Procédé de :préparation de 0M-prégnadiènes La présente invention a pour objet la préparation de 01,4-prégnadiènes.
Récemment, un certain nombre de stéroïdes des séries du prégnène et du prégnadiène, tels que l'hy drocortisone et la 1-déhydro-hydrocortisone sont devenus des agents thérapeutiques importants et sont devenus utiles comme intermédiaires pour la prépa ration d'autres stéroïdes utiles en thérapeutique.
Les nouveaux Al,4-prégnadiènes envisagés suivant l'inven tion sont utiles comme agents anti-inflammatoires dans le traitement de l'arthrite,. de l'asthme, des brû- lures, de la bursite, etc., et aussi dans le traitement des affections cutanées et des maladies du collagène. Ces composés sont utilisés en combinaisons avec des charges, excipients, etc., en tablettes, poudres, pilu les, etc.
Ils peuvent aussi âtre utilisés par voie par entérale, en solution ou en -suspension.
Suivant l'invention, on prépare les àl,4-prégna- diènes en soumettant un 04-prégnène à l'action enzy matique de microorganismes du genre Nocardia ou de l'espèce Corynebacterium simplex. Le procédé de la présente invention peut être illustré par l'équation schématique suivante, dans laquelle la formule 1 représente le 04-prégnène, et la formule II représente le A1,4-prégnadiène obtenu
EMI0001.0032
Dans ces formules, X est un atome d'hydrogène ou d'halogène,
Y est un, groupe méthylène, hydroxy- méthylène ou carbonyle, Z est un groupe méthylène, hydroxyméthylène ou alkanoyloxyméthylène infé rieur, R' est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle, et R est un atome d'hydrogène ou un groupe alcan.oyle inférieur. Dans certains composés préférentiels, X représente le fluor, Y représente CHOH, Z représente CHOR", R' représente OH,
R et R" sont des atomes d'hydrogène ou des radi caux alcanoyle. Pour la mise en oeuvre du présent procédé, on peut cultiver dans des conditions d'aérobiose, dans un milieu nutritif approprié contenant un 04-stéroïde de la série du prégnène, un champignon du genre Nocardia (Bergey, Manual, 6e édition), tel que le corallina ATCC 999 et ATCC 4273, (Culture Lederle No 13) ;
l'astérides ATCC 3308, le kerato- lyticus ATCC 12484, le transvalensis ATCC 12485, l'erythropolis ATCC 4277, le convuluta ATCC 4275, le gardneri ATCC 9604, le leishmanii ATCC 6855, l'opaca ATCC 4276,
le blackwelii ATCC 6846, le caviae ATCC 6848, le cuniculi ATCC 6864, le glo- berula ATCC 9356, le polychromogènes ATCC 3409, le sylvodifera ATCC 7372, le farcinica ATCC 3318 ou le sylvodifera ATCC 4919.
Pendant la croissance de l'organisme dans des conditions favo rables, deux atomes d'hydrogène s'éliminent du noyau stéroïde A, et l'on obtient ainsi une double liaison en position 1,2. Le mécanisme exact de cette déshydrogénation est obscur, mais celle-ci est le résultat des enzymes produites par l'organisme dans le processus de la croissance. Un milieu nutritif approprié contient généralement une source soluble de carbone, d'azote et de sels minéraux.
Comme sources de carbone, on emploie en général des sucres, tels que .le glucose, le saccharose, le maltose, le dextrose, le xylose et le galactose et aussi les alcools tels que le glycérol ou le mannitol ; l'amidon de mais; les acides organiques tels que l'acide citri que, l'acide malique et l'acide acétique ;
et divers produits naturels contenant des hydrates de carbone, tels que la liqueur de macération de maïs, la farine de soja, la farine de graine de coton, et de nombreu ses autres matières que l'on peut trouver et qui ont été utilisées antérieurement comme source de car bone dans les processus de fermentation. Générale ment, on peut utiliser différents corps ci-dessus, dans le milieu, avec de bons résultats.
Comme sources d'azote on peut utiliser certaines des matières citées ci-dessus, telles que la liqueur de macération de maïs, la farine de soja, la farine de graine de coton, etc., et diverses autres substances, telles que l'extrait de baauf, la caséine, la levure, des protéines digérées par enzymes, et les produits de dégradation, comprenant les peptones,
les acides aminés et beaucoup d'autres matières protéiques dis ponibles qui sont susceptibles d'entretenir la crois sance des champignons. Les sources inorganiques d'azote, comprenant l'urée, les sels d'ammonium, les nitrates, etc., peuvent être utilisées dans le milieu comme source d'azote assimilable pour fournir un milieu de croissance favorable à l'organisme.
Les éléments minéraux nécessaires à la fermen tation se trouvent généralement dans les matières brutes que l'on utilise souvent comme sources de carbone et d'azote, ou bien dans l'eau utilisée dans le procédé. Toutefois, il est en général à conseiller d'ajouter des quantités supplémentaires d'éléments minéraux à celles normalement présentes,
pour obte nir une croissance maximum de Nocardia. Il est avantageux- d'ajouter des cations et anions compre nant le sodium, le potassium, le calcium, le magné sium, les ions phosphate, sulfate, chlorure, le cobalt, le manganèse, et autres. L'usage d'oligo-éléments tels que le bore, le cuivre, le cobalt, le molybdène et le chrome est souvent désirable.
La croissance du champignon Nocardia ou du champignon Corynebacterium simplex peut se faire dans des conditions d'aérobiose, et l'on peut réaliser l'aération, dans des flacons par exemple, par agita tion sur une secoueuse alternative ou rotative, ou dans des bouteilles ou des cuves en envoyant sous pression de l'air stérile à travers le mélange de fer mentation.
Il est désirable d'insuffler de l'air stérile à travers le milieu à raison de 1/3 à 2 volumes d'air par volume de milieu et par minute. L'agitation dans les bouteilles ou dans les cuves de fermentation peut être assurée par un agitateur mécanique.
Le cham pignon Nocardia peut pousser à des températures de 5 à 450C, mais il est préférable de conduire le pro cédé à des températures de 25 à 370C. Le Coryne- bacterium simplex peut pousser à des températures de 10 à 450C, mais on l'utilise de préférence à une température de 25 à 38oC.
Pour préparer des inocula, on utilise avantageu sement 1,0 cm3 de suspension de cellules végétatives lavées de champignons du genre Nocardia ou de l'espèce Corynebacterium simplex, pour inoculer 100 em3 de bouillon stérile de soja à la trypticase,
dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. Le bouillon de soja à la trypticase contient généralement 3 % de produit de digestion tryptique de protéines de soja, sous forme de poudre déshydratée (Baltimore Bacteriological Laboratories),
5 % de glycérine et 0,3 % d'extrait de boeuf (Armour), et ce mélange est avantageusement stérilisé pendant 15 minutes à une température de 120C (pression de vapeur de 6,75 kg). Après stérilisation, le pH est compris entre 7,4 et 7,7.
Après avoir inoculé le flacon, on peut le faire incuber à 370C, sur une secoueuse, pendant 4 à 8 heures environ. On peut utiliser ces inocula pour inoculer de grandes quantités de milieu stérile en bouteilles, et ces cultures en bouteille, après fermen tation, peuvent servir à inoculer de grandes quantités de milieu dans des cuves de fermentation.
Au lieu du bouillon de soja à la trypticase indiqué plus haut, on peut utiliser d'autres milieux, comme le montrent les exemples ci-après.
Les A4-stéroïdes de la série du prégnène qui peu vent être utilisés comme produits de départ dans le procédé selon la présente invention sont notamment le 3,20-dicéto-11[3,17a,21-trihydroxy-A4-prégnène (hydrocortisone), le 3,20-dicéto-11(3,21-dihydroxy- A4-prégnène (corticostérone), le 3,20-dicéto-17a,21- dihydroxy-A4-prégnène (substance S de Reichstein), le 3,20-dicéto-lla,17a,
21-trihydroxy-A4-prégnène (11-épi-hydrocortisone), le 3,20-dicéto-ll(3,16a,17a, 21-tétrahydroxy-A4-prégnène, le 3,20-dicéto-9a- fluoro-11(3,16a,17a,21-tétrahydroxy-A4-prégnène, le 3,11,20-tricéto-16 ,17 ,21-trihydroxy-A4-prégnène, le 3,11,20-tricéto-16 ,17 ,21-trihydroxy-A4-prégnène, le 3;11,20-tricéto-17a,21-dihydroxy-A4-prégnène, et leurs esters, etc. On ajoute généralement ces stéroï des à la fermentation, en solution ou sous forme finement divisée.
