Procédé pour transformer un 11-désoxy-stéroïde en 11-oxy-stéroïde correspondant Récemment, plusieurs stéroïdes contenant un groupe hydroxyle en position 11 sont devenus des agents thérapeutiques importants dans le traitement des maladies. Parmi ces stéroïdes figure le composé F de Kendall.
On a mis au point des procédés pour préparer cette substance à partir des 11-désoxy- stéroïdes, mais malheureusement les intermédiaires appropriés sont rares, et les procédés destinés à intro duire un groupe hydroxyle en position 11 sont peu satisfaisants pour diverses raisons.
Il apparaît que le procédé de la présente inven tion représente un progrès par rapport aux procédés antérieurs d'oxydation des stéroïdes en position 11, parce qu'il évite des réactions secondaires et donne des rendements élevés.
Le procédé suivant l'invention pour transformer un 11-désoxy-stéroïde en 11-oxy-stéroïde correspon dant consiste à soumettre le 11-désoxy-stéroïde à l'action de fermentation oxydante d'un ou plusieurs champignons du genre<I>Botrytis.</I>
On cultive, par exemple, dans des conditions aérobies un champignon du genre Botrytis tel que le <I>Botrytis</I> cinerea, le Botrytis peoniae et/ou d'autres espèces de<I>Botrytis,</I> dans un milieu nutritif approprié, et on le laisse agir sur la substance S ou un ester de celle-ci tel que l'acétate, ou un 11-désoxy-stéroïde apparenté. Pendant la croissance de l'organisme dans des conditions favorables, un groupe hydroxyle est introduit en position 11. Le mécanisme exact de cette oxydation est obscur, mais elle résulte d'enzymes produits par l'organisme lorsqu'il se développe.
Un milieu nutritif approprié contient une source soluble de carbone, de l'azote et des matières minérales pou- vant servir comme sources de carbone: l'amidon de maïs, la mélasse, le maltose, le dextrose, le sucrose, le xylose, le galactose, le glycérol, le mannitol et di vers acides organiques tels que l'acide citrique, l'acide malique, l'acide acétique et divers produits naturels contenant des hydrates de carbone, par exemple la liqueur de macération de maïs, la farine de soja,
la farine de graines de coton et beaucoup d'autres matières accessibles que l'on a utilisées an térieurement comme source de carbone dans des pro cessus de fermentation.
Peuvent servir comme sources d'azote par exem ple la liqueur de macération de- maïs, la farine de soja, la farine de graines de coton, etc., et diverses autres substances telles que l'extrait de boeuf, la ca séine, la levure, les protéines digérées par enzymes, et les produits de dégradation tels que les peptones, les aminoacides .et beaucoup d'autres matières pro- téiniques accessibles que l'on a trouvées appropriées à des processus de fermentation, pour entretenir la croissance des champignons.
Diverses sources inor ganiques d'azote, notamment l'urée, les sels d'am monium, les nitrates, etc., peuvent aussi être incluses dans 1e milieu, comme source d'azote assimilable, pour donner un substrat favorable au développement de l'organisme.
Une grande partie des matières minérales néces saires à la fermentation sont présentes déjà dans les matières que -l'on utilise comme sources de carbone et d'azote. Il y en a également dans l'eau utilisée dans le processus. Mais en général, il est à conseiller d'ajouter en plus des substances fournissant des ions phosphate, sulfate, chlorure, sodium, potassium, magnésium, fer, calcium, cobalt, manganèse et divers autres.
On peut ajouter le 11-désoxy-stéroïde au milieu avant l'inoculation ou bien un ou deux jours après. Pour préparer des inocula, on peut procéder de manière suivante<B>:</B> on prend 5 à 10 cm3 d'eau stérili sée dans laquelle on met, en suspension,
la croissance superficielle d'une culture inclinée en tube d'agar- agar. La suspension résultante de spores et de mycé lium sert à inoculer deux ou trois lots de 100 cm3 de milieu stérilisé dans des fioles Erlenmeyer de 500 cm,', comme indiqué dans les exemples ci-après. Après inoculation, on fait incuber les flacons sur un dispositif secoueur à mouvement alternatif à 21o C pendant environ 2 à 4 jours.
