne renfermant de l'alumine activée et lessiver la matière active avec du méthanol ou une solution aqueuse de méthanol. 



     Les   lessives sont recueillies en -petites fractions. 



  L'activité (ou puissance) des fractions est déterminée par essai microbiologique avec le Lactobacillus lactis Dorner. 



    Les   fractions de haute activité sont soit séchées, à partir de l'état solide (=gelé), ou concentrées à un petit volume. 



   La matière chromatorgrpahiee soit solide ou sous forme de lessive concentrée telle la matière obtenue à partir du chromatogramme d'alumine est soumise à une extraction avec de l'éthanol, et les produits solides insolubles dans l'étha- nol sont éliminés. La solution dans l'éthanol est concentrée 

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 à siccité, et après dissolution du résidu dans le méthanol, on ajoute de l'acétone ou de l'éther pour provoquer la pré- cipitation. Le liquide surnageant est alors éliminé, le précipité dissous dans de l'eau et la solution traitée avec de l'acétone. le précipité en résultant est dissous dans le méthanol eton ajoute plusieurs volumes d'acétone. Le liqui- de surnageant est éliminé et le résidu cristallisé par disso- lution dans l'eau et addition prudente d'acétone jusqu'à obtention d'un trouble.

   Les cristaux résultants sont lavés avec de l'acétone et recristallisés en partant de mélanges eau-acétone . 



     D'autrB   part, les concentrés de vitamine 12 peu- vent aussi, après les opérations de précipitation par solvant, subir une purification subséquente par la distribution à contre-courant entre de l'eau et un mélange de 75% toluène- 25% o-crésol, suivie de la cristallisation des meilleures fractions. 



   Si on le désire, les concentrés obtenus par le traitement au charbon actif peuvent être dissous dans un alcool aliphatique inférieur et la solution alcoolique résultante peut être chromatographiée sur une colonne d'alu- mine activée. 



   L'activité des produits est déterminée microbiolo- giquement au moyen d'une réaction de croissance avec le Lactobacillus lactis Dorner comme organisme de test. On a conféré une valeur de 1000 unités par mg. à un concentré de foie choisi arbitrairement. 



   D'après l'invention, le procédé comprend aussi l'extraction d'un concentré brut composé principalement d'un produit d'élaboration du Streptomyces griseus avec un solvant, le fractionnement chromatographique par addition de ladite solution dans le solvant sur une colonne de matière      

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 adsorbante, le lavage de la colonne avec un solvant pour retirer par lessivage fractionné la substance active de l'a- gent adsorbant et la récupération de vitamine B 12 cristalli- ne à partir de la lessive. 



   Pour préparer les composés chimiques nouveaux, on utilise comme matière de départ un concentré brut renfermant une substance active favorisant la croissance du Lactobacil- lus lactis Dorner. Le concentré brut peut être préparé par culture du micro-organisme Streptomyces grisens sur (ou dans) un milieu nutritif convenable, par adsorption de la matière active (hors) du bouillon de culture, par le lavage par dé- cantation de la substance adsorbée avec une solution aqueuse de pyridine ou de pyridine substituée par un groupe alkyle et par la récupération du concentré brut à partir de la sub- stance lavée par décantation. 



   Conformément à un autre principe, un concentré brut composé principalement d'un produit d'élaboration du Strepto- myces griseus est soumis à une extraction par l'eau ou un alcool aliphatique inférieur tel l'alcool méthylique. la sélection du liquide d'extraction est déterminée par la substance adsorbante à utiliser dans le fractionnement chromatographique. 



   Dans la pratique de cette invention, on peut utili- ser des adsorbants variés comprenant le charbon activé, l'alumine activée et les matières analogues; l'alumine acti- vée étant l'adsorbant préféré. Les extractions aqueuses sont traitées dans des colonnes renfermant du charbon actif et les extractions dans un alcool aliphatique inférieur sont utilisées dans des colonnes à alumine activée. La colonne est de préférence chargée (à l'état) humide, par remplissage avec l'adsorbant et le solvant utilisé et par drainage subséquent du solvant jusqu'à ce que son niveau 

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 atteigne le sommet de la matière adsorbante dans la colonne. 



   L'extrait alooolique est versé à la surface supé- rieure de m'adsorbant dans la colonne et on le laisse s'é- couler à travers l'adsorbant par gravité ou sous pression. 



  La colonne est ensuite développée ou lavée par un solvant frais et les fractions convenables du lessivage sont recueil- lies. Les fractions présentant une activité suffisante révé- lée par examen micro biologique ou en vertu de la couleur rose sont concentrées soit séparément ou en mélange. La solution concentrée est ensuite mélangée à un solvant miscible dans lequel la substance active est Insoluble, comme l'acétone, et on recueille un précipité rouge. Le précipité estdissous dans l'eau et on ajoute de l'acétone qui provoque la sépara- tion de cristaux rouges de vitamine B 12, 
Le degré de purification obtenu par un simple frac- tionnement chromatographique peut ne pas être suffisant pour fournir un produit cristallin.