Selon un mode d'exécution particu lier, on dissout le stéroïde dans l'éthanol ou d'autres solvants miscibles à l'eau, et à l'ajouter au milieu de fermentation, au stade désiré du processus. Bien que le stéroïde précipite parfois de la solution quand on l'ajoute de cette façon, il se disperse dans tout le milieu sous forme de suspension fine et se trouve facilement à la disposition de l'organisme en vue de l'oxydation. La quantité de stéroïde ajoutée à la fer mentation peut varier considérablement, mais elle est généralement de l'ordre de 1/1o à 1 g par litre de milieu.
Pendant le processus de fermentation, il est par fois désirable d'ajouter des agents antimousses tels que les silicones, les huiles glycéridiques, etc. On ajoute ces composés de temps en temps, et dans les quantités voulues.
On fait généralement incuber pendant une durée de 16 à 40 heures environ, à une température d'en viron 32oC, les portions de 10 ce de milieu inoculé en tubes de secoueuse de 100 cm3. Au bout de ce temps, on ajoute, dans chaque tube, 2 mg de subs trat stérile (stéroïde A4-prégnène) dissous dans 0,2 cm3 d'éthan:
ol, et l'on poursuit la fermentation à environ 320C. On laisse 1a fermentation se poursuivre pendant un laps de temps suffisamment long pour réaliser la conversion maximum du A4-prégnène en A'@4-prégnadiène. Ce laps de temps peut varier de 1 à 72 heures. ou plus.
A la fin du processus de fermentation, on sépare du milieu de fermentation le A','-stéroïde de la série du prégnadiène obtenu, grâce à la méthode suivante qui décrit en particulier une fermentation sur 10 cm3. C'est là une méthode générale qui est applicable pour des fermentations à diverses échelles : on extrait à quatre reprises le contenu d'un tube de fer mentation, avec quatre volumes de chlorure de méthylène.
On réunit les quatre extraits, puis on lave une fois la solution résultante avec une solution aqueuse à 2 % de bicarbonate de sodium saturée de chlorure de sodium, et ensuite on lave à deux repri ses avec une solution saturée de chlorure de sodium. Après lavage, on peut -sécher la solution de chlorure de méthylène sur du sulfate de magnésium anhydre et la filtrer.
On concentre le filtrat au bain-marie à la pression atmosphérique, jusqu'à un faible volume, et l'on transfère le concentré dans un flacon volu métrique de 10 ce, puis on complète à ce volume avec du chlorure de méthylène. On peut utiliser cette solution pour déterminer la teneur en stéroïde.
Dans les fermentations à grande échelle, on peut récupérer le ou les produits bruts de la liqueur de fermentation, par une simple extraction par solvant, en utilisant un solvant approprié non miscible à l'eau tel que les hydrocarbures inférieurs chlorés, les alcools, les esters, les cétones, etc. On peut procéder à une nouvelle purification et séparer les produits stéroïdes des extraits, par des méthodes connues. La séparation et la purification du mélange de stéroïdes nécessitent souvent l'usage de la chromatographie.
Pour identifier les stéroïdes présents dans la liqueur de fermentation soumise à l'extraction, on peut recourir à la chromatographie à bande de papier. Le système solvant utilisé est en général un système eau-méthanol-benzène, que l'on peut préparer en agitant environ 50 % d'eau et 50 % de méthanol avec du benzène, dans une ampoule à décantation, puis en laissant les deux couches se séparer.
On place généralement une portion de la couche infé rieure dans un cristallisoir ouvert, sur le fond d'un grand cylindre en verre. La couche supérieure est la phase solvant, et elle sert à remplir la cavité en forme d'auge à l'intérieur du cylindre.
On peut pré parer une solution étalon de stéroïde en dissolvant 10 mg de chacun des stéroïdes suivants dans 10 crri3 de chlorure de méthylène 3,20-dicé@to-11P,17a,21-trihydroxy-A4-prégnène ; 3,20-dicéto-11p-21,dshydroxy-A4-prégnène ; 3,20-dicéto-17a,21-dihydroxy-A4-prégnène ; 3,20-dicéto-1 la,17a,21-trihydroxy-A4-prégnène ; 3,20-dicéto-11(3,16a,17cz,21-tétrahydroxy-A4- prégnène; 16,21-diacéto-3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21- tétrahydroxy-A4-prégnène ;
3,20-dicéto-9a-fluoro-11 p,16c1,17a,21-tétra- hydroxy-A4-prégnène; 16a,21-diacéto-3,20-dicéto-9a-fluoro-11(3,16a, 17a,21-tétrahydroxy-A4-p@régnène ; (D'autres stéroïdes peuvent servir dans la solu tion étalon lorsqu'ils sont appropriés).
On peut chromatographier simultanément au moins une solution courante de stéroïde chaque fois que l'on essaie une solution inconnue. On applique généralement .exactement 0,025 cm3 de la solution étalon de stéroïde pour essais, sur la bande de papier, à la ligne de départ, à 10 cm de l'extrémité supérieure de 1a bande, que l'on plie par-dessus le bord de l'auge et que l'on plonge dans la phase sol vant contenue à l'intérieur.
On peut développer alors la bande pendant 2 à 4 heures à environ 370C. De même, on peut appliquer 0,1 cm3 de la solution inconnue sur une autre bande, que l'on plie alors dans la même auge et que l'on développe simultané ment avec la bande étalon au stéroïde. L'auge per met de développer de nombreuses bandes simulta nément.
Après avoir développé convenablement les bandes de papier, on peut les enlever de l'appareil et on les sèche à l'air à environ 370C. Après séchage, on pulvérise généralement sur les bandes une solu tion alcaline de bleu tétrazolium qui fait apparaître la couleur aux points où les stéroïdes sont présents. On aligne des bandes à couleur développée avec au moins une bande étalon et l'on compare. On peut identifier les différents stéroïdes par leur position sur la bande.
Les AIA-stéroïdes obtenus par le procédé selon l'invention seront généralement plus polaires que les A4-stéroïdes correspondants. Il est entendu, de plus, que les A1@4-stéroides obtenus, une fois qu'ils ont été isolés et caractérisés, peuvent eux-mêmes servir- dans une solution étalon de stéroïdes afin d'améliorer le procédé.
Exemple 1 <I>Préparation</I> <I>du</I> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy- AI#Lprégnadiène On lave une culture de Nocardia coralline (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar en tube à essai, au moyen de 7 cm3 de solution saline stérile, et l'on obtient une suspension de cellules végétatives que l'on utilise pour inoculer 100 cm@@ de bouillon de soja stérile à la trypticase (décrit plus haut),
dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber le flacon pendant 7 heures à 370C. On utilise alors cet inoculum pour inoculer un bouillon stérile de soja à la trypticase dans des tubes de secoueuse de 100 cm3. On utilise 1 cm3 d'inoculum pour inoculer chaque portion de 10 cm3 d'un milieu contenant 2 % de mélasse
(Grandma), 1 % d'extrait de baeuf (Difco), et 1 % de glucose dans chaque tube de secoueuse de 100 cm3. On fait incuber les tubes à 32oC pendant 40 heures.
A ce moment, on ajoute dans chaque tube 2 mg de 3,20-dicéto-11(3,17a,21- trihydroxy-Al-prégnène dissous dans 0,2 cm@ d'étha nol. On continue alors l'incubation pendant encore 24 heures.
On extrait à quatre reprises les 10 cm3 de liqueur de l'un des tubes ci-dessus, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu dans 2 cm3 d'acétone, et l'on analyse un échantillon approprié par les techniques à bande de papier décrites ci-dessus.
Le chromato- gramme sur bande de papier indique la présence du 3,20-dicéto-11P,17a,21-trihydroxy-Al>4-prégnadiène. Exemple 2 <I>Préparation</I> <I>du</I> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy- AI,4-prégnadiène On lave une culture de Nocardia sp. (ATCC 12483) sur agar-agar en tube à essais,
au moyen de 5 cm3 de solution salinde stérile. On utilise 2 cm3 de la suspension obtenue pour inoculer 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber le mélange en agitant à 37 C pendant 8 heures,
et l'on utilise la culture obtenue pour inoculer des tubes contenant du bouillon stérile de soja à la tryp-ticase. On utilise 1/2 cm3 de la culture de 8 heures pour inoculer 10 cm3 de milieu dans un tube de 100 cm3. On incube les tubes inoculés à 320C en agitant pendant 16 heures.
Dans chaque tube, on ajoute 2 mg de 21- acéto-3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy-A4-prégnène, dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol. On fait incuber les tubes encore 1 1/2 à 5 heures -et l'on récolte.
La chromatographie sur bande de papier indique que le substrat s'est converti en 3,20-dicéto-11(1,17a,21-tri- hydroxy-Al>4-prégnadiène. On observe encore, sur les bandes de papier, à mesure que le temps croît, l'ap parition de 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy-A4- prégnène, et que sa quantité augmente aux dépens du 21-acéto-3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy-Al- prégnène, suivi par l'apparition en quantité croissante de 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy-Al@4-prégna- diène.