Le contenu de 2 ou 3 de ces flacons sert à inoculer 12 litres de milieu sté rile dans une bouteille de 20 litres.
Les champignons du genre Botrytis croissent à toutes températures de 5 à 30o C et c'est dans cet intervalle de température qu'à lieu de préférence l'oxydation.
Durant le processus de fermentation, on peut as surer l'aération en envoyant de l'air stérilisé à tra vers le milieu à raison d'environ 1/3à 2 volumes d'air par volume de milieu et par minute. On agite en général mécaniquement pour maintenir en suspen sion le mycélium et les autres matières insolubles. On peut ajouter de temps en temps des agents anti- mousse tels que la silicone, les huiles de glycéri des, etc.
Le stéroïde à oxyder peut être ajouté au milieu de la fermentation soit sous forme de poudre. Ainsi on peut dissoudre le stéroïde dans du méthanol ou dans d'autres solvants miscibles à l'eau et l'ajouter au milieu de fermentation. Le stéroïde se disperse dans tout le milieu sous forme de suspension fine et devient facilement accessible à l'organisme en vue de l'oxydation. La quantité de stéroïde ajoutée à la fermentation peut varier considérablement, mais elle est généralement de l'ordre de '/1o à 1 g par litre de milieu.
Lorsque l'oxydation est terminée, on peut isoler le 11-oxy-stéroïde obtenu du milieu de fermentation en ajoutant à celui-ci de l'acétone.
Dans les fermentations sur grande échelle, on peut récupérer le ou les produits bruts dans la li queur de fermentation par une simple extraction par solvant, en utilisant un solvant approprié non mis cible à l'eau, tel qu'un hydrocarbure inférieur chloré, un alcool, un ester, une cétone, etc. On peut opérer une nouvelle purification et on peut séparer les pro duits stéroïdes d'avec les extraits par des méthodes connues. La séparation des mélanges de stéroïdes peut se faire en faisant usage de la chromatogra phie.
On peut identifier les stéroïdes présents dans la liqueur de fermentation extraite décrite ci-dessus par chromatographie sur bande de papier de la manière suivante: le système solvant utilisé est un mélange eau-méthanol-benzène que l'on prépare en agitant environ 50 % d'eau et 50 % de méthanol avec du benzène dans un entonnoir séparateur,
puis en lais sant les deux couches se séparer. On place une por tion de la couche inférieure dans un plateau ouvert sur le fond d'un grand cylindre en verre. La couche supérieure est la phase mobile, et elle sert à remplir la cavité en forme de caniveau à l'intérieur du cylin dre. On prépare une solution étalon de stéroïde en dissolvant 10 mg de chacun des stéroïdes. suivants dans 10 cm3 de chlorure de méthylène Substance S de Reichstein Cortisone Hydrocortisone 11-épi-hydrocortisone On peut également" inclure d'autres stéroïdes dans la solution étalon lorsque c'est nécessaire.
On chromatographie simultanément au moins une solution de stéroïde chaque fois que l'on essaie une solution inconnue. On applique exactement 0,025<I>ce</I> de la solution étalon de stéroïde sur la bande de pa pier, à la ligne de départ, à 10 cm de l'extrémité su périeure de la bande, que l'on replie par-dessus le bord du caniveau et que l'on plonge dans la phase mobile contenue dans celui-ci. On développe alors la bande pendant 2 à 4 heures à 370 C. De même, on applique 0,1 cm3 de la solution inconnue sur une au tre bande que l'on plie alors dans le même cani veau et que l'on développe avec la bande étalon au stéroïde. Le caniveau permet de développer de nom breuses bandes simultanément.
