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La présente invention a pour objet la prépara- tion de nouveaux stéroïdes de la série du. #1,4-prégnadiè- ne.
Récemment,un certain nombre de stéroides des séries du prégnène et du prégnadiène, tels que l'hydrocor- tisone et la 1-déhydro-hydrocortisone sont devenus des agents thérapeutiques importants et sont devenus utiles comme intermédiaires pour la préparation d'autres stérol- des utiles en thérapeutiques. Les nouveaux #1,4-prégna- diènes envisagés suivant l'invention sont utiles comme agents anti-inflammatoires dans le traitement de l'arthri- te, de l'asthme, des brûlures, de la bursite, etc...,et aussi dans le traitement des affections cutanées et des maladies du collagène.
Ces composés sont utilisés en com- binaisons avec des charges, excipients, etc.., en tablet- tes, poudres, pilules, etc...,. Ils peuvent aussi être uti lisés par voie parentérale, en solution ou en suspension.
Suivant l'invention, on prépare lesnouveaux #1,4-prégnadiènes en soumettant un #4-prégnène à une fermentation ensymatique au moyen de champignons du genre Nocardia, ou du champignon Corynebacterium simplex
Le procédé de la présente invention peut être illustré par l'équation schématique suivante, dans laquel- le la formule générale I représente le #4-préngène, et; la formule générale II représente le #1,4-préganadiëne obtenu :
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dans ces formules, X est un atome d'hydrogène ou d'halogè- ne, Y est. un groupe méthylène, hydroxyméthylène ou carbony- le, Z est un groupe méthylène, hydroxyméthylène ou alkylexy méthylène inférieur, R' est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxyle, et R est un atome d'hydrogène ou un grou pe alkyle inférieur. Dans certains composés préférentiels X représente le fluor, Y représente CHOH, Z représente CHOR", R' représente OH, R et R" sont des atomes d'hydro- gène ou des radicaux alkyle.
Dans la conduite du procédé de la présente in- ventiori, on cultive dans des conditions aérobies, dans un milieu nutritif approprié contenant un #4-stéroïde de la série du prégnène, un champignon du genre Nocardia (Ber- gey, Manual, 6ème édition), tel que le corallina, ATCC 999 et ATCC 4273, (Culture Lederle n 13);
l'asteroides, ATCC 3308, le keratolyticus, ATCC 12484, le transvalensis, ATCC 12485, l'erythropolis, ATCC 4277, le convoluta, ATCC 4275, le gardneri, ATCC 9604, le leishmanii, ATCC 6855, l'opaca ATCC 4276,'le blackwelii., ATCC 6846, le caviae, ATCC 6848, le cuniculi, ATCC 6864, le globerula, ATCC 9356, le poly- chromogenes, ATCC 3409, le sylvodifera, ATCC 7372, le far- cinica, ATCC 3318, le sylvodifera ATCC 4919, ou une autre espèce de Nocardia,
ou bien le champignon Corynebacterium
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simplex. Pendant la croissance de l'organisme dans des con- ditions favorables, deux atomes d'hydrogène s'éliminent du noyau stéroïde A,et on obtient ainsi une double liaisom en position 1,2. Le mécanisme exact de cette déshydrogéna- tion est obscur, mais celle-ci est le résultat des enzymes produites par l'organisme dans le processus de la croissan- ce. Un milieu nutritif approprié contient une source solu- ble solubla d'éléments carbonés, azotés, et minéraux.
Les sources de carbone comprennent les sucres, tels que le glu- cose, le sacchacrose, le maltose, le dextrose, le xylose et le galactose, et aussi les alcools tels que le glycérol ou le mannitol; l'amidon de mais; les acides organiques @ tels que l'acide citrique, l'acide malique et l'acide acé- tique; et divers produits naturels) contenant des hydrates de carbone, tels que la liqueur de macération de mais, la farine de soja, la farine de graine de coton, et de nom- breuses autres matières que l'on peut trouver et qui ont été utilisées antérieurement comme source de carbone dans les processus de fermentation. Généralement, on peut uti- liser différents corps ci=dessus, dans le milieu, avec de bons résultats.
Les sources appropriées d'azote comprennent certaines des matières citées ci-dessus, telles que la li- queur de macération de mais, la farine de soja, la farine de graine de coton, etc., et diverses autres substances, telles que l'extrait de boeuf, la caséine, la levure, les protéines digérées par enzymes, et les produits de dégra- dation, comprenant les peptones, les acides aminés et beaucoup d'autres matières protéiques disponibles qui sont susceptibles d'entretenir la croissance des champignons.
Les sources inorganiques d'azote, comprenant l'urée, les sels d'ammonium, les nitrates, etc., peuvent être utili- sées dans le miMeu comme source d'azote assimilable pour
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fournir un milieu de croissance favorable à l'organisme.
Les éléments minéraux nécessaires à la fermen- tation se trouvent généralement dans les matières brutes que l'on utilise souvent comme sources de carbone et d'azo- te, ou bien dans l'eau utilisée dans le procédé. Toute- fois, il est en général à conseiller d'ajouter des quanti- tés supplémentaires d'éléments minéraux à celles normale- ment présentes, pour obtenir une croissance maxima de Nocardis. Il est avantageux d'ajouter des cations et anions comprenant le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, les ions phosphate, sulfate, chlorure, le co- balt, le manganèse, et autres. L'usage d'oligo-éléments tels que le bore, le cuivre, le cobalt, le molybdène et le chrome est souvent désirable.
La croissance du champignon Nocardia ou du champignon Corynebacterium simplex se fait en milieu aéro- bie, et on peut réaliser l'aération, dans des flacons par exemple, par agitation sur une secoueuse alternative ou rotative, ou dans des bouteilles ou des cuves en envoyant sous pression de l'air stérile à travers le mélange de fermentation. Il est désirable d'insuffler de l'air sté- rile à travers le milieu à raison de 1/3 à 2 volumes d'air- par volume de milieu et par minute. L'agitation dans les bouteilles ou dans les cuves de fermentation est assurée par un agitateur mécanique. Le champignon Nocardia peut pousser à des températures de 5 à 45 C, mais il est pré- férable de conduire le procédé à des températures de 25 à 37 C.
Le Corynebacterium simplex peut pousser à des tem- pératures de 10 à 45 C, mais on l'utilise de préférence à une température de 25 à 38 C.
Pour préparer des inocula, on utilise 1,0 cm3 de suspension de cellules végétatives lavées de champigons du genre Nocardia ou de Corynebacterium simplex, pour inoculer 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypti-
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case, dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. Le bouillon de soja à la trypticase contient 3% de produit de diges- tion tryptique de protéines de soja, sous forme de poudre déshydratée (Baltimore Bacteriological Laboratories), 5% de glycérine et 8% d'extrait de boeuf (Armour), et ce mélange est stérilsé pendant 15 minutes à une températu- re de 120 C (pression de vapeur de 675 kg). Après stérilisation, le pH est compris entre 7,4 et 7,7.
Après avoir inoculé le flacon, on le fait incuber à 37 C, sur une secoueuse, pendant 4 à 8 heures environ. Onpeut uti- liser ces inocula pour inoculer de grandes quantités de milieu stérile en bouteilles, et ces cultures en bouteil- le, après fermentation, peuvent servir à.inoculer de gran- des quantités de milieu dans des cuves de fermentation.
Au lieu du bouillon de soja à la trypticase indiqué plus haut, on peut utiliser d'autres milieux, comme le montrent les exemples ci-après.
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Les 4-stéroides de la série du prégnène qui peuvent servir dans le procédé de la présente invention sont notamment le 3,20-dicéto-llbêta, 17 alpha, 21-tri-
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hydroxy- 4¯prégnène (hydrocortisone), le 3,20-dicéto- llbêta, 21-dihydroxy-'.prégnêne {corticostérone), le 3,20-dicéto-17 alpha,21-.dihydraxy..,(''prégnène (substance S de Reichstein), le 3,20-dicéto-ll alpha, 17 alpha, 21- trihydroxy- '-.prégnëne (11-épi-hydrocortisone), le 3,20- dicéto-11 bêta, 16 alpha, 17 alpha, 21-tétrahydroxy- Z-2.- prégnène, le 3 ,2O-dicéto-9alpha,fluor0-llbêtaji6alpha, 17alpha, 21-tétrahydroxy- 4¯prégnènè, le 3,11,20-tricéto- l6alpha, ;l7alpha, 21-trihydroxy- L::::..4..prégnène, le 3,11,20- tricéto-17alpha, 21-dihydroxy- 4¯prégnène, et leurs es- ters etc.
Quand on utilise les substrats de stéroïdes ci- dessus dans la fermentation, les produits formés sont les
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stérolde's'libres. On ajoute généralement ces stéroïdes à
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la fermentation, en solution ou sous forme finement divi- sée. Une méthode préférentielle consiste à dissoudre le stéroïde dans l'éthanol ou d'autres solvants miscibles à l'eau, et à l'ajouter au milieu de fermentation, au stade désiré du processus. Bien que le stéroïde précipite par- fois de la solution quand on l'ajoute de cette façon, il se disperse dans tout le milieu sous forme de suspension fine et se trouve facilement à la disposition de l'organis- me en vue de l'oxydation. La quantité de stéroïde ajoutée à la fermentation peut varier considérablement, mais elle est généralement de l'ordre de 1/10 à 1 g par litre de milieu.
Pendant 'le processus de fermentation, il est parfois désirable d'ajouter des agents antimousses tels que les silicones, les huiles glycéridiques, etc. On ajou te ces composés de temps en temps, et dans les quantités voulues.
Dans le procédé de la présente invention, on fait généralement incuber pendant une durée de 16 à 40 heures environ, à une température d'environ 32 C, des portions de 10 cm3 de milieu inoculé en tubes de secoueu- ses de 100 cm3. Au bout de ce temps, on ajoute, dans cha- que tube, 2 mg de substrat stérile (stéroïde #4-prégnène) dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol, et on poursuit la fermen- tation à environ 32 C. On laisse la fermentation se poursuivre pendant un laps de temps suffisamment long pour réaliser la conversion maxima du #4-prégnène en #1,4- prégnadiène. Ce laps de temps peut varier de 1 à 72 heu- res ou plus.
A la fin du processus de fermentation, on récupère dans le milieu de fermentation le #1,4-stéroïde de la série du prégnadiène que l'on désire obtenir, grâce à la méthode suivante qui décrit en particulier une fermen-
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tation sur 10 cm3. Ce'st là une méthode générale qui est applicable pour des fermentations à diverses échelles.
On extrait à quatre reprises le contenu d'un tube de fermentation, avec quatre volumes de chlorure de méthylène. On réunit les quatre extraits, puis on lave une fois la solution résultante avec une solution aqueuse à 2% de bicarbonate de sodium saturée de chlorure de so- dium, et ensuite on lave à deux reprises avec une solution saturée de chlorure de sodium. Après lavage, on peut sé- cher la solution de chlorure de méthylène sur du sulfate de magnésium anhydre et la filtrer. On concentre le fil- trat au bain-marie à la pression atmosphérique, jusqu'à un faible volume, et on transfère le concentré dans un fla- con volumétrique de 10 cm3, puis on complète à ce volume avec du chlorure de méthylène.