Exemple 3 <I>Préparation</I> <I>du</I> 3,20-dicéto-11(i,16a,17a,21-tétrahydroxy- AI J-prégnadiène On lave une culture de Corynebacterium sim- plex sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm-3 d'eau stérile,
et l'on dis tille la suspension de cellules obtenue pour inoculer 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase dans un flacon Erlenmeyer de 50 em3. On fait incu ber ce mélange avec agitation à 37 C pendant 8 heu res.
On prend 25 flacons Erlenmeyer de 500 cm3, contenant chacun 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase, sans glycérol, et on les inocule chacun avec 1 cm3 de l'inoculum vieux de 8 heures. On fait incuber ces flacons à 32oC pendant 40 heu res.
Au bout de ce temps, on ajoute dans chaque flacon 40 mg de 3,20-dicéto-11(3,lla,17a,21-tétra- hydroxy-A4-prégnène dissous dans 4 cm@ d'éthanol et l'on continue la fermentation pendant 8 heures à 320C. On réunit le contenu des vingt-cinq flacons et l'on obtient une liqueur à pH 8,1.
On réunit les liqueurs après récolte, on extrait une fois avec 3 litres de chlorure de méthylène et trois fois avec deux litres chaque fois de chlorure de méthylène. On lave une fois l'extrait réuni avec une solution saline saturée et l'on évapore jusqu'à siccité sous pression réduite. On obtient 509 mg de résidu huileux, on le dissout dans 1,5 cm,, de la phase sta tionnaire du système, 3 parties d'acétate d'éthyle, 2 parties d'éther de pétrole (90-100C), 3 parties de méthanol, 2 parties d'eau, et l'on mélange avec 3 g de terre d'infusoires.
On entasse alors cette terre d'infusoires imprégnée en haut d'une colonne de verre de 1,5 X 35 cm contenant 25 g de terre d'in fusoires imprégnée de 12,5 em3 de la phase station naire du système ci-dessus. On élue le composé désiré avec la phase mobile du système ci-dessus et l'on obtient 207 g de solide brut.
On cristallise celui- ci dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole (60-70 C) pour obtenir 56 mg de produit à point de fusion de 195-200 C (bloc Kôfler). La recristalli- sation dans le même couple de solvants élève le point de fusion à 202-205C (bloc) ; point de fusion (par méthode capillaire) 229-231,JC. Spectre ultraviolet
EMI0004.0127
241 mou (E 14.500).
Spectre infrarouge 3412, 1718, 1667, 162.2, 1612 (palier), 1098,
EMI0005.0001
1072 cm-1.
EMI0005.0003
<I>Analyse</I>
<tb> Calculée <SEP> pour <SEP> C21Hz80 <SEP> (376,44)
<tb> C <SEP> 67,00 <SEP> 0/0 <SEP> ; <SEP> H <SEP> 7,50 <SEP> %
<tb> Effective <SEP> : <SEP> C <SEP> 66,80 <SEP> 0/0 <SEP> ; <SEP> H <SEP> 7,62 <SEP> 0/0. Les propriétés physiques et chimiques du com posé sont celles du 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21- tétrahydroxy-Ah4-prégnadiène.
D'une manière analogue à celle des exemples susmentionnés, on peut obtenir les àl,4-prégnadiènes mentionnés dans le tableau suivant en utilisant les matières premières et les microorganismes mention nés dans ledit tableau.
EMI0005.0009
Tableau
<tb> Exemple <SEP> Microorganisme <SEP> employé <SEP> Matière <SEP> première <SEP> employée <SEP> Produit <SEP> final <SEP> résultant
<tb> 4 <SEP> Nocardia <SEP> sp. <SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroXy-04-prégnène <SEP> Al,4-prégnadiène
<tb> 5 <SEP> Nocardia <SEP> gardneri <SEP> (ATCC <SEP> 9604) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> AIJ-prégnadiène
<tb> 6 <SEP> Nocardia <SEP> gardneri <SEP> (ATCC <SEP> 9604) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-Al>4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 7 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-dicéto=11(3,21- <SEP> - <SEP> 3,20-dicéto-11(3,
21-dihydroxy dihydroxy-A4-prégnène <SEP> A1,4-prégnadiène
<tb> 8 <SEP> Nocardia <SEP> leishmanii <SEP> (ATCC <SEP> 6855) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dic6ta-11(3,16a,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydioxy-Al,4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 9 <SEP> Nocardia <SEP> leishmanii <SEP> (ATCC <SEP> 6855) <SEP> 3,20-dicéto-1 <SEP> 1p,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dic6to-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> Al,'-prégnadiène
<tb> 10 <SEP> Nocardia <SEP> sp.
<SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,21- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,21-dihydroxy dihydroxy-A4-prégnène <SEP> Al,4-prégnadiène
<tb> 11 <SEP> Nocardia <SEP> Corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-dicéto-17a,21- <SEP> 3,20-dicéto-17a,21-dihydroxy dihydroxy-A4 <SEP> prégnène <SEP> Ah4-prégnadiène
<tb> 12 <SEP> Nocardia <SEP> caviae <SEP> (ATCC <SEP> 6848) <SEP> 3,20-d-icéto-1 <SEP> 1(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> Ah4-prégnadiène
<tb> 13 <SEP> Nocardia <SEP> caviae <SEP> (ATCC <SEP> 6848) <SEP> 3,20-dicéto-1 <SEP> 1(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-A',4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 14 <SEP> Nocardia <SEP> sp.
<SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-dicéto-17a,21- <SEP> 3,2,0-dicéto-17a,21-dihydroxy dihydroxy-A4 <SEP> prégnène <SEP> A1,4-prégnadiène
<tb> 15 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-dicéto-11a,17a,21- <SEP> 3,20-dicéto-11a,17a,21-trihyd.roxy trihydroxy-A4-prégnène <SEP> A1.4-prégnadiène
<tb> 16 <SEP> Nocardia <SEP> convoluta <SEP> (ATCC <SEP> 4275) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-AM-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 17 <SEP> Nocardia <SEP> convoluta <SEP> (ATCC <SEP> 4275) <SEP> 3,20-dicéto-11(1,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> A1,4-prégnadiène
<tb> 18 <SEP> Nocardia <SEP> sp.
<SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-dicéto-11a,17a,21- <SEP> 3,20-dicéto-11a,17a,21-trihydroxy trihydroxy-A4-prégnène <SEP> Al,4-prégnadiène
<tb> 19 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-dicéto-1 <SEP> 1(3,16 ,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-t6tra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-A',4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 20 <SEP> Nocardia <SEP> globerula <SEP> (ATCC <SEP> 9356) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> Al,4-prégnadiène
<tb> 21 <SEP> Nocardia <SEP> globerula <SEP> (ATCC <SEP> 9356) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-Al@4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 22 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 16a,21-diacéto-3,20-di- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,
21-tétra céto-11(3,17a-dihydr- <SEP> hydroxy-A1,4-prégn.adiène
<tb> oxy-A4-prégnène
<tb> 23 <SEP> Nocardia <SEP> sp. <SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,2.0-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dic6to-11(3,16a,17a.,21-tétra 21-tétrahyd'roxy-A4- <SEP> hydroxy-Al, <SEP> -1-prégnadiène
<tb> prégnène
EMI0006.0001
Tableau <SEP> (suite)
<tb> Exemple <SEP> Microorganisme <SEP> employé <SEP> Matière <SEP> première <SEP> employée <SEP> Produit <SEP> final <SEP> résultant
<tb> 24 <SEP> Nocardia <SEP> polychromogènes <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11U),16a,17a,21-tétra (ATCC <SEP> 3409) <SEP> 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hyd,roxy-Al <SEP> @4-prégnadiène
<tb> prégnadiène
<tb> 25 <SEP> Nocardia <SEP> polychromogènes <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy (ATCC <SEP> 3409)
<SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> A1,4-prégnadiène
<tb> 26 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-dicéto-9a-fluoro- <SEP> 3,20-dicéto-9a-fluoro-11P,16a,17a.,
<tb> 1l(3,16a,17a,21-tétra- <SEP> 21-tétrahydroxy-Al@4-prégnadiène
<tb> hydroxy-A4-prégnène
<tb> 27 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 16,21-diacéto-3,20-dicéto- <SEP> 16,21-diacéto-3,20-dicéto-9cz 11(3,16a,17a,21-tétra- <SEP> fluoro-11(3,16a,17a,21-tétra hydroxy-A4-prégnène <SEP> hydroxy-A',4-prégnadiène
<tb> 28 <SEP> Nocardia <SEP> sylvodifera <SEP> (ATCC <SEP> 7372) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dcéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> AIA-prégnadiène
<tb> 29 <SEP> Nocardia <SEP> sp.
<SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-dicéto-9a-fluoro- <SEP> 3,20-dicéto-9a.-fluoro-11(3,16a,17a,
<tb> 11(3,16a,17a,21-tétra- <SEP> 21-tétrahydroxy-Al@4-prégnadiène
<tb> hydroxy-A4-prégnène
<tb> 30 <SEP> Nocardia <SEP> astéroïdes, <SEP> souche <SEP> isolée <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17cx,21-trihydroxy A-3163 <SEP> (ATCC <SEP> 3308) <SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> AIJ-prégnadiène
<tb> 31 <SEP> Nocardia <SEP> astéroïdes <SEP> (ATCC <SEP> 3308) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-@\1.4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 32 <SEP> Nocardia <SEP> astéroïdes, <SEP> souche <SEP> isolée <SEP> 3,20-dicéto-11P,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-1113,17a,21-trihydroxy No.
<SEP> E-20 <SEP> (ATCC <SEP> 3308) <SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> AM-prégnadiène
<tb> 33 <SEP> Nocardia <SEP> farcinica <SEP> (ATCC <SEP> 3318) <SEP> 3,20-dicêto-11(3,17cc,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(P,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> A1.4-prégnadiène
<tb> 34 <SEP> Nocardia <SEP> erythropolis, <SEP> souche <SEP> iso- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy lée <SEP> A-8845 <SEP> (ATCC <SEP> 4277) <SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> A1-4-prégnadiène
<tb> 35 <SEP> Nocardia <SEP> blackwelii <SEP> (ATCC <SEP> 6846) <SEP> 3,20-dicéto-11.(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy hydroxy-M-prégnène <SEP> AL4-prégnadiène
<tb> 36 <SEP> Nocardia <SEP> transvalensis, <SEP> souche <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy isolée <SEP> E-42 <SEP> (ATCC <SEP> 12485)
<SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> ALI-prégnadiène
<tb> 37 <SEP> Nocardia <SEP> cuniculi <SEP> (ATCC <SEP> 6864) <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16v.,17a,21-tétra 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-Al--1-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 38 <SEP> Nocardia <SEP> keratolyticus, <SEP> souche <SEP> 3,20-dicéto-11P,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy isolée <SEP> E-43 <SEP> (ATCC <SEP> 12484) <SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> A1,4-prégnadiène
<tb> 39 <SEP> Nocardia <SEP> cuniculi <SEP> (ATCC <SEP> 6864) <SEP> 3,20-dione-11(3,17a,21- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy trihydroxy-A4-prégnène <SEP> Al.4-prégnadiène
<tb> 40 <SEP> Nocardia <SEP> corallina, <SEP> souche <SEP> isolée <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy No.
<SEP> 13 <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> AIA-prégnadiène
<tb> 41 <SEP> Nocardia <SEP> opaca <SEP> (ATCC <SEP> 4276) <SEP> 3,20-dicéto-11F),17a,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11p,17a,21-trihydroxy hydroxy-A4-prégnène <SEP> ,\','-prégnadiène
<tb> 42 <SEP> Nocardia <SEP> corallina, <SEP> souche <SEP> isolée <SEP> 3,20-dicéto-11P,17a.,21-tri- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,17a,21-trihydroxy 228 <SEP> (ATCC <SEP> 4273) <SEP> hydroxy-A4-prégnène <SEP> AL4-prégnadiène
<tb> 43 <SEP> Nocardia <SEP> sylvodifera <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a, <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra (ATCC <SEP> 4919) <SEP> 21-tétrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-Al-4-prégnadiène
<tb> prégnène
<tb> 44 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 16,21-diacéto-3,20-di- <SEP> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétra céto-11(3,16a,17a,
21- <SEP> hydroxy-A1.4-prégnadiène
<tb> tétrahydroxy-A4-prégnène Exemple 45 <I>Préparation</I> <I>du</I> 3,20-dicéto-11(3,16a,17a,21-tétrahydroxy- Ahl-prégnadiène On réunit les liqueurs provenant d'une fermen tation comme celle décrite à l'exemple 1, ci-dessus, après récolte, et l'on extrait par 7 portions de 2 litres de chlorure de méthylène et l'on évapore les extraits réunis jusqu'à siccité sous pression réduite. On obtient 1,585 g d'un semi-solide brut que l'on chro matographie. On réunit les fractions contenant le composé désiré, et l'on évapore jusqu'à siccité pour donner 601 mg de résidu cristallin.
La cristallisation dans l'acétone et l'éther de pétrole donne 278 mg de produit à point de fusion de 229-231 C. La recris- tallisation dans le même couple de solvants élève le point de fusion à 231-2320C[a]D +77 C (méthanol). Spectre ultraviolet : @ma- : 241-242 mu, (E 14.800).
etnanel Spectre infrarouge :vmBx' : 3436, 1715, 1664, 1621, 1603, 1129, 1063 cm-'.
EMI0007.0009
<I>Analyse</I>
<tb> Calculée <SEP> pour <SEP> ,1H.,,70,; <SEP> (376,44)
<tb> C <SEP> 67,00 <SEP> @/o <SEP> ; <SEP> H <SEP> 7,50 <SEP> %
<tb> Effective <SEP> : <SEP> C <SEP> 66,82 <SEP> % <SEP> ; <SEP> H <SEP> 7,27 <SEP> <B>%</B>. Le produit est identique à un échantillon de 3,20 -dicéto-11 p,16a,17a,21-tétrahydroxy-A1 @4-prégna- diène.
Exemple 46 <I>Préparation</I> <I>du 16,</I> 21-diacéto-3,20-dicéto-9a-f luoro-11(p- 16cx,17u" 21-tétrahydroxy-AI#4-prégnadiène On lave une culture sur agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, on obtient une suspension de spores de Coryne- bacterium simplex,
que l'on ajoute à 100 cmil de bouillon stérile de soja à la trypticase dans un flacon Erlenmeyer de 500=2. On fait incuber le mélange à 320C pendant 8 heures. On utilise 1<I>ce</I> de cette culture pour inoculer chacun des dix flacons conte nant chacun 100 ce de bouillon stérile de soja à la trypticase. On fait incuber les dix flacons avec agita tion à 320C pendant 16 heures.
On ajoute dans cha que flacon 20 mg de 16,21-diacéto-3,20-dicéto-9a- fluoro-11(3,16a,17a,21-tétrahydroxy-A4-prégnène, dis sous dans 2 cm3 d'éthanol et l'on réunit le contenu des flacons. On extrait la solution globale à plusieurs reprises par un grand volume de chlorure de mé thylène, on lave avec une solution saline saturée, et l'on évapore sous pression réduite. On dissout le résidu dans le méthanol, on traite par le charbon activé, on filtre sur de la terre d'infusoires et l'on évapore à nouveau pour donner 277 mg d'huile, qu'on acétyle pendant une nuit.
La chromatographie, sur bande de papier, indique des quantités approxi mativement égales de substrat et d'un produit plus polaire (16,21-diacéto-3,20-dicéto-9a-fluoro-11(1, 16u,17a,21-tétrahydroxy-Al,4-prégnadiène), ainsi que de très petites quantités de deux produits moins polaires. Par chromatographie de partage de 0,25 g du résidu (colonne de terre d'infusoires ; système 2 parties d'acétate d'éthyle, 3 parties d'éther de pétrole (90-1000C), 3 parties de méthanol et 2 par ties d'eau), on sépare les produits moins polaires et le substrat. Le produit désiré, à polarité maximum, reste sur la colonne et on l'élue avec 500<I>ce</I> de méthanol.
On prend le résidu (90 mg) obtenu par évaporation du méthanol et on le répartit à nouveau sur de la terre d'infusoires (système : 3 parties d'acé tate d'éthyle, 2 parties d'éther de pétrole (90-1000C), 3 parties de méthanol et 2 parties d'eau) et l'on évapore sous pression réduite la fraction contenant le produit désiré (déterminé par spectre d'absorption d'ultraviolet), pour donner 18 mg de solide.
La cris tallisation dans un mélange acétone-éther de pétrole donne 13 mg d'aiguilles incolores de 16,21-diacéto- 3,20- dicéto-9a-fluoro-11(3,16a,17a,21-tétrahydroxy- A1,4-pr6gnadiène ; point de fusion (bloc Kdfler) : environ 150-2400C, avec perte apparente de solvant à 1500C. La recristallisation dans l'acétone et l'éther de pétrole ne change pas le point de fusion. Spectre ultraviolet : ImaY- : 239 mu (s 15.200). Spectre ale. abs.
dans l'acide sulfurique: RH sè9: 2,61, 308, 387 mu. On prépare la 2,4-bis-dinitrophénylhydrazone du composé ci-dessus et l'on détermine son spectre d'absorption d'ultraviolet : ImHCLa : 258, 300 (in flexion), 312 (inflexion) et 400 mu.