Après avoir dévelop pé convenablement les bandes de papier, on les en lève de l'appareil et on les sèche à l'air. Après sé chage, on pulvérise les bandes avec une solution al caline de bleu tétrazolium, qui produit de la couleur avec les stéroïdes qui contiennent une chaîne latérale cétole. On aligne des bandes ayant subi le dévelop pement coloré, avec au moins une bande étalon , et on les apprécie. On peut identifier les différents stéroïdes par leurs positions sur les bandes.
<I>Exemple 1</I>
EMI0002.0073
/o <SEP> en <SEP> poids
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>.... <SEP> 1,25</B>
<tb> Mannitol <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> (NHi)2HP04 <SEP> <B>....... <SEP> . <SEP> ------- <SEP> 1</B> <SEP> 0,2
<tb> KH,P04 <SEP> ...'................... <SEP> 0,15
<tb> K,HP04 <SEP> <B>...... <SEP> - <SEP> ---------- <SEP> . <SEP> . <SEP> -</B> <SEP> 0,05
<tb> MgS01.7H.;
,,O <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,025
<tb> NaCl <SEP> ........................ <SEP> 0,2
<tb> Solution <SEP> <B>de</B> <SEP> sels <SEP> Wisconsin <SEP> A-Z <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb> Eau: <SEP> q. <SEP> s.
<tb> PH <SEP> :
<SEP> 6,5 <SEP> - <SEP> 7,0 On prend 12 litres du milieu ci-dessus contenant 3 g de substance S de Reichstein, stérilisée dans une bouteille de 20 litres, et on les inocule avec 200 cm3 d'une culture mycélienne de 3 jours de Botrytis cine- rea (culture Lederle No N-51).
On conduit la fermen tation à 28 C pendant 240 heures, et au bout de ce temps les analyses sur bandes de papier indiquent une conversion en hydrocortisone de 201% environ.
On filtre le mélange de fermentation résultant, et on. lave le mycélium avec 2 litres, d'acétone. On réu nit cet extrait à la liqueur de fermentation et on 6va- pore l'acétone sous pression réduite. On extrait alors la liqueur par 4 volumes, successifs de 2 litres de chlorure de méthylène ; on réunit les extraits et on les lave à deux reprises avec une solution saline sa turée. Après séchage sur du sulfate de sodium anhy dre, on évapore l'extrait sous pression réduite, et on obtient 4 g d'un résidu huileux.
On dissout alors le désidu dans une portion; de la phase solvant du système: acétate d'éthyle, 4% en poids ; éther de pétrole (point d'ébullition. 90 - 1000, 2 % en poids; méthanol, 3 % en poids; eau, 2 0/0 en poids ;
et on place sur une colonne formée de 220g de terre d'infusoires et 110g de la phase aqueuse du système ci-dessus. On réunit les fractions éluées contenant le stéroïde et on évapore jusqu'à siccité sous pression réduite.
La cristallisation du résidu par le mélange acétone-éther de pétrole (60 - 70 ) donne des, cristaux fondant à 213-216o C, [a = 1Û = -I- 1621) (éthanol) spectre ultraviolet ?, éthanol max. = 240 - 241 [, (e 16 300). Le spectre d'absorption d'infrarouge est identique à celui d'un échantillon authentique de A-1-prégnène-11P, 17a, 21- triol-3,20-dion.e (hydrocortisone).