On utilise cette solution pour déterminer la teneur en stéroide, comme indiqué ci- après.
Dans les fermentations à grande échelle, on peut récupérer le ou les produits bruts de la liqueur de fermentation, par une simple extraction par solvant, en utilisant un solvant approprié non miscible à l'eau tel que les hydrocarbures inférieurs chlorés, les alcools, les esters, les cétones, etc.. On peut procéder à une nouvel- le purification et séparer les produits stéroïdes des ex- traits, par des méthodes bien connues du technicien. La séparation et la purification du mélange de stéroïdes né- cessitent souvent l'usage de la chromatographie.
Le procédé employé pour identidier les stérol- des présents dans la liqueur de fermentation soumise à l'extraction et mentionnée plus haut, est la chromatogra- phie à bande de papier. La système solvant utilisé est un système eau-méthanol-benzène, que l'on prépare en agi- tant environ 50% d'eau et 50% de méthanol avec du benzène,
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dans une ampoule à décantation, puis n laissant les deux couches se séparer. On place une portion de la couche in- férieure dans un cristallisoir ouverte sur'le fond d'un grand cylindre en verre. La couche supérieure est la pha- se solvant, et elle sert à remplir la cavité en forme d'au- ge à l'intérieur-du cylindre.
On prépare une solution
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étalon de stéroïde en dissolvant 10 mgl;hacun des sté- roides suivants dans 10 cm3 de chlorure'de;méthylène:
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3,20-dicéto-llbta,l7alpha,21-trihydroxy f-prégnène; , 20-dicéto-llbta, 21-.dihydroxy..,'-prégnéne.
3, 20-dicéto-17alpha, 21-dihydroxt-j'-prégnëne; 3,20-dicéto-llalpha,l7alpha,21-trihßdroxy-'-prégnène; 3,20-dicéto-llbta,16a1pha,17alpha,21-tirahydroxy-jj'-. prégnène;
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16,2-diacéto-3,20-dicéto-11-bta,l6alpha,l7alpha,21-té- - trahydroxy-4¯prêgnène; 3,20-dicéto-9alpha-fluoro-llbêta,l$alpha,17alpha,21-tétra hydroxy--prégnène ; \ (/ lôalpha , 21-diacéto-3 , 20-dicéto-9alpha-f luoro-llbêta , lôal- pha,l7alpha,21-tétrahydraxy-f,'-prégnène; (D'autres stéroides peuvent servir dans la solution étalon lorsqu'ils sont appropriés).
On chromatographe simultanément au moins une solution courante de stéroïde chaque fois que l'on essaie une solution inconnue. On applique exactement 0,025 cm3 de la solution étalon de stéroïde pour essais, sur la bande de papier, à la ligne de d épart, à 10 cm de l'ex- trémité supérieure de la bande, que l'on plie par-dessus le bord de l'auge et que l'on plonge dans la phase solvant contenue à l'intérieur. On développe alors la bande pen- dant 2 à 4 heures à environ 37 C. De même, on applique
0,1 cm3 de la solution inconnue sur une autre bande, que l'on plie alors dans la même auge et que l'on développe
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simultanément avec la bande étalon au stéroïde. L'auge permet de développer de nombreuses bandes simultanément.
Après avoir développé convenablement les bandes de papier, on les enlève de l'appareil et on les sèche à l'air à en- viron 37 C. Après séchage, on pulvérise sur les bandes une solution alcalino de bleu tétrazolium qui fait apparat- tre la couleur aux points où les stéroïdes sont présents.
On aligne des bandes à couleur développés avec au moins une bande "étalon" et en compare. On peut identifier les dif- férents stéroides par leur position sur la bande.
Les 2\' -stéroïdes; désirés seront plus polai-
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res que les 4"'stéroïdes correspondants. Il est entendu, de plus, que les ('''-stéro3de's désirés, une fois qu'ils ont été isolés et caractérisés, peuvent eux-mêmes servir dans une solution étalon de stéroïdes afin d'améliorer le procédé.
Les exemples précis qui suivent illustrent en détail la déshydrogénation des #4-ptéroïdes de la sé- rie du prégnène, pour préparer les #-1,4-stéroïdes corres- pondants de la série du prégnadiène.
EJ#MPLE 1
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.Préparation du 3,20dicéto-.llbéta-l7alpha,l.-trihydroxy z\ le4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia corallina (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar en tube à essai, au moyen de 7 cm3 de solution saline stérile, et on obtient une suspension de cellules végétatives que l'on utilise pour inoculer 100 cm3 de bouillon de soja stérile à la trypticase (décrit plus haut), dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber le flacon pendant 7 heures à 37 C. Un utilise alors cet inoculum pour ino- culer un bouillon stérile de soja à la trypticase dans des tubes de secoueuse de 100 cm3. On utilise 1 cm3
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diinoculum'pour inoculer chaque portion de 10 cm3 d'un milieu contenant 2% de mélasse (Grandma), 1% d'extrait de boeuf (Difco, et 1% de glucose dans chaque tube de secoueuse de 100 cm3. On fait incuber les tubes à 32 C pendant 40 heures.
A ce moment, on ajoute dans chaque tu-
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be 2 mg de 3,20-dicéto-llbêta,l7alpha,21-trihydroxy-ü'- prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol. On continue alors l'incubation pendant encore 24 heures.
On extrait à quatre reprises les 10 cm3 de liqueur de l'un des tubes ci-dessus, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu dans 2 cm3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprié par les techniques à bande de papier décrites ci-dessus. Le chromatogramme sur bande de papier indique
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la présence du 3,20-d.icéto-llbéta,l7alpha,21-trihydroxy- l,4¯prégnadiène. EXEMPLE 2 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy-
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l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia sp.(ATCC 12483) sur agar-agar en tube adossais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile. On utilise 2 cm3 de la suspendison obtenue pour inoculer 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber le mélange en agitant à 37 C pendant 8 heu- res, et on utilise la culture obtenue pour inoculer des tubes contenant du bouillon stérile de soja à la trypti- case. On utilise 1/2 cm3 de la culture de 8 heures pour inoculer 10 cm3 de milieu dans un tube de 100 cm3. On incube les tubes inoculés à 32 C en agitant pendant 16 heures. Dans chaque tube, on ajoute 2 mg de 21-acéto-
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3, 20-dicéto-l.béta,l7alpha,21-trihpdroxy-.'-prégnène
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dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol.
On fait incuber les tubes encore 1 1/2 à 5 heures et on récolte. La chromatographie sur bande de papier indique que le substrat s'est converti
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en 3,20ddicéto-llb,-ta,l7alpha,21-trihydroxy.,,1*-prégna- diène. On observe encore, sur les bandes de papier, à me- sure que le temps croît, l'apparition de 3,20-dicéto-llbê-
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ta,l7alpha,21-trihydroxy.-'-prégnëne, et que sa quantité augmente aux dépens du 21-acéto-3,20-di%to-11-bêta.17alphe, 21-trihydroxy-j'-prégnène, suivi par l'apparition en quantité croissance de 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-tri- hydroxy-l,4¯prégnadiène.
EXEMPLE 3 Préparation du 3,20-dicéto-llbêt9,17alpha,21-trihydroxy- ######################j################# 1,4-prégnadiène. '
On lave une culture de Nocardia sp. (ATCC 12483) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile. On prend deux portions de 100 cm3 de bouillon de soja à la trypticase dans des flacons Erlenmeyer de 500 cm3, et on. inocule chacune avec 1 cm3 de cette suspension. On fait .incuber les flacons sur une secoueuse alternative pendant 7 heures à 32 C. On utilise alors cet inoculum pour ino- culer un bouillon de soja stérile à la trypticase dans des tubes de secoueuse de 100 cm3. Il y en a 96 tubes, conte- nant chacun 10 cm3 de milieu., On fait incuber ces tubes pendant 23 1/2.heures à 32 C avec agitation.
Au bout de ce temps, on ajoute dans chaque tube 2 mg de 3,20-dicéto-
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llbêta,17alpha,21-trihydroxy-/\17-prégnène dissous dans' 0,2 cm3 de méthanol. On continue alors la fermentation encore pendant 5 heures à 32 C. On réunit le contenu des tubes, et on extrait à quatre reprises la liqueur obtenue. chaque fois avec 500 cm3 de chlorure de méthylène. On réu- nit les quatre extraits et on les concentre sous vide jus-
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qu'à obtention d'un résidu huileux. On dissout ce résidu dans 2 cm3 de la phase stationnaire du système; 3 parties d'acétate d'éthyle, 2 parties d'éther de pétrole.(90-10000), 3 parties de méthanol et 2 parties d'eau.
On mélange cette. solution avec 4 g de terre d'infusoires et on entasse le mélange obtenu au sommet d'une colonne chromatographique mesurant 2 x 39 en et comprenant 50 g de terre d'infusoi- res, on mélange avec 25 cm3 de la phase stationnaire dû système précédent. On développe la colonne obtenue à l'aide d'une phase mobile, et on recueille par fractions le liquide qui filtre. On concentre la fraction appro- priée jusqu'à siccité, sous pression réduite. On dissout le résidu dans l'acétone, et on cristallise le produit brut par addition d'éther de pétrole (60-70 C). Le rende- ment est de 27 mg d'un produit qui fond à 192-205 C. On recristallise cette matière dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole, on obtient un produit qui fond à
25 231-233 C et qui mesure [Ó] D- +103 (dioxane).
Le spectre infra-rouge de ce produit est identique à celui
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d'un échantillon authentique de 3920-dicéto-Ilbêtael7alphas 21-trihydroxy-/ '"-prégnadiêne.
EXEMPLE 4 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- le4-prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia gardneri (ATCC 9604) sur soja à la trypticase et agar-agsr, en tu- be à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives ainsi obtenue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile contenant 1% de céréalose, 0,1% d'extrait de levure, 0,25% de chloru- re de sodium, 0,4% d'extrait de boeuf (Difco) et 0,4% de peptone, à pH 7 (milieu n 13) dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une secoueuse alterna-
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tive pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une au- tre quantité de 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On fait incuber ce dernier flacon, avec agitation, pendant 24 heures à 32 C, et au
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bout de ce temps on ajoute 20 mg de 3,20-dicéto-llbêta, l7alpha,21-trihydroxy-,'-prégnène dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On continue l'incubation, et on retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à 4 reprises avec 40 cm3 de chlorure de méthylène chaque fois. On réunit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide.
On reprend le résidu dans 2 cm3 d'acétone et on analyse un échantillon approprié par les techniques à bande de papier décrites plus haut. Les chromatogrammes sur bande de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-llbêta,
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l'alpha , 21-trihydroxy-a,l' *.pré gnadiène . EXEMPLE 5 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,l6alpha,17alpha,21-té- ,
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trahydroxy-,L\ 1,4¯pré-nadiène.
On lave une culture de Nocardia gardneri (ATCC 9604) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile et on utilise des portions de 1 cm3 de la suspen- sion de cellules végétatives obtenue pour inoculer des portions de 10 cm3 de milieu n 13 stérile ajustées à pH 7, chaque portion étant dans un tube de secoueuse de 100 cm3.
