BE627002A - - Google Patents

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BE627002A
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verrucarin
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Description

       

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Procédé d'isolement de nouveaux composés. 
 EMI1.1 
 --.---..--.. 



   La présente invention a trait à un procédé de sépara- tion et d'isolement des nouveaux composés à action   antibiotique,   verrucarine A, verrucarine et roridine A, à partir des liquides de culture   et/ou   des mycéliums des souches mycétiennes   Myrothecium     verrucaria   (Albertini et Schweinitz) Ditmar ex   ries   et Myrothecium roridum Tode ex Fries. 



   Le présent procédé de séparation et d'isolement de la verrucarine A, de la verrucarine B et de la roridine A consiste   à   séparer en ses composantes le mélange d'antibiotiques par pré- 
 EMI1.2 
 cipitation, partage, adsorption ehroraatographique, chromatographie de partage ou partage à contre-courant (partage   fractionné).'   
On isole des colonies des   mycètes   Myrothecium   verrucaria.   et Myrothecium roridum à partir d'échantillons de sol d'origines 

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 les plus variées. Du point de vue morphologique, toutes ces souches correspondent aux descriptions telles   qu'elles   sont données par exemple dans Gilman, J.C.   1957,   A Manual of Soil Fungi, 2ème éd. 



  The lova State College Fress, Ames, Iowa, U.S.A. Les différentes souches isolées, dont certaines sont obtenues à partir du même échantillon de sol, peuvent présenter des caractères différents, aussi bien au point de vue morphologique, par exemple par leur plus ou moins grande tendance à la formation de spores, qu'au point de vue physiologique, par exemple par la composition du milieu de culture dont elles ont besoin pour la production des antibio- tiques. 



   On peut utiliser comme matière première non seulement le liquide de culture ou le mycélium des souches des mycètes Myrothecium verrucaria et Myrothecium   roridum,   mais aussi le li- quide de culture et le mycélium de variants de ces organismes, comme par exemple ceux que   l'on   obtient par sélection de secteurs (variations sectorielles) ou de mutants, en particulier après   ac-   tion des rayons ultraviolets ou des rayons X. 



   On peut par exemple réaliser la culture en culture superficielle sans agitation, ou bien en culture submergée, dans des fermenteurs, en secouant ou en agitant avec de l'air ou de l'oxygène. 



   Il est possible de cultiver les souches de Myrothecium verrucaria et Myrothecium roridum sur des milieux très variés   con-        tenant les éléments nutritifs usuels. Cela signifie qu'elles peu- vent utiliser comme source de carbone le glucose, l'amidon, la dextrine, le lactose, le saccharose, etc... comme source d'azote   des j   composés azotés organiques et minéraux tels que la peptone, la levure ou les extraits de viande, le sulfate d'ammonium, le ni- trate   d'ammonium,   les amino-acides, etc, ainsi que les sels minéraux et éléments acides usuels. 



   La demanderesse a trouvé qu'il est possible d'isoler, à partir des liquides de culture de plusieurs souches de   Myrothecium .   

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   verrucaria   et Myrothecium   rorldum,   au moins 8 composantes sous une forme bien définie, pure et cristallisée. La présence et les rap- ports quantitatifs de ces composantes varient suivant les condi- tions de culture. Conformément au présent procédé on extrait les corps actifs du filtrat de culture avec du chloroforme* du dichlo-   rom6thane   ou de l'acétate d'éthyle.   Apres   réduction à un Moindre volume, les extraits ainsi obtenus sont lavés à la lessive de soude caustique et a. l'eau à 0 C, lorsque le pH du liquide de culture initial est   inférieur à   3,5.

   Les extraits obtenus à partir de   li.   quides de culture présentant un pH supérieur à 3,5 sont en outre lavés avec l'acide chlorhydrique binormal. Ceci permet d'éliminer les impuretés colorées inactives. 



   Après évaporation du solvant, on obtient un produit brut huileux   d'une   coloration allant du jaune au brun d'où l'on peut isoler un produit cristallisé brut, par addition d'éther, plus ou moins facilement suivant la quantité d'impuretés huileuses présentes. L'analyse par chromatographie en couche mince montre qu'il s'agit principalement de verrucarine A, mais qu'il contient également de la verrucarine   B   et parfois de la roridine B, comme constituants secondaires, lorsqu'il a été préparé à partir de cul- tures de M. verrucaria.

   Lorsqu'on a opéré avec des cultures de M. roridum, le produit cristallisé brut obtenu est principalement constitué de roridine A.,mais il contient généralement aussi, comme produits accessoires, de la roridine B, de la   verruoarine   A et de la verrucarine   B.   La séparation eu composantes bien définies se fait par une ou plusieurs chromatographies d'absorption successives, effectuées soigneusement, sur des colonnes d'oxyde d'aluminium ou de gel de silice, et par recristallisations répétées dans des mé- langes acétone-éther, méthanol-éther, chloroforme-éther-éther de pétrole et dichlorométhane-éther; au cours de ces processus, il est nécessaire de contrôler la pureté des fractions par chromatogra- phie en couche mince. 



   C'est ainsi qu'enpartant des filtrats de culture de M. verrucaria on parvient généralement à isoler en quantités variable , 

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 des fractions   élevées   par du chloroforme et par des mélanges 99/1 et 98/2 de chloroforme et de   méthanol,   les   verrucarines   C, D   et 3   et les   roridines   A et B, à l'état pur et cristallisé, tandis que le   domposé   principale la verrucarine A, ne peut   généralement   pas être obtenu a l'état pur de cette façon, mais est toujours encore souillé de verrucarine il  
On peut obtenir de la même manière, à partir des fil- 
 EMI4.1 
 trats de culture M.

   roridum, la roridine A à l'état pur et cris-   tallisé   comme produit principal, et également comme produits   accès**   res les   roridines   B et C ainsi que les verrucarines A et B, elles aussi sous forme pure et   cristallisée.   Les premières   fractions   
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 chromatographiques éludes au benzène abandonnent des constituants huileux qui sont rejetés. Les fractions suivantes, éluées au chloroforme-méthanol (98/2), (95/5)  (9/1 (4/1) et (1/1)p      donnent un produit amorphe.

   La séparation du mélange cristallisé de   verrucerines   A et B en composantes bien définies se fait pas chromatographie de partage, avec   l'eau   comme phase stationnaire   et, .   
 EMI4.3 
 comme phase mobile, des mélanges de benzine-chloroforme saturés d'eeui On utilise comme support de la phase stationnaire de la terre 
 EMI4.4 
 de diatomées. Il y a au début séparation de la verrucarine B à l'é- tot pur; dans les fractions ultérieures, on trouve uniquement de la   verrucarine   
Le tableau 1 suivant donne des indications sur les   sub-   stances isolées   à   partir de diverses souches de M. verrucaria et M. roridum. 
 EMI4.5 
 



  T A b L 3 A U 1 mir2lh2gium a) Souche 8 118 'exrttcar3.ne A Verrucarine B Verrucarine 0   Koridine   B b) Souche S 750: Verrucarine A 
Verrucarine B 
 EMI4.6 
 Roridine à 

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 c) Souche 8 833: Verrucarine A 
Verrucarine   B   
Verrucarine D 
Verrucarine E Myrothecium roridum a) Souche S 973: Roridine A 
Substance A (non isolée à l'état pur) b) Souche 8 1135Roridine A 
Roridine B 
Roridine C   Verrucarine   A 
Verrucarine   B   
Substance A (non isolée à l'état pur) 
L'emploi de cultures des souches S 973 et S   1135   de M. roridum permet de mettre en évidence par chromatographie un autre composé qui est désigné sous le nom de substance A. La substance A n'a pas encore été isolée sous forme pure; elle n'existe que mélangée à la roridine A. 



   L'extraction du mycélium d'une culture de la souche S 118 de M. verrucaria par du méthanol aqueux donne, après puri-   fication   de l'extrait par partage entre eau et acétate d'éthyle, un produit brut contenu dans les portions solubles dans l'acétate   d'éthyle,   que l'on peut ensuite séparer, après vérification chroma- tographique sur colonne de gel de silice, en verrucarine A brute et cristallisée (contenant encore de la verrucarine B) et en rori- dine   B.   



   A côté des méthodes classiques permettant de caractériser les composés cristallisés isolés, la chromatographie en couche mince se montre un instrument précieux de vérification de la pureté des fractions amorphes ainsi que des composés cristallisés. L'exemple 13 décrit en détail un mode d'exécution partiellement adapté à ce but. Il est par exemple très difficile de déterminer la pureté des verrucarines A et B sans utiliser l'analyse   ohromatographique.   

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   Ci-dessous sont données les caractéristiques   essentiel-   les des substances isolées. 
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  L'antibiotique verrucarine A forme, après reoriltal11- sation dans des mélanges méthanol-éther, ecétone-dther ou chloro- forme-éther-éther de pétrole, des paillettes rectangulaires 
 EMI6.2 
 incolores qui ne fondent pas en dessous de 3SO C. Au voisinage de   280 C,   les cristaux commencent à prendre une coloration jaune à brune due à un début de décomposition.

   Ils sont insolubles dans 
 EMI6.3 
 l'eau, l'éther dléthyl1que, l'éther úi1sopropyllque et dans les hydrocarbures saturés liquides (pentane, hexane, heptane, cyclo- hexane); par contre, ils sont solubles dans les cétones inférieures (acétone,   méthyléthylcétone,   etc...), dans les alcools inférieurs (méthanol, éthanol, propanol, etc...); dans le   diox&nne,   dans les hydrocarbures halogènes à chaîne courte   (dichlorométhane,   chloro- forme, tétrachlorure de carbone), dans la pyridine, le benzène 
 EMI6.4 
 et le toluène. Les pouvoirs rotatoires spécifiques sont: a""2 + 206 20 (chloroforme) et L-Q-Ï2 . + 208  + 2  (dioxanne). 



  Les analyses élémentaires donnent les pourcentages suivantes Cri64,5? 64 64,2% H:6,9J 7,0; 6,7% et Os 29,0; 28e4; 28,7%. 



  L'antibiotique ne contient ni azote, ni soufre, ni halogène La détermination du poids moléculaire selon la méthode de hast (camphre) donne un poids moléculaire de 517 et la   microdétermina-'   tion thermoélectrique donne 527. Ces résultats sont en accord avec la détermination du poids moléculaire faite en mesurant la radioactivité du composé acétylé obtenu avec l'anhydride   ecétique   marqué par 14C, laquelle donne un poids moléculaire de 520. Cet faits permettent d'admettre comme   formule   brute la plus probable 
 EMI6.5 
 'C27H309 (502,5).

   Le spectre d'adsorption UV dans l'éthanol présente un m.ri.mun à 260 a,u; log=4,25 (calculé pour un poids moléculaire de   502, 5)  Le spectre IR d'une solution de l'antibiotique dans le dichlorométhane présente des bandes (les plus intenses sont   souli-   
 EMI6.6 
 gnées ) à 0, 2970, 1,71&p A6?5f 5' ,1a75,, 1410, 1385p 1213, 1190, 1186, 9b8, 878 et 820 r,t"f. A l'état solide (suspension dans 

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 EMI7.1 
 le nujol) on observe des bandes à 3 560-3580. 2930, z70, 1709. 1 22Z1, i621, 1587, 1457, 1377, 127$, 1213, 1195, 1123, 1103, 10S5, 1053e 1032, 1023, 9730 967, 887, 832 cm"i.

   La verrucarine A ne | contient pas de groupe méthoxy, contient 5 de carbone méthy11- i: que (selon Kuhn .icoth, de 0,17 a. 0,25% d'hydrogène mobile r: (mesure faite par la méthode de   Zerevitinov) ,   prend par micro  hydrogénation 3 molécules d'hydrogène, ne donne, avec le tétrani-   trométhane   dans le chloroforme, aucune coloration jaune, décolore immédiatement les solutions de permanganate de potassium dans , l'acétone et de brome dans le chloroforme. Les réactions de   Tollens,   
 EMI7.2 
 .f!'ehl1ng, Molisch, Légal, Zimmermann et Liebermann donnent des résultats négatifs. Il en résulte que la verrucarine A est un compo neutre   lipoïdosoluble.   



   L'antibiotique verrucarine B a des propriétés très voisines de celles de la verrucarine A, qu'il a très souvent ten- dance à accompagner lors des cristallisations. Il cristallise dans l'acétone-éther sous forme d'aiguilles qui ne fondent pas au-dessous 
 EMI7.3 
 de j60 C. Aux environs de 280OU les cristaux commencent à. prendre une coloration allant du jaune au brun, ce qui indique une décom- position.

   Ils sont insolubles dans l'eau, l'éther   diéthylique,   
 EMI7.4 
 l'éther diisopropylique et dans les hydrocarbures saturés liquides (pentnne, hexane, heptane, cyclohexane), solubles par contre dans les cétones a bas poids moléculaire (actone, méthylthylcétone, etcta les alcools à bas poids moléculaire (méthanol,   ôthanol,   propanol,   etc.),   dans le dioxanne, dans les hydrocarbures halogènes à chaîne courte   (dichlorométhane,   chloroforme, tétrachlorure de carbone), dans la pyridine, le benzène et le toluène. Les pouvoirs rota- toires spécifiques dépendent beaucoup, ce qui est surprenant, de 
 EMI7.5 
 la nature du solvant. On trouve par exemple a"",D3 = + 94' + 2  #* ***22 dans le chloroforme; L c",%pz = + 10. + 10 dans le dioxanne et L a3 1470 20 dans le benzène.

   Les analyses élémentaires donnent les résultats suivants: C:65,4 et 64,7%; H:6,5 et braz et 0:28,1 et   28,9%.   La verrucarine B ne contient pas d'azote, de 

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 soufre ni d'halogènes. La détermination du poids moléculaire faite selon la méthode de Hast (camphre) donne les valeurs de 629 et 645; la mierodétermination thermoélectrique donne 490. D'après ces résultats on peut envisager les formules brutes Gx'2uy(5fl0,5)' et peut-être Cbdfll2 (662xl) et Ch,lab64,7). Le spectre d'absorption UV dans l'éthanol présente un maximum à 259 a/ut log - 4,35 (calculé pour un poids moléculaire de 4901. Le spectre IR d'une solution dans le dichlorométhane présente des bandes à 2880, 17.¯6.. 7.01, 1670. L621p IL81., 1419, 1240, 1100, 1080, 1038, 995, 965 et 877 ci-'.

   A l'état solide (suspension dans le nujol), il existe des bandes a s 29300 2885, 1736. 17."2 1675. ;1, 590. j 1460, 1378, 1263, 1200, 1104, 1087, 1038, 97fil, 892, 825, 740 et 646 cm-1. Le composé ne contient pas de groupes mthoxy ni d'hydrogène mobile (Zerevitinov). Par mierohydrogénation, il absorbe 3 moles   d'hydrogène(si   l'on admet un poids   moléculaire   de   670)   ou 4 moles d'hydrogène (si l'on se base sur un poids moléculaire de 
 EMI8.2 
 40). Il contient 219% de carbone méthylique (selon Kuhn-Hoth). 



  De même que la verrucarine A, la verrucarine B est un composé neu- tre   lipoldosoluble.   



   La verrucarine C ne se forme que dans certaines cul-        tures   et toujours en très faibles quantités. Elle cristallise dans le méthanol-éther ou l'acétone-éther sous forme de prismes incolo- res fondant de 223 à 224 C.      



   11 en est de même pour la verrucarine D, qui n'est pas obtenue dans toutes les conditions de culture et, en tout cas, en quantités   extrêmement   faibles. Elle cristallise dans un mélange 
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 d'éther et d'éther de pétrole sous forme d'aiguilles j'ondwit entre 1270 et 1280C. 