<I>Exemple 2</I> On prend 100 cm-1 de milieu tel que décrit ci- dessus à l'exemple 1, dans un flacon Erlenmeyer de 500 c<I>e</I>, et on inocule avec 1 cm3 d'une suspension de spores de<I>Botrytis</I> cinerea (culture Lederle N,>N-51,
sur agar-agar TSA (l'agar-agar TSA est for mé de 3% de bouillon de soja trypticase (Laboratoire Biologique de Baltimore), 5 % de glycérine, 0,
3 0/0 d'extrait de boeuf et 1,5 % d'agar-agar). Au bout de 58 heures d'agitation à 280 C, on utilise 1 cm3 de cet inoculum pour inoculer des tubes:
de secoueuse de 100 cm3 contenant 10 cm3 de milieu stérile comme dans l'exemple 1, et 2 mg de substance S de Reich stein. On fait incuber un tube pendant 96 heures, et au bout de ce temps les chromatographies sur papier indiquent la présence d'environ 1 mg d'hydro- cortisone (rendement 50 %).
<I>Exemple 3</I>
EMI0003.0096
1% <SEP> en <SEP> poids
<tb> Cérélose <SEP> <B>............ <SEP> - <SEP> .........</B> <SEP> 1,0
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb> NaCl <SEP> <B>................. <SEP> - <SEP> ... <SEP> ....</B> <SEP> 0,25
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> .... <SEP> .. <SEP> . <SEP> .. <SEP> .. <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> 0,4
<tb> Peptone <SEP> .................... <SEP> 0,4
<tb> Eau:
<SEP> q. <SEP> s.
<tb> pfl <SEP> ajusté <SEP> à <SEP> 7 <SEP> par <SEP> NaOH On met 12 litres du milieu ci-dessus dans une bouteille de 20 litres équipée d'un agitateur et d'un aérateur et on inocule avec 300cm3 d'une culturemy- célienne de 3 jours de<I>Botrytis</I> cinerea (cultureEderle No N-51-61). On conduit la fermentation à 210 C. On ajoute dans la bouteille 3 g de substance S de Reichstein avant de passer à l'autoclave.
La fermentation est suivie périodiquement par un titrage sur bande de papier, et on récolte la bouteille au bout de 72 heures, lorsque le titrage montre une conversion pratiquement complète de la substance S de Reichstein.
Après un traitement comme celui-ci décrit à l'exemple 1, on obtient 7,92 g d'un résidu gommeux. On fractionne ce résidu sur de la terre d'infusoires en utilisant le système :
acétate d'éthyle 3 % en poids; éther de pétrole 2 % en poids; méthanol 3 % en poids ;
eau 2 % en poids pour donner 2,2 g d'un solide cristallin. Quand on chromatographie à nouveau ce solide sur le même système de fraction nement, on sépare le stéroïde désiré, soit 1,043 g, fondant entre 200 et 216,50 C (rendement 33,3 0/0). La cristallisation par le mélange acétone-éther de pétrole donne le composé F pur, point de fusion 217 - 2180 C. Le spectre infrarouge est identique à celui d'un échantillon authentique.
<I>Exemple 4</I> Dans une autre expérience dans des conditions comparables à celles de l'exemple 2, en utilisant le milieu de l'exemple 3, on remplace la substance S de Reichstein par l'acétate de la substance de Reich stein, et on obtient un rendement similaire en hydro cortisone, comme l'indique l'analyse chromatogra- phique. On utilise le<I>Botrytis</I> cinerea (culture Le- derle N N-51-61) comme microorganisme et on conduit la fermentation à 210 C.
<I>Exemple 5</I> Dans une autre expérience dans des conditions similaires à celles utilisées dans l'exemple 4, la <I>Botrytis</I> cinerea, la<I>Botrytis</I> peoniae et trois autres espèces de Botrytis convertissent la substance S de Reichstein en hydrocortisone, comme le montre l'analyse chromatographique.
Method for converting an 11-deoxy-steroid to the corresponding 11-oxy-steroid Recently, several steroids containing a hydroxyl group at the 11-position have become important therapeutic agents in the treatment of diseases. Among these steroids is Kendall's F compound.
Methods have been developed for preparing this substance from 11-deoxy-steroids, but unfortunately suitable intermediates are scarce, and methods for introducing a hydroxyl group at the 11-position are unsatisfactory for various reasons.