   Dans ces conditions la ma- tière amorphe peut   tre   purifiée à nouveau par la dissolu- tion dans un alcool aliphatique inférieur. La solution est alors ajoutée à (introduite dans) une seconde colonne de ma- tière adsorbante et les fractions les plus actives de la lessive décelées comme dit ci-dessus sont recueillies et concentrées à siccité. Le résidu sec est dissous dans l'al- cool méthylique et de l'acétone ajoutée à la solution pour provoquer un précipité rouge de vitamine B 12 qui est séparé. 



  Ce précipité est dissous dans l'eau et de l'acétone ajoutée   à la   solution provoque la séparation de cristaux rouges. 



   La vitamine B 12, obtenue conformément à cette in- vention, est un composé rouge ayant la composition approxi- mative de   55,7%   C, 6,5% H, 13.9 % N, 5,2% P et 4,4% Co et est essentiellement soluble dans l'eau, l'alcool méthylique,* l'alcool éthylique et le phénol et essentiellement insoluble 

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 dans l'acétone, l'éther et le chloroforme. La vitamine B 12 a un coefficient apparent de partage d'environ 1,46 dans le système : 75% toluène- 25% ortho-crésol; eau. la vitamine B 12 cristallise à partir de solutions convenables telle l'acétone aqueuse en cristaux rouges ayant les propriétés cristallographiques suivantes : 
 EMI7.1 
 indice de réfra,ction 1616; 1,65; 1, 664.

   La vitamine B 12 cristallisée est d'autre part caractérisée par les di- mensions de cellule unitaire approximatives 16 sur 19 sur 21 A, comme déterminé à partir des données de diffraction aux rayons X. 



   Les cristaux de vitamine B 12 n'ont pas de point de   ftlsion   défini mais noircissent à (s'assombrissent) environ 
 EMI7.2 
 210 - 20  . 



   La vitamine B 12 en solution aqueuse donne le spectre d'absorption suivant dans le visible et l'ultra-violet, (séchée 2 heures à   100 ) :   
 EMI7.3 
 
<tb> max. <SEP> 1%
<tb> o <SEP> E
<tb> A <SEP> 1 <SEP> cm. <SEP> 
<tb> 
<tb> 



  2780 <SEP> 119
<tb> 3050 <SEP> 68
<tb> 3230 <SEP> 59
<tb> 3610 <SEP> 187
<tb> 4080 <SEP> 28
<tb> 5200 <SEP> 56
<tb> 5480 <SEP> 59
<tb> 
 Le spectre d'absorption infra- rouge a été déterminé avec un spectromètre Perkin-Elmer 12A soigneusement   calibré.   



  Les maxima d'absorption ont été les suivants : 
 EMI7.4 
 Longueur d'onde en Mu ( 10 -4 cm.) 
 EMI7.5 
 
<tb> 3,05 <SEP> S <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 4.62 <SEP> W <SEP> 
<tb> 
<tb> 5,98S
<tb> 
<tb> 6.13 <SEP> M
<tb> 
<tb> 6.70 <SEP> S
<tb> 
<tb> 7.14 <SEP> S <SEP> 
<tb> 
<tb> 7.35 <SEP> S
<tb> 
<tb> 7.60 <SEP> W
<tb> 
<tb> 8.15 <SEP> S
<tb> 
<tb> 8.67 <SEP> S
<tb> 
<tb> 9.36 <SEP> S
<tb> 
 

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 EMI8.1 
 
<tb> Longueur <SEP> d'onde <SEP> en <SEP> Mu <SEP> (10- <SEP> cm. <SEP> )
<tb> 
<tb> 
<tb> 10. <SEP> 00 <SEP> S <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 10. <SEP> 80 <SEP> W
<tb> 
<tb> 11,10W
<tb> 
<tb> 11.81 <SEP> M
<tb> 
<tb> 12.35 <SEP> M <SEP> 
<tb> 
 S.M et W désignent des intensités d'absorption fortes, moyen- nes etfaibles. 



   On a trouvé que la vitamine B 12 obtenue conformémen' à l'inventionpossède une activité biologique telle que 0,000013 Ó par ml. de milieu de culture est suffisant pour engendrer une croissance égale à la moitié du maximum du Lactobacillus lactis Dorner sous les   candi tiens   employées. 



  La vitamine B 12 possède une haute valeur thérapeutique dans le traitement de l'anémie pernicieuse d'Addison, ainsi, le produit cristallin a produit une réaction hématologique posi- tive chez trois patients par injections intramusculaires res- pectivement de 150, 6   et 3 .   Quatre patients ayant reçu chacun des injections de concentrés amorphes renfermant   20.000   à 40. 000 unités   L.L.D.   donnèrent des réactions hémato- logiques fortes ou maxima. Un mg. de la substance cristalli- ne est équivalent à environ   11x10   unités L.L.D. et un à environ   11.000   unités. 