On agite les tubes sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures, et au bout de ce temps,-on ajoute dans
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chaque tube 2 mg de 3,20-dicéto-llbgta,16alpha,17alpha, 21-tétrahydroxy.-'-prégnène, dissous dans 0,2 cm3 d'étha- nol aqueux à 70%. On récolte les tubes au bout de 6, 24,
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72 heures d'incubation supplémentaire après l'addition du substrat.
On extrait chacune des liqueurs fermentées à quatre reprises, chaque fois par 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur et on concentre jusqu'à obtention d'un résidu sec, sous pression réduite. On reprend chaque résidu dans 2 cm3 de pyridine, et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mélanges sur un cône à vapeur pendant 10 à 15 minutes, puis on les concentre sous vide jusqu'à siccité. On dis- sout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone et on chromatogra- phie des volumes appropriés de solutions résultantes. Les chromatogrammes montrent que le substrat a été converti
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en 3,20-dicéto-llbêta,16alPha,17alpha,21-tétrahYdroxy¯1'4 -prégnadiène.
EXEMPLE 6
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Préparation du 3,20-dicéto-llbéta,21-dihydroxy.µls'-pré- gnadiène.
On conduit cette fermentation d'une façon si- milaire à l'exemple 1, en utilisant le Nocardia corallina (ATCC 999) sauf que l'on continue la fermentation pendant 72 heures après l'addition du substrat de stéroïde qui
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est le 3,20-dicéto-llbëta,21-dihydroxy-4-prégnène. Le produit est le 3,20-dicéto-llbêta,21-dihydroxy-/"-pré- gnadiène, que l'on identifie par chromatographie sur pa- pier comme dans l'exemple 1. exemple 7
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Préparation du 3,20-aicéto-llbêta,l6alpha,17alpha,21-té- trahydroxy-L, 1,4-pré,-nadiène.
On lave une culture de Nocardia leishmanii (ATCC 6855) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise des portions de 1 cm3 de la sus-
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pension de cellules végétatives obtenue pour inoculer des . à portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 jausté pH 7, chaque portion étant dans un tube de secoueuse de 100 cm3.
On agite les tubes sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures, et au bout de ce temps on ajoute dans chaque tube 2 mg de substrat constitué par du 3,200dicéto-
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llbêta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy-'.-prégnène dis- sous dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On récolte les tubes au bout de 6, 24 et 72 heures supplémentaires d'in- cubation, après l'addition du substrat.
On extrait à quatre reprises chaque liqueur fermentée, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthy- lène. On réunit les'extraits de chaque liqueur et on con-. centre jusqu'à résidu sec sous pression réduite. On re- prend chaque résidu par 2 cm3 de pyridine et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique.,On chauffe ces mélanges sur un cône à vapeur pendant 10-15 minutes, et ensuite on con- centre jusqu'à résidu sec sous vidé. On dissout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone, et on chromatographie des vo- lumes appropriés des solutions résultantes. Les chroma- togrammes indiquent que le substrat s'est converti en
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3 , 20-âicéto-llbéta, l6alpha, l7alpha, 21-tëtrahydroxy.-l '-. prégnadiène.
EXEMPLE 8
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Bréparation du 3,20-dicéto-llbgta,17alpha,21-trihydroxy- lj4¯prégnadiène.
On lave ,une culture de Nocardia leishmanii (ATCC 6655) sur soja à la trypticase et agar-agar, en tuba à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives obte- nue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une
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secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps,on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait. incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heu- res à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de substrat constitué par du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-
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trihydroxy-4¯prégnène dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On continue l'incubation, et on en retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heu- res.
On extrait chaque portion à quatre reprises,- chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone et on analyse un échantillon approprié par la technique des bandes de papier décrite ci-dessus. Les chromatogrammes sur bande de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-
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llbta,l7alpha,21-trihydxoxyl'"-prégnadiène.
EXEMPLE 9 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,2l-dihydroxy-/ '-.pré- gnadiène.
On conduit une autre expérience d'une manière similaire à l'exemple 1, sauf que l'on remplace le 3,20-
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dicéto-llbta, l7alpha, 21-trihydroxy.. f'. prégnène par le 3,20-dicéto-llbta,21-dihydroxy-f'-prégnène, et que l'or- ganisme utilisé est le Nocardia sp. (ATCC 12483). Quand on essaie le produit obtenu, par des méthodes chromato- graphiques sur bandes de papier, il indique la présence
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du 3,20-dicéto-llbêta,21-dihydroxy-(1''-prégnadiène.
EXEMPLE 10 Préparation du 3,20..dicéto-l7alpha,21-dihydroy..l''..pré- gnadiène.
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On conduit la fermentation et l'identification du produit de la façon décrite à l'exemple 1, en utilisant le champignon Nocardia Corallina (ATCC 999) sauf que l'on utilise comme substrat le 3,20-dicéto-17alpha,21-dihydro-
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xy-4¯prégnèRe, et que le produit obtenu est le 3,20- di céto-l' alpha, 1-dihydroxyvl' '..prégnadiène .
EXEMPLE 11 Préparation du 3,20dicéto-llbêta,l7alpha,21-trihydroxy- A ' -prégnadiène .
On lave une culture de Nocardia caviae (ATCC 6Ô4Ô) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un fla- con Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heures, à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de sub- strat, constitué par du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-tri-
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hydroxy-4¯prégnêne, dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On continue l'incubation, et on retire des por- tions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7,23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises par 40 cm3 de chlorure de méthylène à chaque fois. On réunit les extraits et on évapore jusqu'à siccité sous vi- de. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone et on analy- se un échantillon approprié par les techniques à bandes .de papier décrites plus haut. La chromatographie sur bande de papier indique la présence du 3,20-dicéto-llbêta,
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l7alpha, 21-trihydroxy-1' '-prégnadi,ène
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TEMPLE 12
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Préparation du 3,2U-dicéto-llbta,16a1pha,l7alpha,21-té- trahydroxy-1 f-prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia caviae (ATCC 6848) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise des portions de 1 cm3 de la suspension de cellu- les végétatives obtenue pour inoculer des portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7, chaque portion dans un tube de secoueuse de 100 cm3. On agite les tubes sur une secoueuse rotative à 32 C pendant 40 heures, et au bout. de ce temps on ajoute, dans chaque tube, 2 mg de
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substrat constitué par du 3j20¯dicéto->llbêta,l6alpha, 17alpha,21-tétrahydroxy-/y-prégnène, dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On récolte les tubes au bout de 6, 24 et 72 heures supplémentaires d'incubation après l'ad- dition du substrat.
On extrait chacune des liqueurs fermentées à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur, et on concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite.
On reprend chaque résidu par 2 cm3 de pyridine, et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mé- langes sur un cône à vapeur pendant 10-15 minutes, puis on concentre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone, et on chromatographie des volumes appropriés des solutions résultantes. Les chromatogrammes montrent que le substrat s'est converti
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en 320-dicéto-llbtaJlbalpha,l7alpha,21-tétrahydroxy- /\"14-prégnadiène.
EXEMPLE 13 Préparation du 3,20-dicéto-l7alpha,21-dihydroxy-1,.- prégnadiène.
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On conduit une fermentation en utilisant le procédé et le mode dtidentification du produit décrits - à l'exemple 1, sauf que le champignon est le Nocardia sp..
(ATCC 12483), au lieu du Nocardia corallina, et que le
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substrat est le 3,20-d3céto-l'alpha,2ï-dihydroxy-,,,'-pré- gnène, au lieu du 3,20-dicéto-llbµta,17alpha,21-trihydro- xy-4¯prégnène.
EXEMPLE 14 Préparation du 3,20-dicéto-llalpha,l7alpha,21-trihydroxy'-
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/'\1,4--prégnadiène.
On conduit une expérience de fermentation en utilisant la méthode décrite à l'exemple 6, sauf que l'on
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utilise comme substrat le ,20-dicéto-llalpha=17a1pha, 21-trihydroxy-'-prégnène, au lieu du 20-dicétorllbêta l7alpha,21-trihydroxy.-'-prégnène. Le chromatogramme sur bande de papier indique la présence du 3,20-dicéto-llal- pha,17alpha,21-trihydroxy-A le4 -prégnadiène.
EXEMPLE 15 Préparation au 3,20-dicéto-llbêta,16alpha,17alpha,21-tê- trahydroxy- 34-prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia convoluta (ATCC 4275) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube.à essais, au moyen de 7 cm3 de solution saline stérile, et on utilise 1 cm3 de la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7, avant passage à l'autoclave (pH 6,75 après passage à l'autoclave), dans un tube de secoueuse de 100 cm3. On agite le tube sur une secoueuse alternati- ve pendant 16 heures à 32 C. On utilise des portions de 1 cm3 de la culture obtenue pour inoculer cinq portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans des tubes de se- coueuse de 100 cm3.
On fait incuber ces tubes sur une
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secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps, on ajoute dans,chaque tube 2 mg de sub- strat constitué par du 3,20-dicéto-llbêta,16alpha,17alpha,
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21-tétrahydroxy-'-prégnène dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On récolte les tubes après des temps d'incubation supplémentaire de 1/2, 2, 7, 24 et 72 heures.
On extrait chacune des liqueurs fermentées, à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur et on les concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite.
On reprend chaque résidu par 2 cm3 de pyridine, et on ajou- te 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mélanges sur un cône à vapeur pendant 10 à 15 minutes puis on con- centre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone, et pn chromatographie des vo- lumes appropriés de solutions obtenues. Les chromatogram- mes montrent que le substrat s'est converti en 3,20-dicé-
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to-llbêta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy.ül'-prégnadiê.. ne.
EXEMPLE 16
EMI20.3
Préparation du 3 ,20-dicéto-llbêija,17alpha,21-trihydroxy- l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia convoluta (ATCC 4275) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un fla- con Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon¯sur une se- coueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incu- ber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heures à
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32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de substrat
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constitué par du 3'20-dicéto-llbéta,l7alpha,21-trihydroxy- 4¯prégnène dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On continue l'incubation et on retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7,23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises avec 40 cm3 de chlorure de méthylène chaque fois. On réu- nit les extraits et on évapore jusqu'à siccité sous vide.
On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprié, par les techniques à bandes de pa- pier décrites plus haut. Les chromatogrammes sur bande de
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papier indiquent la présence du 3i20-dicéto-llbêta,17alpha, 21-trihydroxy.-l' '-prêgnadiène.
. EXEMPLE 17 Préparation du 3,20-dicéto-llalpha,17alpha,21-trihydroxy-
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Li.l,4¯prégnadiène.
On conduit une expérience similaire à l'exem- ple 14, sauf que l'on utilise le champignon Nocardia sp.
(ATCC 12483) dans la fermentation, au lieu du Nocardia co- rallina. Le produit obtenu, examiné par chromatographie sur bande de papier, est identique à celui de l'exemple ' 14.