Process for: preparation of OM-pregnadienes The present invention relates to the preparation of 01,4-pregnadienes.
Recently, a number of steroids of the pregnene and pregnadiene series, such as hydrocortisone and 1-dehydro-hydrocortisone have become important therapeutic agents and have become useful as intermediates for the preparation of other steroids useful in therapy. therapeutic.
The novel Al, 4-pregnadienes contemplated according to the invention are useful as anti-inflammatory agents in the treatment of arthritis. asthma, burns, bursitis, etc., and also in the treatment of skin diseases and collagen diseases. These compounds are used in combinations with fillers, excipients, etc., in tablets, powders, tablets, etc.
They can also hearth used enterally, in solution or in -suspension.
According to the invention, the α1, 4-pregnadienes are prepared by subjecting an 04-pregnene to the enzymatic action of microorganisms of the genus Nocardia or of the species Corynebacterium simplex. The process of the present invention can be illustrated by the following schematic equation, in which formula 1 represents O4-pregnene, and formula II represents the A1,4-pregnadiene obtained.
EMI0001.0032
In these formulas, X is a hydrogen or halogen atom,
Y is a methylene, hydroxymethylene or carbonyl group, Z is a methylene, hydroxymethylene or lower alkanoyloxymethylene group, R 'is a hydrogen atom or a hydroxyl group, and R is a hydrogen atom or an alkan group lower oyl. In certain preferred compounds, X represents fluorine, Y represents CHOH, Z represents CHOR ", R 'represents OH,
R and R "are hydrogen atoms or alkanoyl radicals. For carrying out the present process, it is possible to cultivate under aerobic conditions, in a suitable nutrient medium containing a 4-steroid of the pregnene series. , a fungus of the genus Nocardia (Bergey, Manual, 6th edition), such as the corallina ATCC 999 and ATCC 4273, (Culture Lederle No. 13);
asterides ATCC 3308, keratolyticus ATCC 12484, transvalensis ATCC 12485, erythropolis ATCC 4277, convuluta ATCC 4275, gardneri ATCC 9604, leishmanii ATCC 6855, opaca ATCC 4276,
blackwelii ATCC 6846, caviae ATCC 6848, cuniculi ATCC 6864, globula ATCC 9356, polychromogens ATCC 3409, sylvodifera ATCC 7372, farcinica ATCC 3318 or sylvodifera ATCC 4919.
During the growth of the organism under favorable conditions, two hydrogen atoms are eliminated from the steroid nucleus A, and a double bond is obtained in the 1,2 position. The exact mechanism of this dehydrogenation is obscure, but it is the result of enzymes produced by the body in the process of growth. A suitable nutrient medium generally contains a soluble source of carbon, nitrogen and mineral salts.
As carbon sources, sugars, such as glucose, sucrose, maltose, dextrose, xylose and galactose, and also alcohols such as glycerol or mannitol are generally employed; corn starch; organic acids such as citric acid, malic acid and acetic acid;
and various natural products containing carbohydrates, such as corn maceration liquor, soybean meal, cottonseed meal, and many other materials thereof which may be found and which have been used previously as source of carbon in fermentation processes. Generally, one can use different bodies above, in the middle, with good results.
As sources of nitrogen there can be used some of the materials mentioned above, such as corn maceration liquor, soybean meal, cottonseed meal, etc., and various other substances, such as extract. baauf, casein, yeast, proteins digested by enzymes, and degradation products, including peptones,
amino acids and many other available protein materials which may support the growth of fungi. Inorganic sources of nitrogen, including urea, ammonium salts, nitrates, etc., can be used in the medium as a source of assimilable nitrogen to provide a favorable growth medium for the organism.
The mineral elements required for fermentation are usually found in the raw materials which are often used as sources of carbon and nitrogen, or in the water used in the process. However, it is generally advisable to add additional amounts of mineral elements to those normally present,
to obtain maximum growth of Nocardia. It is advantageous to add cations and anions including sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphate, sulfate, chloride, cobalt, manganese, and the like. The use of trace elements such as boron, copper, cobalt, molybdenum and chromium is often desirable.
The growth of the fungus Nocardia or the fungus Corynebacterium simplex can take place under aerobic conditions, and aeration can be carried out, in flasks for example, by shaking on a reciprocating or rotary shaker, or in bottles. or tanks by sending pressurized sterile air through the fermentation mixture.
It is desirable to blow sterile air through the medium at a rate of 1/3 to 2 volumes of air per volume of medium per minute. Agitation in the bottles or in the fermentation tanks can be provided by a mechanical stirrer.
Nocardia sprocket can grow at temperatures of 5 to 450C, but it is best to run the process at temperatures of 25 to 370C. Corynebacterium simplex can grow at temperatures from 10 to 450C, but it is preferably used at 25 to 38oC.
To prepare inocula, one uses advantageously 1.0 cm3 of suspension of washed vegetative cells of fungi of the genus Nocardia or of the species Corynebacterium simplex, to inoculate 100 em3 of sterile soy broth with trypticase,
in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. Trypticase soy broth generally contains 3% tryptic digest of soy protein, as a dehydrated powder (Baltimore Bacteriological Laboratories),
5% glycerin and 0.3% beef extract (Armor), and this mixture is advantageously sterilized for 15 minutes at a temperature of 120C (vapor pressure of 6.75 kg). After sterilization, the pH is between 7.4 and 7.7.
After inoculating the vial, it can be incubated at 370C, on a shaker, for about 4 to 8 hours. These inocula can be used to inoculate large amounts of sterile bottled medium, and these bottled cultures, after fermentation, can be used to inoculate large amounts of medium into fermentation tanks.
Instead of the trypticase soy broth mentioned above, other media can be used, as shown in the examples below.
The A4-steroids of the pregnene series which can be used as starting products in the process according to the present invention are in particular 3,20-diketo-11 [3,17a, 21-trihydroxy-A4-pregnene (hydrocortisone) , 3,20-diketo-11 (3,21-dihydroxy-A4-pregnene (corticosterone), 3,20-diketo-17a, 21-dihydroxy-A4-pregnene (substance S of Reichstein), 3,20 -diketo-lla, 17a,
21-trihydroxy-A4-pregnene (11-epi-hydrocortisone), 3,20-diketo-ll (3,16a, 17a, 21-tetrahydroxy-A4-pregnene, 3,20-diketo-9a-fluoro-11 (3,16a, 17a, 21-tetrahydroxy-A4-pregnene, 3,11,20-triketo-16, 17, 21-trihydroxy-A4-pregnene, 3,11,20-triketo-16, 17, 21 -trihydroxy-A4-pregnene, 3; 11,20-triketo-17a, 21-dihydroxy-A4-pregnene, and their esters, etc. These steroids are generally added to fermentation, in solution or in finely divided form.
According to a particular embodiment, the steroid is dissolved in ethanol or other water-miscible solvents, and added to the fermentation medium, at the desired stage of the process. Although the steroid will sometimes precipitate out of solution when added in this way, it disperses throughout the medium as a fine suspension and is readily available to the body for oxidation. The amount of steroid added to the fermentation can vary considerably, but is generally in the order of 1/1 to 1 g per liter of medium.
During the fermentation process, it is sometimes desirable to add defoamers such as silicones, glyceridic oils, etc. These compounds are added from time to time, and in the desired amounts.
Usually, 10 cc portions of inoculated medium are incubated for about 16 to 40 hours at a temperature of about 32oC in 100 cc shaker tubes. At the end of this time, 2 mg of sterile substrate (steroid A4-pregnene) dissolved in 0.2 cm3 of ethan are added to each tube:
ol, and fermentation continues at about 320C. Fermentation is allowed to continue for a sufficiently long period of time to achieve maximum conversion of A4-pregnene to A'-4-pregnadiene. This time can vary from 1 to 72 hours. or more.
At the end of the fermentation process, the A ',' - steroid of the pregnadiene series obtained is separated from the fermentation medium by the following method which describes in particular a fermentation over 10 cm3. This is a general method which is applicable for fermentations at various scales: the contents of a fermentation tube are extracted four times, with four volumes of methylene chloride.
The four extracts were combined, then the resulting solution was washed once with a 2% aqueous solution of sodium bicarbonate saturated with sodium chloride, and then washed twice with a saturated solution of sodium chloride. After washing, the methylene chloride solution can be dried over anhydrous magnesium sulfate and filtered.