It appears that the process of the present invention represents an improvement over previous processes for the oxidation of steroids at position 11, because it avoids side reactions and gives high yields.
The process according to the invention for converting an 11-deoxy-steroid into the corresponding 11-oxy-steroid consists in subjecting the 11-deoxy-steroid to the oxidative fermentation action of one or more fungi of the genus <I> Botrytis . </I>
For example, a fungus of the genus Botrytis such as <I> Botrytis </I> cinerea, Botrytis peoniae and / or other species of <I> Botrytis </I> is cultivated under aerobic conditions in a suitable nutrient medium, and allowed to act on substance S or an ester thereof such as acetate, or a related 11-deoxy-steroid. During the growth of the organism under favorable conditions, a hydroxyl group is introduced at position 11. The exact mechanism of this oxidation is obscure, but it results from enzymes produced by the organism as it grows.
A suitable nutrient medium contains a soluble source of carbon, nitrogen, and minerals which can be used as carbon sources: corn starch, molasses, maltose, dextrose, sucrose, xylose, galactose, glycerol, mannitol and various organic acids such as citric acid, malic acid, acetic acid and various natural products containing carbohydrates, for example corn maceration liquor, corn flour. soy,
cottonseed meal and many other accessible materials that have previously been used as a source of carbon in fermentation processes.
Can be used as sources of nitrogen, for example, maize maceration liquor, soybean meal, cottonseed meal, etc., and various other substances such as beef extract, caesin, soybean. yeast, proteins digested by enzymes, and degradation products such as peptones, amino acids, and many other accessible protein materials which have been found suitable for fermentation processes, to support the growth of fungi .
Various inorganic sources of nitrogen, including urea, ammonium salts, nitrates, etc., can also be included in the medium, as a source of assimilable nitrogen, to provide a favorable substrate for the development of the cell. 'organization.
Much of the mineral matter necessary for fermentation is already present in the materials used as sources of carbon and nitrogen. It is also present in the water used in the process. But in general, it is advisable to add in addition substances providing phosphate, sulfate, chloride, sodium, potassium, magnesium, iron, calcium, cobalt, manganese and various other ions.
The 11-deoxy-steroid can be added to the medium before inoculation or one or two days after. To prepare inocula, one can proceed as follows <B>: </B> we take 5 to 10 cm3 of sterilized water in which we suspend,
the shallow growth of a slant culture in an agar-agar tube. The resulting suspension of spores and mycelium is used to inoculate two or three 100 cc batches of sterilized medium in 500 cc Erlenmeyer flasks, as shown in the examples below. After inoculation, the vials are incubated on a reciprocating shaker device at 21o C for about 2-4 days.
The contents of 2 or 3 of these vials are used to inoculate 12 liters of sterile medium in a 20-liter bottle.
The fungi of the genus Botrytis grow at all temperatures from 5 to 30o C and it is in this temperature range that oxidation takes place preferably.
During the fermentation process, aeration can be ensured by sending sterilized air through the medium at a rate of approximately 1/3 to 2 volumes of air per volume of medium per minute. In general, mechanical agitation is carried out to keep the mycelium and other insoluble materials in suspension. Defoamers such as silicone, glyceride oils, etc. can be added from time to time.
The steroid to be oxidized can be added in the middle of the fermentation either in powder form. Thus, the steroid can be dissolved in methanol or other water-miscible solvents and added to the fermentation medium. The steroid disperses throughout the medium as a fine suspension and becomes readily available to the body for oxidation. The amount of steroid added during fermentation can vary widely, but is generally in the range of 1/10 to 1 g per liter of medium.
When the oxidation is complete, the obtained 11-oxy-steroid can be isolated from the fermentation medium by adding acetone thereto.
In large scale fermentations, the crude product (s) can be recovered from the fermentation li quer by simple solvent extraction, using a suitable non-water target solvent, such as chlorinated lower hydrocarbon, alcohol, ester, ketone, etc. A further purification can be carried out and the steroid products can be separated from the extracts by known methods. The separation of the steroid mixtures can be done by making use of chromatography.