   L'antibiotique roridine A s'obtient, après cristalli- sation dans l'acétone-éther, sous forme de cristaux incolores 
 EMI8.4 
 qui fondent soit entre 1910 et 196 C, soit entre 1980 et 204 C. 



  Ils sont facilement solubles, dans les cétones à bas poids molécu- laire (acétone, méthyléthyl-cétone)y dans les alcools à bas poids 

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 EMI9.1 
 ddthanolp éthanol, propanol), dans le dioxanne,, dans "11\ ' 1) tttl' h les 'h;4toi IWI 'res halogènes à chaîne courte (dichlorométhane, chlo- reforma, tétrachlorure de carbone) et dans la pyridine. Le produit est difficilement soluble dans l'eau, l'éther dléthyllque, l'étH8 d!ljioP111qUe et dans les hydrocarbures saturas liquides 
 EMI9.2 
 (pentane, hexane, heptane, cyclohexane), le benzène et le toluène. 
 EMI9.3 
 



  Le pouvoir rotatoire spécifique est de 22 a + 129* ± 1. 



  ..ans le c'rorforme). Les analyses élémentaires donnent les r6- sulUijsî . .st ç6,i! R 5,4d3 Ht7p4 et Ot27p4j 26,b,9. La détermina- tion du moléculaire selon Hast (camphre) donne les valeurs 3 t la microdétermination thermoélectrique donne 543. 



  U en ful1 que l'on peut proposer comme formule brute pour la roridine A UIHJUU7(406,,), BUs 49,6) et CUuy 53,b  S36).. spectre d'absorption dans l'éthanol présente il spectre d'absorption OV dans l'ethanol présente un maximum à 263 m,uj .o 4,27 (basé sur un poids moléculaire.de *>.*.$, 6). Le spectre le de sa solution dans le dichlorom4thene pré- sente des bandes à zou, 370. 2970, ;i721-24, 11Q2, 637. 1600, il80, 11231 1100, 1085p 103, 1008, 970, 927, z.3, 813 et 650 cm"1* A 1'tat tSiiSe (soutenu dans KBr), on observe des bandes intenses à 1 K7.UJ I'b, 2860, 1742. 1704464, J94, 1482, 1418, 135, 1170-80, l1J,j 1103, 1082, 1037, 972, 815, 755 et 650 cai f.

   On se trouve en irence d'un composé neutre lipoldosoluble. bh roridine a s'obtient, après recristallisation dans l' acét01:Ht...Clti1roro:-me..m;thanol, sous forme d'aiguilles ou de pail- 3 tteÉj tl 1.$kes fondant entre 14JO et 149*Co Les cristaux sont flSlilM (Ht s8;.ubles dans les cétones à chaîne courte (acétone, tkll H!tbtone), les alcools à chaîne courte (méthanol, éthanol, IropBHUi; 1M hydrocarbures halogènes à chaîne courte (dichloro- mèthanej ttft,oforme, tétrachlorure de carbone), dans le dioxine, 1. bonttioi it la pyridine. Ils sont peu solubles dans l'eau et dans 
 EMI9.4 
 les hydrocarbures saturés liquides (pentane, hexane, heptane, cycle- 

 <Desc/Clms Page number 10> 

 
 EMI10.1 
 hexane). On trouve, pour le pouvoir rotatoire spécifiques les valeurs suivantes: /--C&-/ ,23 D a -1230 i 20 (chloroforme) et L-a-7' . 



  -126" + 20 (benzène). L'analyse élémentaire donne les valeurs sui- vantes! 0 m 83,8 H:ll,l et O:4,8. La détermination du poids mo-   léculaire   selon Hast (camphre) donne une valeur de 318 et la micro- détermination thermoélectrique donne 426. En partant de ces   résul-   
 EMI10.2 
 tats, on peut admettre les formules brutes C21HJ20  *5) et C2SM4bU (?,6). Le spectre d'absorption UV dans l'éthanol est vide* Dans le spectre 111. (comprimé dans Sur) on trouve des bandes 4Ct?-,4,5,ü¯, 29èU# 2860, 1&&, , 1460, 1370, 1068, 1040,98$, 970, S.)3 et 804 cm*1, ear microhydrogénation, il y a absorption de 4 à 5 moles d'hydrogène (en admettant un poids moléculaire de 318). 
 EMI10.3 
 



  L'antibiotique verrucarine A possède une puissante action inhibitrice vis-à-vis de divers microorgan,s,nes. L'activi- té inhibitrice de la croissance de la verrucarine A a été évaluée par la méthode des dilutions couramment utilisée dans ce but. 



  On a mesuré la concentration la plus faible du   composé   possédant, pour chacun des germes, un effet inhibiteur total ou partiel, mais important, dans un milieu de culture approprié. On a utilisé des 
 EMI10.4 
 concentrations allant de 10.4,3 à 10" ou de 10-4 à 10 *"8, Le tableau suivant donne le résultat des diverses évaluations. 

 <Desc/Clms Page number 11> 

 



  -log de la concentration la plus basse ayant une action inhibitrice sur la croissance 
 EMI11.1 
 
<tb> Organisme <SEP> totale <SEP> partielle <SEP> Durée <SEP> de
<tb> 
<tb> 
<tb> essayé <SEP> l'incuba*.
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  , <SEP> tion <SEP> en
<tb> 
<tb> heures
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Saccharomyces
<tb> 
<tb> 
<tb> cerevisiae <SEP> 5,8 <SEP> 6,3 <SEP> 6
<tb> 
<tb> 
<tb> 5,8 <SEP> 6,3 <SEP> . <SEP> 20.
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  5,3 <SEP> 5,8 <SEP> 40
<tb> 
<tb> 
<tb> Candide <SEP> albicans <SEP> 5,0 <SEP> 5,5 <SEP> 20
<tb> 
<tb> 
<tb> Candida <SEP> albicans
<tb> 
<tb> 
<tb> Souche <SEP> Dermat.univ.
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  Klinik <SEP> ZUrich, <SEP> Nr. <SEP> 5e5
<tb> 
<tb> 
<tb> 1101 <SEP> A <SEP> 5,5 <SEP> 6,0 <SEP> 20
<tb> 
<tb> 
<tb> Candida <SEP> tropicalis <SEP> 6,3 <SEP> 7,8 <SEP> 6
<tb> 
 
 EMI11.2 
 Klinik Zurich Nr. 5,8 6,3 20 
 EMI11.3 
 
<tb> 169/61 <SEP> 5,3 <SEP> 6,3 <SEP> 40
<tb> 
<tb> Candida <SEP> krusei <SEP> 6,3 <SEP> 6,8 <SEP> 6
<tb> 
<tb> A <SEP> Souche <SEP> Inst.trop. <SEP> 6,3 <SEP> 6,8 <SEP> 20
<tb> 
<tb> med. <SEP> London <SEP> N . <SEP> 270 <SEP> 6,3 <SEP> 6,8 <SEP> 40
<tb> 
<tb> 
<tb> Torulopsis <SEP> glabrata
<tb> 
 
 EMI11.4 
 Souche Cbe Nr.

   18 4,0 5,0 20' 
 EMI11.5 
 
<tb> Absidia <SEP> lichtheimi
<tb> 
<tb> souche <SEP> CbS-Lendner <SEP> 5,0 <SEP> 5,5 <SEP> 20
<tb> 
<tb> Aspergillus <SEP> fumigatus <SEP> 5,5 <SEP> 6,0 <SEP> 20
<tb> 
 
 EMI11.6 
 laastomyces brasiliensis 5,5 6,0 20 richaph.gpseum 4,3 5,3 3 
 EMI11.7 
 
<tb> 7
<tb> 
 
 EMI11.8 
 Achorion quinckeanum 4,3 5,3 3 Souche Derjuat.Univ. 
 EMI11.9 
 
<tb> 



  Klinik <SEP> Zurich <SEP> Nr. <SEP> 4,3 <SEP> 7-
<tb> 
<tb> 964 <SEP> 4,3 <SEP> 14 <SEP> . <SEP> , <SEP> , <SEP> 
<tb> 
<tb> {sarrette. <SEP> marcescens <SEP> 4,3 <SEP> 6
<tb> 
<tb> 4,3 <SEP> 20
<tb> 
 
 EMI11.10 
 C t'roteus mirabilis 4,3 6 Souche NCWC 5887 4,3 20 Pî3eudomones aeruginosa 4,3 6 
 EMI11.11 
 
<tb> 4,3 <SEP> 20
<tb> 
 
 EMI11.12 
 Mi 11 eUXI\Q11':Lt.1t.JU. 



  A c levures et autres champignons bouillon de wlture ifco sauf B (à l'exception de Saccharomyces cerevisiae ? bouillon maltoaé de Sabouraud; Torulopsis glabra- ta) . 



  B = dermatophytes Maltose-Agar de Sabouraud. 
 EMI11.13 
 



  C Il germes gram négatifs bouillon de culture D*f00  , L'activité de la verrucar1ne A, de la verrucarine B et de la roridine A, vis-à-vis des tumeurs animales, fut étudiée sur les tumeurs expérimentales d'inoculation chez la souris et chez le 

 <Desc/Clms Page number 12> 

 
 EMI12.1 
 rat. Parmi les tumeurs animales qui se sont montrées s.ns1be' aux produits, figurent la tumeur ascitique d'Ehrlich, le sarcome " 180, le sarcome 37 de la souris et le sarcome Yoshida du rat.

   Les tableaux suivants renseignent sur les donné" et 111 les r8Ultat. 1,: des essais effectués avec la verrucarine Ae t, T,,p.r1ne B }# , et la roridine A sur quelques tumeurs an11Ua+8' Verrucarine A --. --- 
 EMI12.2 
 :i9.1.ertUl\l.UD I 
 EMI12.3 
 
<tb> Sature <SEP> de <SEP> Dose <SEP> Durée <SEP> Inhibi- <SEP> Nombre <SEP> Nombre <SEP> ;

   <SEP> 
<tb> 
 
 EMI12.4 
 Nature ,Dose D tion dsani- dyani- 
 EMI12.5 
 
<tb> la <SEP> rois <SEP> en% <SEP> maux <SEP> maux <SEP> - <SEP> , <SEP> 
<tb> 
 
 EMI12.6 
 tumeur par jour en uti- morte tumeur 3  ut1- morts lises ¯¯¯¯ î' 0,36 7 jour. 94   0 que d-Ibrlich O,38mg/kg jours 
 EMI12.7 
 
<tb> de <SEP> la <SEP> souris
<tb> 
 
 EMI12.8 
 Sarcome 180 sarcome 180 0,12k, jour, de la souris Oxl25mg/kg jours 23 
 EMI12.9 
 
<tb> Sarcome37
<tb> 
 
 EMI12.10 
 de la souris 0,75mg/kg 7 jour. 43 de la souri. ,,p mg/kg 8 jours 33 Yoshida du rat 0,05mg/kg 14 jours 35 ' Verrucarine B oéranc1 Nature de Dose Durée Inh1bi- Nombre Nombre la Dose Dure. tion dpani. d'mi.

   tumeur par jour en maux maux tumeur uti- morts lises ¯¯¯¯ Tumeur tlsc1- dlich llümg/kg 6 jours 84 6 0 de la souris 3po'mg/kg 7 jours 95 6 1 Sarcome 37 1,0 mg/kg 7 jours 23 6 0 
 EMI12.11 
 
<tb> Roridine <SEP> A
<tb> 
 
 EMI12.12 
 Sarcome 37 0,5mg/kg 8 jours 18 6 
 EMI12.13 
 La verrucarine A, la verrucarine B et la roridine A ont également une activité prononcée sur la culture cellulaire. L'ac tion sur des cultures de fibroblastes d'embryon de poulet donne le résultat suivant: lorsqu'elle agit pendant 6 heures, la verrucarine A a une 

 <Desc/Clms Page number 13> 

 
 EMI13.1 
 DE-50 de 0,0025 y/ml (la DE-50 est lk, concentration qui arrête le déroulement de la moitié des mitoses).

   A cette concentration et même à des concentrations 1000" fois supérieures, on n'observe pas de modifications morphologiques des cellules qui ne   participent   pas au   phénomène   de divisions cellulaires. Par contre, lescal- Iules qui se divisent tombent sous   l'influence   de la verrucarine A. 
 EMI13.2 
 



  L'action de la verrucarine B est quâltativement identi.. que à celle de la verrucarine Ap mais un peu plus faible; la DE-50 ! est de 0,01 ylml. L'action roridine A est qualitativement identique à celle de la verrucarine A. La DiS-50 est de 0,003 Y/ml. 



   On a étudié in vitro l'effet inhibiteur sur la   multl-     plication   de cellules tumorales (cellules du mastocytome P-815 de la souris) et on a obtenu les résultats suivants; 
Dans une solution nutritive appropriée ces cellules 
 EMI13.3 
 de tumeur se multiplient en zou heures jusqu'à atteindre z a 5 fois leur nombre primitif. La   DE-50   (concentration qui Inhibe de 50% cet- te multiplication; de la verrucarine A vis-à-vis de ces cellules 
 EMI13.4 
 est de O,UQ06 y/ml (- 1:1.600.000.000). 



  La DE-50 de la verrucarine B vis-à-vis de ces cellules est de 0,003 Y/m7. et celle de la roridine A est de 0,001 Y/ml. 



   La toxicité de la verrucarine A, de la verrucarine B et de la   roriaine   A fut étudiée plus spécialement sur la souris. 
 EMI13.5 
 



  La toxicité aiguë, mesurée par la DL-50, rut déterûin6e par administre tion des produits par la voie intraveineuse. 
 EMI13.6 
 
<tb> Verrucarine <SEP> A <SEP> DL-50 <SEP> i.v. <SEP> 1,5 <SEP> mg/kg
<tb> 
 
 EMI13.7 
 Verrucarine R DL-50 i.v. 7 mg/kg Roridine À DL-50 i.v. 1 mg/kg. 
 EMI13.8 
 
<tb> 
<tb> 
 



  De plus, la verrucarine A peut être utilisée pour le 
 EMI13.9 
 traitement de maladies du sang (par exemple leucémie myéloique ou lymphatique) et de maladies du système lymphatique (par exemple 
 EMI13.10 
 maladies de Hodgkine lymphosarcome). 



  Si l'on traite des chiens par des doses quotidiennes e 0,1 mg/kg de verrucarine A, administrées en une seule fois par la 

 <Desc/Clms Page number 14> 

 voie   intraveineuse,   on constate, au bout de plusieurs injections, une forte baisse du nombre de leucocytes dans le sang   périphérique.   



    EXEMPLES*   
 EMI14.1 
 
<tb> Avant <SEP> le <SEP> traitement <SEP> Après <SEP> le <SEP> traitement
<tb> 
 
 EMI14.2 
 Chien A 8900 leuccytes/mm' 2900 leucocyte"B/MM3 Chien B 125UQ leucocytes/MM3 100 leucocytes/=3 Chien C 9300 lrucoaytes/ulm3 5000 leucocYtes/rma3 
 EMI14.3 
 La verrucarine A, la verrucarine R et la roridine A peuvent trouver des applications comme médicaments, sous forme de préparations pharmaceutiques.

   Ces préparations renferment les composes   mentionnés   en mélange avec un support organique ou minéral 
 EMI14.4 
 approprié pour l'application entérale, parentFrale ou locale, Ce support devra être un corps qui ne   réagisse   pas avec les nou- veaux composés, connue par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools 
 EMI14.5 
 benzyliques, des gommes, des polyal.kylâne..g.ycols, des vaselines, le cholestérol ou d'autres supports connus pour médicaments. Les médicaments peuvent se présenter par exemple sous forme de   compri-   més, de dragées, de poudres, de crèmes, de suppositoires ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. 