   TABLE I 
 EMI8.2 
 
<tb> Concentrés <SEP> amorphes. <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  Cas <SEP> -- <SEP> A
<tb> 
<tb> 
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 14 <SEP> 23 <SEP> 29 <SEP> 42 <SEP> 119
<tb> 
<tb> RBCx106 <SEP> 1. <SEP> 7 <SEP> 2.4 <SEP> 2,6 <SEP> 2.8 <SEP> 3.3 <SEP> 4. <SEP> 5
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 6.8 <SEP> 7. <SEP> 8 <SEP> 9.5 <SEP> 9.8 <SEP> 11.0 <SEP> 14.0
<tb> 
<tb> 
<tb> Retics. <SEP> % <SEP> 2. <SEP> 4 <SEP> 20. <SEP> 0 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 1. <SEP> 0 <SEP> 13. <SEP> 6 <SEP> 121 <SEP> -
<tb> 
<tb> Unités <SEP> L.L.D. <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> l.8x106
<tb> 
 
Le patient rentra à la maison le 4Sème jour et n'a pas subi d'autre traitement que celui signalé. 

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    TABLE il    
 EMI9.1 
 Vîtamîne B 12 recristallisée. 
 EMI9.2 
 
<tb> 



  Cas <SEP> B <SEP> C
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 14 <SEP> 23 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 14
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> RBC <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 2. <SEP> 6 <SEP> 3.4 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 2. <SEP> 6
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> .Hgb.gm. <SEP> 4,5 <SEP> 7.0 <SEP> 9. <SEP> 0 <SEP> 7. <SEP> 8 <SEP> 10. <SEP> 0
<tb> 
 
 EMI9.3 
 Raties. l% 0.5 27.0 2.0 0.5 2.8 26.0 3.1 Hct. % .4;

  0 25.0 29.017.0 31 
 EMI9.4 
 
<tb> WBC <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 3 <SEP> 9. <SEP> 0 <SEP> 26.0 <SEP> 9.0 <SEP> 2,3 <SEP> 5.8
<tb> 
 
 EMI9.5 
 Vitamine B12 150 6 L.L.D. 
 EMI9.6 
 
<tb> Unités <SEP> 1,6 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 6.6 <SEP> x <SEP> 104
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Cas <SEP> D
<tb> 
<tb> 
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 9 <SEP> 15
<tb> 
<tb> 
<tb> RBC <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1. <SEP> 4 <SEP> 2.6
<tb> 
<tb> 
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 6. <SEP> 8 <SEP> 9.8
<tb> 
<tb> 
<tb> Retics. <SEP> % <SEP> 2.8 <SEP> 10. <SEP> 14. <SEP> 0 <SEP> 2,6
<tb> 
<tb> 
<tb> Hct.% <SEP> 17 <SEP> 31
<tb> 
 
 EMI9.7 
 V.#C x 103 4.2 8 .1 
 EMI9.8 
 
<tb> Vitamine <SEP> B12 <SEP> 3 <SEP> 50
<tb> 
 
 EMI9.9 
 L.I,.D . 
 EMI9.10 
 
<tb> Unités <SEP> 3. <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 5.5 <SEP> x <SEP> 105
<tb> 
 
La vitamine B 12 est aussi capable d'augmenter la vitesse de croissance des poussins.

   Par exemple, dans une expérience, l'addition de 30 parties par billion de vitamine B 12 à une nourriture de base renfermant de la caséine puri- fiée (dite exempte de vitamines) comme source de protéine provoque une augmentation de la vitesse de croissance telle que le poids moyen des poussins après 16 jours de nourriture avec la nourriture de base avec complément était de 127 grammes, tandis que celui des poussins recevant la nourriture sans le complément n'était que de 99 grammes. 



   Les exemples suivants illustrent les méthodes d'ap- plication de la présente invention, mais il doit être enten- du que ces exemples sont donnés dans leur principe à titre d'illustration et non à titre limitatif. 

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  Exemple 1   Un!gramme   d'un concentré ayant une activité micro- biologique de 3200 unités par mg. fut dissous dans 10 ml d'eau et chromatographié sur une colonne renfermant lOgr. de charbon actif, de préférence lavé à l'acide. La colonne a été lavée parfaitement avec de l'eau et la matière active soumise à un lessivage avec de l'éthanol à 50%. La lessive a été recueillie en   ane   série de fractions d'environ 10 ml. chacune. Les fractions (Inactivité la plus grande, d'après mesure par essai microbiologique, ont été réunies et séchées à l'état congelé. La produit séché (115   mg.   avait une ac- tivité microbiologique d'environ 10. 000 unités par mg., re- présentant un rendement d'environ 50% Exemple 2 
Un concentré de 6.000 unités/mg.

   (14,6g.) renfermant un total de 8 millions d'unités a été extrait trois fois par agitation pendant environ 30 minutes avec 200 ml. de méthanol. Les extraits réunis ont été passés au travers d'une colonne d'environ 7,5 cm. de diamètre renfermant 600g. d'alumine activée. Lorsque la dernière fraction de cette so- lution eut pénétré dans l'alumine, on a ajouté du méthanol qu'on a laissé filtrer à travers la colonne pour le dévelop- pement du chromatogramme. Pendant cette opération, une bande rose s'est déplacée vers le bas à travers la colonne, lais- sant essentiellement la totalité de la couleur brun-jaiine de la solution primitive au sommet de la colonne.