The steroids present in the extracted fermentation liquor described above can be identified by chromatography on a strip of paper as follows: the solvent system used is a water-methanol-benzene mixture which is prepared by stirring about 50% d 'water and 50% methanol with benzene in a separating funnel,
then allowing the two layers to separate. A portion of the lower layer is placed in an open tray on the bottom of a large glass cylinder. The top layer is the mobile phase, and it serves to fill the gutter-shaped cavity inside the cylinder. A standard steroid solution is prepared by dissolving 10 mg of each of the steroids. in 10 cm3 of methylene chloride Reichstein's Substance S Cortisone Hydrocortisone 11-epi-hydrocortisone Other steroids may also be included in the standard solution when necessary.
At least one steroid solution is chromatographed simultaneously each time an unknown solution is tested. Apply exactly 0.025 <I> ce </I> of the standard steroid solution to the paper strip, at the starting line, 10 cm from the top end of the strip, which is folded over by above the edge of the channel and which is immersed in the mobile phase contained in it. The strip is then developed for 2 to 4 hours at 370 ° C. Likewise, 0.1 cm3 of the unknown solution is applied to another strip which is then folded in the same channel and which is developed with the standard steroid band. The gutter allows many bands to be developed simultaneously.
After having properly developed the paper strips, they are removed from the apparatus and dried in the air. After drying, the bands are sprayed with an alcaline solution of tetrazolium blue, which produces color with steroids which contain a ketole side chain. Color-developed bands are aligned with at least one standard band and rated. The different steroids can be identified by their positions on the bands.
<I> Example 1 </I>
EMI0002.0073
/ o <SEP> in <SEP> weight
<tb> Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP> <B> .... <SEP> 1,25 </B>
<tb> Mannitol <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 1.0
<tb> (NHi) 2HP04 <SEP> <B> ....... <SEP>. <SEP> ------- <SEP> 1 </B> <SEP> 0.2
<tb> KH, P04 <SEP> ...'................... <SEP> 0.15
<tb> K, HP04 <SEP> <B> ...... <SEP> - <SEP> ---------- <SEP>. <SEP>. <SEP> - </B> <SEP> 0.05
<tb> MgS01.7H .;
,, O <SEP> <B> ... </B> <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.025
<tb> NaCl <SEP> ........................ <SEP> 0.2
<tb> Solution <SEP> <B> of </B> <SEP> salts <SEP> Wisconsin <SEP> A-Z <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.1
<tb> Water: <SEP> q. <SEP> s.
<tb> PH <SEP>:
<SEP> 6.5 <SEP> - <SEP> 7.0 Take 12 liters of the above medium containing 3 g of Reichstein's substance S, sterilized in a 20 liter bottle, and inoculate them with 200 cm3 of a 3-day mycelial culture of Botrytis cine- rea (Lederle culture No. N-51).
The fermentation is carried out at 28 ° C. for 240 hours, and at the end of this time the analyzes on paper strips indicate a conversion to hydrocortisone of approximately 201%.
The resulting fermentation mixture is filtered, and one. washes the mycelium with 2 liters of acetone. This extract is combined with the fermentation liquor and the acetone is evaporated off under reduced pressure. The liquor is then extracted with 4 successive volumes of 2 liters of methylene chloride; the extracts are combined and washed twice with saline solution. After drying over anhydrous sodium sulfate, the extract is evaporated under reduced pressure, and 4 g of an oily residue are obtained.
The desire is then dissolved in one portion; of the solvent phase of the system: ethyl acetate, 4% by weight; petroleum ether (boiling point 90 - 1000, 2% by weight; methanol, 3% by weight; water, 20% by weight;
and one places on a column formed of 220g of diatomaceous earth and 110g of the aqueous phase of the above system. The eluted fractions containing the steroid are combined and evaporated to dryness under reduced pressure.