EXEMPLE 18
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Préparation du 3,20¯dicéto-llbêta,l6alpha,17alphas21-tétra=- hydroxy-l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia corallina (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar en tube à essais, au moyen de 7 cm3 de solution saline stérile. On ajoute la suspension obtenue à 100 cm3 de bouillon de soja à la trypticase sans glycérol dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber le mélange avec agitation à 32 C pendant 40 heures. On ajoute dans chaque flacon 20 mg de
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3,20-dicéto-llbéta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy..Lf-prê- gnène dissous dans 2 cm3 d'éthanol. On fait alors incuber les flacons avec agitation à 32 C pendant 8 1/2 heures.
Un réunit le contenu des flacons,'ce qui donne une liquoue à pH 7,3. Après récolte, on réunit les liqueurs et on ex- trait de la façon usuelle, et on obtient 352 mg de cris- taux bruts. La cristallisation dans un mélange acétone- éther de pétrole donne 145 mg, à point de fusion de 216- 218 C. La recristallisation dans un mélange acétone-éther de pétrole élève le point de fusion à 229-231 C. Le spec- tre infra-rouge est identique à celui d'un échantillon
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authentique de 3,20-dicëto-llbéta,l6alpha,l7alpha,21-té- trahydroxy-l,4¯prégnadiène.
EXEMPLE 1S Préparation du 3,20-dicéto-llbêtà,17alpha,21-trihydroxy- 1'f-prêgnadiène.
On lave une culture de! Nocardia globerula (ATCC 9356) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile et on utilise la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un fla- con Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une se- coueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incu- ber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heures à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de substrat
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constitué par du 3,20-dicéto-llbê"ta,17alpha,21-trihydroxy- 4¯prégnène dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On continue l'incubation et on retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises,
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chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réu- nit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone et on ana- lyse un échantillon approprié par les techniques à bande de papier décrites plus haut. Les chromatogrammes sur bande de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-
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llbétal7alpha,21-trihyd-rox.y- '1''vp-rêgnadiène.
EXEJYjpLE 20 Préparation du 3,20-dicéto.llbta,l6alpha,lialpha,21-té-. trahydroxy-b 1,4 -prég-'
On lave une culture de Nocardia globerula (ATCC 9356) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile et on utilise des portions de 1 cm3 de la suspen- sion de cellules.végétatives obtenue pour inoculer des portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7, chaque portion dans un tube de secoueuse de 100 cm3. On agite les tubes sur une secoueuse rotative pendant 40 heures . 23 C, et au bout de ce temps on ajoute, dans cha- que tube, 2 mg de substrat constitué par du 3,20-dicéto-
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llbcta9:6alphayl7alpha'21-tëtrahydroxywprégnêne, dis- sous dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On récolte les tubes au bout de 6, 24 et 72 heures d'incubation supplé- mentaire après l'addition du substrat.
On extrait chacune des liqueurs fermentées, à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque.liqueur et on concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite. On reprend chaque résidu dans 2 cm3 de pyridine et on ajou- te 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mélanges sur un cône à vapeur pendant 10 à 15 minutes,puis on con- centre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone et on chromatographie des vo-
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lumes appropriés de solutions obtenues. Les chromatogram- mes montrent que le substrat s'est converti en 3,20-dicé-
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to-llbta,l6alpha,l'?alpha,21-tétrahydroxp-.1'-prégna- diène.
EXEMPLE 21
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Préparation du 3,20-dicétorllbéta,16a1pha,l'alpha,21-té- trahydroxy-l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia corallina (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 7 cm3 de solution saline stérile et on utilise la sus- pension résultante pour inoculer 100 cm3 de milieu stéri- le n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On incube le mélange avec agitation pendante 7 1/2 heures à 37 C.
On utilise des portions de 1 cm3 de cette culture pour inoculer des portions de 10 cm3 du milieu stérile dans des tubes de 100 cm3. On fait incuber les tubes à 32 C pendant 40 heures, et au bout de ce temps on ajoute dans
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chaque tube 2 mg de l6alpha,21-diabétate-3,20-dicéto- llbêta,l7alpha-.dihydroxy-,f-prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol. On fait alors incuber les tubes pendant 24 heures. On extrait à quatre reprises le contenu d'un tu- be (10 cm3), avec chaque fois 40 cm3 de chlorure de méthy- lène. On réunit les extraits et on'concentre jusqu'à résidu sec sous pression. On reprend le résidu par 2 cm3 de pyridine et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ce mélange sur un cône à vapeur pendant 10-15 mi- nutes, puis on concentre jusqu'à résidu sec sous vide.
On dissout le résidu dans 2 cm3 d'acétone et on chromato- graphie un volume approprié de la solution obtenue. Le chromatogramme montre que le substrat s'est converti en
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3,20-dicéto-llbta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy-,(ln' prégnadiène.
EXEMPLE 22 Préparation du 3, 20-dicéto-llbêta, lôalpha, 17alpha,21-tê-
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trahydroxy-L it4-prégnadiène.
On conduit une expérience de fermentation com- me celle décrite à l'exemple 18, avec le Nocardia sp.
(ATCC 12483) au lieu du Nocardia corallina. Quand on es- saie le produit sur un chromatogramme sur bande de papier,
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on obtient du 3,20-dicéto-llbéta,l6alpha,l'(alpha,21-tétra- hYdroxy-l,4¯prégnadiène qui est identique au produit de l'exemple l.
EXEMPLE 23 Préparayion du 3,20-dicéto-llbêta,16alpha,17alpha,21-té-
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trahydroxY-Â 1,4 -prégnadi.ène.
On lave une culture de Nocardia polychromo- gènes (ATCC 3409) sur dextrose de pomme de terre et agar- agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution sali- ne stérile, et on utilise des portions de 1 cm3 de la sus- pension de cellules végétatives obtenue pour inoculer des portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7, chaque portion dans un tube de secoueuse de 100 cm3.' On agite les tubes sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures, et au bout de ce temps on ajoute dans chaque tube 2 mg de substrat constitué par du 3,20-dicé-
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to-llbéta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy-'-prégnadiène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On récolte les tubes au bout de 6,24 et 72 heures supplémentaires d'incubation après l'addition du substrat.
On extrait chacune des liqueurs fermenté es à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure du méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur et on concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite.
On reprend chaque résidu dans 2 cm3 de pyridine, et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mé- langes sur un cône à vapeur pendant 10-15 minutes, puis
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on concentre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout; chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone et on chromatographie des volumes appropriés des solutions résultantes. Les chromatogrammes montrent que le substrat s'est converti
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en 3,20-dicéto-llbêta,l6alpha,17alpha,21-tétrahydroxy- l,4¯prégnadiène.
EXEMPLE 24 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- 124-prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia polychromogè- nes (ATCC 3409) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile et on utilise la suspension de cellules végétatibes obte-' nue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On agite ce flacon sur une secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture résultante pour inoculer une autre portion de 100 cm3 du milieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On fait incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heu- res à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de
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substrat, constitué par du 3,20-dicéto-llbùta,17alpha, 21-trihydroxy-/'-prégnène, dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On continue l'incubation et on retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits et on évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprié par les techniques à ban- de de papier décrites ci-dessus. Les chromatogrammes sur bandes de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-
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llbéta,17a1pha, 21-trihydroxy-,(l' '-prégnadiène.
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EXEMPLE 25 Préparation du 3,20-dicéto-9alpha-fluoro-llbêta,l6alpha,
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lidlpha,21-tétrahpdroxy-, '.-prégnadi:ne.
On lave uhe culture de Nocardia corallina (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 7 cm3 d'une solution saline stérile et on utilise la suspension résultante pour inoculer 100 cm3 de milieu n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incu- ber ce mélange avec agitation à 37 C pendant 7 1/2 heures.
On utilise alors des portions de 1 cm3 de cette culture pour inoculer des portions de 10 cm3 du milieu stérile n 13 dans des tubes de fermentation de 100 cm3.On fait incuber les tubes inoculés pendant 40 heures Ó 32 C. Au bout de ce temps, on ajoute dans chaque tube 2 mg de
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3 , 20-dicéto-9alpha-f.uoro-llhéta, .balpha ,l7alpha., 21-té- trahydroxy-4¯prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol.
On fait incuber les tubes pendant 72 heures. Au bout de ce temps, on extrait à quatre reprises le contenu d'un tube, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène.
On réunit les extraits et on les concentre jusqu'à résidu sec sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 de pyridi- ne et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ce mélange sur un cône à vapeur pendant 10 à 15 minutes, puis on concentre jusqu'à résidu sec sous vide. On dis- sout le résidu dans 2 cm3 d'acétone, et on chromatogra-- phie un volume approprié de la solution obtenue. La chro- matographie donne des quantités importantes de 16,21-dia-
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céto-3,20-dicéto-9alpha-fluoro-llbêta,l6alpha,l7alpna-21- tétrahYdroxy-1,4¯prégnadiène. On voit ainsi que le 3,zo-dicétoa9alpha-.fluo-ra-llbéta.l6alpria,17a1hha, 21-étra hYdroxy-l,4¯prégnadiène s'est formé en quantités déca- lables pendant la fermentation.
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EXEMPLE 26
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Préparation du 1b,21-diacéto-3,20-dicéto9alpha-fluoro- llbêta-l6alpha,l7alpha,21-tstrahydroxy-.1'-.prégnadiène.
On utilise 7 cm3 de solution saline stérile pour laver une culture de Nocardia corallina (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar en tube à essais, et on utilise la suspension obtenue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On fait incuber le mélange pendant 8 heures à 37 C et on utilise des portions de 1 cm3 de cette culture pour inocu- ler des portions de 100 cm3 de milieu stérile dans 32 fla- cons de 500 cm3. On fait incuber ces flacons à 32 C pen- dant 40 heures, et au bout de ce temps on ajoute dans cha-
EMI28.2
que flacon 25 mg de 16,21-diacéto-3,20-dicéto-llbâta, lalpha,l7alpha,21-tétrahyaroxy-'-prégnène dissous dans 2,5 cm3 d'éthanol. On fait incuber les flacons pendant 53 heures. On réunit le contenu des flacons, et on ajou- te un volume égal d'acétone. On filtre la solution sur de la terre d'infusoires et on évapore l'acétone sous pression réduite. On sature de sel la phase aqueuse et on l'extrait à cinq reprises par des portions de 500 cm3 de n-butanol. On évapore l'extrait butanolique sous pres- sion réduite jusqu'à siccité.
On délaie le résidu avec environ 1 litre d'acétone bouillante pour séparer le rési- du organique d'avec les sels inorganiques, puis on filtre sur de la terre d'infusoires. On évapore l'acétone et on dissout le résidu dans la pyridine, puis on acétyle par l'anhydride acétique (à température ambiante pendant une nuit). On ajoute du méthanol et on évapore la solution sous pression réduite jusqu'à siccité (poids 1,17 g).. La chromatographie de partage (système solvant * 3 parties d'acétate d'éthyle, 2 parties d'éther de pétrole à 90- 100 C, 3 parties de méthanol et 2 parties d'eau) donne
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0,50 g de produit brut désiré qui est le 16,21-diacéto-
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3 , 2Wdicéto9a3.phafluoro-llbta, l6alpha, l."Iaâpha s 21--tétra- hydroxy-1,4¯prégnadiène.
Quand on cristallise le résidu dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole, on ob- tient 341 mg, point de fusion 153-233 C avec ramollisse- ment préalable. La large gamme de point de fusion résulte probablement de la solvatation.