   Le fil- fiât a été recueilli en une série de fractions, parmi les- quelles on a choisi celles montrant l'activité   microbiologi-   que la plus prononcée et/ou la couleur rose la plus prononcée et on les a réunies pour les opérations subséquentes . 



  Cette solution, qui renfermait suivant essai microbiologique 

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 environ 65 millions d'unités, a été évaporée dans le vide à une température en-dessous de 25  jusqu'à consistance légèrement sirupeuse. Pendant l'évaporation, le pH de la solution, qui tend à croître, était maintenu àenviron 6 à 7 par l'addition d'acide chlorhydrique dilué (2,5N) suivant le besoin. Le résidu a été finalement séché sous une faible pression (1 mm. de mercure) à la température ambiante. 



  Exemple 3 
245 mg. de résidu rouge du chromatogramme d'alumine ont été extraits avec 15   ml.   d'éthanol absolu, donnant   34mg   de résidu incolore insoluble et une solution rouge. La solution rouge fournit 218 mg. d'une huile rouge. L'huile et rouge a été dissoute dans 0,5 ml. de méthanol/25 ml. d'acé- tone   fdrent   ajoutés, lorsque furent obtenus un précipité rouge et un liquide surnageant jaune. 



   Ce précipité (31 mg. ) a donné une valeur d'essai de 1 à7 millions d'unités mg* et un maximum d'absorption à 3600A.E   %= 26,9.   



   Ila été précipité 'hors de   l'eau   (0,75ml.) par l'acétone (13 ml.). L'huile rouge en résultant, 1,8 mg, a été de nouveau précipitée d'une solution dans le méthanol avec de l'acétone, sans )nouvelle perte de poids. Le produit montre un maximum   d'absorption   à 3600 A, E %   =51,1.   



   On a dissous environ 12 mg. de cette matière dans 0,7 ml. d'eau et ajouté de l'acétone (3-4 ml.( jusqu'à apparition d'un trouble. la solution déposa des amas de cristaux d'un rouge foncé, en aiguilles, après repos d'une nuit. Après deux jours la liqueur mère fut enlevée et les cristaux lavés avec de l'acétone et séchés; on a obtenu 2.0mg Un complément de 1,4 mg. de cristaux fut obtenu à partir de la liqueur mère. 

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    Exemple 4.    



   Une portion de 6,0 mg. du concentré de vitamine B 12 de l'exemple 3 avec une activité d'environ 1 à2 x   10 u/mg.   a été fractionnée dans un distributeur à dux plateaux à contre-courant avec de l'eau et un mélange de 75% de toluène 25% p-crésol saturé dans les deux phases non miscibles. 



  Deux millilitres de chaque phase furent utilisés par tube et les phases inférieures (aqueuses) furent transvasées. 



  Après remplissage du distributeur, les produits ont été déplacés vers les phases aqueuses par addition de 8 ml. de chloroforme par tube. Les phases aqueuses des tubes numéro- tés   de 2   à 5 (le tube 0 représentant la matière non transfé- rée) ont été réunies, lavées avec du chloroforme et lyophi- liées, donnant 1,1 mg. de concentré de vitamine B   12   rouge amorphe d'une activité   microbioiogique   de 7 x 106 u/mg. 



   Ce produit fut aisément cristallisé par solution dans l'eau et addition d'acétone. La vitamine cristalline B L2 ainsi obtenue pesait environ 0,6 mg. 



  Exemple 5. 



   Une portion de 3,2 mg. de vitamine B   12   cristallisée une fois dérivant de foie a été dissoute dans du méthanol, filtrée et le filtatochentré à siccité dans le vide. 



  Le résidu fut dissous dans 0,15 ml. d'eau et on a ajouté de l'acétone (environ 1 ml.) jusqu'à ce que la solution devienne trouble; la solution fut ensemencée et laissée au repos pour la nuit à la température ambiante. Les cris- taux qui s'étaient déposés furent séparés de la liqueur mère, lavés avec de l'acétone, et séchés. Le rendement fut d'en- viron 2mg. 



   La vitamine B 12 recristallisée présentait, après séchage dans le vide à 100  pendant deux heures, un spectre 

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 d'absorption dans l'ultra-violetdans l'eau caractérisé comme suit : 
 EMI13.1 
 
<tb> Max. <SEP> E1%
<tb> 
<tb> 
<tb> 2780 <SEP> 119
<tb> 
<tb> 3050 <SEP> 68
<tb> 
<tb> 3230 <SEP> 59
<tb> 
<tb> 3610 <SEP> 187
<tb> 
<tb> 4080 <SEP> 28
<tb> 
<tb> 5200 <SEP> 56
<tb> 
<tb> 5480 <SEP> 59
<tb> 
 
Les cristaux en aiguilles, biréfringents (signe d'élongationpositif) ont après séchage les indices de ré- fraction : Ó 1,616; ss, 1.652 ;   et ,   1. 664. 



   Dans l'essai L.L.D., un échantillon de vitamine B 12    recristallisée donnait une valeur.(corrigée pour perte de 6 20,6x106 u/mg.   poids au séchage) de 11,2 x 10   u/mg/   Ceci correspond à une croissance du demi maximum du L. lactis Dorner en pré- sence de 0,000013 ml. de milieu de culture dans les conditions utilisées. 