Crystallization of the residue with acetone-petroleum ether (60-70) gives crystals melting at 213-216o C, [a = 10 = -I- 1621) (ethanol) ultraviolet spectrum?, Ethanol max. = 240 - 241 [, (e 16,300). The infrared absorption spectrum is identical to that of an authentic sample of A-1-pregnene-11P, 17a, 21-triol-3,20-dion.e (hydrocortisone).
<I> Example 2 </I> 100 cm-1 of medium is taken as described above in Example 1, in a 500 c <I> e </I> Erlenmeyer flask, and inoculated with 1 cm3 of a suspension of <I> Botrytis </I> cinerea spores (Lederle culture N,> N-51,
on TSA agar (TSA agar is made up of 3% trypticase soy broth (Baltimore Biological Laboratory), 5% glycerin, 0,
3% beef extract and 1.5% agar-agar). After 58 hours of stirring at 280 C, 1 cm3 of this inoculum is used to inoculate tubes:
shaker of 100 cm3 containing 10 cm3 of sterile medium as in Example 1, and 2 mg of substance S from Reich stein. A tube is incubated for 96 hours, and at the end of this time paper chromatography indicates the presence of about 1 mg of hydrocortisone (50% yield).
<I> Example 3 </I>
EMI0003.0096
1% <SEP> in <SEP> weight
<tb> Cerelosis <SEP> <B> ............ <SEP> - <SEP> ......... </B> <SEP> 1.0
<tb> Extract <SEP> of <SEP> yeast <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.1
<tb> NaCl <SEP> <B> ................. <SEP> - <SEP> ... <SEP> .... </B> <SEP > 0.25
<tb> Extract <SEP> from <SEP> beef <SEP> .... <SEP> .. <SEP>. <SEP> .. <SEP> .. <SEP>. <SEP> <B> ... </B> <SEP> 0.4
<tb> Peptone <SEP> .................... <SEP> 0.4
<tb> Water:
<SEP> q. <SEP> s.
<tb> pfl <SEP> adjusted <SEP> to <SEP> 7 <SEP> by <SEP> NaOH 12 liters of the above medium are placed in a 20 liter bottle equipped with a stirrer and an aerator and we inoculate with 300cm3 of a 3-day-old cultemycelia of <I> Botrytis </I> cinerea (cultureEderle No N-51-61). The fermentation is carried out at 210 C. 3 g of Reichstein's substance S are added to the bottle before passing to the autoclave.
Fermentation is followed periodically by paper tape titration, and the bottle is harvested after 72 hours, when the titration shows almost complete conversion of Reichstein's substance S.
After a treatment as described in Example 1, 7.92 g of a gummy residue is obtained. This residue is fractionated on diatomaceous earth using the system:
ethyl acetate 3% by weight; petroleum ether 2% by weight; methanol 3% by weight;
water 2% by weight to give 2.2 g of a crystalline solid. When this solid is chromatographed again on the same fractionation system, the desired steroid is separated, ie 1.043 g, melting point between 200 and 216.50 C (yield 33.3%). Crystallization with an acetone-petroleum ether mixture gives pure compound F, melting point 217-2180 C. The infrared spectrum is identical to that of an authentic sample.
<I> Example 4 </I> In another experiment under conditions comparable to those of Example 2, using the medium of Example 3, the substance S of Reichstein is replaced by the acetate of the substance of Reich stein, and a similar yield of hydrocortisone is obtained, as indicated by chromatographic analysis. <I> Botrytis </I> cinerea (Lderle N N-51-61 culture) is used as the microorganism and the fermentation is carried out at 210 C.
<I> Example 5 </I> In another experiment under conditions similar to those used in Example 4, <I> Botrytis </I> cinerea, <I> Botrytis </I> peoniae and three others Botrytis species convert Reichstein's substance S to hydrocortisone, as shown by chromatographic analysis.