EXEMPLE 2?
EMI29.2
Préparation du 3 ,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- ,14-prégnadiènea
On lave une culture de Nocardia sylvodifera (ATCC 7372) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile et on utilise la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un fla- con Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On fait incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heu- res à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de
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substrat constitué par du 3,2Q.-dicëi;o-l2bwta,l alpha , 21- trihydroxy-L-4prégnène, dissous dans 2 cm3 déthanol aqueux à 70%. On continue l'incubation et on en retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heu- res.
On extrait chaque portion à quatre reprises par 40 cm3 de chlorure de méthylène chaque fois. On réu- p-t les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cni3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprié par les techniques à ban- de de papier décrite plus haut. Les chromatogrammes sur
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bande de papier indiquent la présence de 3 ,20-dicéto-llbê- ta,l7alpha,21-trihydroxy-"l'-prégnadiène.
EXEMPLE 28 Préparation du 3$20-dicéto-galpha-fluoro-llbeta,16alpha, 17a1pha,21-tétrahydroxy.- ''-prégnadiène.
Dans une autre expérience de fermentation uti- lisant les conditions de l'exemple 1, avec le champignon Nocardia sp. (ATCC 12483) au lieu du champignon nocardia
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corallina, et avec le 3,20-dicéto-9alpha-fluoro-llbgta, l6alpha,17alpha,21-tétrahydroxy-'-prégnène au lieu du 3t20-dicéto-llbêta,l7alpha,21-trihydroxy-,'-prégnène le chromatogramme sur bande de papier indique la présence du 3,20-dicéto-galpha-fluoro-llbêta,lbalpha'l7alpha,21-tétra hydroXy-L11,4¯prégnadiène.
EXEMPLE 29 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- '
EMI30.3
1,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia astéroïdes, souche isolée A-3163 (ATCC 3308) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilisel 1 cm3 de la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans. un tube de secoueuse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce temps, on ajoute 2 mg de 3,20-di-
EMI30.4
céto-llbêta,l7alpha,21-trihydroxy..,j'-prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol, et on continue la fermentation.
Quand on dose, par les méthodes à bande de papier décri- tes précédemment, des échantillons prélevés au bout de 2 à 24 heures sur la nouvelle fermentation, on constate la
EMI30.5
présence du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- l,4¯pradiène.
<Desc/Clms Page number 31>
EXEMPLE 30
EMI31.1
Préparation du 3,20dicéto-11'aétG.,l6alpha,¯7alpha,21-té- trahydroxy.- -prégnadiène.
On lave une culture de Nocarfia asteroides (ATCC 3308) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline sté- rile, et on utilise des portions de 1 cm3 de la suspension de cellules végétatives résultante pour inoculer des por- tions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7, chaque portion dans un tube de secoueuse de 100 cm3. On agite les tubes sur une secoueuse alternative à 32 C pen- dant 40 heures, et au bout de ce temps, on ajoute dans chaque tube 2 mg de.substrat constitué par du 3,20-dicéto-
EMI31.2
ll.béta,16ü1pha,,'alpha,21-tétrGhydroxy--'-prégnène dis- sous dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70% On récolte les tubes au bout de 6, 24 et 72 heures supplémentaires d'in- cubation après l'addition du substrat.
On extrait chacune des liqueurs fermentées à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur et on concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite. On reprend chaque résidu par 2 cm3 de pyridine, et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mélanges sur un cône à vapeur pendant 10-15 minutes, puis on con- centre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone, et on chromatographie des volumes appropriés des solutions résultantes. Les chro- matogrammes montrent que le substrat s'est converti en
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3,20-dicéto-llbèta,l6alpha,a7alpha,21-tétrahydroxy-1'"- prégnadiène.
EXEMPLE 31
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Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21¯trihydroxy- l,4...prégnadiène..
<Desc/Clms Page number 32>
On lave une culture de Nocardia astéroïdes, souche isolée n E-20(ATCC 3308) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilise 1 cm3 de la suspension résultante pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans un tube de secoueuse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce
EMI32.1
temps, on ajoute 2 mg de 3,20-dicéto-llbéta,l7alpha-2ltri- hYdroxy-4¯prégnène, dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol, et on continue la fermentation. Quand on titre, par les mé- thodes à bande de papier décrites plus haut, des échantil- lons prélevés au bout de. 2-24 heures de nouvelle fermenta-
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tion,on constate la-présence de',20-dicéto-llbêta,17alpha, 21-trihydroxy 1'a'-prégnadiène.' EXEMPLE 32 Préparation du 3,2U-dicéto-llba,l'alpha,21-.trihydroxy- 41)4-prégnadiène.
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ,
On lave une culture de Nocardia farcinica (ATCC 3318) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de\cellules végétatives obte- nue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 50 cm3. On agite le flacon sur une secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture résultante pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heu- res à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de
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substrat, constitué par du 3,20-dicéto-llbêta,17alPha$21- trihydroxy-4¯prégnène, dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On continue l'incubation, et on en retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, , 23 et 72 heures
<Desc/Clms Page number 33>
On extrait chaque portion à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réu- nit les extraits et on les évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprié par les techniques à ban- de de papier décrites plus haut. Les chromatogrammes sur bande de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-
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llbèta,l7alpha,21-trihydroxy-1''-prégnadiêne.
EXEMPLE 33 Préparation du 3,20-dicéto-llbéta,l.7.lpha,2l-trihydroxy- /\ ' -prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia erthropolis, souche isolée A-ÔÔ45' (ATCC 4277) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilise 1 cm3 de la suspension résultante pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans un tube de secoueuse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce
EMI33.2
temps, on ajoute 2 mg de 3,20-dicéto-llbéta,17alpha,21- trihYdroxy-4¯prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol, et on continue la fermentation. Quand on titre,par les méthodes.à bande de papier décrites plus haut, des échan- tillons prélevés au bout de 2-24 heures de nouvelle fer-
EMI33.3
mentation, on constate la présence de 3,20-dicéto-llbgta, l7alpha, 21-.trihydroxy- jl' '-prégnadiène .
EXEMPLE 34 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia blackwelii (ATCC 6846) sur soja à la prypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives obte--
<Desc/Clms Page number 34>
nue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de pilieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On incu- be ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heures à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de substrat,
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constitué par du 3,20-dicéto-llbêta,l7alpha,21-trihydroxy- /\ -prégnène dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 701o.
On continue l'incubation et on retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réu- nit les extraits et on évapore jusqu'à siccité sous vide.
On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprié par les techniques à bande de papier décrites plus haut. Les chromatogrammes sur bande de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-llbêta,
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1?alpha, 21-trihydroxy-l''-prégnadiène .
EXEMPLE 35 'Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy-
EMI34.3
1,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia transvalensis, souche isolée E-42 (ATCC 12485) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilise 1 cm3 de la suspension résultante pour inocu- ler 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans un tube de secou- euse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une se- coueuse alternative à 32 C pendant 40 heures. Au bout de
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ce temps, on ajoute 2 mg de 3,20-dicéto-llb8ta,17-alpha, 21-trihydroxy-, -pregnene dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol
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et on continue la fermentation. Quand on titre, par les méthodes à bande de papier décrites plus haut, des échan- tillons prélevés après 2 à 24 heures de la nouvelle fermer'
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tation, on constate la présence de 3,20-dicéto-llb8ta) l7alpha, 21-trihydrdxy-al''-prégnadiène .
EXEMPLE 36 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,16alpha,17alpha,21-té- trahYdroxy¯l,4¯prégn8diène.
On lave une culture de Nocardia cuniculi (ATCC 6864) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais, au moyen de 7 cm3 de solution saline stérile, et on utilise 1 cm3 de la suspension de cellules végétatives résultante pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7 avant passage à l'autoclave (pH 6,75 après passage à l'autoclave), dans un tube de secoueuse de 100 cm3. On agite le tube sur une secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C. On utilise des portions de 1 cm3 de la culture obtenue pour inoculer cinq portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans des tubes de secoueuse de 100 cm3.
On fait incuber ces tubes sur la secoueuse alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute dans chaque tube 2 mg
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de substrat, constitué pat du 3,20-dicéto-llbâta,16alpha, 17alpha,21-tétrahydroxy-/\"-prégnène dans 0,2 cm3 d'étha- nol aqueux à 70%. On récolte les tubes après de nouveaux temps d'incubation dé 1/2, 2, 7, 24 et 72 heures.
On extrait chacune des liqueurs fermentées à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur et on les concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite.
On reprend chaque résidu dans 2 cm3 de pyridine, et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mé- langes sur un cané à vapeur pendant 10-15 minutes puis on
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concentre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout chaque résidu dans 2 cm3 d'acétone, et on chromatographie des vo- lumes appropriés des solutions obtenues. Les chromato- grammes montrent que le substrat s'est converti en 3,20-
EMI36.1
dicéto-llbéta,lbalpha,l7alpha,21-tétrahydroxy 1''-prégna- diène.
EXEMPLE 37
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Préparation du 320-.dïcéto-llbéta,l'7alpha,21-trihydroxy. le4-prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia kerstolyticus, souche isolée E-43 (ATCC 12484) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilise 1 cm3 de la suspens'on obtenue pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans un tube de secoueuse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce
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temps, on ajoute 2 mg de 3,20-dicéto-llbéta, 17alpha, 21.-trihyàroxy-j'-prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'étha- nol, et on continue la fermentation. Quand on dose, par les méthodes à bande de papier décrites précédemment, des échantillons prélevés au bout de 2-24 heures de nouvelle fermentation, on constate la présence du 3,20-dicéto-
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lliéta,17 alpha , 21-trihydroxy-19 *-prégnad,ène .
EXEMPLE 38 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy-
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,4¯prégnadiène..
On lave une culture de Nocardia cuniculi (ATCC 6864) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives obterue pour inoculer 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une
<Desc/Clms Page number 37>
secoueuse alternative pendant 16 heures 4 32 C, ez sur bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour inoculer une autre portion de 100 cm3 de milieu sté- rile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heures à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de sub-
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strat constitué par du 3,20-dione-llbgta,17alpha.21-trihy- droxy-4¯prégnène, dissous dans 2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%.
On continue l'incubation, et on retire des portion de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3 de chlorure de méthylène. On réu- nit les extraits et on les évaporb jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone et on analyse un échantillon approprié par la technique à bande de papier décrite plus haut. Les,chromatogrammes sur ban- de de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-llbêta,
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l7alpha,21-trihydroxy-1*-prégnadiène.
EXEMPLE 39 Préparation du 320-dïcéto-llbêta,l7 alpha,21-trihydroxy- A. ' -prégnadiène.
On lave une culture de Nocardie corallina, souche isolée n 13 (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilise 1 cm3 de la suspension résultante pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans un tube de secoueuse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une secoueuse alternative à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce temp on ajoute 2 mg de 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- #4-prégnène dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol et on continue la fermentation. Quand on dose, par les méthodes à bande de papier décrites plus haut, des échantillons prélevés au bout de 2-24 heures de nouvelle fermentation, on consta-
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te la présence du 3j20-âicéto-llbêta¯17alpha,21-trihydroxy- ' -prégnadiène.