   Dans le micro-essai de chauffage, la vitamine re- cristallisée B 12 prend une couleur sombre allant jusqu'au noir à environ 210-220 , mais ne se liquéfie pas en-dessous de 300 . 



   Les concentrés de vitamine B 12 obtenus conformément à cette invention possèdent une grande valeur thérapeutique dans le traitement de certains types d'anémie humaine comme l'anémie pernicieuse d'Addison et analogues, ainsi le pro- duit cristallin a produit une réaction   hematologique   positive chez trois patients recevant chacun des injections intra- musculaires respectivement de 150,6 et 8, Quatre patients recevant chacun des injections des concentrés amorphes ren- fermant 20.000 à 40. 000 unités L.L.D. donnèrent des réactions hématologiques fortes ou maxima. Un mg. du produit cristal*! 

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 lin est équivalent a environ 11 x 106   L.L.D.   unités et un a environ   il.000   unités . 



   TABLE I 
 EMI14.1 
 g2±±È2¯±±h1 
 EMI14.2 
 
<tb> Cas <SEP> A
<tb> 
<tb> 
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 14 <SEP> 23 <SEP> 9 <SEP> 42 <SEP> 119
<tb> 
<tb> 
<tb> RBC <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1.7 <SEP> 2.4 <SEP> 2.6 <SEP> 2. <SEP> 8 <SEP> 3. <SEP> 3 <SEP> 4.5
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 6 <SEP> .8 <SEP> 7,8 <SEP> 9.5 <SEP> 9 <SEP> .8 <SEP> 11. <SEP> 0 <SEP> 14.0
<tb> 
 
 EMI14.3 
 l1etics. % 2.4 20.0 1.5 1.0 13.6 1.1 
 EMI14.4 
 
<tb> Unités <SEP> L.L.D. <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 1.8 <SEP> x106
<tb> 
 
Le patient   rentra   à la maison le 45ème jour et n'a pas subi d'autre traitement que celui signalé. 



    TABLE il    
 EMI14.5 
 Vitamine . 2 recristallisée. 
 EMI14.6 
 
<tb> 



  Cas <SEP> B <SEP> C
<tb> 
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 14 <SEP> 23 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 14
<tb> 
<tb> 
<tb> RBC <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1.5 <SEP> 2.6 <SEP> 3. <SEP> 4 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> 2.6
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 4. <SEP> 5 <SEP> 7.0 <SEP> 9.0 <SEP> 7.8 <SEP> 10. <SEP> 0
<tb> 
 
 EMI14.7 
 Retics. % 0.5 27.0 4.0 0.5 a.8 26.0 3.1 
 EMI14.8 
 
<tb> Hct. <SEP> %. <SEP> 14. <SEP> 0 <SEP> 25. <SEP> 0 <SEP> 29.0 <SEP> 17. <SEP> 0 <SEP> 31
<tb> 
 
 EMI14.9 
 WBC x 103 9.0 25.0 9.0 2.3 5.8 Vitamine B joz 150 6 
 EMI14.10 
 
<tb> L.L.D.
<tb> 
<tb> 



  Unités <SEP> 1.6 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 6. <SEP> 6 <SEP> x <SEP> 104
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Cas <SEP> D
<tb> 
<tb> 
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 9 <SEP> 15
<tb> 
<tb> 
<tb> RBC <SEP> x106 <SEP> 1.4 <SEP> 2,6
<tb> 
<tb> 
<tb> Hgb. <SEP> gm. <SEP> 6. <SEP> 8 <SEP> 9. <SEP> 8
<tb> 
<tb> 
<tb> Ratios. <SEP> % <SEP> 2. <SEP> 8 <SEP> 10.2 <SEP> 4. <SEP> 0 <SEP> 2.6
<tb> 
<tb> 
<tb> Hct. <SEP> % <SEP> 17 <SEP> 31
<tb> 
<tb> 
<tb> WBC <SEP> x <SEP> 103 <SEP> 4.2 <SEP> 8. <SEP> 1
<tb> 
<tb> 
<tb> Vitamine <SEP> B12 <SEP> 3 <SEP> 50
<tb> 
<tb> 
<tb> L.L.D.
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  Unités <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 5. <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 105
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 
La vitamine B 12 est également capable d'augmenter la vitesse de croissance des poussins avec une nourriture debase renfermant tous les agents nutritifs connus. Par exem- ple. dans une expérience, une teneur de 0,000003   %   de la vi- tamine cristalline dans la nourriture approduit une réaction telle que le poids moyen des poussins après une période d'ali- mentation de 16 jours était de 124 g., comparé avec un poids moyen de 110 g. pour le groupe de contrôle, dont la ration n'était pas additionnée de vitamine B 12. 



  Exemple 6 
Environ 750 grammes d'un concentré sec sont obtenus par culture d'un filtrat du micro-organisme Streptomyces griseus sur un agent de nutrition convenable et récupération de la matière active hors du bouillon de culture par aesporp- tion de la matière active ,hors. du bouillon de culture, pur -le lessivage de l'adsorbé avec une solution aqueuse de pyridi- ou une pyridine ne/substituée par un groupe alkyle, et par la récupération du concentré brut de la lessive. Ce concentré séché a une activité microbiologique d'environ 1500 à 2000 unités /mg. 