    Eventuellement   elles sont   stérilisées     et/ou   elles contiennent des adjuvants, tels que des a;ents de conservation, des stabilisants, 
 EMI14.6 
 des mouillants ou des é"uls1onnnnts. Mais elles peuvent également contenir d'autres corps dou s d'activités thérapeutiques. 



   Les exenples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée. Les rapports relatifs aux solvants s'entendent toujours en volume. 



  EXEMPLE 1 : 
Préparation et isolement de la verrucarine A, de la 
 EMI14.7 
 verrucarine B et de la verrucarine E A l'état brut. 



  Avec une suspension de conidies de la souche 8 833 3ro.  thecium verrucia on ensemence 10U cultures agitées faites chacune dans un rlenme1er de '?u0 ml contenait 100 ml de solution nutritive 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 
 EMI15.1 
 de Richard, modifiée par G. Luz, (1934 z Phytopatho1. Z. 1, 589) et contenant, par litre, î>u,0 g de glucose extra pure (Ph.H.V), les sels suivants de qualité analytiquement pure;   10,0   g de nitra- 
 EMI15.2 
 te d'ammonium, 5,0 g de phosphate mono-potassique, 2e5 g de sulfate de magnésium (.7 H20) ope2 g de chlorure ferrique et la quantité suffisante d'eau déminéralisée.

   Après incubation pendant 9 jours à 
 EMI15.3 
 .:.7 C sur une machine à secousses animée d'un mouvement de va-et-vient   (fréquence:   100 par minute) on sépare le mycélium par essorage et on extrait deux fois le filtrat de culture limpide avec chaque fois 1 litre   d'acétate   d'éthyle.

   Les extraits sont lavés avec de 
 EMI15.4 
 l'acide chlorhydrique binormale, de la lessive de soude caustique   binormale   et de l'eau, une fois avec chaque solvant, et ils sont évaporés sous pression réduite .On obtient 115 mg de produit brut 
 EMI15.5 
 brun qui, sur le chroatograr#me en couche mince (support; gel de silice; solvant d'lutï,ans chloroforme-méthanol dans le rapport 97 3f coloration des taches de substances dans une atmosphère d'iode (jaune-brun)) donnent deux taches qui   correspondent à.   la verrucarine A et à la verrucarine B. Pour purifier davantage on chromatographie sur 6 g de gel de silice. Pour   l'élution   on utilise 12 ml de solvant par fraction.

   Les fractions 1 à 5 (éluées avec benzène, 
 EMI15.6 
 chloroforme et ohloroforme-methanol-'(99!l) donnent 3,6 mg de ma- tière amorphe que l'on jette. Les fractions 6 et 7 (26 mg, éluées avec chloroforme-méthanol-(99:l) donnent, après recristaliisation dans l'éther, 8 mg de verrucarine A   brute cristallisée (contenant   encore de la verrucarine   B).  Les fractions 9 et 10 (éluées avec 
 EMI15.7 
 chloroforme-méthanol-(99!l) donnent, après cristallisation dans l'éther, 13 mg de verrucarine E cristallisée et brute. Sur le chro matogramuie en couche mince, la vexrucar3.na donne en atmosphère d'azote, au bout de 10 minutes environ, une tache violet-rouge. Les fractions 16 à 24 (éluées avec chloroforme-méthanol-(99il) et   (98:2)   fournissent 15 mg de matière amorphe que l'on jette. 
 EMI15.8 
 



  ,u"'Lb: Préparation et isolement de la verrucarine A et de la verxyuaa,rine b brutes. 
 EMI15.9 
 



  La souche 8 833 est cultivée à 270C dane 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 10 litres de la solution nutritive décrite à   l'exemple   1, dans un fermenteur de 14 litres   (New   Brunswick Co., New Brunswick,E.U.A. type FS 314), pendant 6 jours, à 450 tours par minute de   l'agita-,   teur et sous aération (10 litres d'air par minute).On filtre 1 li- tre du bouillon de culture sur une couche de kieselguhr (Celite) et on extrait deux fois le filtrat limpide avec chaque fois 1 litre d'acétate d'éthyle. Les extraits d'acétate d'éthyle sont lavés une fois avec 100 ml d'acide chlorhydrique   binormal,   deux fois avec chaque fois 50   ml   d'une solution binormale de soude caustique et deux fois avec chaque fois 50 ml d'eau, et ils sont évaporés sous pression réduite.

   On obtient 277 mg d'un extrait brut de tein- te brune qui présente, sur le chromatogramme en couche mince, trois taches qui correspondent à la   verrucarine   A, à la verrucarine   B   et à la verrucarine E. On chromatographie la quantité totale sur 14 g de gel de silice. Pour   l'élution   on utilise 30 ml de solvant par fraction. Les fractions 1 a   11   (éluées avec benzène, chlorure de méthylène et chlorure de méthylène-méthanol-(99:1)) fournissent 127 mg d'une matière amorphe dans laquelle on peut déceler, sur le chromatogramme en couche mince, de la verrucarine A et de la verrucarine   B.

   Les   fractions 12 et 13 (11   mg,   éluées avec un   mé.   lange   99:1   de chlorure de méthylène et de méthanol) donnent, après      recristallisation dans l'éther, 3,5 mg de verrucarine E cristalli- sée. Les fractions 14 à 22 (éluées avec un mélange   99:1   de chlorure de méthylène et de méthanol) fournissent 30 mg de matière amorphe. 



  La matière des fractions 6 à   11   et 14 à 17, ainsi que les   liqueurs-.   mères des fractions 12 et   13   sont mélangées (125 mg) et elles sont   chromatographiées   encore une fois de manière analogue sur 13 g de gel de silice.   A   partir des fractions éludes avec un mélange 99,5:0,5 de chlorure de méthylène et de méthanol on isole, après   cristalli-   sation dans l'éther, un total de 3 mg de verrucarine A cristallisée et brute qui contient encore un peu de verrucarine B. 

 <Desc/Clms Page number 17> 

 



    EXEMPLE   3.- 
Préparation et isolement de la   verrucarine   A et de la verrucarine B brutes. 



   La souche S 833 est incubée dans les conditions de l'exemple 1 dans la solution nutritive de Weindling (H.   Weindling,   Phytopathol.24,   1155,   R.   weindling   et A. Emerson, ibid. 26, 1068) contenant, pour 1 litre, 25,0 g de glucose extra pur (Ph.

   H.V.), les substances suivantes de qualité analytiquement pure: 2,0 g de tar- trate   d'ammonium,     2,0   g de phosphate   mono-potassique,     1,0 g   de   sul-   fate de magnésium (.7H2O), 1,0 mg de sulfate de fer (.7H2O), 0,15 mg de sulfate de cuivre (.5H2O), 1,0 mg de sulfate de zinc (.7H2O), 1,0 mg de sulfate de manganèse   (.H20),   0,1 mg de manganate de sodium et la quantité suffisante d'eau déminéralisée* On ex- trait 1 litre du bouillon de culture avec de l'acétate d'éthyle, comme décrit a l'exemple 2. Les extraits sont lavis deux fois avec chaque fois 50 ml d'une solution   blnormale   de soude caustique et deux fois avec chaque fois 50 ml d'eau, et ils sont évaporés cous pression réduite.

   Il reste 142 mg d'extrait brut qui, sur le chro- matogramme en couche mince, présente trois taches dont deux corres- pondent a la verrucarine A et a la verrucarine   B.   Pour parfaire la purification on chromatographie sur 7 g de gel de silice en utilisant pour   l'élutlon   15 ml de solvant par fraction. Les frac- tions 1 à 8   (éluées   avec benzène, chlorure   de méthylène   et chlorure de méthylène-méthanol-(99:1)) donnent   54   mg d'une matière amorphe que l'on jette. La fraction 9 (6,5   mg,   éluée avec un mélange   99:1   de chlorure de méthylène et de méthanol) fournit, dans l'éther, 0,5 mg de verrucarine A cristallisée (contenant encore de la verru-   earine   B).

   Les fractions 10 à 14 (éluées avec un mélange 99 :1 de chlorure de méthylène et de   mthanol)   et 15 à 20 (éluées avec un mélange 98:2 de chlorure de méthylène et de méthanol) fournissent 28   mg   d'une matière amorphe dans laquelle, à l'aide du chromato- gramme en couche mince, on peut encore déceler des quantités supplé- mentaires de   verruoarine   A et de verrucarine B. 

 <Desc/Clms Page number 18> 

 
 EMI18.1 
 



  4t. 
 EMI18.2 
 Préparation et isolement de la verrucarine A et de la verrucarine B brutes. 



   La souche S   118   est incubée dans les conditions de 
 EMI18.3 
 l'exemple 1, mais dans la solution nutritive de Vlelndling (voir l'exemple 3). Après quoi, pour éliminer le mycélium on filtre 39?ma. du bouillon de culture, on extrait deux fois le filtrat limpide avec chaque fois 1 litre d'acétate   d'éthyle,   on lave les extraits une fois à l'eau, deux fois avec une solution binormale de soude caustique et deux fois à   l'eau   et on les évapore sous pression réduite.

   Il reste 428 mg d'un produit brut de teinte jaune qui, sur le chromatogramme en couche mince   (.réalisa   comme décrit l'exemple 1), donne deux taches qui correspondent à la verrucarine      A et   à   la verrucarine   B.   Pour purifier davantage on chromatographie      le produit brut sur 25 g de gel de silice   pour     l'exécution   voir la description   donnée   à l'exemple   1).   On obtient, 3,5mg de verru- 
 EMI18.4 
 carine A brute et cristallisée (contenant encore de la verrucarine # , BXJdtPLtt b,- . 



  Préparation et détection de la verrucarine A et de la verrucarine B. la souche S   118   est incubée dans les conditions de l'exemple 1. L'extraction et le traitement complémentaire, effec- tués sur 78U ml de bouillon de culture, se font exactement comme décrit a l'exemple 1. On obtient   44   mg d'extrait brut dans l'acétate 
 EMI18.5 
 d'éthyle (de teinte brune) qui montre, sur le chromatogramme en couche mince (réalisé comme à l'exemple 1), deux taches dont les distances de parcours correspondentàl& verruccarine A et à la verru-' carine B. EXEHPLE 6.- 
Préparation et isolement de la   verrucarine   A, de la verru- carine B et de la roridine A brutes. 
 EMI18.6 
 



  La souche 8 750 est cultivée z, 27*C dans un fermenteur de 7 litres (New Brunswick Co., New Prunswick, E.U.A. type 8 304) 

 <Desc/Clms Page number 19> 

 avec 5 litres d'une solution nutritive (solution de Richard, voir exemple 1), sous aération et sous agitation (300 tours par minute). 



  Après élimination du mycélium par filtration on extrait 4, 1 litres du filtrat de culture, de teinte jaune claire, à trois reprises avec chaque fois 5 litres d'acétate d'éthyle, on lave les extraits réunis une fois avec 1 litre d'eau et on concentre la solution ob- tenue sous pression réduite jusqu'à ce que son volume ne soit plus que de 500 ml. La solution concentrée est ensuite lavée à 0 C a trois reprises avec chaque fois 100   ml   d'une solution   binormale   de soude caustique   et a   trois reprises aveo chaque fois 100 ml d'eau, et elle est évaporée sous pression réduite. On obtient 680 mg d'un produit brut de teinte jaune. Pour le purifier   davanta- '   ge on chromatographie ce produit sur 30 g de gel de silice. 



  Pour l'élution on utilise à chaque fois 60 ml de solvant par frac* tion. Les fractions 1 a 10   (éluées   avec du benzène et du chloroforma fournissent 318 mg d'huile, d'une huile que l'on jette. La frac- tion 11 (81 mg éluée avec un mélange 99:1 de chloroforme et de   métha.   nol) donne, dans l'éther, 34 mg de verrucarine A cristallisée qui, d'après le chromatogramme en couche mince (voir exemple 1), se révèle être de constitution unique. A partir des liqueurs-mères on obtient, par cristallisation dans l'éther, encore 11 mg d'un mélange constitué de verrucarine A et de roridine A.

   Les fractions 12 à 16 (152 mg éluées avec un mélange 99:1 de chloroforme et de méthanol) fournissent, après cristallisation dans l'éther, 61 mg d'un mélanga cristallin qui, d'après le chromatogramme en couche mince, est principalement constitué de verrucarine A, mais contient encore de la verrucarine B et de la roridine A. Les   liqueurs-mères   réunies des fractions 11 à 16 (125 mg) renferment encore environ 30 mg de verrucarine A et 30 mg de roridine A. Les fractions 17 à 23 $(luées par des mélanges 99:1, $98 :2 et 1:1 de chloroforme et de méthanol) fournissent 79 mg d'une matière amorphe que l'on jette* EXEMPLE 7. - 
Préparation et isolement de la roridine A. 

 <Desc/Clms Page number 20> 

 



   Sous aération ('litres par minute) et sous agitation (300 tours par minute) on cultive la souche S 973, Myrothecium roridum, dans 5 litres de solution nutritive (20 g de glucose extra pure,   Ph.   H.V., 2,0 g d'extrait de malt, Schweiz. Ferment   AG,   2,0 g de   Xeast   extract   Difco'   2,0 g de pepton   Cudahay,   2,0 g de phosphate - mono-potassique, 2,0 g de sulfate de magnésium (.7H20), 0,2 g de sulfate de fer (.7H2O)), dans un fermenteur (New Brunswick Co., New Brunswick E.U.A. type FS 307). Après élimination du mycélium par filtration on extrait   à   trois reprises la solution lipide, de teinte jaune et de pH 6, avec chaque fois 5 litres d'acétate d'éthy- le.

   La solution obtenue en mélangeant les extraits est lavée une fois avec 1 litre d'eau, puis elle est concentrée jusqu'à un volume de 700   ml   sous pression réduite, elle est   lavée, à   0 C, trois fois avec chaque fois 80 ml d'une lessive de soude caustique binor- male et deux fois avec chaque fois 80 ml d'eau et elle est évaporée. 



  On obtient 5,7 g de produit brut de teinte jaune qui, par cristal- lisation dans un mélange d'acétone et d'éther, donne 105 mg de roridine A cristallisée fondant à 190-195 C (le chromatogramme en couche mince montre que ce produit est de constitution unique). 



  Les liqueurs-mères (5,6 g) sont chromatographiées sur 250 g de gel de silice. Pour   l'élution   on utilise 250 ml de solvant par frac- tion. Les fractions 1 a 10 (éluées avec du benzène, du chloroforme et un mélange 99,5:0,5 de chloroforme et de méthanol) fournissent 2,32 g d'un produit huileux que l'on jette. Les fractions   11   à 21 (2,45 g, éluées par un mélange 99:1 de chloroforme et de méthanol) donnent, par cristallisation dans un mélange 97:3 de chlororoforme et de méthanol, 1,2 g de roridine A cristallisée brute qui, d'après le chromatogramme en couche mince, renferme encore un peu de   verru   carine A et une substance A non identifiée.

   Après cristallisa- tion dans un mélange d'acétone, d'éther et d'éther de pétrole on obtient 428 mg de roridine A cristallisée fondant à 191-196 C, 166 mg de roridine A cristallisée contenant encore des traces de la substance A, ainsi que 218 mg d'un mélange cristallisé de roridine 

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 A et de la substance A dans le rapport 1:1. 



   Après recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther, la roridine A s'obtient sous forme de prismes incolores fondant à 191-196 C ou 198-204 C. 



  EXEMPLE 8. - 
Préparation et isolement   de,la     verrucarine   A de la ver- rucarine B et de la roridine A. 



   La souche 8 1135 (variation sectorielle de la souche S 973) est cultivée dans la solution nutritive décrite à l'exemple 7, dans un   fermeneur   de 50 litres (système Ultramix type FB 005,Hch. 