EXEMPLE 40
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Préparation du 3'20-dicéto-llbéta,l'Ïalpha,21¯trihydroxy- Lil,4.prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia opaca (ATCC 4276) sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à es- sais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer 100 cra3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On agite le flacon sur une secoueu-. se alternative pendant 16 heures à 32 C, et au bout de ce temps on utilise 2 cm3 de la culture obtenue pour ino- culer une autre portion de 100 cm3 de milieu stérile n 13 dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On fait incuber ce dernier flacon avec agitation pendant 24 heures à 32 C, et au bout de ce temps on ajoute 20 mg de substrat, con- stitué par du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-trihydroxy- #4-prégnène dissous dans 2 cm3 dtéthanol aqueux à 70%.
On continue l'intubation, et on en retire des portions de 10 cm3 au bout de 2, 4, 7, 23 et 72 heures.
On extrait chaque portion à quatre reprises par 40 cm3 de chlorure de méthylène chaque fois. On réunit les extraits et on évapore jusqu'à siccité sous vide. On reprend le résidu par 2 cm3 d'acétone, et on analyse un échantillon approprie par les techniques à bande de pa- pier décrites ci-dessus. Les chromatogrammes sur bande
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de papier indiquent la présence du 3,20-dicéto-llbgta, l7alpha, 21-tr ihydroxy..l' '¯prégnadiène .
EXEMPLE 41 Préparation du 3,20-dicéto-Ilbêta,17alpha,21-trihydroxy- l,4¯prégadiène..
On lave une culture de Nocardia corallina,
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souche isolée 228 (ATCC 4273) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen de 6 cm3 de solution saline stérile.
On utilise 1 cm3 de suspension obtenue pour inoculer 10 cm3 de milieu stérile n 13 dans un tube de secoueuse de 100 cm3, et on fait incuber le tube sur une secoueuse alterna- tive à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce temps, on
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ajoute 2 mg de 3,20-dicéto-llbgta,17alpha-21-trihydroxy- #4-prégnène, dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol, et on conti- nue la fermentation. Quand on dose, par les méthodes à bande de papier décrites plus haut, des échantillons préle- vés au bout de 2-24 heures de fermentation supplémentaire on constate la présence du 3,20-dicéto-llbêta,17alpha,21-'
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trihydroxy-A,le4-prégnadiène.
EXEMPLE 42 Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,l6alpha,17alpha,21-tétra- hydroxy-l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia sylvodifera (ATCC 4919) sur dextrose de pomme de terre et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, et on utilise des portions de 1 cm3 de la suspen- sion de cellules végétatives obtenue pour inoculer des portions de 10 cm3 de milieu stérile n 13 ajusté à pH 7, chaque portion dans un tube de secoueuse de 100 cm3. On
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agite les tubes sur une secoueuseàlternative à 32 C pen- dant 40 heures, et au bout de ce temps, on ajoute dans cha- que tube 2 mg de substrat constitué par du 3,20-dicéto-
EMI39.4
llbgta,lb alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy-*-prégnène dis- sous dans 0,2 cm3 d'éthanol aqueux à 70%. On récolte les tubes au bout de 6, 24 et 72 heures supplémentaires d'in- cubation après l'addition du substrat.
On extrait chacune des liqueurs fermentées à quatre reprises, chaque fois avec 40 cm3/de chlorure de méthylène. On réunit les extraits de chaque liqueur et on
<Desc/Clms Page number 40>
les concentre jusqu'à résidu sec sous pression réduite.
On reprend chaque résidu dans 2 cm3 de pyridine, et on ajoute 0,5 cm3 d'anhydride acétique. On chauffe ces mé- langes sur un cône à vapeur pendant 10-15 minutes, puis on concentre jusqu'à résidu sec sous vide. On dissout cha- que résidu dans 2 cm3 d'acétone et on chromatographie des volumes appropriés des solutions obtenues. Les chromato- grammes montrent que le substrat s'est converti en 3,20-
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dicéto-llbéta-lbalpha'.7alphü,21-tétrahydroxy-fl'.-pré- . gnadiène.
EXEMPLE 43
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Préparation du 3,20-dicéto-llbêta,lôalpha,17alpha,21-té- trahYdrQxy¯l,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Nocardia corallina (ATCC 999) sur extrait de levure et agar-agar, au moyen d'une solution saline stérile. On utilise la suspension de cellules végétatives obtenue pour inoculer un flacon
Erlenmeyer de 500 cm3 contenant 100 cm3 de milieu stéri- le n 13. On place ce flacon sur une secoueuse alternati- ve à 37 C pendant 7 1/2 heures. On utilise 1 cm3 de la culture obtenue pour inoculer chacun des cinq tubes de secoueuse de 100 cm3 contenant 10 cm3 de milieu stérile n 13., On fait incuber les tubes sur une secoueuse alter- native à 32 C pendant 40 heures, et au bout ce ce temps,
EMI40.3
on ajoute dans chaque tube mg de I6,21-diacéto-3j20-dicê¯ to,llbéta,lô.alpha,l7r.pha,2l.-têtrahydroxy- -.prégtènps dissous dans 0,2 cm3 d'éthanol.
On récolte les tubes après 2,7 1/2, 24, 48 et 72 heures de plu s. Les titrages, sur bande de paoier, des liqueure de fermentation extrai- tes indiquent qu'une quantité appréciable de la matière
EMI40.4
première s'est transformée en 3,20-dicéto-llbµta,l6alpha, 1.'ala-2ltêtrahydroxyw'!'-prégnadi.ène.
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EXEMPLE 44
EMI41.1
Préparation du 3,20-dicéto-llbgta,16alpha,17alpha,21-té- trahYdroxy1,4¯prégnadiène.
On lave une culture de Corynebacterium simplex sur soja à la trypticase et agar-agar en tube à essais, au moyen de 5 cm3 d'eau stérile, et on utilise la suspen- sion de cellules obtenue pour inoculer 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase dans-un flacon Erlenmeyer de 500 cm3. On fait incuber ce mélange avec agitation à 37 C pendant.8 heures. On prend 25 flacons Erlenmeyer de 500 cm3, contenant chacun 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase, sans glycérol, et on les inocule chacune avec 1 cm3 de l'inoculum vieux de 8 heures. On fait incuber ces flacons à 32 C pendant 40 heures. Au bout de ce temps, on ajoute dans chaque flacon 40 mg de
EMI41.2
3,20-dicéto-llbêta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy-'- prégnène dissous dans 4 cm3 d'éthanol, et on continue la fermentation pendant 8 heures à 32 C.
On réunit le con- tenu des vingt-cinq flacons, et on obtient une liqueur à pH 8,1.
On réunit les liqueurs après récolte, on ex- trait une fois avec 3 litres de chlorure de méthylène et trois fois avec deux litres chaque fois de chlorure de méthylène. On lave une fois l'extrait réuni avec une so- lution saline saturée, et on évapore jusqu'à siccité sous pression réduite. On obtient 509 mg de résidu huileux, on le dissout dans 1,5 cm3 de la phase stationnaire du système, 3 parties d'acétate d'éthyle, 2 parties d'éther de pétrole (90-100 C), 3 parties de méthanol, 2 parties d'eau, et on mélange avec 3 g de terre d'infusoires.' On entasse alors cette terre d'infusoires imprégnée en haut d'une colonne de verre de 1,5 x 35 cm contenant 25 g de terre d'infusoires imprégnée de 12,5 cm3 de la phase sta- tionnaire du système ci-dessus.
On élue le composé dési-
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ré avec la phase mobile du système ci-dessus, et on obtient 207 g de solide brut. On cristallise celui-ci:dans un mé- lange d'acétone et d'éther de pétrole(60-7000) pour obte- . nir 56 mg de produit à point de fusion de 195-200 C (bloc Kofler). La recristallisation dans le même couple de sol- vants élève le point de fusion à 202-205 C (bloc); point de fusion (par méthode capillaire) 229-231 C. Spectre ultra-violet :
EMI42.1
A max. 241 m /"# ( r 14 500). Spectre :infra-rouge: Max 34l2, 1718e 1667, 1622, 1612 (palier), 1098, 1072 cm"1.
Analyse : Calculée pour G2lH2,0 (375,.t.j ë CB¯ 67.00%:
21-28 H= 7,50% Effective :c- 66,80%;
H-7,62%.
Les propriétés physiques et chimiques du com-
EMI42.2
posé sont celles du 320-dicéto-<llbêta,l6alpha;17alpha 21-tétrahydroxy-,1 "-prégnadiène .
EXEMPLE 45 Préparation du 3920-dicétollbéta,lbalphaal7alpha,2lté trahydroxy-als4-pré,-nadiène.
On réunit les liqueurs provenant dfune fermen- tation comme celle décrite à l'exemple 1, ci-dessus, après récolte, et on extrait par 7 portions de 2 litres de chlo- rure de méthylène, et on évapore les extraits réunis jus- qu'à siccité sous pression réduite. On obtient 1,585 g d'un semi-solide brut que l'on chromatographie. On réunit les fractions contenant le composé désiré, et on les évapo- re jusqu'à siccité pour donner 601 mg de résidu cristal- lin. La cristallisation dans l'acétone et l'éther de pé- trole donne 278 mg de produit à point de fusion de 229- 231 C. La recristallisation dans le même couple de sol- vants élève le point de fusion à 231 - 2320 C.[d ] D24
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+ 77 C (méthanol).
Spectre ultra-violet
EMI43.1
À 1 éthanol 241-242 mp ( (- 14. 800). Spectre infra-rouge: Max . 3436, l715, 1664, 162le 1603e 1129, 1063 cm-la Analyse: Calculée pour C21H2$06(376,1.) ; C=67,00%; Bzz,5%; Effective C=66,82%; H=7,27.
Le produit est identique à un échantillon de
EMI43.2
3 , 20-dicéto-llbéta, l6alpha,1'7alpha, 21-tétrahydrocy-Ol '- prégnadiène obtenu comme dans 'l'exemple 1.
EXEMPLE 46
EMI43.3
16,21-diacéto-20-dicéto--llbéta,l,6alpha,l7alpha,21-tétra..
########################################## hYdroxy-1,4¯prégnadiène.
On laisse reposer une nuit, à la température ambiante, un mélange de 100 mg de 3,20-dicéto-llbêta,
EMI43.4
l6alpha,l'7alpha-21-tétrahydroxy-,l''-prgnadiène dans 10 cm3 de pyridine contenant 2 cm3 d'anhydride ecétique, après quoi on évapore la solution jusqu'à siccité sous pression réduite. On cristallise le résidu solide dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole (90-100 C), et on obtient 105 mg (86%) de l6,21-diacéto-3,20-dicé-
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to-llbêta,16alpha,17alpha,21-tétrahydroxy-/\ 1,4-pr6gnadiù- ne, à point de fusion de 147-1500C. La recristallisation dans le même couple de solvants élève le point de fusion à 161-163 C. Spectre infra-rouge :
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Y KBr : 3456, 175S 1668, 1632, 1612 (palier) 1234, 1060 cm-1.