   (L'activité des produits à laquelle on se réfère est détermi- née par une méthode d'essai de réaction de croissance micro- biologique utilisant le Lactobacillus lactis Dorner comme organisme de test, en prenant comme standard (étalon) une pré- paration de foie choisie arbitrairement, représentant une activité de 1000 unités Lactobacillus lactis Dorner par mg.). 



  Ce concentré aêché est ajouté à environ 2,5 litres d'alcool méthylique sec (anhydre). Le mélange est agité pendant en- viron 30 minutes et ensuite filtré. On ajoute ensuite envi- ron 2,5 litres d'alcool méthylique sec au résidu solide etle mélange est agité et filtré. Ce processus est répété avec deux portions successives de 2,5 litres d'alcool méthylique 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 sec.. les filtrats réunis ont une activité micro biologique d'environ 1,2 billion d'unités. 



   Les filtrats réunis sont fractionnés chromatogra- phiquement par adsorption sur de l'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique. De l'alcool méthylique est en* suite introduit dans la colonne et on recueille un certain nombre de fractions de lessive. Ces fractions présentant une activité suffisante (généralement au moins 10. 000 unités /ml.) déterminée microbiologiquement et indiquée habituelle- ment par une coloration rose sont réunies et concentrées à une température inférieure à 30 C, et sous une pression moindre que la pression atmosphérique à environ un dixième du volume initial. S'il se forme une petite quantité de matière blanche insoluble, le mélange concentré est filtré. Le fil- trat est ensuite concentré dans le vide en un sirop épais. 



  On ajoute à ce sirop de l'alcool éthylique absolu et le pré- cipité blanc insoluble qui apparaît est séparé de la solu- tion. On ajoute alors un volume égal d'acétone à la solution rouge clair dans l'alcool éthylique, ce qui provoque un pré- cipité floconneux rouge de séparant de la solution. 



   La matière active précipitée de l'alcool éthylique par l'addition d'acétone est dissoute dans environ 2 ml. d'eau et précipitée à nouveau sous la forme d'une huile rouge par l'addition d'environ 12 volumes d'acétone. L'huile est séparée, dissoute dans environ 1 ml. d'eau, et la solution traitée avec de l'acétone jusqu'à apparition d'un trouble. 



  Après repos, la vitamine B 12 se sépare de la solution sous forme d'amas de petits cristaux rouges en aiguilles. 
 EMI16.1 
 !12¯7. 



   Comme autre exemple, on prépare   cornue   dans l'exemple 1 un précipité rouge floconneux obtenu par l'addi.tion d'acé- tone à la solution rouge clair dans l'alcool éthylique. 

 <Desc/Clms Page number 17> 

 



  Par lavage du précipité avec de l'acétone et séchage, on ob- tient une substance ayant une activité microbiologique d'en- viron 4 millions d'unités.mg. Une seconde portion de même   actinité   est récupérée par addition à la liqueur mère d'un second volume d'acétone. La nouvelle addition d'acétone à la liqueur mère entraîne la précipitation d'une huile rouge qui est recueillie. L'huile est traitée avec unmélange d'al- cool éthylique et d'acétone et une matière solide rouge amor- phe ayant une activité microbiologique d'environ 1, 5 millions   d'unités/mg.   précipite et est séparée. 



     Les   différentes fractions insolubles dans l'acétone séchées   sontéunies,   dissoutes dans environ 4 ml. d'alcool méthylique et la solution est adsorbée sur environ 10 gram- mes d'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique dans une colonne chromatographique,La colonne est ensuite développée avec de l'alcool méthylique et une bande rouge foncé traversala colonne. A   l"apparition   de la couleur rou- ge dans la lessive, on prélève des fractions successives de 10 ml jusqu'à ce que le liquide sorte réellement incolore. 



    Les   trois premières fractions renfermant la plus grande partie de la couleur rouge, sont réunies et évaporées à siccité à une pression inférieure à la pression atmosphérique et une température inférieure à 25 . le résidu sec est dissous dans environ 2 ml. d'alcool méthylique et la solution traitée avec environ 8 volumes d'a- cétone provoquant un précipité rouge amorphe se séparant de la solution. Ce précipité est récupéré par centrifigation et reprécipité sous   unrocessus   similaire à partir d'un mé- lange d'alcool méthylique et d'acétone. Une portion de cette matière ( 5 mg. sur un total de 27,8 mg. ) est dissoute dans environ 0,5 ml. d'eau et la solution traitée avec environ 5 ml. d'acétone.

   Après repos, des amas de cristaux rouges en 

 <Desc/Clms Page number 18> 

 aiguilles de vitamine B 18, ayant une activité mdcroblogi- que d'environ 11 millions d'unités mg se séparent de la solution et sont recueillies Exemple 8 
Environ 1388 grammes d'un concentré séché composé d'un produit d'élaboration du Streptomyces griseus et ayant une activité microbiologique d'environ 2000 unités/mg. sont ajoutés à environ 16 litres d'alcool méthylique sec. Le mélange est agité pendant environ 30 minutes et filtré. 