    Bertrams   A.G., Bâle,   Suisse,   nous agitation (1450 tours par minute), sous aération (50 litres par minute) et sous une surpression de   0,4   atmosphère. Après avoir ajouté du kieselguhr (colite) qui sert d'auxiliaire de filtration, on filtre le bouillon de culture (50 li-   tres),   on extrait à six reprises le filtrat de culture limpide, de teinte jaune avec chaque fois 40 litres d'acétate d'éthyle et on lave les extraits a l'eau. Le mélange de mycélium et de kiesel- guhr est additionné d'eau, homogénéisé et extrait trois fois par agitation avec chaque fois 10   ml   d'acétate d'éthyle.

   Les extraits Obtenus après filtration et lavage à l'eau sont réunis aux extraits d'acétate d'éthyle provenant du filtrat de culture, et la solution globale est concentrée sous pression réduite jusque un volume d'environ litres. Après avoir lavé avec   1   litre d'une solution binormale de soude caustique et deux fois avec   chaque, fois   0,5litre d'une solution binormale de soude caustique et avec 0,5 litre d'eau on évapore à siccité sous pression réduite.

   Le résidu obtenu (206 g) fournit, après addition   d'éther,     78   g d'un produit cristal- lisé brut qui, d'après le chromatogramme en couche mince (réalisé comme décrit a l'exemple   1),   est principalement constitué de rori- dine A, mais contient encore de la roridine C, de la verrucarine A et de la   verrucarine   B comme produits secondaires. Il reste 128,5g d'un   résidu 1   de liqueurs-mères.   On   reprend le cristallisât brut (78 g) dans du méthanol et on filtre. Les'fractions insolubles dans      

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 le mthanol (2, g) constituent un cristallisant où S'est concentrée principalement la roridine C mais qui renferme encore de la vexrut  carine A comme impureté.

   Les fractions solubles dans le méthanol sont évaporées et le résidu est soumis à une cristallisation 
 EMI22.2 
 fractionnée dans lilétha.nol-éther. On obtient 1) 33,9 g de roridlne      A cristallisée pure, 2) 26,0 g de roridine A cristallisée conte- nant encore un peu de roridine C, de verrucarine A et de substance 
 EMI22.3 
 A et i) 15,6 g de résidu de liqueurs-mères II. Ce dernier est joint au résidu de liqueurs-mères 1   (144   g) et le tout est dissous dans 520 ml d'un mélange 3:1 de chloroforme et de benzène. On chromato-      graphie, de même qu'a l'exemple   1,   260 ml de cette solution (oor- resrondant à 72 g de résidu de liqueurs-mères) sur 3,77 kg do gel de silice.

   Des fractions eluées avec un mélange 95:5de chloro- forme et de méthanol on isole, par cristallisation avec de   l'éther,     1,2   g de verrucarine A cristallisée pure. 
 EMI22.4 
 



  EXJmPLfc. 9.  
Préparation et isolement de la roridine A, de la   rori-   dine   B,   de la roridine C, de la   verrucarine   A et de la verrucarine C. 



   La souche 8 1135 de Myrothecium roridun est incubée dans 
 EMI22.5 
 un fermenteur de 10 litres (système U.tranix, type FU 001, Roh.   Bertrams   A.G.,   Baie,   suisse) avec 10 litres d'air par minute,      sous une pression relative de   0,4   atmosphère et a une température de 27 C, dans la solution nutritive ayant la composition suivante! 
 EMI22.6 
 30,0 g de glucose extra pur (Ph. ti.ir), zou g de leest extract Disco, 4,0 g de nitrate d'a,runanium, 2,72 g ae phosphate mono-potassique, 1,2 g de sulfate de magnésium (.7 H20), 0,028 g de sulfate ferreux (.7 H20), 0,003 g de sulfate de zinc (.7 H 20).

   Le bouillon de cul- ture   (10   litres) est filtré sur une couche de Kieselguhr   (Cellte)   et le filtrat de culture limpide, de teinte jaune, est extrait à 
 EMI22.7 
 trois reprises avec chaque fois 10 litres d îie6t*<te a'thyle. Les extraits, lavés avec 1 litre d'eau, sont évaporés complètement sous      pression réduite. On dissout le resicu   dans 1   litre de chloro- forme et on lave la solution à troit reprises avec chaque fois 100 m1 d'une solution binormale de soude caustique et a quatre reprises 

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 avec chaque fois 100 ml d'eau.

   Après évaporation de la solution chloroformique lavée on obtient   12,0 g   d'un produit brut de teinte ' jaune que l'on Chromatographie sur 250 g de gel de silice pour continuer la séparation. -Chromatographie I. 



   Pour   l'élution   on utilise 500 ml de solvant par fraction. 



  Les fractions 1 et 2   (éluées   avec du benzène) contiennent 7,88 g d'une huile que l'on jette. Les fractions 3 à 6   (482   mg, éluées avec du chloroformer fournissent, dans l'éther ou l'éther de   pétro-   le, 23 mg de roridine   B   cristallisée fondant à   140-147 C,   produit qui   diaprés   le chromatogramme en couche mince, se révèle parfaite- ment bien défini. Les fractions 7 et 8 (éluées avec un mélange 99:1 de chloroforme et de méthanol) fournissent 101 g d'une matière amorphe que l'on jette. Les fractions 9 et 10 (1,48 g, éluées avec un   nélange   99 :1 de chlororforme et de méthanol) donnent,, par cris- tallisation dans   l'ether,   646 mg de cristaux fondant à 122-143 C. 



  Après recristallisation dsns un mélange d'acétone et d'éther on obtient 400 mg d'un produit cristallisé fondant à 130-138 C qui est principalement constitué de roridine A, ainsi que de ver- rucarine A et de roridine C. La séparation ultérieure du produit cristallisé se fait dans la chromatographie II (voir   ci-dessous).,   La fraction 11   (.305   mg éluée avec un mélange 99:1 de chloroforme et de méthanol), donne dans l'éther, 106 mg de roridine A cristal- lisée qui contient encore des traces d'impuretés. La   purifica-   tion ultérieure se fait par la chromatographie III, et celle des liqueurs-mères se fait parla chromatographie II. les fractions 12   à.   20   (éluées   avec des mélanges 99:1, 98t2 et 1:1 de chloroforma et de méthanol) ne donnent pas de cristaux.

   La purification ulté- rieure des fractions 12 et   13   (330 mg) se fait dans la chromatogra- phie II. 



  -Chromatographie II. 



   Les résidus de liqueurs-mères des fractions 9, 10 et 11, ainsi que les fractions 12 et 13, soit au total 1,39 g de   matière,'   sont réuniset le tout est   soumis à   une chromatographie de partage avec, pour phase stationnaire,   700 g   d'un mélange de partie. 

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 égales de kieselguhr et d'eau et, pour phase mobile, les slovants saturés d'eau indiquée ci-dessous (200 ml par fraction). Les   frac- :   tions 1 à 19   Rivées   avec du benzène et avec un mélange 95:5 de benzène et de chloroforme) fournissent 269 mg d'une matière amor- phe que l'on jette. Les fractions 20 à 25 (91   mg,   éluées avec un mélange 95:5 de benzène et de chloroforme) donnent, dans l'éther, 13 mg de verrucarine B cristallisée et pure.

   Les fractions 26 à 30   (éluées   avec un mélange 95:5 de benzène et de chloroforme) four- nissent 62 mg d'une matière amorphe que l'on jette. Les fraction)! 31 à 38 (130 mg, éludes avec un mélange 95:5 de benzène et de chlo- roforme) donnent, dans l'éther, 12 mg de verrucarine A cristallisée      et pure. A partir des liqueurs-mères on obtient, dans l'éther, 20 mg de roridine C cristallisée et pure qui fond à 117-121 C. 



  Les fractions 39 à   43   (60 mg, éluées avec un mélange 95:5de ben-   zène   et de   chloroforme)   fournissent, dans l'éther, après   cristalli-   sation fractionnée, 28 mg de verrucarine A cristallisée et pure et 17 mg de roridine C cristallisée et pure. Les liqueurs-mères con- tiennent de la   verrucarine   B et de la roridine C. Les fractions 44 à 75 (269 mg, éluées avec des mélanges 95:5, 9:1 et 4:1 de benzène et de chloroforme) fournissent, après cristallisation fractionnée, 48 mg de verrucarine A cristallisée pure. Les liqueurs-mères con- tiennent de la verrucarine B et de la roridine C.

   Les fractions 76 à 125   (éluées   avec un mélange de parties égales de benzène et de chloroforme et avec du chloroforme) donnent 526 mg d'une matière amorphe que l'on jette. Les fractions 126 à 133 (250 mg, éluées avec un mélange   9:1   de chloroforme et d'acétate d'éthyle) four- nissent dans l'éther,   305   mg de roridine A   cristallisée   et pure qui fond à 194-202 C. Les fractions   134 â   159 (éluées avec des   mélangea 9:1   et   4:1   de chloroforme et d'acétate d'éthyle et avec de   l'acétate   d'éthyle) donnent 278 mg de matière amorphe que l'on ' jette. 



  -Chromatographie III. 



   On chromatographie sur 80 g d'alumine 800 mg du mélan- 

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 ge cristallisé des fractions 9 à Il de la chromatographie I. Pour l'élution on utilise 100 ml de solvant par fraction. Les fractions 1 à Il (éluées avec du chloroforme) donnent des traces de matière amorphe que l'on jette. Les fractions   12 à   21 (éluées avec un mélange 95,5:0,5 de chloroforme et de méthanol) fournissent, dans l'éther, 200 mg d'un mélange cristallisé de roridine A et de roridine C. Les fractions 22 à 51   (éluées   avec un mélange   99 il   de chloroforme et de méthanol) fournissent, dans l'éther, 432 mg de roridine A   cristallisée   de constitution unique.

   Les fractions 52 à 67 (éluées avec des mélanges 95:5 9:1 et 4:1 de chloroforme et de méthanol) donnent 46 mg de matière amorphe que l'on jette. 
 EMI25.1 
 hXtMPL, 10. - 
Préparation et isolement de la verrucarine A et de la verrucarine B brutes ainsi que de la verrucarine C et de la roridi- ne B. 



   La souche S 118 est incubée à 27 C sous forme d'une culture en surface au repos dans un Erlenmeyer de   500   ml avec   cha-   que fois 100 ml de solution nutritive, dans le milieu nutritif décrit à l'exemple 7 et complété par addition de 3,0 g de chlo- rure d'ammonium par litre; Le liquide de culture est débarrassé du mycélium par filtration. Par extraction de 30   litres   du bouil- lon de culture avec de l'acétate d'éthyle on obtient   14   g d'extrait brut.   On   dissout   12,7   g de cet extrait dans 1,5 litre de chloro- forme, on lave la solution, à 0 C à trois reprises avec chaque foie 150 ml d'une solution binormale de soude caustique et à deux reprises avec chaque fois 150 ml d'eau et on évapore.

   On obtient 9,5 g d'un produit brut neutre que l'on chromatographie sur 250 g de gel de silice. 



   Pour l'élution on utilise chaque fois 400 ml du solvant par fraction. Les fractions 1 à 10 (éluées avec du chloroforme et avec un mélange   99,5   :0,5 de chloroforme et de méthanol) fournissent 1,46 g de matière amorphe que l'on jette. Les fractions   11   à 20   (4,324   g, éludes avec un mélange   99 il   de chloroforme et de méthanol) 

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 donnent 200 mg de verrucarine A cristallisée et pure qui contient encore de la verrucarine B. Les fractions 21 à 30   (éluées   avec des mélanges 98:2 et 9:1 de chloroforme et de méthanol) donnent   4e2l   g de matière amorphe que l'on jette.

   Les résidus de liqueurs- mères des fractions   11   à 20 (3,56 g) sont chromatographiés, pour être   purifiés   davantage, sur alumine neutre de degré d'activité   Il*   Pour   l'élution   on utilise 400   ml   de solvant par fraction. La frac- tion 1 (1,54 g, éluée avec un mélange 4:1 de chloroforme et de benzène) fournit dans l'éther, 25 mg de verruoarine A cristallisée et brute (contenant encore de la verrucarine B). Les fractions 2 à   19 (éluées   par 'un mélange 4:1 de chloroforme et de benzène, par du chloroforme et par des mélanges 99:1, 98:2 et 95:5 de chloroforme et de méthanol) fournissent 1,54 g de matière amorphe que l'on jette. 



  La fraction 20 (61 mg, éluée par un mélange 3:1 de chloroforme et de méthanol) donne, dans méthanol-éther, 8 mg de cristaux fon- dant à   226-228 C.   Après recristallisation dans acétone-éter on obtient la verrucarine C pure sous forme de prismes fondant à 223-   224 C.   



   -Extraction du mycélium. 



   On extrait le mycélium séché, à trois reprises, avec chaque fois 2 litres de méthanol et 200 ml   d'eau   pendant   45 minu-   tes à 40-50 C, on filtre et on évapore. Le résidu (12,8 g) est ensuite partagé (par dissolution) entre 500 ml d'eau et 1 litre d'acétate d'éthyle et la phase aqueuse est extraite encore.trois fois avec chaque fois 1 litre d'acétate d'éthyle. Les extraits dans l'acétate d'éthyle, après évaporation du solvant, laissent 5,20 g d'une huile brune que l'on chromatographie, comme décrit plus haut, sur 120 g de gel de silice.

   A partir des fractions   (.157   mg) éluées par un mélange 99,5:0,5 de chloroforme et de   mé-   thanol on obtient, dans l'éther, 41 mg de roridine B cristallisée et pure sous forme d'aiguilles fondant a l47-152- C Les fractions éluées plus tard avec un mélange 99:1 de chloroforme et de méthanol fournissent, par cristallisation dans l'éther, 16 mg de verrucarine A brute (contenant encore de la verrucarine B). 

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  EXEMPLE 11. - 
Préparation et isolement de la verrucarine A, de la ver- rucarine B et de la roridine B brutes. 



   La souche 8 118 est incubée pendant 63 heures dans   la,   solution nutritive qui a été décrite à l'exemple   10,   dans'un fer- menteur de 50 litres(voir exemple 7), sous agitation   (1450   tours' par minute) et sous aération constante (0,8 litre par minute et par litre de solution   nutritive).  Après avoir ajouté du kieselguhr (Celite) on extrait le bouillon de culture avec un total de 22 li- très d'acétate d'éthyle   (la   séparation des phases se fait à la centrifugeuse). Après concentration de l'extrait à 4 litres sous pression réduite on lave à quatre reprises avec chaque fois 400   ml   d'une solution binormale de soude caustique et à trois reprises avec chaque fois 300 ml d'eau, et on évapore.

   On obtient 19,5 g d'extrait pur provenant de l'acétate d'éthyle. Dans l'éther, on isole par cristallisation 2,31 g de verrucarine A cristallisée et brute (contenant encore de la verruoarine B). On   chromatogra-   phie les liqueurs-mères   (17,2   g) sur 850 g de gel de silice. Four - le lavage ultérieur des fractions on utilise 1,7 litre de solvant par fraction. La fraction 1 (7,u g, éluée par du benzène) fournit, dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole, 19 mg de cristaux fondant A 237-239 c (produit non identifié). Les fractions 2 à 6   (4,15   g, éludes par du chloroforme) donnent, dans éther-éther de pétrole,   60   mg de roridine B cristallisée sous forme d'aiguilles fondant à 139-143 C.

   Les fractions 7 à 10 (éluées par un mélange; 99:1 de chloroforme et de méthanol) donnent 1,09 g d'une matière amorphe que l'on jette. Les fractions 11 à 18   (3,25   g,   éluées   par un mélange 98:2 de chloroforme et de méthanol) donnent, dans l'éther 2,18 g de verrucarine A cristallisée et brute (contenant encore à de   la   verrucarine   B).   Les fractions suivantes sont jetées. 