The filtrate is concentrated in a water bath at atmospheric pressure, to a small volume, and the concentrate is transferred to a 10 cc volumetric flask, then made up to this volume with methylene chloride. This solution can be used to determine the steroid content.
In large-scale fermentations, the crude product (s) from the fermentation liquor can be recovered by simple solvent extraction, using a suitable water-immiscible solvent such as chlorinated lower hydrocarbons, alcohols, esters, ketones, etc. It is possible to carry out a further purification and to separate the steroid products from the extracts, by known methods. The separation and purification of the steroid mixture often requires the use of chromatography.
To identify the steroids present in the fermentation liquor subjected to extraction, paper strip chromatography can be used. The solvent system used is generally a water-methanol-benzene system, which can be prepared by stirring about 50% water and 50% methanol with benzene, in a separatory funnel, then leaving the two layers separate.
Usually a portion of the lower layer is placed in an open crystallizer on the bottom of a large glass cylinder. The top layer is the solvent phase, and it serves to fill the trough-shaped cavity inside the cylinder.
A standard steroid solution can be prepared by dissolving 10 mg of each of the following steroids in 10 cc of methylene chloride 3,20-dice® to-11P, 17a, 21-trihydroxy-A4-pregnene; 3,20-diketo-11p-21, dshydroxy-A4-pregnene; 3,20-diketo-17a, 21-dihydroxy-A4-pregnene; 3,20-diketo-1 la, 17a, 21-trihydroxy-A4-pregnene; 3,20-diketo-11 (3,16a, 17cz, 21-tetrahydroxy-A4-pregnene; 16,21-diaceto-3,20-diketo-11 (3,16a, 17a, 21-tetrahydroxy-A4-pregnene;
3,20-diketo-9a-fluoro-11p, 16c1,17a, 21-tetrahydroxy-A4-pregnene; 16a, 21-diaceto-3,20-diketo-9a-fluoro-11 (3,16a, 17a, 21-tetrahydroxy-A4-p @ regnene; (Other steroids can be used in the standard solution when they are appropriate).
At least one current steroid solution can be chromatographed simultaneously each time an unknown solution is tried. Typically, exactly 0.025 cc of the standard test steroid solution is applied to the paper strip at the start line, 10 cm from the top end of the strip, which is folded over the edge. of the trough and that we plunge into the ground phase vant contained inside.
The band can then be developed for 2 to 4 hours at about 370C. Likewise, 0.1 cm3 of the unknown solution can be applied to another strip, which is then folded in the same trough and developed simultaneously with the standard steroid strip. The trough makes it possible to develop numerous bands simultaneously.
After properly developing the paper strips, they can be removed from the apparatus and air dried at about 370C. After drying, the strips are generally sprayed with an alkaline solution of tetrazolium blue which causes the color to appear at the points where the steroids are present. Color-developed bands are aligned with at least one standard band and compared. The different steroids can be identified by their position on the strip.
The AIA-steroids obtained by the process according to the invention will generally be more polar than the corresponding A4-steroids. It is further understood that the resulting A1 @ 4-steroids, once isolated and characterized, may themselves be used in a standard steroid solution in order to improve the process.
Example 1 <I> Preparation </I> <I> of </I> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-trihydroxy-AI # Lpregnadiene A culture of Nocardia coralline (ATCC 999) is washed on extract of yeast and agar-agar in a test tube, using 7 cm3 of sterile saline solution, and a vegetative cell suspension is obtained which is used to inoculate 100 cm @@ sterile soybean broth with trypticase (described above),
in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. The flask is incubated for 7 hours at 370C. This inoculum is then used to inoculate sterile trypticase soy broth in 100 cc shaker tubes. 1 cm3 of inoculum is used to inoculate each 10 cm3 portion of medium containing 2% molasses
(Grandma), 1% Beef extract (Difco), and 1% glucose in each 100cc shaker tube. The tubes are incubated at 32oC for 40 hours.
At this time, 2 mg of 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-trihydroxy-Al-pregnene dissolved in 0.2 cm 2 of ethanol are added to each tube. The incubation is then continued for another 24 hours.
The 10 cm3 of liquor is extracted four times from one of the above tubes, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue is taken up in 2 cm3 of acetone, and a suitable sample is analyzed by the paper strip techniques described above.
The paper strip chromatogram indicates the presence of 3,20-diketo-11P, 17a, 21-trihydroxy-Al> 4-pregnadiene. Example 2 <I> Preparation </I> <I> of </I> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-trihydroxy-Al, 4-pregnadiene A culture of Nocardia sp. (ATCC 12483) is washed. ) on agar-agar in a test tube,
with 5 cm3 of sterile saline solution. 2 cm3 of the suspension obtained is used to inoculate 100 cm3 of sterile trypticase soy broth in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. The mixture is incubated with shaking at 37 ° C. for 8 hours,
and the resulting culture is used to inoculate tubes containing sterile soybean broth with tryp-ticase. 1/2 cm3 of the 8 hour culture is used to inoculate 10 cm3 of medium in a 100 cm3 tube. The inoculated tubes are incubated at 320C with shaking for 16 hours.
In each tube, 2 mg of 21-aceto-3,20-diketo-11 (3,17a, 21-trihydroxy-A4-pregnene, dissolved in 0.2 cm3 of ethanol are added. Tubes are incubated for a further 1 1/2 to 5 hours -and we harvest.
Chromatography on a paper strip indicates that the substrate has converted to 3,20-diketo-11 (1,17a, 21-tri-hydroxy-Al> 4-pregnadiene. On the paper strips, it is still observed at as time increases, the appearance of 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-trihydroxy-A4-pregnene, and its quantity increases at the expense of 21-aceto-3,20-diketo-11 (3,17a, 21-trihydroxy-Al-pregnene, followed by the appearance in increasing amount of 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-trihydroxy-Al @ 4-pregnadiene.
Example 3 <I> Preparation </I> <I> of </I> 3,20-diketo-11 (i, 16a, 17a, 21-tetrahydroxy-AI J-pregnadiene A culture of Corynebacterium sim-plex is washed on Soybean with trypticase and agar-agar in a test tube, using 5 cm-3 of sterile water,
and the resulting cell suspension is distilled to inoculate 100 cm3 of sterile trypticase soy broth in a 50 em3 Erlenmeyer flask. This mixture is incubated with stirring at 37 ° C. for 8 hours.
25 Erlenmeyer flasks of 500 cm3, each containing 100 cm3 of sterile trypticase soy broth, without glycerol, are taken and each inoculated with 1 cm3 of the 8 hour old inoculum. These flasks are incubated at 32oC for 40 hours.
At the end of this time, 40 mg of 3,20-diketo-11 (3, 11a, 17a, 21-tetra-hydroxy-A4-pregnene dissolved in 4 cm @ ethanol are added to each vial and the process continues. fermentation for 8 hours at 320 C. The contents of the twenty-five flasks are combined and a liquor is obtained at pH 8.1.
The liquors are combined after harvest, extracted once with 3 liters of methylene chloride and three times with two liters each time of methylene chloride. Once the extract is combined, washed with saturated saline solution and evaporated to dryness under reduced pressure. 509 mg of oily residue are obtained, it is dissolved in 1.5 cm 3 of the stationary phase of the system, 3 parts of ethyl acetate, 2 parts of petroleum ether (90-100C), 3 parts of methanol, 2 parts of water, and mixed with 3 g of diatomaceous earth.
This impregnated diatomaceous earth is then stacked at the top of a 1.5 x 35 cm glass column containing 25 g of diatomaceous earth impregnated with 12.5 em3 of the stationary phase of the above system. The desired compound is eluted with the mobile phase of the above system and 207 g of crude solid are obtained.
The latter is crystallized from a mixture of acetone and petroleum ether (60-70 C) to obtain 56 mg of product with a melting point of 195-200 C (Köfler block). Recrystallization from the same couple of solvents raises the melting point to 202-205C (block); melting point (by capillary method) 229-231, JC. Ultraviolet spectrum
EMI0004.0127
241 soft (E 14,500).
Infrared spectrum 3412, 1718, 1667, 162.2, 1612 (step), 1098,
EMI0005.0001
1072 cm-1.
EMI0005.0003
<I> Analysis </I>
<tb> Calculated <SEP> for <SEP> C21Hz80 <SEP> (376.44)
<tb> C <SEP> 67.00 <SEP> 0/0 <SEP>; <SEP> H <SEP> 7.50 <SEP>%
<tb> Effective <SEP>: <SEP> C <SEP> 66.80 <SEP> 0/0 <SEP>; <SEP> H <SEP> 7.62 <SEP> 0/0. The physical and chemical properties of the compound are those of 3,20-diketo-11 (3,16a, 17a, 21-tetrahydroxy-Ah4-pregnadiene.