Spectre ultra-violet : \ max : 242 m/u éthanol ( 14 200) éthanol EXEMPLE 42
EMI43.7
Préparation du 16,21-diacëto-,20-..dxcéto-.9alpha-.fluaro.. llbèta,l6alpha,l7alpha,21-tû'trahydroxy- ''-prégnadiène.
On lave une culture sur agar-agar en tube à
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essais, au moyen de 5 cm3 de solution saline stérile, on obtient une suspension de spores de Ccrynebacterium sim- plex, que l'on ajoute à 100 cm3 de bouillon stérile de so- ja à la trypticase dans un flacon Erlenmeyer de 500 cm3.
On fait incuber le mélange à 32 C pendant 8 heures. On utilise 1 cm3 de cette culture pour inoculer chacun des dix flacons contenant chacun 100 cm3 de bouillon stérile de soja à la trypticase. On fait incuber les dix flacons avec agitation à 32 C pendant 16 heures. On ajoute dans
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chaque flacon 20 mg de l6,21-diacétob3,20-dicéto-9alpha- fl.uoro-llbéta al6alpha l'alph.a, 21.--tétrah ydroxy-d-prégnêr ne, dissous dans 2 cm3 d'éthanol, et on réunit le contenu des flacons. On extrait la solution global lusieurs reprises par un grand volume de chlorure de méthylène, on lave avec une solution saline saturée, et on évapore sous pression réduite.
On dissout le résidu dans le mé- thanol, on traite par le charbon activé, on filtre sur de la terre d'infusoires, et on évapore à nouveau pour don- ner 277 mg d'huile, qu'on acétyle pendant une nuit. La chromatographie, sur bande de papier indique des quantités approximativement égales de substrat et d'un produit plus
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polaira16,21-diaaéto-3,20-dicéto9a3.phafluorollbta l6alpha,17alpha,21-tétrahydroxy-l,4¯prègnadiène), ainsi que de très petites quantités de deux produit moins polai- res. Par chromatographie de partage de 0,25 g du résidu (colonne de terre d'infusoires) système : 2 parties d'acé- tate d'éthyle, 3 parties d'éther de pétrole (90-100 C), 3 parties de méthanol et 2 parties d'eau), on sépare les produits moins polaires et le substrat.
Le produit dési- ré, à polarité maxima, reste sur la colonne et on l'élue avec '500 cm3 de méthanol. On prend le résidu (90 mg) obtenu par évaporation du méthanol, t on le répartit à nouveau sur de la terre d'infusoires (système : 3 parties
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d'acétate d'éthyle, 2 parties d'éther de pétrole (90-100 C), 3 parties de méthanol et 2 parties d'eau), et on éva- pore sous pression réduite la fraction contenant le pro- duit désiré (déterminé par spectre d'absorption d'ultra- violet), pour donner 1$ mg de solide.
La cristallisation dans un mélange acétone-éther de pétrole donne 13 mg d'aiguilles incolores de 16,21-diacéto-3,20-dicéto-9alpha-
EMI45.1
fluoro-llbêta,lôalpha-l7alpha,21-tétrahydroxy-U,1'-pré- gnadmène; point de fusion (bloc K/Fler) :;environ 150-240 C, avec perte apparente de solvant à 150 C. La recristalli- sation dans l'acétone et l'éther de pétrole ne change pas le point de fusion. Spectre ultra-violet :
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Max. mu ( 15 200); spectre dans l'acide ale.abs.' 239 miu ( (¯ 20?); spectre dans l'acide sulfurique : /\ ma** 26l, 30$i 387 mil.
On prépare le H2SO4 2,4-bis-dinitrophénylhydrazone du,composé ci-dessus, et on
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détermine son spectre d'absorption''d'ultra-violet : A max. 258) 300 (inflexion), 312 (inflexion), et 400 m/u.
EXEMPLE 48
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3,20-dicéto-9alpha-fluoro-llbêta,l6alpha,17alpha,21-té- trahydroxy-1,4¯prégnadiène.
On dissout 100 mg de 16,21-diacéto-3,20-dicéto 9alpha-fluoro-llbéta,l6alpha,l7alpha,21-tétrahydroxy-1'. prégnadiène dans 10 cm3 de méthanol et on refroidit à 0 C.
Après balayage à l'azote, on ajoute, à la solution de stéroide, une solution de 35 mg de potasse dans 2 cm3 de méthanol .
On laisse reposer 1 heure à la température ambiante) puis on neutralise la solution, et l'on éva l'acide acétique glacial sous atmosphère d'azote jusqu-:
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obtention d'un solide blanc. On ajoute de l'eau, et après refroidissement on filtre le produit et on le lave à l'eau
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pour obtenir 52 mg de 3,20-diceto-,9alpha-fl.iioro-llbêta, l6alpha,l7alph,2ltétra.ydrox5r-,,1''prégnadi.ëne, point de fusion 246-249 C. Trois cristallisations dans le mé- lange acétone-éther de pétrole donnent 29 mg de tétrol, point de fusion 260-262,5 Analyse :
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Calculé pour CZIH2706F : c= 63,94; H= 6,90%; F- 4,82%; Effective C= 6., 19; H= 717%; F= 4,90
REVENDICATIONS 1.
Nouveaux stéroides de la série du #1,4-prégna- diène ayant la formule générale suivante :
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dans laquelle X est un atome d'hydfogène ou d'halogène, Y est un groupe méthylène, hydrcxyméthylène ou carbonyle,
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Z est un groupe méthylène, hydroxyméthylène ou alkyloxy- méthylène inférieur, R' est un atome d'hydrogène ou un
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groupe hydroxyle et R est un atome ü s n frûr: ;c ou un
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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The present invention relates to the preparation of novel steroids of the du series. # 1,4-pregnadiene.
Recently, a number of steroids of the pregnene and pregnadiene series, such as hydrocortisone and 1-dehydro-hydrocortisone have become important therapeutic agents and have become useful as intermediates for the preparation of other sterols. useful in therapy. The novel # 1,4-pregnadienes contemplated according to the invention are useful as anti-inflammatory agents in the treatment of arthritis, asthma, burns, bursitis, etc., and also in the treatment of skin conditions and collagen diseases.
These compounds are used in combination with fillers, excipients, etc., in tablets, powders, pills, etc.,. They can also be used parenterally, in solution or in suspension.
According to the invention, the new # 1,4-pregnadienes are prepared by subjecting a # 4-pregnene to enymatic fermentation using fungi of the genus Nocardia, or the fungus Corynebacterium simplex.
The process of the present invention can be illustrated by the following schematic equation, wherein the general formula I represents # 4-prengene, and; general formula II represents # 1,4-pregnanadiene obtained:
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in these formulas, X is a hydrogen or halogen atom, Y is. a methylene, hydroxymethylene or carbonyl group, Z is a methylene, hydroxymethylene or lower alkyl-methylene group, R 'is a hydrogen atom or a hydroxyl group, and R is a hydrogen atom or a lower alkyl group. In certain preferred compounds, X represents fluorine, Y represents CHOH, Z represents CHOR ", R 'represents OH, R and R" are hydrogen atoms or alkyl radicals.
In carrying out the process of the present invention, a fungus of the genus Nocardia is cultivated under aerobic conditions, in a suitable nutrient medium containing a # 4-steroid of the pregnene series (Bergey, Manual, 6th edition). ), such as corallina, ATCC 999 and ATCC 4273, (Culture Lederle # 13);
asteroides, ATCC 3308, keratolyticus, ATCC 12484, transvalensis, ATCC 12485, erythropolis, ATCC 4277, convoluta, ATCC 4275, gardneri, ATCC 9604, leishmanii, ATCC 6855, opaca ATCC 4276, 'the blackwelii., ATCC 6846, the caviae, ATCC 6848, the cuniculi, ATCC 6864, the globerula, ATCC 9356, the polychromogenes, ATCC 3409, the sylvodifera, ATCC 7372, the far- cinica, ATCC 3318, the sylvodifera ATCC 4919, or another species of Nocardia,
or the fungus Corynebacterium
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simplex. During the growth of the organism under favorable conditions, two hydrogen atoms are eliminated from the steroid nucleus A, and thus a double bond is obtained in position 1,2. The exact mechanism of this dehydrogenation is obscure, but it is the result of enzymes produced by the body in the process of growth. A suitable nutrient medium contains a soluble source of carbon, nitrogen, and mineral elements.
Sources of carbon include sugars, such as glucose, sacchacrose, maltose, dextrose, xylose and galactose, and also alcohols such as glycerol or mannitol; corn starch; organic acids such as citric acid, malic acid and acetic acid; and various natural products) containing carbohydrates, such as corn maceration liquor, soybean meal, cottonseed meal, and many other materials that can be found and have been used previously as a source of carbon in fermentation processes. Generally, different bodies of the above can be used in the medium with good results.
Suitable sources of nitrogen include some of the above materials, such as corn maceration liquor, soybean meal, cottonseed meal, etc., and various other substances, such as. beef extract, casein, yeast, enzyme digested proteins, and degradation products, including peptones, amino acids and many other available protein materials which are likely to support the growth of fungi.
Inorganic sources of nitrogen, including urea, ammonium salts, nitrates, etc., can be used in miMeu as a source of assimilable nitrogen for
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provide a favorable growth medium for the organism.
The mineral elements required for fermentation are usually found in the raw materials which are often used as sources of carbon and nitrogen, or in the water used in the process. However, it is generally advisable to add additional amounts of mineral elements to those normally present, in order to obtain maximum growth of Nocardis. It is advantageous to add cations and anions including sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphate, sulfate, chloride, cobalt, manganese, and the like. The use of trace elements such as boron, copper, cobalt, molybdenum and chromium is often desirable.
The growth of the fungus Nocardia or the fungus Corynebacterium simplex takes place in an aerobic medium, and aeration can be carried out, in flasks for example, by shaking on an alternative or rotary shaker, or in bottles or vats by sending pressurized sterile air through the fermentation mixture. It is desirable to blow sterile air through the medium at a rate of 1/3 to 2 volumes of air per volume of medium per minute. Agitation in the bottles or in the fermentation tanks is provided by a mechanical agitator. The Nocardia fungus can grow at temperatures of 5 to 45 C, but it is preferable to run the process at temperatures of 25 to 37 C.
Corynebacterium simplex can grow at temperatures of 10 to 45 C, but it is preferably used at 25 to 38 C.
To prepare inocula, 1.0 cm3 of washed vegetative cell suspension of fungi of the genus Nocardia or Corynebacterium simplex is used to inoculate 100 cm3 of sterile soybean broth with trypti-
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case, in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. Trypticase Soy Broth contains 3% tryptic soy protein digest, as a dehydrated powder (Baltimore Bacteriological Laboratories), 5% glycerin and 8% beef extract (Armor), and this mixture is sterilized for 15 minutes at a temperature of 120 ° C. (vapor pressure of 675 kg). After sterilization, the pH is between 7.4 and 7.7.
After inoculating the vial, it is incubated at 37 ° C, on a shaker, for about 4 to 8 hours. These inocula can be used to inoculate large amounts of sterile bottled medium, and these bottle cultures, after fermentation, can be used to inoculate large amounts of medium into fermentation tanks.
Instead of the trypticase soy broth mentioned above, other media can be used, as shown in the examples below.