  EXEMPLE   12 : -   
Préparation et isolement de la verrucarine A, de la ver- rucarine B et de la verrucarine D. 

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   La souche S 833 est incubée sous forme   d'une   culture secouée comme à l'exemple 1, dans un milieu qui contient, par litre, 30 g de saccharose, 2,5 g de chlorure d'ammonium, 1,0 g de phosphate monopotassique, 0,5 g de sulfate de magnésium (.7 H2O),   0,5   g de chlorure de potassium, 0,01 g de sulfate de fer (.7 H2O) et la quantité suffisante d'eau. On extrait 900 ml du bouillon de culture avec 2 litres d'acétate d'éthyle. Après lavage   &   l'eau, avec une solution binormale de soude caustique et encore à l'eau et après évaporation sous pression réduite, l'extrait fournit 24J mg d'un produit brut huileux que l'on chromatographie sur 12 g de gel de silice.

   A partir des fractions éluées par du   chloroforme   on obtient, dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole, 2 mg de verrucarine D pure sous forme d'aiguilles fondant a 127-128 C. 



  Sur le chromatogramme en   euche   mince, la verrucarine D   migre   à peu près aussi vite que la verrucarine A. A partir des fractions suivantes   éluées   avec un mélange 99:1 de chloroforme et de méthanol on obtient 38 mg de verrucarine A cristallisée et brute qui contient encore de la Verrucarine B. 



  EXEMPLE 13 ;- 
Séparation de la   verrucarine   A cristallisée et brute (contenant de la   verrucarine   B) en verrucarine A pure et en verru- carine B pure. 



   On soumet 9,53 g de verrucarine A cristalline et brute (contenant de la verrucarine B) à une chromatographie de partage sur 5,4 kg d'un mélange de parties égales de kieselguhr et d'eau, Les solvants qui servent pour   l'élution   sont saturés d'eau (1,2 li- tre par fraction). Les fractions 1 a 20 (éluées   avec   du benzène et avec un mélange 95:5 de benzène et de chloroforme) donnent 445 mg d'une matière huileuse que l'on jette. Les fractions 21 à 34   (1,20     g,   éluées avec un mélange 95:5 de benzène et de chloroforme) donnent, dans acétone-éther, 747 mg de verrucarine B cristallisée et pure qui, au chromatogramme en couche mince, se révèle être un produit bien défini.

   Les fractions 35 à 37 (172 mg, éluées avec un 

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 mélange 95:5 de benzène et de chloroforme) donnent, dans acétone- éther, 126 mg d'un mélange cristallisé constitué d'environ 50% de   verrucarine   A et d'environ 50% de verrucarine B. Les fractions 
 EMI29.1 
 38 à 40 (éludes avec un mélange 95  5 de benzène et de chloroforme) fournissent 406 mg d'une matière qui est principalement constituée de   verruoarine   A (produit principal) et de 3 ou 4 autres produits secondaires non identifiés.

   Les fractions 41 à 84 (8,6 g, éluées 
 EMI29.2 
 avec des mélanges ytl, 8:., >:2 et 7:3 de benzène et de chloroforme et avec du chloroforme) donnent, dans acétone-éther, 6,13 g 
 EMI29.3 
 de Verrucarine A cristallisée et pure qui, au chromatogramme en couche mince, se révèle être un produit bien défini. t.J1Pl:. Mu -, . 



  Chro11lstogrph1e en couche mince des verrucarines et des roridines. t 
La chromatographie en couche mince est effectuée par des Méthodes connues. 



   Valeurs Rf 
 EMI29.4 
 
<tb> Substance <SEP> Valeur <SEP> Rf <SEP> réaction <SEP> Couleur <SEP> à
<tb> 
<tb> Substance <SEP> colorie <SEP> la <SEP> lumière
<tb> 
<tb> avec <SEP> ultra-
<tb> 
<tb> 12 <SEP> violette
<tb> 
 
 EMI29.5 
 Verrucarine A 0,70 u26 U9 brun jaune claire Verrucarine b ù,8j$ 0,47 0,69 brun jaune claire Verrucarine C Oe74 0,28 0,59 brun jeune brillante 
 EMI29.6 
 
<tb> claire
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Verrucarine <SEP> D <SEP> 0,70 <SEP> 0,28 <SEP> 0,59 <SEP> brun <SEP> jaune <SEP> foncée
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Verrucarine <SEP> E <SEP> -- <SEP> 0,91 <SEP> violet <SEP> foncée
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Substance <SEP> Valeur <SEP> faction <SEP> Couleur <SEP> à
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 1) <SEP> 2) <SEP> 3)

   <SEP> colorée <SEP> la <SEP> lumière
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> avec <SEP> ultra-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 12 <SEP> violette
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Roridine <SEP> A <SEP> 0,70 <SEP> 0,18 <SEP> 0,55 <SEP> brun <SEP> jaune <SEP> foncée
<tb> 
 
 EMI29.7 
 roridine li 0,55 0,36 0,41 noir vert foncée 
 EMI29.8 
 
<tb> Horidine <SEP> C <SEP> -- <SEP> 0,42 <SEP> brun <SEP> jaune <SEP> foncée
<tb> 
 
 EMI29.9 
 1) Support: alumine, filuants chlorofnrAe-méthanol-(98:2) 2) Support: gel de silice. Gluant: chloroforme-méthanol-(98:2) 3) Support: gel de silice. Eluant: chloroforae-raéthanol-(97$3).



   <Desc / Clms Page number 1>
 



  Method for the isolation of new compounds.
 EMI1.1
 --. --- ..-- ..



   The present invention relates to a process for the separation and isolation of the novel compounds with antibiotic action, verrucarin A, verrucarin and roridin A, from culture fluids and / or mycelia of the mycetial strains Myrothecium verrucaria (Albertini et al. Schweinitz) Ditmar ex ries and Myrothecium roridum Tode ex Fries.



   The present process for separating and isolating verrucarin A, verrucarin B and roridin A consists of separating into its components the mixture of antibiotics by pre-
 EMI1.2
 cipitation, partitioning, chromatographic adsorption, partition chromatography or countercurrent partition (fractional partition). '
Colonies of the fungus Myrothecium verrucaria are isolated. and Myrothecium roridum from original soil samples

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 the most varied. Morphologically, all of these strains correspond to the descriptions as given for example in Gilman, J.C. 1957, A Manual of Soil Fungi, 2nd ed.



  The lova State College Fress, Ames, Iowa, USA The different strains isolated, some of which are obtained from the same soil sample, may present different characters, both from a morphological point of view, for example by their greater or lesser size. tendency to form spores only from a physiological point of view, for example by the composition of the culture medium which they require for the production of antibiotics.



   It is possible to use as raw material not only the culture liquid or the mycelium of the strains of the fungi Myrothecium verrucaria and Myrothecium roridum, but also the culture liquid and the mycelium of variants of these organisms, such as, for example, those which are found. obtained by selection of sectors (sectoral variations) or mutants, in particular after the action of ultraviolet rays or X-rays.



   The culture can for example be carried out in surface culture without stirring, or else in submerged culture, in fermenters, by shaking or by stirring with air or oxygen.



   It is possible to cultivate the strains of Myrothecium verrucaria and Myrothecium roridum on a wide variety of media containing the usual nutrients. This means that they can use glucose, starch, dextrin, lactose, sucrose, etc. as a source of carbon, as a source of nitrogen organic and mineral nitrogen compounds such as peptone, yeast or meat extracts, ammonium sulphate, ammonium nitrate, amino acids, etc., as well as the usual mineral salts and acid elements.



   The Applicant has found that it is possible to isolate, from culture liquids, several strains of Myrothecium.

 <Desc / Clms Page number 3>

   verrucaria and Myrothecium rorldum, at least 8 components in a well-defined, pure and crystallized form. The presence and the quantitative ratios of these components vary according to the growing conditions. According to the present method, the active substances are extracted from the culture filtrate with chloroform *, dichloromethane or ethyl acetate. After reduction to a lower volume, the extracts thus obtained are washed with caustic soda lye and a. water at 0 C, when the pH of the initial culture liquid is less than 3.5.

   The extracts obtained from li. Culture quids with a pH greater than 3.5 are further washed with binormal hydrochloric acid. This makes it possible to remove inactive colored impurities.



   After evaporation of the solvent, an oily crude product is obtained with a coloration ranging from yellow to brown, from which a crude crystalline product can be isolated by adding ether, more or less easily depending on the amount of oily impurities. present. Analysis by thin layer chromatography shows that it is mainly verrucarin A, but also contains verrucarin B and sometimes roridin B, as secondary constituents, when it was prepared from cultures of M. verrucaria.

   When working with cultures of M. roridum, the crude crystalline product obtained mainly consists of roridin A., but it generally also contains, as accessory products, roridin B, verruoarin A and verrucarin B The separation into well-defined components is carried out by one or more successive absorption chromatographies, carried out carefully, on columns of aluminum oxide or of silica gel, and by repeated recrystallizations in acetone-ether mixtures, methanol-ether, chloroform-ether-petroleum ether and dichloromethane-ether; during these processes it is necessary to control the purity of the fractions by thin layer chromatography.



   Thus, starting from the culture filtrates of M. verrucaria we generally succeed in isolating in variable quantities,

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 fractions elevated by chloroform and by 99/1 and 98/2 mixtures of chloroform and methanol, verrucarins C, D and 3 and roridins A and B, in the pure and crystallized state, while the main domposé verrucarin A, usually cannot be obtained neat this way, but is still contaminated with verrucarin it
We can obtain in the same way, from the threads
 EMI4.1
 M.

   roridum, roridin A in the pure and crystallized state as the main product, and also as access products ** roridins B and C as well as verrucarins A and B, also in pure and crystallized form. The first fractions
 EMI4.2
 Chromatographic studies with benzene drop oily constituents which are discarded. The following fractions, eluted with chloroform-methanol (98/2), (95/5) (9/1 (4/1) and (1/1) p give an amorphous product.

   The separation of the crystallized mixture of verrucerins A and B into well-defined components is carried out by partition chromatography, with water as the stationary phase and,.
 EMI4.3
 as mobile phase, mixtures of benzine-chloroform saturated with water. The stationary phase of the earth is used as support
 EMI4.4
 of diatoms. At the beginning there is separation of verrucarin B in the pure state; in the subsequent fractions, only verrucarin is found
The following Table 1 gives information on the substances isolated from various strains of M. verrucaria and M. roridum.
 EMI4.5
 



  T A b L 3 A U 1 mir2lh2gium a) Strain 8 118 'exrttcar3.ne A Verrucarin B Verrucarine 0 Koridine B b) Strain S 750: Verrucarin A
Verrucarin B
 EMI4.6
 Roridin at

 <Desc / Clms Page number 5>

 c) Strain 8 833: Verrucarine A
Verrucarin B
Verrucarin D
Verrucarin E Myrothecium roridum a) Strain S 973: Roridin A
Substance A (not isolated in pure form) b) Strain 8 1135Roridin A
Roridin B
Roridin C Verrucarin A
Verrucarin B
Substance A (not isolated in pure form)
The use of cultures of strains S 973 and S 1135 of M. roridum makes it possible to demonstrate by chromatography another compound which is referred to as substance A. Substance A has not yet been isolated in pure form; it only exists when mixed with roridin A.



   Extraction of the mycelium from a culture of M. verrucaria strain S 118 with aqueous methanol gives, after purification of the extract by partitioning between water and ethyl acetate, a crude product contained in the soluble portions. in ethyl acetate, which can then be separated, after chromatographic verification on a silica gel column, into crude and crystallized verrucarin A (still containing verrucarin B) and roridin B.



   Besides the classical methods for characterizing isolated crystalline compounds, thin layer chromatography is a valuable tool for verifying the purity of amorphous fractions as well as crystallized compounds. Example 13 describes in detail an embodiment partially suitable for this purpose. It is, for example, very difficult to determine the purity of verrucarins A and B without using ohromatographic analysis.

 <Desc / Clms Page number 6>

      



   The essential characteristics of the isolated substances are given below.
 EMI6.1
 



  The antibiotic verrucarin A forms, after reoriltalization in methanol-ether, ecetone-dther or chloroform-ether-petroleum ether mixtures, rectangular flakes
 EMI6.2
 colorless which do not melt below 3SO C. At around 280 C, the crystals begin to take a yellow to brown color due to the onset of decomposition.

   They are insoluble in
 EMI6.3
 water, ethyl ether, isopropyl ether and in liquid saturated hydrocarbons (pentane, hexane, heptane, cyclohexane); on the other hand, they are soluble in lower ketones (acetone, methyl ethyl ketone, etc.), in lower alcohols (methanol, ethanol, propanol, etc.); in dioxin, in short chain halogenated hydrocarbons (dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride), in pyridine, benzene
 EMI6.4
 and toluene. The specific rotatory powers are: a "" 2 + 206 (chloroform) and L-Q-12. + 208 + 2 (dioxane).



  The elementary analyzes give the following percentages Cri64.5? 64 64.2% H: 6.9J 7.0; 6.7% and Os 29.0; 28e4; 28.7%.



  The antibiotic does not contain nitrogen, sulfur or halogen Determination of molecular weight according to the hast method (camphor) gives a molecular weight of 517 and the thermoelectric microdetermination gives 527. These results are in agreement with the determination. of molecular weight made by measuring the radioactivity of the acetylated compound obtained with ecetic anhydride labeled with 14C, which gives a molecular weight of 520. These facts allow us to admit as the most probable crude formula
 EMI6.5
 'C27H309 (502.5).

   The UV adsorption spectrum in ethanol shows a m.ri.mun at 260 a, u; log = 4.25 (calculated for a molecular weight of 502.5) The IR spectrum of a solution of the antibiotic in dichloromethane shows bands (the most intense are underlined
 EMI6.6
 genes) at 0, 2970, 1.71 & p A6? 5f 5 ', 1a75 ,, 1410, 1385p 1213, 1190, 1186, 9b8, 878 and 820 r, t "f. In the solid state (suspension in

 <Desc / Clms Page number 7>

 
 EMI7.1
 nujol) bands at 3,560-3580 are observed. 2930, z70, 1709. 1 22Z1, i621, 1587, 1457, 1377, $ 127, 1213, 1195, 1123, 1103, 10S5, 1053e 1032, 1023, 9730 967, 887, 832 cm "i.

   Verrucarin A ne | contains no methoxy group, contains 5 of methy11- i carbon: that (according to Kuhn .icoth, from 0.17 to 0.25% of mobile hydrogen r: (measurement made by the method of Zerevitinov), taken by micro hydrogenation 3 molecules of hydrogen, with tetranitromethane in chloroform, does not give any yellow coloration, immediately discolors solutions of potassium permanganate in acetone and bromine in chloroform. Tollens reactions,
 EMI7.2
 .f! 'ehl1ng, Molisch, Legal, Zimmermann and Liebermann give negative results. As a result, verrucarin A is a neutral fat soluble compound.



   The verrucarin B antibiotic has properties very similar to those of verrucarin A, which it very often tends to accompany during crystallization. It crystallizes in acetone-ether in the form of needles that do not melt below
 EMI7.3
 from j60 C. At around 280OU the crystals start to. turn yellow to brown, indicating decomposition.