   Le filtrat est adsorbé sur environ 15 kg. d'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique dans une colonne chromatographique, La colonne est alors développée avec de l'alcool méthylique etun certain nombre de fractions de la lessive sont recueillies. 



   Les fractions chromatographiques ayant l'activité microbiologique la plus prononcée sont réunies et concen- trées dans le vide à environ un dixième du volume initial. 



   Le mélange concentré est filtré et le filtrat à nouveau con- centré dans le vide en un épais sirop. On ajoute à ce sirop de l'alcool éthylique et le mélange est filtré. Le filtrat est ensuite traité avec une quantité suffisante d'acétone avec agitation pour provoquer la complète précipitation de la substance rouge y contenue. te précipité rouge est ree cueilli et redissous dans environ 100 ml. d'alcool méthylique. 



   La solution est ensuite versée lentement sous agitation dans environ 1 litre d'acétone. Une substance légèrement rouge floconneuse précipite de la sotion et est recueillie.   Par   lavage et séchage du précipité, on recueille 7,8 g. d'une poudre rouge, ayant une activité microbiologique d'environ 
65.000 unités/mg. 



     10.0   grammes de concentré ayant une activité moyen- ne de 80.000 unités/mg. sont dissous dans l'alcool   .méthyli-   

 <Desc/Clms Page number 19> 

 que et la solution absorbée sur environ 500 grammes d'alumine activée humidifiée avec de l'alcool méthylique dans une colon- ne chromatographdque. La colonne est ensuite développée avec de l'alcool méthylique et on recueille des fractions séparées de la lessive. Les fractions ayant une activité microbiolo- gique prononcée sont sélectionnées, réunies et évaporées à siccité sous une pression inférieure à la pression atmosphé- rique. Le résidu est extrait avec de l'alcool éthylique absolu et la substance blanche qui ne se dissou.t pas est enlevée. 



    La   solution rouge dans l'alcool éthylique est traitée avec un excès d'acétone, provoquant la séparation d'une huile rouge insoluble. L'huile est recueillie et dissoute dans environ 10 ml. d'eau, La matière active, avec un peu de matière Inerte incluse, est de nouveau précipitée sous forme d'huile par addition d'un excès d'acétone. La substance hautement active rouge est dissoute à nouveau dans environ 3 ml. d'eau et la solution traitée avec de l'acétone jusqu'à ceque l'on observe un léger trouble. A.près repos, des cristaux rouges, en aiguilles, de vitamine B 12 se séparent de la solution. 



   Des modifications peuvent être apportées dans le pro- cessus de l'application de la présente invention sans se de- partir de l'esprit et de la portée de celle-ci et l'invention se trouve limitée seulement par les revendications annexées.

Claims (1)

1. REVENDICATIONS.

   1.- Procéda pour la préparation, de vitamine B 22 qui cousis- te à soumettre une préparation de foie ayant une activité dé- passant 1000 unîtes par mg. ou une solution d'un concentré brut compose principalement d'un produit d'élaboration du Streptomyces griseus il' action d'une colonne de uatiere ac- tivée, et à récupérer cette vitamine sous une forme puri- fiée.

   2.- Procédé suivant la revendication 1, dans lequel la ma- tiàre activée est l'alumine activée.

   3. - Procédé suivant les revendications 1 et 2, dans lequel le concentré de foie est extrait avec un alcool aliphati- que inférieur, la colonne est soumise à un lessivage avec un alcool aliphatique inférieur après passage de l'extrait alcoolique à travers elle, la solution alcoolique formée est concentrée à siccité, le résidu est dissous dans un al- cool aliphatique inférieur, et la vitamine B 12 est précipi- tée par addition d'un solvant organique.

   4.- Procédé suivant la revendication 1, dans lequel l'ex- trait de foie est adsorbé sur une colonne de charbon de bois activé.

   5.- Procédé suivant les revendications 1 à 4, dans lequel la vitamine B 12 est précipitée d'une solution de lessievage de la même par addition d'acétone.

   6.- Procédé suivant les revendications 1 à '+, dans lequel la vitamine '-, 12 est précipitée d'une solution de lonsivage de la même par addition d'éther.

   7.- Procédé suivant la revendication 5, dans lequel la ma- tière active précipitée est dissoute dans l'eau, la solu- <Desc/Clms Page number 21> tion traitée avec de l'acétone, et la vitamine B 12 isolée sous forme cristalline par dissolution répétée de la matière active dans l'eau, et précipitation avec de l'acétone.

   8.- Procédé suivant les revendications 3 à 5 et 7, dans lequel le charbon de bois est soumis àun lessivage avec de l'éthanol à 50% la solution alcoolique résultante est concentrée a sic- cité, le résidu résultant est entrait avec de l'éthanol et le résidu insoluble éliminé, la solution alcoolique restante ert concentrée ésiccité et le résidu résultant est dissous dans le méthanol.