In a manner analogous to that of the aforementioned examples, the α1, 4-pregnadienes mentioned in the following table can be obtained by using the starting materials and the microorganisms mentioned in said table.
EMI0005.0009
Board
<tb> Example <SEP> Microorganism <SEP> employed <SEP> Raw material <SEP> <SEP> employed <SEP> Final product <SEP> <SEP> resulting
<tb> 4 <SEP> Nocardia <SEP> sp. <SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-trihydroxy hydroXy-04 -pregnene <SEP> Al, 4-pregnadiene
<tb> 5 <SEP> Nocardia <SEP> gardneri <SEP> (ATCC <SEP> 9604) <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11 11 (3,17a, 21-trihydroxy hydroxy-A4-pregnene <SEP> AIJ-pregnadiene
<tb> 6 <SEP> Nocardia <SEP> gardneri <SEP> (ATCC <SEP> 9604) <SEP> 3,20-diketo-11 (3,16a, 17a, <SEP> 3,20-diketo-11 ( 3,16a, 17a, 21-tetra 21-tetrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-Al> 4-pregnadiene
<tb> pregnene
<tb> 7 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-diketo = 11 (3,21- <SEP> - <SEP> 3,20-diketo 11 (3,
21-dihydroxy dihydroxy-A4-pregnene <SEP> A1,4-pregnadiene
<tb> 8 <SEP> Nocardia <SEP> leishmanii <SEP> (ATCC <SEP> 6855) <SEP> 3,20-diketo-11 (3,16a, 17a, <SEP> 3,20-dic6ta-11 ( 3,16a, 17a, 21-tetra 21-tetrahydroxy-A4- <SEP> hydioxy-Al, 4-pregnadiene
<tb> pregnene
<tb> 9 <SEP> Nocardia <SEP> leishmanii <SEP> (ATCC <SEP> 6855) <SEP> 3,20-diketo-1 <SEP> 1p, 17a, 21-tri- <SEP> 3,20- dic6to-11 (3,17a, 21-trihydroxy hydroxy-A4-pregnene <SEP> Al, '- pregnadiene
<tb> 10 <SEP> Nocardia <SEP> sp.
<SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-diketo-11 (3,21- <SEP> 3,20-diketo-11 (3,21-dihydroxy dihydroxy-A4-pregnene <SEP> Al , 4-pregnadiene
<tb> 11 <SEP> Nocardia <SEP> Corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-diketo-17a, 21- <SEP> 3,20-diketo-17a, 21-dihydroxy dihydroxy -A4 <SEP> Pregnene <SEP> Ah4-Pregnadiene
<tb> 12 <SEP> Nocardia <SEP> caviae <SEP> (ATCC <SEP> 6848) <SEP> 3,20-d-icéto-1 <SEP> 1 (3,17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-trihydroxy hydroxy-A4-pregnene <SEP> Ah4-pregnadiene
<tb> 13 <SEP> Nocardia <SEP> caviae <SEP> (ATCC <SEP> 6848) <SEP> 3,20-diketo-1 <SEP> 1 (3,16a, 17a, <SEP> 3,20- diketo-11 (3,16a, 17a, 21-tetra 21-tetrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-A ', 4-pregnadiene
<tb> pregnene
<tb> 14 <SEP> Nocardia <SEP> sp.
<SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-diketo-17a, 21- <SEP> 3,2,0-diketo-17a, 21-dihydroxy dihydroxy-A4 <SEP> pregnene <SEP> A1 , 4-pregnadiene
<tb> 15 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-diketo-11a, 17a, 21- <SEP> 3,20-diketo-11a, 17a, 21-trihyd.roxy trihydroxy-A4-pregnene <SEP> A1.4-pregnadiene
<tb> 16 <SEP> Nocardia <SEP> convoluta <SEP> (ATCC <SEP> 4275) <SEP> 3,20-diketo-11 (3,16a, 17a, <SEP> 3,20-diketo-11 ( 3,16a, 17a, 21-tetra 21-tetrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-AM-pregnadiene
<tb> pregnene
<tb> 17 <SEP> Nocardia <SEP> convoluta <SEP> (ATCC <SEP> 4275) <SEP> 3,20-diketo-11 (1,17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11 11 (3,17a, 21-trihydroxy hydroxy-A4-pregnene <SEP> A1,4-pregnadiene
<tb> 18 <SEP> Nocardia <SEP> sp.
<SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-diketo-11a, 17a, 21- <SEP> 3,20-diketo-11a, 17a, 21-trihydroxy trihydroxy-A4-prégnene <SEP> Al , 4-pregnadiene
<tb> 19 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-diketo-1 <SEP> 1 (3,16, 17a, <SEP> 3,20- diketo-11 (3,16a, 17a, 21-t6tra 21-tetrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-A ', 4-pregnadiene
<tb> pregnene
<tb> 20 <SEP> Nocardia <SEP> globerula <SEP> (ATCC <SEP> 9356) <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11 11 (3,17a, 21-trihydroxy hydroxy-A4-pregnene <SEP> Al, 4-pregnadiene
<tb> 21 <SEP> Nocardia <SEP> globerula <SEP> (ATCC <SEP> 9356) <SEP> 3,20-diketo-11 (3,16a, 17a, <SEP> 3,20-diketo-11 ( 3,16a, 17a, 21-tetra 21-tetrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-Al @ 4-pregnadiene
<tb> pregnene
<tb> 22 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 16a, 21-diaceto-3,20-di- <SEP> 3,20-diketo-11 (3, 16a, 17a,
21-tetra-keto-11 (3,17a-dihydr- <SEP> hydroxy-A1,4-pregn.adiene
<tb> oxy-A4-pregnene
<tb> 23 <SEP> Nocardia <SEP> sp. <SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,2.0-diketo-11 (3,16a, 17a, <SEP> 3,20-dic6to-11 (3,16a, 17a., 21-tetra 21- tetrahyd'roxy-A4- <SEP> hydroxy-Al, <SEP> -1-pregnadiene
<tb> pregnene
EMI0006.0001
Table <SEP> (continued)
<tb> Example <SEP> Microorganism <SEP> employed <SEP> Raw material <SEP> <SEP> employed <SEP> Final product <SEP> <SEP> resulting
<tb> 24 <SEP> Nocardia <SEP> polychromogenic <SEP> 3,20-diketo-11 (3,16a, 17a, <SEP> 3,20-diketo-11U), 16a, 17a, 21-tetra (ATCC <SEP> 3409) <SEP> 21-tetrahydroxy-A4- <SEP> hyd, roxy-Al <SEP> @ 4-pregnadiene
<tb> pregnadiene
<tb> 25 <SEP> Nocardia <SEP> polychromogenic <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-trihydroxy ( ATCC <SEP> 3409)
<SEP> hydroxy-A4-pregnene <SEP> A1,4-pregnadiene
<tb> 26 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 3,20-diketo-9a-fluoro- <SEP> 3,20-diketo-9a-fluoro-11P, 16a, 17a.,
<tb> 1l (3,16a, 17a, 21-tetra- <SEP> 21-tetrahydroxy-Al @ 4-pregnadiene
<tb> hydroxy-A4-pregnene
<tb> 27 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 16,21-diaceto-3,20-diketo <SEP> 16,21-diaceto-3,20- diketo-9cz 11 (3,16a, 17a, 21-tetra- <SEP> fluoro-11 (3,16a, 17a, 21-tetra hydroxy-A4-pregnene <SEP> hydroxy-A ', 4-pregnadiene
<tb> 28 <SEP> Nocardia <SEP> sylvodifera <SEP> (ATCC <SEP> 7372) <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-tri- <SEP> 3,20-dketo- 11 (3,17a, 21-trihydroxy hydroxy-A4-pregnene <SEP> AIA-pregnadiene
<tb> 29 <SEP> Nocardia <SEP> sp.
<SEP> (ATCC <SEP> 12483) <SEP> 3,20-diketo-9a-fluoro- <SEP> 3,20-diketo-9a.-fluoro-11 (3,16a, 17a,
<tb> 11 (3,16a, 17a, 21-tetra- <SEP> 21-tetrahydroxy-Al @ 4-pregnadiene
<tb> hydroxy-A4-pregnene
<tb> 30 <SEP> Nocardia <SEP> asteroids, <SEP> strain <SEP> isolated <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17cx, 21-trihydroxy A-3163 <SEP> (ATCC <SEP> 3308) <SEP> hydroxy-A4-pregnene <SEP> AIJ-pregnadiene
<tb> 31 <SEP> Nocardia <SEP> asteroids <SEP> (ATCC <SEP> 3308) <SEP> 3,20-diketo-11 (3,16a, 17a, <SEP> 3,20-diketo-11 ( 3,16a, 17a, 21-tetra 21-tetrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy - @ \ 1.4-pregnadiene
<tb> pregnene
<tb> 32 <SEP> Nocardia <SEP> asteroids, <SEP> strain <SEP> isolated <SEP> 3,20-diketo-11P, 17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-1113,17a , 21-trihydroxy No.