   They are insoluble in water, diethyl ether,
 EMI7.4
 diisopropyl ether and in liquid saturated hydrocarbons (pentnne, hexane, heptane, cyclohexane), soluble on the other hand in low molecular weight ketones (actone, methyl ethyl ketone, etcta low molecular weight alcohols (methanol, ethanol, propanol, etc. .), in dioxane, in halogenated short-chain hydrocarbons (dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride), in pyridine, benzene and toluene. The specific rotational powers are surprisingly very dependent on
 EMI7.5
 the nature of the solvent. For example, a "", D3 = + 94 '+ 2 # * *** 22 is found in chloroform; L c ",% pz = + 10. + 10 in dioxane and L a3 1470 20 in benzene.

   Elemental analyzes give the following results: C: 65.4 and 64.7%; H: 6.5 and braz and 0: 28.1 and 28.9%. Verrucarin B does not contain nitrogen,

 <Desc / Clms Page number 8>

 
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 sulfur or halogens. The determination of the molecular weight made according to the Hast method (camphor) gives the values of 629 and 645; the thermoelectric mierodetermination gives 490. From these results we can consider the gross formulas Gx'2uy (5fl0.5) 'and perhaps Cbdfll2 (662xl) and Ch, lab64.7). The UV absorption spectrum in ethanol shows a maximum at 259 a / ut log - 4.35 (calculated for a molecular weight of 4901. The IR spectrum of a solution in dichloromethane shows bands at 2880, 17. ¯6 .. 7.01, 1670. L621p IL81., 1419, 1240, 1100, 1080, 1038, 995, 965 and 877 ci- '.

   In the solid state (suspension in nujol), there are bands as 29300 2885, 1736. 17. "2 1675.; 1, 590. j 1460, 1378, 1263, 1200, 1104, 1087, 1038, 97fil, 892, 825, 740 and 646 cm-1. The compound does not contain methoxy groups and mobile hydrogen (Zerevitinov). On mierohydrogenation, it absorbs 3 moles of hydrogen (assuming a molecular weight of 670) or 4 moles of hydrogen (based on a molecular weight of
 EMI8.2
 40). It contains 219% methyl carbon (according to Kuhn-Hoth).



  Like verrucarin A, verrucarin B is a fat soluble neutral compound.



   Verrucarin C is only formed in certain cultures and always in very small amounts. It crystallizes in methanol-ether or acetone-ether in the form of colorless prisms melting from 223 to 224 C.



   The same is true for verrucarin D, which is not obtained under all culture conditions and, in any case, in extremely small quantities. It crystallizes in a mixture
 EMI8.3
 ether and petroleum ether in the form of needles I ondwit between 1270 and 1280C.



   The antibiotic roridin A is obtained after crystallization from acetone-ether in the form of colorless crystals
 EMI8.4
 which melt either between 1910 and 196 C, or between 1980 and 204 C.



  They are easily soluble, in low molecular weight ketones (acetone, methyl ethyl ketone) and in low weight alcohols.

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 EMI9.1
 ddthanol (ethanol, propanol), in dioxane, in "11 \ '1) tttl' h les 'h; 4toi IWI' res short-chain halogens (dichloromethane, chloroforma, carbon tetrachloride) and in pyridine. product is hardly soluble in water, ethyl ether, ljioP111QEH8 and in liquid saturated hydrocarbons
 EMI9.2
 (pentane, hexane, heptane, cyclohexane), benzene and toluene.
 EMI9.3
 



  The specific optical rotation is 22 a + 129 * ± 1.



  ..in the reform). Elementary analyzes give the results. .st ç6, i! R 5,4d3 Ht7p4 and Ot27p4j 26, b, 9. Determination of the molecular according to Hast (camphor) gives the values 3 t the thermoelectric microdetermination gives 543.



  U in ful1 which can be proposed as the crude formula for roridin A UIHJUU7 (406 ,,), BUs 49,6) and CUuy 53, b S36) .. absorption spectrum in ethanol exhibits the spectrum of OV absorption in ethanol shows a maximum at 263 m, uj .o 4.27 (based on a molecular weight of *>. *. $, 6). The spectrum le of its solution in dichlorom4thene shows bands at zou, 370. 2970,; i721-24, 11Q2, 637. 1600, il80, 11231 1100, 1085p 103, 1008, 970, 927, z.3, 813 and 650 cm "1 * In the tSiiSe state (supported in KBr), intense bands are observed at 1 K7.UJ I'b, 2860, 1742. 1704464, J94, 1482, 1418, 135, 1170-80, l1J, j 1103, 1082, 1037, 972, 815, 755 and 650 cai f.

   We find ourselves in the presence of a neutral fat-soluble compound. bh roridin a is obtained after recrystallization in acet01: Ht ... Clti1roro: -me..m; thanol, in the form of needles or pail- 3 tteÉj tl 1. $ kes melting between 14O and 149 * Co Crystals are flSlilM (Ht s8;. Soluble in short chain ketones (acetone, tkll H! Tbtone), short chain alcohols (methanol, ethanol, IropBHUi; 1M halogenated short chain hydrocarbons (dichloromethanej ttft, oforme, carbon tetrachloride), in dioxin, 1. good in pyridine They are poorly soluble in water and in
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 liquid saturated hydrocarbons (pentane, hexane, heptane, ring-

 <Desc / Clms Page number 10>

 
 EMI10.1
 hexane). The following values are found for the specific optical rotation: / - C & - /, 23 D a -1230 i 20 (chloroform) and L-a-7 '.



  -126 "+ 20 (benzene). Elemental analysis gives the following values! 0 m 83.8 H: ll, l and O: 4.8. Determination of the molecular weight according to Hast (camphor) gives a value of 318 and the thermoelectric micro-determination gives 426. On the basis of these results
 EMI10.2
 states, we can admit the raw formulas C21HJ20 * 5) and C2SM4bU (?, 6). The UV absorption spectrum in ethanol is empty * In spectrum 111. (compressed in Sur) we find bands 4Ct? -, 4,5, ü¯, 29èU # 2860, 1 &&,, 1460, 1370, 1068 , $ 1040.98, 970, S.) 3 and 804 cm * 1, ear microhydrogenation, there is absorption of 4 to 5 moles of hydrogen (assuming a molecular weight of 318).
 EMI10.3
 



  The antibiotic verrucarin A has a powerful inhibitory action against various microorganisms. The growth inhibitory activity of verrucarin A was evaluated by the dilution method commonly used for this purpose.



  The lowest concentration of the compound having, for each of the seeds, a total or partial inhibitory effect, but significant, in a suitable culture medium was measured. We used
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 concentrations ranging from 10.4.3 to 10 "or from 10-4 to 10 *" 8. The following table gives the results of the various evaluations.

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  -log of the lowest concentration having an inhibitory action on growth
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<tb> Organization <SEP> total <SEP> partial <SEP> Duration <SEP> of
<tb>
<tb>
<tb> tried <SEP> the incuba *.
<tb>
<tb>
<tb>



  , <SEP> tion <SEP> en
<tb>
<tb> hours
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharomyces
<tb>
<tb>
<tb> cerevisiae <SEP> 5.8 <SEP> 6.3 <SEP> 6
<tb>
<tb>
<tb> 5.8 <SEP> 6.3 <SEP>. <SEP> 20.
<tb>
<tb>
<tb>



  5.3 <SEP> 5.8 <SEP> 40
<tb>
<tb>
<tb> Candide <SEP> albicans <SEP> 5.0 <SEP> 5.5 <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> albicans
<tb>
<tb>
<tb> Strain <SEP> Dermat.univ.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>



  Klinik <SEP> ZUrich, <SEP> Nr. <SEP> 5e5
<tb>
<tb>
<tb> 1101 <SEP> A <SEP> 5.5 <SEP> 6.0 <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> tropicalis <SEP> 6.3 <SEP> 7.8 <SEP> 6
<tb>
 
 EMI11.2
 Klinik Zurich Nr. 5.8 6.3 20
 EMI11.3
 
<tb> 169/61 <SEP> 5.3 <SEP> 6.3 <SEP> 40
<tb>
<tb> Candida <SEP> krusei <SEP> 6.3 <SEP> 6.8 <SEP> 6
<tb>
<tb> A <SEP> Strain <SEP> Inst.trop. <SEP> 6.3 <SEP> 6.8 <SEP> 20
<tb>
<tb> med. <SEP> London <SEP> N. <SEP> 270 <SEP> 6.3 <SEP> 6.8 <SEP> 40
<tb>
<tb>
<tb> Torulopsis <SEP> glabrata
<tb>
 
 EMI11.4
 Strain Cbe Nr.

   18 4.0 5.0 20 '
 EMI11.5
 
<tb> Absidia <SEP> lichtheimi
<tb>
<tb> strain <SEP> CbS-Lendner <SEP> 5.0 <SEP> 5.5 <SEP> 20
<tb>
<tb> Aspergillus <SEP> fumigatus <SEP> 5.5 <SEP> 6.0 <SEP> 20
<tb>
 
 EMI11.6
 laastomyces brasiliensis 5.5 6.0 20 richaph.gpseum 4.3 5.3 3
 EMI11.7
 
<tb> 7
<tb>
 
 EMI11.8
 Achorion quinckeanum 4.3 5.3 3 Strain Derjuat.Univ.
 EMI11.9
 
<tb>



  Klinik <SEP> Zurich <SEP> Nr. <SEP> 4,3 <SEP> 7-
<tb>
<tb> 964 <SEP> 4.3 <SEP> 14 <SEP>. <SEP>, <SEP>, <SEP>
<tb>
<tb> {sarrette. <SEP> marcescens <SEP> 4.3 <SEP> 6
<tb>
<tb> 4.3 <SEP> 20
<tb>
 
 EMI11.10
 C t'roteus mirabilis 4.3 6 Strain NCWC 5887 4.3 20 Pî3eudomones aeruginosa 4.3 6
 EMI11.11
 
<tb> 4.3 <SEP> 20
<tb>
 
 EMI11.12
 Mi 11 eUXI \ Q11 ': Lt.1t.JU.



  A c yeasts and other fungi ifco wlture broth except B (except Saccharomyces cerevisiae? Sabouraud maltoea broth; Torulopsis glabra- ta).



  B = Maltose-Agar dermatophytes from Sabouraud.
 EMI11.13
 



  C Il gram-negative bacteria culture broth D * f00, The activity of verrucarin A, verrucarin B and roridin A, against animal tumors, was studied on experimental tumors inoculation in mouse and

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 EMI12.1
 rat. Among the animal tumors which have been shown to be resistant to the products are Ehrlich's ascites tumor, 180 sarcoma, 37 mouse sarcoma and rat Yoshida sarcoma.

   The following tables provide information on the data "and 111 r8Ultat. 1: tests carried out with verrucarin Ae t, T ,, p.r1ne B} #, and roridin A on some tumors an11Ua + 8 'Verrucarin A - . ---
 EMI12.2
 : i9.1.ertUl \ l.UD I
 EMI12.3
 
<tb> Saturates <SEP> with <SEP> Dose <SEP> Duration <SEP> Inhibi- <SEP> Number <SEP> Number <SEP>;

   <SEP>
<tb>
 
 EMI12.4
 Nature, Dose D tion dsani- dyani-
 EMI12.5
 
<tb> the <SEP> kings <SEP> in% <SEP> evils <SEP> evils <SEP> - <SEP>, <SEP>
<tb>
 
 EMI12.6
 tumor per day in use dead tumor 3 use 1 - dead ¯ ¯ ¯ ¯ ¯ 0.36 7 days. 94 0 that d-Ibrlich O, 38mg / kg days
 EMI12.7
 
<tb> from <SEP> the <SEP> mouse
<tb>
 
 EMI12.8
 Sarcoma 180 sarcoma 180 0.12k, day, mouse Oxl 25mg / kg day 23
 EMI12.9
 
<tb> Sarcoma37
<tb>
 
 EMI12.10
 mouse 0.75 mg / kg 7 day. 43 of the smile. ,, p mg / kg 8 days 33 Rat Yoshida 0.05 mg / kg 14 days 35 'Verrucarin B oéranc1 Nature of Dose Duration Inh1bi- Number Number the Hard Dose. tion dpani. of mi.

   tumor per day in ailments ailments tumor used ¯¯¯¯ Tumor tlsc1- dlich llümg / kg 6 days 84 6 0 of the mouse 3po'mg / kg 7 days 95 6 1 Sarcoma 37 1.0 mg / kg 7 days 23 6 0
 EMI12.11
 
<tb> Roridin <SEP> A
<tb>
 
 EMI12.12
 Sarcoma 37 0.5mg / kg 8 days 18 6
 EMI12.13
 Verrucarin A, verrucarin B and roridin A also have pronounced activity on cell culture. The action on cultures of chicken embryo fibroblasts gives the following result: when it acts for 6 hours, verrucarin A has a

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 EMI13.1
 DE-50 of 0.0025 y / ml (the DE-50 is 1k, concentration which stops the progress of half of the mitoses).

   At this concentration and even at concentrations 1000 "times higher, we do not observe any morphological modifications of the cells which do not participate in the phenomenon of cell divisions. On the other hand, the dividing scales fall under the influence of verrucarin. AT.
 EMI13.2
 



  The action of verrucarin B is relatively identical to that of verrucarin Ap but a little weaker; the DE-50! is 0.01 ylml. The roridin A action is qualitatively identical to that of verrucarin A. The DiS-50 is 0.003 Y / ml.



   The inhibitory effect on tumor cell multiplication (mouse P-815 mastocytoma cells) was studied in vitro and the following results were obtained;
In an appropriate nutrient solution these cells
 EMI13.3
 of tumors multiply in zou hours until reaching z to 5 times their original number. The DE-50 (concentration which Inhibits this multiplication by 50%; of verrucarin A vis-à-vis these cells
 EMI13.4
 is 0, UQ06 y / ml (- 1: 1,600,000,000).



  The ED-50 of verrucarin B with respect to these cells is 0.003 Y / m7. and that of roridin A is 0.001 Y / ml.



   The toxicity of verrucarin A, verrucarin B and roriaine A was studied more specifically in mice.
 EMI13.5
 



  Acute toxicity, measured by the LD-50, determined by administration of the products by the intravenous route.
 EMI13.6
 
<tb> Verrucarin <SEP> A <SEP> DL-50 <SEP> i.v. <SEP> 1.5 <SEP> mg / kg
<tb>
 
 EMI13.7
 Verrucarin R DL-50 i.v. 7 mg / kg Roridin AT DL-50 i.v. 1 mg / kg.
 EMI13.8
 
<tb>
<tb>
 



  In addition, verrucarin A can be used for
 EMI13.9
 treatment of blood diseases (eg myelogenous or lymphatic leukemia) and diseases of the lymphatic system (eg
 EMI13.10
 Hodgkine lymphosarcoma diseases).



  If dogs are treated with daily doses of 0.1 mg / kg of verrucarin A, administered once by the

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 intravenously, after several injections, there is a sharp drop in the number of leukocytes in the peripheral blood.



    EXAMPLES *
 EMI14.1
 
<tb> Before <SEP> the <SEP> treatment <SEP> After <SEP> the <SEP> treatment
<tb>
 
 EMI14.2
 Dog A 8900 leucocytes / mm '2900 leucocyte "B / MM3 Dog B 125UQ leucocytes / MM3 100 leucocytes / = 3 Dog C 9300 lrucoaytes / ulm3 5000 leucocytes / rma3
 EMI14.3
 Verrucarin A, verrucarin R and roridin A can find applications as medicaments, in the form of pharmaceutical preparations.

   These preparations contain the compounds mentioned mixed with an organic or inorganic carrier
 EMI14.4
 suitable for enteral, parentFral or local application, This carrier should be a body which does not react with the new compounds, known for example gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, alcohols
 EMI14.5
 benzyls, gums, polyal.kylâne..g.ycols, petroleum jellies, cholesterol or other known carriers for drugs. The medicaments can be presented, for example, in the form of tablets, dragees, powders, creams, suppositories or in liquid form in the form of solutions, suspensions or emulsions.