   9.- Procédé suivant les revendications 1 à 3 et 5, comprenant le lavage de la colonne avec une quantité additionnelle d'un alcool aliphatique inférieur, l'évaporabion de la solution alcoolique résultante et la di ssolution du résidu dans un al- cool aliphatique inférieur, la précipitation de la matière active par traitement avec de l'acétone, la purification du produit formé par la distribution à contre-courant entre de l'eau et un mélange de solvants organiques, le déplacement de la matière active dans la phase eau par addition de chlo- roforme, et la précipitation de la vitamine B 12 par le trai- tement de la solution aqueuse avec de l'acétone.

   10. - Procédé suivant les revendications 1,3, 4 et 5, compre- nant le lessivage du charbon de bois avec un solvant organique, la concentration de la solution résultante à siccité, la disso- lution du résidu résultant dans un alcool aliphatique infé- rieur, le passage de la solution alcoolique formée à travers unecolonne d'alumine activée, le lavage de la colonne avec une quantité additionnelle d'un alcool aliphatique inférieur, l'évaporation de la solution alcoolique formée et la dissolu- tion du résidu dans un alcool aliphatique inférieur, la. préci- pitation de la matière active par traitement à l'acétone,

   la purification du produit formé par la distribution à contre- <Desc/Clms Page number 22> courant entre de l'eau et un mélange de o-crésol et de toluène, le déplacement de la matière active dans la phase eau par addi- tion de chloroforme, et la précipitation de la vitamine B 12 par traitement de la solution aqueuse avec l'acétone.

   11.- Procédé suivant les revendications 1 et 2, dans lequel la vitamine B 12 est préparée sous une forme amorphe par extraction d'un concentré de foie avec un alcool aliphatique inférieur, le passage de la solution alcoolique résultante â travers une colonne d'alumine activée, le lavage de la colonne avec une quantité additionnelle d'un alcool aliphatique inférieur, l'é- vaporation de la solution alcoolique résultante et la disso- lution du résidu dans un alcool aliphatique inférieur, la pré- cipitation de la matière active par traitement avec de l'acétone, la purification du produit formé par une distribution à contro- courant entre de l'eau et un mélange de solvants organiques, le déplacement de la matière active dans la phase eau par l'addi- tion de chloroforme et la récupération de la vitamine de la phase eau.

   12.- Procédé suivant les revendications 1 et 2, dans lequel un concentré brut composé principalement d'un produit d'élabora- tion du streptomyces griseus est extrait avec un solvant, un fractionnement chromatographique est effectué par addition de la solution dans le solvant à une colonne de matière adsorban- te, la colonne est lavée avec un solvant pour enlever par les- sivage la substance active hors de la matière adsorbante et l'on récupère de la lessive des cristaux rouges ayant la com- EMI22.1 position approximative de 55,7' C, 6, 5, H, 13, 9, ô N, 5,2; P et 1i-, ZI-; Co.

   13.- Procédé suivant les revendications 1,2 et 12, comprenant la concentration de la lessive à un petit volume, l'addition d'un alcool aliphatique inférieur au concentré, l'addition d'un <Desc/Clms Page number 23> solvant miscible dans lequel la matière active est insolo- ble, la récupération de la matière active, ladissolution de la matière dans l'eau, le traitement de la solution avec de l'acétone etl'isolement de la vitamine cristalline B 12 EMI23.1 ayant la composition approximative de 5'?,7 %' C, 6,%' H, 13)9/,* N, 5,2% P, et 4,4% Co, par dissolution répétée de la matière ac- tive dans l'eau et précipitation avec de l'acétone.

   14.- Procède suivant les revendications 1,2,12 et 13, dans lequel le solvant pour le lavage de la colonne, après frac- tionnement chromatographique, est un alcool aliphatique infé- rieur.

   15.- Procédé suivant les revendications 1,2,12,13 et 14, dans lequel le solvant pour extraire le concentré brut composé principalement d'un produit d'élaboration du streptomyces grisous est l'alcool méthylique ; 16.- Le procédé suivant les revendications 13 à 15 dans le- quel l'alcool aliphatique inférieur ajouté à la lessive con- centrée est l'alcool éthylique.

   17.- Procédé suivant les revendications 1,2 et 12à 15, compre- nant le fractionnement chromatographique répété de la solution dans le solvant.

   18.- Procédé en substance comme décrit ci-dessus.

   19.- Vitamine B 12, matière rouge ayant la composition appro- EMI23.2 ximative de 5,7,",' C, 6,5'% H, 13)9%' N) ,2%' P et 4,'+% Co, brs- que préparée suivant le procédédes revendications 1 à 18.

   20.- Comme produit nouveau, la vitamine pure B 12 laquelle est un solide de coloration roage cristallin montr ant des '.ondes EMI23.3 d'absorption forte à 278O A , 3610 Â et :;l.t.80 1, qui a les in- dices de rF:fractvon 1, 1 6 , 1, û52, 1, 664, et qui a la.c.om-' posi tion approximative de ,7%' C, 6,5%' H, 13,9fi I'1> 5,2:; P et 4,)-Lc//.' Co, lorsque préparée suivant le procédé des reven- dications 1 à 18.