<SEP> E-20 <SEP> (ATCC <SEP> 3308) <SEP> hydroxy-A4-pregnene <SEP> AM-prégnadiene
<tb> 33 <SEP> Nocardia <SEP> farcinica <SEP> (ATCC <SEP> 3318) <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17cc, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11 11 (P, 17a, 21-trihydroxy hydroxy-A4-pregnene <SEP> A1.4-pregnadiene
<tb> 34 <SEP> Nocardia <SEP> erythropolis, <SEP> strain <SEP> iso- <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo- 11 (3,17a, 21-trihydroxy <SEP> A-8845 <SEP> (ATCC <SEP> 4277) <SEP> hydroxy-A4-pregnene <SEP> A1-4-pregnadiene
<tb> 35 <SEP> Nocardia <SEP> blackwelii <SEP> (ATCC <SEP> 6846) <SEP> 3,20-diketo-11. (3,17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo -11 (3,17a, 21-trihydroxy hydroxy-M-pregnene <SEP> AL4-pregnadiene
<tb> 36 <SEP> Nocardia <SEP> transvalensis, <SEP> strain <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a , 21-trihydroxy isolated <SEP> E-42 <SEP> (ATCC <SEP> 12485)
<SEP> hydroxy-A4-pregnene <SEP> ALI-pregnadiene
<tb> 37 <SEP> Nocardia <SEP> cuniculi <SEP> (ATCC <SEP> 6864) <SEP> 3,20-diketo-11 (3,16a, 17a, <SEP> 3,20-diketo-11 ( 3,16v., 17a, 21-tetra 21-tetrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-Al - 1-pregnadiene
<tb> pregnene
<tb> 38 <SEP> Nocardia <SEP> keratolyticus, <SEP> strain <SEP> 3,20-diketo-11P, 17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21 -trihydroxy isolated <SEP> E-43 <SEP> (ATCC <SEP> 12484) <SEP> hydroxy-A4-pregnene <SEP> A1,4-pregnadiene
<tb> 39 <SEP> Nocardia <SEP> cuniculi <SEP> (ATCC <SEP> 6864) <SEP> 3,20-dione-11 (3,17a, 21- <SEP> 3,20-diketo-11 ( 3,17a, 21-trihydroxy trihydroxy-A4-pregnene <SEP> Al.4-pregnadiene
<tb> 40 <SEP> Nocardia <SEP> corallina, <SEP> strain <SEP> isolated <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11 (3,17a, 21-trihydroxy No.
<SEP> 13 <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> hydroxy-A4-pregnene <SEP> AIA-pregnadiene
<tb> 41 <SEP> Nocardia <SEP> opaca <SEP> (ATCC <SEP> 4276) <SEP> 3,20-diketo-11F), 17a, 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11p , 17a, 21-trihydroxy hydroxy-A4-pregnene <SEP>, \ ',' - pregnadiene
<tb> 42 <SEP> Nocardia <SEP> corallina, <SEP> strain <SEP> isolated <SEP> 3,20-diketo-11P, 17a., 21-tri- <SEP> 3,20-diketo-11 ( 3,17a, 21-trihydroxy 228 <SEP> (ATCC <SEP> 4273) <SEP> hydroxy-A4-pregnene <SEP> AL4-pregnadiene
<tb> 43 <SEP> Nocardia <SEP> sylvodifera <SEP> 3,20-diketo-11 (3,16a, 17a, <SEP> 3,20-diketo-11 (3,16a, 17a, 21-tetra ( ATCC <SEP> 4919) <SEP> 21-tetrahydroxy-A4- <SEP> hydroxy-Al-4-pregnadiene
<tb> pregnene
<tb> 44 <SEP> Nocardia <SEP> corallina <SEP> (ATCC <SEP> 999) <SEP> 16,21-diaceto-3,20-di- <SEP> 3,20-diketo-11 (3, 16a, 17a, 21-keto-11 tetra (3,16a, 17a,
21- <SEP> hydroxy-A1.4-pregnadiene
<tb> tetrahydroxy-A4-pregnene Example 45 <I> Preparation </I> <I> of </I> 3,20-diketo-11 (3,16a, 17a, 21-tetrahydroxy-Ahl-pregnadiene The liquors from a fermentation such as that described in Example 1 above, after harvest, and extracted with 7 portions of 2 liters of methylene chloride and the combined extracts evaporated to dryness under reduced pressure 1.585 g of a crude semi-solid are obtained which are chromatographed, the fractions containing the desired compound are combined and evaporated to dryness to give 601 mg of crystalline residue.
Crystallization from acetone and petroleum ether gives 278 mg of product with a melting point of 229-231 C. Recrystallization from the same couple of solvents raises the melting point to 231-2320C [a] D +77 C (methanol). Ultraviolet spectrum: @ ma-: 241-242 mu, (E 14,800).
etnanel Infrared spectrum: vmBx ': 3436, 1715, 1664, 1621, 1603, 1129, 1063 cm-'.
EMI0007.0009
<I> Analysis </I>
<tb> Calculated <SEP> for <SEP>, 1H. ,, 70 ,; <SEP> (376.44)
<tb> C <SEP> 67.00 <SEP> @ / o <SEP>; <SEP> H <SEP> 7.50 <SEP>%
<tb> Effective <SEP>: <SEP> C <SEP> 66.82 <SEP>% <SEP>; <SEP> H <SEP> 7.27 <SEP> <B>% </B>. The product is identical to a sample of 3,20-diketo-11 p, 16a, 17a, 21-tetrahydroxy-A1 @ 4-pregnadiene.
Example 46 <I> Preparation </I> <I> of 16, </I> 21-diaceto-3,20-diketo-9a-fluoro-11 (p-16cx, 17u "21-tetrahydroxy-AI # 4 -Pregnadiene A culture is washed on agar-agar in a test tube, using 5 cm3 of sterile saline solution, a suspension of Corynebacterium simplex spores is obtained,
which is added to 100 cmil of sterile soy broth with trypticase in an Erlenmeyer flask of 500 = 2. The mixture is incubated at 320C for 8 hours. 1 <I> cc </I> of this culture is used to inoculate each of ten vials each containing 100 cc of sterile trypticase soy broth. The ten flasks are incubated with agitation at 320C for 16 hours.
20 mg of 16,21-diaceto-3,20-diketo-9a-fluoro-11 (3,16a, 17a, 21-tetrahydroxy-A4-pregnene, dissolved in 2 cm3 of ethanol and The contents of the flasks are combined. The whole solution is extracted several times with a large volume of methylylene chloride, washed with saturated saline solution, and evaporated under reduced pressure. The residue is dissolved in water. methanol, treated with activated charcoal, filtered through diatomaceous earth and evaporated again to give 277 mg of oil, which is acetylated overnight.
Chromatography, on a paper strip, indicates approximately equal amounts of substrate and a more polar product (16,21-diaceto-3,20-diketo-9a-fluoro-11 (1, 16u, 17a, 21- tetrahydroxy-Al, 4-pregnadiene), as well as very small amounts of two less polar products. By partition chromatography of 0.25 g of the residue (diatomaceous earth column; 2 part ethyl acetate system, 3 parts of petroleum ether (90-1000C), 3 parts of methanol and 2 parts of water), the less polar products and the substrate are separated. The desired product, at maximum polarity, remains on the column and is the chosen one with 500 <I> cc </I> of methanol.
The residue (90 mg) obtained by evaporating the methanol is taken and distributed again over diatomaceous earth (system: 3 parts of ethyl acetate, 2 parts of petroleum ether (90-1000C) ), 3 parts of methanol and 2 parts of water) and the fraction containing the desired product (determined by ultraviolet absorption spectrum) is evaporated under reduced pressure, to give 18 mg of solid.
Crystallization in an acetone-petroleum ether mixture gives 13 mg of colorless needles of 16,21-diaceto-3,20-diketo-9a-fluoro-11 (3,16a, 17a, 21-tetrahydroxy-A1,4 -pr6gnadiene; melting point (Kdfler block): about 150-2400C, with apparent loss of solvent at 1500C. Recrystallization from acetone and petroleum ether does not change the melting point. Ultraviolet spectrum: ImaY-: 239 mu (s 15.200) Spectrum ale. Abs.
in sulfuric acid: RH sè9: 2.61, 308, 387 mu. The 2,4-bis-dinitrophenylhydrazone of the above compound is prepared and its ultraviolet absorption spectrum is determined: ImHCLa: 258, 300 (in flexion), 312 (inflection) and 400 mu.