    Optionally they are sterilized and / or they contain adjuvants, such as preservatives, stabilizers,
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 wetting agents or oils. But they can also contain other therapeutically active substances.



   The following examples illustrate the present invention without in any way limiting its scope. Solvent ratios always refer to volume.



  EXAMPLE 1:
Preparation and isolation of verrucarin A,
 EMI14.7
 verrucarin B and verrucarin E In the raw state.



  With a suspension of conidia of strain 8 833 3ro. thecium verrucia were inoculated 10U shaken cultures each made in a 0 ml container containing 100 ml of nutrient solution

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 EMI15.1
 by Richard, modified by G. Luz, (1934 z Phytopatho1. Z. 1, 589) and containing, per liter, 1> u, 0 g of extra pure glucose (Ph.H.V), the following salts of analytically pure quality; 10.0 g of nitra
 EMI15.2
 te of ammonium, 5.0 g of mono-potassium phosphate, 2e5 g of magnesium sulfate (.7 H20) ope2 g of ferric chloride and the sufficient quantity of demineralized water.

   After incubation for 9 days at
 EMI15.3
 .:. 7 ° C. on a shaking machine moving back and forth (frequency: 100 per minute) the mycelium is separated by spin-drying and the clear culture filtrate is extracted twice with 1 liter of dye each time. 'ethyl acetate.

   The extracts are washed with
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 binormal hydrochloric acid, binormal caustic soda solution and water, once with each solvent, and they are evaporated under reduced pressure. 115 mg of crude product are obtained
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 brown which, on the chroatograr # me in a thin layer (support; silica gel; solvent of luti, chloroform-methanol in the ratio 97 3f staining of the spots of substances in an atmosphere of iodine (yellow-brown)) give two spots that correspond to. verrucarin A and verrucarin B. For further purification, chromatography is carried out on 6 g of silica gel. For the elution, 12 ml of solvent are used per fraction.

   Fractions 1 to 5 (eluted with benzene,
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 chloroform and chloroform-methanol - (99 µl) gave 3.6 mg of amorphous material which was discarded. Fractions 6 and 7 (26 mg, eluted with chloroform-methanol- (99: 1) give, after recrystallization from ether, 8 mg of crystallized crude verrucarin A (still containing verrucarin B). Fractions 9 and 10 (eluted with
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 chloroform-methanol- (99! l) give, after crystallization from ether, 13 mg of crystallized and crude verrucarin E. On the chro matogramuie in thin layer, the vexrucar3.na gives in a nitrogen atmosphere, after about 10 minutes, a purple-red spot. Fractions 16-24 (eluted with chloroform-methanol- (99il) and (98: 2) provide 15 mg of amorphous material which is discarded.
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  , u "'Lb: Preparation and isolation of raw verrucarin A and verxyuaa, rine b.
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  Strain 8 833 is cultivated at 270C dane

 <Desc / Clms Page number 16>

 10 liters of the nutrient solution described in Example 1, in a 14-liter fermenter (New Brunswick Co., New Brunswick, USA type FS 314), for 6 days, at 450 revolutions per minute of the agitator and under aeration (10 liters of air per minute). 1 liter of the culture broth is filtered through a layer of kieselguhr (Celite) and the clear filtrate is extracted twice with 1 liter of ethyl acetate each time. . The ethyl acetate extracts are washed once with 100 ml of binormal hydrochloric acid, twice with each time 50 ml of a binormal solution of caustic soda and twice with each time 50 ml of water, and they are evaporated under reduced pressure.

   277 mg of a crude extract of tint brown is obtained which shows, on the thin layer chromatogram, three spots which correspond to verrucarin A, verrucarin B and verrucarin E. The total quantity is chromatographed on 14 g of silica gel. For the elution, 30 ml of solvent are used per fraction. Fractions 1 to 11 (eluted with benzene, methylene chloride and methylene chloride-methanol- (99: 1)) provide 127 mg of an amorphous material in which verrucarin can be detected on the thin layer chromatogram. A and verrucarin B.

   Fractions 12 and 13 (11 mg, eluted with a 99: 1 mixture of methylene chloride and methanol) give, after recrystallization from ether, 3.5 mg of crystallized verrucarin E. Fractions 14-22 (eluted with a 99: 1 mixture of methylene chloride and methanol) provide 30 mg of amorphous material.



  The material of fractions 6 to 11 and 14 to 17, as well as the liquors. Mers of fractions 12 and 13 are mixed (125 mg) and they are chromatographed again in a similar manner on 13 g of silica gel. From the fractions studied with a 99.5: 0.5 mixture of methylene chloride and methanol is isolated, after crystallization from ether, a total of 3 mg of crystallized and crude verrucarin A which still contains a little verrucarin B.

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    EXAMPLE 3.-
Preparation and isolation of raw verrucarin A and verrucarin B.



   Strain S 833 is incubated under the conditions of Example 1 in Weindling's nutrient solution (H. Weindling, Phytopathol 24, 1155, R. weindling and A. Emerson, ibid. 26, 1068) containing, for 1 liter , 25.0 g of extra pure glucose (Ph.

   HV), the following substances of analytically pure quality: 2.0 g of ammonium tartrate, 2.0 g of mono-potassium phosphate, 1.0 g of magnesium sulphate (.7H2O), 1, 0 mg of iron sulfate (.7H2O), 0.15 mg of copper sulfate (.5H2O), 1.0 mg of zinc sulfate (.7H2O), 1.0 mg of manganese sulfate (.H20), 0.1 mg of sodium manganate and the sufficient quantity of demineralized water * 1 liter of the culture broth is extracted with ethyl acetate, as described in Example 2. The extracts are washed twice each time with 50 ml of a normal solution of caustic soda and twice with 50 ml of water each time, and they are evaporated under reduced pressure.

   142 mg of crude extract remains which, on the thin-layer chromatogram, shows three spots, two of which correspond to verrucarin A and verrucarin B. To complete the purification, chromatography is carried out on 7 g of silica gel. using for elution 15 ml of solvent per fraction. Fractions 1 to 8 (eluted with benzene, methylene chloride and methylene chloride-methanol- (99: 1)) give 54 mg of an amorphous material which is discarded. Fraction 9 (6.5 mg, eluted with a 99: 1 mixture of methylene chloride and methanol) provides, in ether, 0.5 mg of crystallized verrucarin A (still containing verrucarin B).

   Fractions 10-14 (eluted with a 99: 1 mixture of methylene chloride and methanol) and 15-20 (eluted with a 98: 2 mixture of methylene chloride and methanol) provide 28 mg of an amorphous material in which, using the thin-layer chromatogram, additional amounts of verruoarin A and verrucarin B can be detected.

 <Desc / Clms Page number 18>

 
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  4t.
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 Preparation and isolation of raw verrucarin A and raw verrucarin B.



   Strain S 118 is incubated under the conditions of
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 Example 1, but in Vlelndling's nutrient solution (see Example 3). After which, to remove the mycelium, 39? Ma filtered. from the culture broth, the clear filtrate is extracted twice with 1 liter of ethyl acetate each time, the extracts are washed once with water, twice with a binormal solution of caustic soda and twice with water. water and evaporated under reduced pressure.

   There remains 428 mg of a crude product of yellow tint which, on the thin layer chromatogram (. Carried out as described in Example 1), gives two spots which correspond to verrucarin A and verrucarin B. To further purify one chromatograph the crude product on 25 g of silica gel for the execution see the description given in Example 1). We obtain 3.5 mg of wart
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 crude and crystallized carine A (still containing verrucarin #, BXJdtPLtt b, -.



  Preparation and detection of verrucarin A and verrucarin B. strain S 118 is incubated under the conditions of example 1. The extraction and the additional treatment, carried out on 78U ml of culture broth, are carried out exactly. as described in Example 1. 44 mg of crude extract in acetate are obtained.
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 of ethyl (brown tint) which shows, on the thin layer chromatogram (carried out as in Example 1), two spots whose travel distances correspond to & verruccarin A and wart B. EXAMPLE 6.-
Preparation and isolation of crude verrucarin A, verrucarin B and roridin A.
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  Strain 8750 is grown at z.27 ° C in a 7 liter fermenter (New Brunswick Co., New Brunswick, USA type 8304)

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 with 5 liters of a nutrient solution (Richard's solution, see example 1), with aeration and with stirring (300 revolutions per minute).



  After removal of the mycelium by filtration, 4.1 liters of the culture filtrate, light yellow in color, are extracted three times with 5 liters of ethyl acetate each time, the combined extracts are washed once with 1 liter of water. and the solution obtained is concentrated under reduced pressure until its volume is no more than 500 ml. The concentrated solution is then washed at 0 ° C. three times with 100 ml of a binormal solution of caustic soda each time and three times with 100 ml of water each time, and it is evaporated under reduced pressure. 680 mg of a crude product of yellow tint is obtained. To further purify it, this product is chromatographed on 30 g of silica gel.



  For the elution, 60 ml of solvent are used in each fraction. Fractions 1 to 10 (eluted with benzene and chloroforma yielded 318 mg of oil, of an oil which was discarded. Fraction 11 (81 mg eluted with a 99: 1 mixture of chloroform and metha . nol) gives, in ether, 34 mg of crystallized verrucarin A which, according to the thin-layer chromatogram (see example 1), appears to be of unique constitution. From the mother liquors one obtains, by crystallization in ether, another 11 mg of a mixture consisting of verrucarin A and roridin A.

   Fractions 12 to 16 (152 mg eluted with a 99: 1 mixture of chloroform and methanol) give, after crystallization from ether, 61 mg of a crystalline mixture which, according to the thin layer chromatogram, is mainly consisting of verrucarin A, but still contains verrucarin B and roridin A. The combined mother liquors of fractions 11 to 16 (125 mg) still contain approximately 30 mg of verrucarin A and 30 mg of roridin A. Fractions 17 at $ 23 (read by 99: 1, $ 98: 2 and 1: 1 mixtures of chloroform and methanol) provides 79 mg of an amorphous material which is discarded * EXAMPLE 7. -
Preparation and isolation of roridin A.

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   Under aeration ('liters per minute) and with stirring (300 revolutions per minute), the strain S 973, Myrothecium roridum, is cultivated in 5 liters of nutrient solution (20 g of extra pure glucose, Ph. HV, 2.0 g of 'malt extract, Schweiz. Ferment AG, 2.0 g of Xeast extract Difco' 2.0 g of Cudahay pepton, 2.0 g of phosphate - mono-potassium, 2.0 g of magnesium sulfate (.7H20) , 0.2 g of iron sulfate (.7H2O)), in a fermenter (New Brunswick Co., New Brunswick EUA type FS 307). After removal of the mycelium by filtration, the lipid solution, yellow in color and pH 6, is extracted three times with 5 liters of ethyl acetate each time.

   The solution obtained by mixing the extracts is washed once with 1 liter of water, then it is concentrated to a volume of 700 ml under reduced pressure, it is washed, at 0 C, three times with 80 ml of water each time. with a detergent of binary caustic soda and twice with 80 ml of water each time and it is evaporated.



  5.7 g of crude product of yellow tint is obtained which, by crystallization in a mixture of acetone and ether, gives 105 mg of crystallized roridin A, melting point 190-195 C (the thin layer chromatogram shows that this product is unique).



  The mother liquors (5.6 g) are chromatographed on 250 g of silica gel. For the elution, 250 ml of solvent are used per fraction. Fractions 1-10 (eluted with benzene, chloroform and a 99.5: 0.5 mixture of chloroform and methanol) provide 2.32 g of an oily product which is discarded. Fractions 11 to 21 (2.45 g, eluted with a 99: 1 mixture of chloroform and methanol) give, by crystallization from a 97: 3 mixture of chlororoform and methanol, 1.2 g of crude crystallized roridin A which , according to the thin layer chromatogram, still contains some carine A wart and an unidentified substance A.

   After crystallization from a mixture of acetone, ether and petroleum ether, 428 mg of crystallized roridin A is obtained, melting at 191-196 C, 166 mg of crystallized roridin A still containing traces of substance A, as well as 218 mg of a crystalline mixture of roridine

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 A and substance A in the ratio 1: 1.



   After recrystallization from a mixture of acetone and ether, roridin A is obtained in the form of colorless prisms melting at 191-196 C or 198-204 C.



  EXAMPLE 8. -
Preparation and isolation of, verrucarin A from ver- rucarin B and roridin A.



   Strain 8 1135 (sectoral variation of strain S 973) is cultivated in the nutrient solution described in Example 7, in a 50 liter fermeneur (Ultramix system type FB 005, Hch.



    Bertrams A.G., Basel, Switzerland, US agitation (1450 rpm), under aeration (50 liters per minute) and under an overpressure of 0.4 atmosphere. After adding kieselguhr (colitis) which serves as a filter aid, the culture broth (50 liters) is filtered, the clear, yellow-colored culture filtrate is extracted six times with 40 liters each time. ethyl acetate and the extracts washed with water. Water is added to the mixture of mycelium and kieselguhr, homogenized and extracted three times by stirring with 10 ml of ethyl acetate each time.

   The extracts obtained after filtration and washing with water are combined with the ethyl acetate extracts from the culture filtrate, and the overall solution is concentrated under reduced pressure to a volume of about liters. After washing with 1 liter of a binormal solution of caustic soda and twice each time with 0.5 liter of a binormal solution of caustic soda and with 0.5 liter of water, the mixture is evaporated to dryness under reduced pressure.

   The residue obtained (206 g) gives, after addition of ether, 78 g of a crude crystallized product which, according to the thin-layer chromatogram (produced as described in Example 1), mainly consists of roridin A, but still contains roridin C, verrucarin A and verrucarin B as side products. 128.5 g of a residue 1 of mother liquors remain. The crude crystallize (78 g) is taken up in methanol and filtered. The 'insoluble fractions in

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 methanol (2, g) constitute a crystallizing agent in which roridin C is mainly concentrated but which still contains vexrut carine A as an impurity.

   The fractions soluble in methanol are evaporated and the residue is subjected to crystallization.
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 fractionated in lilétha.nol-ether. This gives 1) 33.9 g of pure crystallized roridin A, 2) 26.0 g of crystallized roridin A still containing a little roridin C, verrucarin A and substance
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 A and i) 15.6 g of mother liquor residue II. The latter is added to the residue of mother liquors 1 (144 g) and the whole is dissolved in 520 ml of a 3: 1 mixture of chloroform and benzene. As in Example 1, 260 ml of this solution (corresponding to 72 g of mother liquor residue) are chromatographed on 3.77 kg of silica gel.

   From the fractions eluted with a 95: 5 mixture of chloroform and methanol, 1.2 g of pure crystallized verrucarin A are isolated by crystallization with ether.
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  EXJmPLfc. 9.
Preparation and isolation of roridin A, roridin B, roridin C, verrucarin A and verrucarin C.



   Myrothecium roridun strain 8 1135 is incubated in
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 a 10 liter fermenter (U.tranix system, type FU 001, Roh. Bertrams AG, Bay, Switzerland) with 10 liters of air per minute, under a relative pressure of 0.4 atmospheres and at a temperature of 27 C, in the nutrient solution having the following composition!
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 30.0 g of extra pure glucose (Ph. Ti.ir), zou g of the Disco extract, 4.0 g of a, runanium nitrate, 2.72 g of mono-potassium phosphate, 1.2 g of magnesium sulfate (.7 H20), 0.028 g of ferrous sulfate (.7 H20), 0.003 g of zinc sulfate (.7 H20).

   The culture broth (10 liters) is filtered through a layer of Kieselguhr (Cellte) and the clear, yellow-tinted culture filtrate is extracted with
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 three times each time with 10 liters of ethyl alcohol. The extracts, washed with 1 liter of water, are evaporated completely under reduced pressure. The resicu is dissolved in 1 liter of chloroform and the solution is washed three times with each time 100 ml of a binormal solution of caustic soda and four times.

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 with 100 ml of water each time.

   After evaporation of the washed chloroform solution, 12.0 g of a crude product of yellow tint is obtained which is chromatographed on 250 g of silica gel to continue the separation. -Chromatography I.



   For the elution, 500 ml of solvent are used per fraction.



  Fractions 1 and 2 (eluted with benzene) contain 7.88 g of an oil which is discarded. Fractions 3 to 6 (482 mg, eluted with chloroformer give, in ether or petroleum ether, 23 mg of crystallized roridin B, melting point 140-147 C, a product which shows the thin layer chromatogram, was found to be perfectly well defined. Fractions 7 and 8 (eluted with a 99: 1 mixture of chloroform and methanol) provided 101 g of an amorphous material which was discarded. Fractions 9 and 10 (1.48 g, eluted with a 99: 1 mixture of chloroform and methanol) gives, on crystallization from ether, 646 mg of crystals, melting at 122-143 C.



  After recrystallization in a mixture of acetone and ether, 400 mg of a crystalline product, melting at 130-138 C, is obtained which consists mainly of roridin A, as well as of ver- rucarin A and of roridin C. The subsequent separation of the crystallized product is carried out in chromatography II (see below)., Fraction 11 (.305 mg eluted with a 99: 1 mixture of chloroform and methanol), gives in ether, 106 mg of crystal roridin A - lisée which still contains traces of impurities. Further purification is by chromatography III, and that of the mother liquors is done by chromatography II. fractions 12 to. 20 (eluted with 99: 1, 98t2 and 1: 1 mixtures of chloroforma and methanol) did not give crystals.

   The subsequent purification of fractions 12 and 13 (330 mg) is carried out in chromatography II.



  -Chromatography II.



   The mother liquor residues from fractions 9, 10 and 11, as well as fractions 12 and 13, i.e. a total of 1.39 g of material, 'are combined and the whole is subjected to partition chromatography with, for stationary phase, 700 g of a part mix.

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 equals of kieselguhr and water and, for mobile phase, the water-saturated slovants indicated below (200 ml per fraction). Fractions 1-19 (riveted with benzene and with a 95: 5 mixture of benzene and chloroform) provide 269 mg of an amorphous material which is discarded. Fractions 20 to 25 (91 mg, eluted with a 95: 5 mixture of benzene and chloroform) give, in ether, 13 mg of crystallized and pure verrucarin B.

   Fractions 26-30 (eluted with a 95: 5 mixture of benzene and chloroform) provided 62 mg of an amorphous material which was discarded. Fractions)! 31 to 38 (130 mg, eluted with a 95: 5 mixture of benzene and chloroform) gives, in ether, 12 mg of pure crystallized verrucarin A. From the mother liquors, 20 mg of crystallized and pure roridin C are obtained in ether, which melts at 117-121 C.



  Fractions 39 to 43 (60 mg, eluted with a 95: 5 mixture of benzene and chloroform) give, in ether, after fractional crystallization, 28 mg of crystallized and pure verrucarin A and 17 mg of roridin C crystallized and pure. The mother liquors contain verrucarin B and roridin C. Fractions 44 to 75 (269 mg, eluted with 95: 5, 9: 1 and 4: 1 mixtures of benzene and chloroform) provide, after fractional crystallization, 48 mg of pure crystallized verrucarin A. Mother liquors contain verrucarin B and roridin C.

   Fractions 76-125 (eluted with a mixture of equal parts benzene and chloroform and with chloroform) give 526 mg of amorphous material which is discarded. Fractions 126 to 133 (250 mg, eluted with a 9: 1 mixture of chloroform and ethyl acetate) provide in ether 305 mg of pure crystallized roridin A which melts at 194-202 C. Fractions 134-159 (eluted with 9: 1 and 4: 1 mixtures of chloroform and ethyl acetate and with ethyl acetate) gave 278 mg of amorphous material which was discarded.



  -Chromatography III.



   The mixture is chromatographed on 80 g of alumina 800 mg of the mixture.

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 crystallized ge of fractions 9 to II from chromatography I. For elution, 100 ml of solvent are used per fraction. Fractions 1 to II (eluted with chloroform) give traces of amorphous material which is discarded. Fractions 12 to 21 (eluted with a 95.5: 0.5 mixture of chloroform and methanol) provide, in ether, 200 mg of a crystalline mixture of roridin A and roridin C. Fractions 22 to 51 (eluted with a 99 µl mixture of chloroform and methanol) provides, in ether, 432 mg of crystallized roridin A of unique constitution.

   Fractions 52-67 (eluted with 95: 5 9: 1 and 4: 1 mixtures of chloroform and methanol) gave 46 mg of amorphous material which was discarded.
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 hXtMPL, 10. -
Preparation and isolation of raw verrucarin A and verrucarin B as well as verrucarin C and roridin B.



   Strain S 118 is incubated at 27 ° C. in the form of a surface culture at rest in a 500 ml Erlenmeyer flask with 100 ml of nutrient solution each time, in the nutrient medium described in Example 7 and completed by addition. 3.0 g of ammonium chloride per liter; The culture liquid is freed from the mycelium by filtration. Extracting 30 liters of the culture broth with ethyl acetate gave 14 g of crude extract. 12.7 g of this extract are dissolved in 1.5 liters of chloroform, the solution is washed at 0 C three times with each liver 150 ml of a binormal solution of caustic soda and twice with each time 150 ml of water and evaporated.

   9.5 g of a neutral crude product is obtained which is chromatographed on 250 g of silica gel.



   For the elution, 400 ml of the solvent are used each time per fraction. Fractions 1 to 10 (eluted with chloroform and with a 99.5: 0.5 mixture of chloroform and methanol) provide 1.46 g of amorphous material which is discarded. Fractions 11 to 20 (4.324 g, eludes with 99 µl mixture of chloroform and methanol)

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 give 200 mg of pure crystallized verrucarin A which still contains verrucarin B. Fractions 21 to 30 (eluted with 98: 2 and 9: 1 mixtures of chloroform and methanol) give 41 g of amorphous material which is throws.

   The mother liquor residues from fractions 11 to 20 (3.56 g) are chromatographed, in order to be further purified, on neutral alumina of activity level II. For the elution, 400 ml of solvent are used per fraction. Fraction 1 (1.54 g, eluted with a 4: 1 mixture of chloroform and benzene) provides in ether 25 mg of crude crystallized verruoarin A (still containing verrucarin B). Fractions 2 to 19 (eluted with a 4: 1 mixture of chloroform and benzene, with chloroform and with 99: 1, 98: 2 and 95: 5 mixtures of chloroform and methanol) provide 1.54 g of amorphous material that is thrown away.



  Fraction 20 (61 mg, eluted with a 3: 1 mixture of chloroform and methanol) gives, in methanol-ether, 8 mg of crystals melting at 226-228 C. After recrystallization in acetone-eter, verrucarin is obtained. Pure C in the form of prisms melting at 223-224 C.



   -Extraction of mycelium.



   The dried mycelium is extracted three times with 2 liters of methanol and 200 ml of water each time for 45 minutes at 40-50 C, filtered and evaporated. The residue (12.8 g) is then partitioned (by dissolution) between 500 ml of water and 1 liter of ethyl acetate and the aqueous phase is extracted three more times with 1 liter of ethyl acetate each time. ethyl. The extracts in ethyl acetate, after evaporation of the solvent, leave 5.20 g of a brown oil which is chromatographed, as described above, on 120 g of silica gel.

   From the fractions (.157 mg) eluted with a 99.5: 0.5 mixture of chloroform and methanol, 41 mg of crystallized and pure roridin B are obtained in ether in the form of needles melting a 147-152 C Fractions eluted later with a 99: 1 mixture of chloroform and methanol give, on crystallization from ether, 16 mg of crude verrucarin A (still containing verrucarin B).

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  EXAMPLE 11. -
Preparation and isolation of crude verrucarin A, crude rucarin B and roridin B.



   Strain 8118 is incubated for 63 hours in the nutrient solution which was described in Example 10, in a 50 liter fer- mentor (see Example 7), with stirring (1450 rpm) and under constant aeration (0.8 liters per minute and per liter of nutrient solution). After adding kieselguhr (Celite), the culture broth is extracted with a total of 22 liters of ethyl acetate (phase separation is done in a centrifuge). After concentrating the extract to 4 liters under reduced pressure, it is washed four times with 400 ml of a binormal solution of caustic soda each time and three times with 300 ml of water each time, and the mixture is evaporated off.

   19.5 g of pure extract are obtained from ethyl acetate. 2.31 g of crude crystallized verrucarin A (still containing verruoarin B) are isolated from ether by crystallization. The mother liquors (17.2 g) are chromatographed on 850 g of silica gel. Oven - subsequent washing of fractions 1.7 liters of solvent are used per fraction. Fraction 1 (7.1 u g, eluted with benzene) gives, in a mixture of ether and petroleum ether, 19 mg of crystals melting at 237-239 c (product not identified). Fractions 2 to 6 (4.15 g, eluted with chloroform) give, in petroleum ether-ether, 60 mg of roridin B crystallized in the form of needles, melting at 139-143 C.

   Fractions 7-10 (eluted with a mixture; chloroform and methanol 99: 1) gave 1.09 g of an amorphous material which was discarded. Fractions 11 to 18 (3.25 g, eluted with a 98: 2 mixture of chloroform and methanol) give 2.18 g of crude crystallized verrucarin A in ether (still containing verrucarin B). The following fractions are discarded.



  EXAMPLE 12: -
Preparation and isolation of verrucarin A, ver- rucarin B and verrucarin D.

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   The strain S 833 is incubated in the form of a shaken culture as in Example 1, in a medium which contains, per liter, 30 g of sucrose, 2.5 g of ammonium chloride, 1.0 g of phosphate. monopotassium, 0.5 g of magnesium sulfate (.7 H2O), 0.5 g of potassium chloride, 0.01 g of iron sulfate (.7 H2O) and the sufficient amount of water. 900 ml of the culture broth are extracted with 2 liters of ethyl acetate. After washing with water, with a binormal solution of caustic soda and again with water and after evaporation under reduced pressure, the extract gives 24J mg of an oily crude product which is chromatographed on 12 g of sodium gel. silica.

   From the fractions eluted with chloroform, 2 mg of pure verrucarin D are obtained in a mixture of ether and petroleum ether in the form of needles melting at 127-128 C.



  On the thin euche chromatogram, verrucarin D migrates about as quickly as verrucarin A. From the following fractions eluted with a 99: 1 mixture of chloroform and methanol, 38 mg of crystallized and crude verrucarin A are obtained which contains more Verrucarine B.



  EXAMPLE 13; -
Separation of raw crystallized verrucarin A (containing verrucarin B) into pure verrucarin A and pure verrucarin B.



   9.53 g of crude, crystalline verrucarin A (containing verrucarin B) is subjected to partition chromatography on 5.4 kg of a mixture of equal parts of kieselguhr and water, The solvents which are used for the elution are saturated with water (1.2 liters per fraction). Fractions 1-20 (eluted with benzene and with a 95: 5 mixture of benzene and chloroform) give 445 mg of an oily material which is discarded. Fractions 21 to 34 (1.20 g, eluted with a 95: 5 mixture of benzene and chloroform) give, in acetone-ether, 747 mg of crystallized and pure verrucarin B which, on the thin layer chromatogram, appears to be a well-defined product.

   Fractions 35 to 37 (172 mg, eluted with a

 <Desc / Clms Page number 29>

 95: 5 mixture of benzene and chloroform) give, in acetone-ether, 126 mg of a crystalline mixture consisting of approximately 50% verrucarin A and approximately 50% verrucarin B. The fractions
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 38-40 (studies with a 955 mixture of benzene and chloroform) provide 406 mg of a material which is primarily verruoarin A (main product) and 3 or 4 other unidentified side products.

   Fractions 41 to 84 (8.6 g, eluted
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 with ytl, 8:.,>: 2 and 7: 3 mixtures of benzene and chloroform and with chloroform) give, in acetone-ether, 6.13 g
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 of pure crystallized Verrucarin A which, on thin layer chromatograms, appears to be a well-defined product. t.J1Pl :. Mu -,.



  Thin-layer cholestogrph1e of verrucarins and roridins. t
Thin layer chromatography is carried out by known methods.



   Rf values
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<tb> Substance <SEP> Value <SEP> Rf <SEP> reaction <SEP> Color <SEP> to
<tb>
<tb> Substance <SEP> colors <SEP> the <SEP> light
<tb>
<tb> with <SEP> ultra-
<tb>
<tb> 12 <SEP> purple
<tb>
 
 EMI29.5
 Verrucarin A 0.70 u26 U9 light yellow brown Verrucarine b ù, 8j $ 0.47 0.69 light yellow brown Verrucarine C Oe74 0.28 0.59 bright young brown
 EMI29.6
 
<tb> clear
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<tb> Verrucarine <SEP> D <SEP> 0.70 <SEP> 0.28 <SEP> 0.59 <SEP> brown <SEP> yellow <SEP> dark
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<tb> Verrucarine <SEP> E <SEP> - <SEP> 0.91 <SEP> purple <SEP> dark
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<tb> Substance <SEP> Value <SEP> faction <SEP> Color <SEP> to
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<tb> 1) <SEP> 2) <SEP> 3)

   <SEP> colored <SEP> the <SEP> light
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<tb> with <SEP> ultra-
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<tb> 12 <SEP> purple
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<tb>
<tb> Roridin <SEP> A <SEP> 0.70 <SEP> 0.18 <SEP> 0.55 <SEP> brown <SEP> yellow <SEP> dark
<tb>
 
 EMI29.7
 roridin li 0.55 0.36 0.41 black dark green
 EMI29.8
 
<tb> Horidin <SEP> C <SEP> - <SEP> 0.42 <SEP> brown <SEP> yellow <SEP> dark
<tb>
 
 EMI29.9
 1) Support: alumina, strings chlorofnrAe-methanol- (98: 2) 2) Support: silica gel. Glutinous: chloroform-methanol- (98: 2) 3) Support: silica gel. Eluent: chloroforae-ethanol- ($ 97 3).

Claims (1)

R E S U M E . ABSTRACT . La présente invention comprena notamment; 1 ) Un procéda de séparation et d'isolement des nou- velles composantes du mélange obtenu 6 partir des liquides de cul- ture et/ou des mycéliums de souches des mycates Myrothersium ver- ' rucaria (Albertini et Schweinitz) Dimar ex tries et Myrothecium roridum Tode ex Pries, procédé selon lequel on sépare le mélange en ces composantes par précipitation, partage, chromatographie d'adsorption, chrématographie de partage ou partage a contre- courant partage fractionné) et on isole les composantes activer à savoir la verrucarine A, la verrucarine B et la roridine A. The present invention comprises in particular; 1) A procedure for separating and isolating the new components of the mixture obtained from the culture fluids and / or mycelia of strains of the mycates Myrothersium ver- 'rucaria (Albertini and Schweinitz) Dimar ex tries and Myrothecium roridum Tode ex Pries, process according to which the mixture is separated into these components by precipitation, partitioning, adsorption chromatography, partition chrematography or countercurrent partition (fractional partition) and isolate the active components, namely verrucarin A, verrucarin B and roridin A. 2 ) A titre de produits industriels nouveaux, la verru- carine A, la verrucarine B et la roridine A obtenues selon le procédé spécifié sous 1 ). 2) As new industrial products, verrucarin A, verrucarin B and roridin A obtained according to the process specified under 1). 3 ) Procède et produits en substance comme ci-dessus décrit avec référence aux exemples cités. 3) Process and produced in substance as described above with reference to the examples cited.
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