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The 4-steroids of the pregnene series which can be used in the process of the present invention are in particular 3,20-diketo-llbeta, 17 alpha, 21-tri-
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4-hydroxypregnene (hydrocortisone), 3,20-diketo-llbeta, 21-dihydroxy - '. pregnene (corticosterone), 3,20-diketo-17 alpha, 21-.dihydraxy .., (' 'pregnene (Reichstein's substance S), 3,20-diketo-11 alpha, 17 alpha, 21-trihydroxy- '-. pregnen (11-epi-hydrocortisone), 3,20-diketo-11 beta, 16 alpha, 17 alpha, 21-tetrahydroxy- Z-2.- pregnene, 3, 2O-diketo-9alpha, fluor0-llbêtaji6alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy-4¯pregnene, 3,11,20-triketo-l6alpha,; l7alpha, 21-trihydroxy- L :::: .. 4..pregnene, 3,11,20-triketo-17alpha, 21-dihydroxy-4¯pregnene, and their esters etc.
When using the above steroid substrates in fermentation, the products formed are the
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sterolde's' free. These steroids are usually added to
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fermentation, in solution or in finely divided form. A preferred method is to dissolve the steroid in ethanol or other water miscible solvents, and add it to the fermentation medium, at the desired stage of the process. Although the steroid sometimes precipitates out of solution when added in this way, it disperses throughout the medium as a fine suspension and is readily available to the body for use. oxidation. The amount of steroid added to fermentation can vary widely, but is generally in the range of 1/10 to 1g per liter of medium.
During the fermentation process, it is sometimes desirable to add defoamers such as silicones, glyceridic oils, etc. These compounds are added from time to time, and in the desired amounts.
In the method of the present invention, 10 cc portions of medium inoculated in 100 cc shaker tubes are generally incubated for about 16 to 40 hours at a temperature of about 32 ° C. At the end of this time, 2 mg of sterile substrate (steroid # 4-pregnene) dissolved in 0.2 cm3 of ethanol is added to each tube, and fermentation is continued at about 32 ° C. allow fermentation to continue for a sufficiently long period of time to effect maximum conversion of # 4-pregnene to # 1,4-pregnadiene. This period can vary from 1 to 72 hours or more.
At the end of the fermentation process, the desired # 1,4-steroid of the pregnadiene series is recovered from the fermentation medium, using the following method which describes in particular a fermentation.
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tation on 10 cm3. This is a general method which is applicable for fermentations at various scales.
The contents of a fermentation tube are extracted four times with four volumes of methylene chloride. The four extracts were combined, then the resulting solution was washed once with a 2% aqueous solution of sodium bicarbonate saturated with sodium chloride, and then washed twice with a saturated solution of sodium chloride. After washing, the methylene chloride solution can be dried over anhydrous magnesium sulfate and filtered. The filtrate is concentrated in a water bath at atmospheric pressure, to a small volume, and the concentrate is transferred to a 10 cc volumetric flask, then made up to this volume with methylene chloride.
This solution is used to determine the steroid content, as shown below.
In large-scale fermentations, the crude product (s) from the fermentation liquor can be recovered by simple solvent extraction, using a suitable water-immiscible solvent such as chlorinated lower hydrocarbons, alcohols, esters, ketones, etc. The steroid products can be further purified and separated from the extracts by methods well known to those skilled in the art. Separation and purification of the steroid mixture often requires the use of chromatography.
The method employed to identify the sterols present in the fermentation liquor subjected to extraction and mentioned above is paper strip chromatography. The solvent system used is a water-methanol-benzene system, which is prepared by stirring approximately 50% water and 50% methanol with benzene,
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in a separatory funnel, then n allowing the two layers to separate. A portion of the lower layer is placed in an open crystallizer on the bottom of a large glass cylinder. The top layer is the solvent phase, and it serves to fill the trough-shaped cavity inside the cylinder.
We prepare a solution
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Steroid standard by dissolving 10 mgl; each of the following steroids in 10 cm3 of methylene chloride:
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3,20-diketo-llbta, 17alpha, 21-trihydroxy f-pregnene; , 20-diketo-llbta, 21-.dihydroxy .., '- pregnene.
3,20-diketo-17alpha, 21-dihydroxt-I-pregnen; 3,20-diketo-llalpha, 17alpha, 21-trihβdroxy -'-pregnene; 3,20-diketo-llbta, 16a1pha, 17alpha, 21-tirahydroxy-jj'-. pregnene;
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16,2-diaceto-3,20-diketo-11-beta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy-4¯prêgnene; 3,20-diketo-9alpha-fluoro-llbeta, 1 $ alpha, 17alpha, 21-tetra hydroxy - pregnene; \ (/ l6alpha, 21-diaceto-3, 20-diketo-9alpha-fluoro-llbeta, lôal-pha, l7alpha, 21-tetrahydraxy-f, '- pregnene; (Other steroids may be used in the standard solution when 'they are appropriate).
At least one current steroid solution is chromatographed simultaneously each time an unknown solution is tried. Apply exactly 0.025 cm3 of the standard test steroid solution to the paper strip at the start line 10 cm from the top end of the strip and fold over the strip. edge of the trough and which is immersed in the solvent phase contained inside. The strip is then developed for 2 to 4 hours at about 37 C. Likewise,
0.1 cm3 of the unknown solution on another strip, which is then folded in the same trough and developed
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simultaneously with the standard steroid band. The trough allows many bands to develop simultaneously.
After the paper strips have been properly developed, they are removed from the apparatus and air dried at about 37 C. After drying, the strips are sprayed with an alkaline solution of tetrazolium blue which shows. color at the points where steroids are present.
Developed color bands are aligned with at least one "standard" band and compared. The different steroids can be identified by their position on the strip.
The 2 \ '-steroids; desired will be more polar
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as the corresponding 4 "'steroids. It is further understood that the desired (' '' -steroids, once isolated and characterized, may themselves be used in a steroid standard solution in order to '' improve the process.
The specific examples which follow illustrate in detail the dehydrogenation of # 4-pteroids of the pregnene series to prepare the corresponding # -1,4-steroids of the pregnadiene series.
EJ # MPLE 1
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. Preparation of 3,20diketo-.llbeta-17alpha, l.-trihydroxy z \ le4¯pregnadiene.
A culture of Nocardia corallina (ATCC 999) is washed on yeast extract and agar-agar in a test tube, using 7 cm3 of sterile saline solution, and a suspension of vegetative cells is obtained which is used to inoculate 100 cm3 of sterile trypticase soy broth (described above), in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. The flask is incubated for 7 hours at 37 ° C. This inoculum is then used to inoculate sterile trypticase soy broth in 100 cc shaker tubes. We use 1 cm3
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diinoculum 'to inoculate each 10 cm3 portion of medium containing 2% molasses (Grandma), 1% beef extract (Difco, and 1% glucose in each 100 cm3 shaker tube. tubes at 32 C for 40 hours.
At this time, we add in each tu-
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be 2 mg of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy-ü'-pregnene dissolved in 0.2 cm3 of ethanol. The incubation is then continued for a further 24 hours.
The 10 cm3 of liquor is extracted four times from one of the above tubes, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue is taken up in 2 cm3 of acetone, and a suitable sample is analyzed by the paper strip techniques described above. The chromatogram on a strip of paper indicates
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the presence of 3,20-d.iketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy-1,4-prregnadiene. EXAMPLE 2 Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy-
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1.4 Pregnadiene.
A culture of Nocardia sp. (ATCC 12483) is washed on agar-agar in a back-to-back tube, using 5 cm3 of sterile saline solution. 2 cm3 of the suspension obtained are used to inoculate 100 cm3 of sterile trypticase soy broth in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. The mixture is incubated with shaking at 37 ° C for 8 hours, and the resulting culture is used to inoculate tubes containing sterile soybean broth into the trypticase. 1/2 cm3 of the 8 hour culture is used to inoculate 10 cm3 of medium in a 100 cm3 tube. The inoculated tubes are incubated at 32 ° C with shaking for 16 hours. In each tube, 2 mg of 21-aceto-
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3, 20-diketo-1.beta, 17alpha, 21-trihpdroxy -.'- pregnene
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dissolved in 0.2 cm3 of ethanol.
Tubes are incubated an additional 1 1/2 to 5 hours and harvested. Paper strip chromatography indicates that the substrate has converted
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in 3,20ddiketo-11b, -ta, 17alpha, 21-trihydroxy. ,, 1 * -pregnadiene. We can still observe, on the strips of paper, as time increases, the appearance of 3,20-diketo-llbê-
EMI11.2
ta, l7alpha, 21-trihydroxy.-'- pregnene, and that its amount increases at the expense of 21-aceto-3,20-di% to-11-beta. 17alphe, 21-trihydroxy-i-pregnene, followed by the appearance in a growing amount of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-tri-hydroxy-l, 4¯pregnadiene.
EXAMPLE 3 Preparation of 3,20-diketo-llbêt9,17alpha, 21-trihydroxy- ####################### j ########### ####### 1,4-Pregnadiene. '
A culture of Nocardia sp. (ATCC 12483) on trypticase soybean and agar-agar test tube, using 5 cm3 of sterile saline. Two 100 cm3 portions of trypticase soy broth are taken in 500 cm3 Erlenmeyer flasks, and one. each inoculate with 1 cm3 of this suspension. The vials were incubated on a reciprocating shaker for 7 hours at 32 ° C. This inoculum was then used to inoculate sterile trypticase soy broth in 100 cc shaker tubes. There are 96 tubes, each containing 10 cc of medium. These tubes are incubated for 23 1/2 hours at 32 ° C with shaking.
At the end of this time, 2 mg of 3,20-diketo is added to each tube.
EMI11.3
11beta, 17alpha, 21-trihydroxy - / \ 17-pregnene dissolved in 0.2 cc of methanol. The fermentation is then continued for 5 hours at 32 ° C. The contents of the tubes are combined, and the liquor obtained is extracted four times. each time with 500 cm3 of methylene chloride. The four extracts are combined and concentrated in vacuo until
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only to obtain an oily residue. This residue is dissolved in 2 cm3 of the stationary phase of the system; 3 parts of ethyl acetate, 2 parts of petroleum ether (90-10000), 3 parts of methanol and 2 parts of water.
We mix this. solution with 4 g of diatomaceous earth and the resulting mixture is piled on top of a chromatographic column measuring 2 x 39 in and comprising 50 g of diatomaceous earth, mixed with 25 cm3 of the stationary phase of the system previous. The column obtained is developed with the aid of a mobile phase, and the liquid which filters is collected in fractions. The appropriate fraction is concentrated to dryness under reduced pressure. The residue is dissolved in acetone, and the crude product is crystallized by adding petroleum ether (60-70 C). The yield is 27 mg of a product which melts at 192-205 C. This material is recrystallized from a mixture of acetone and petroleum ether to give a product which melts at
25 231-233 C and which measures [Ó] D- +103 (dioxane).
The infrared spectrum of this product is identical to that
EMI12.1
of an authentic sample of 3920-diketo-Ilbetael7alphas 21-trihydroxy- / '"-pregnadiene.
EXAMPLE 4 Preparation of 3,20-diketo-11beta, 17alpha, 21-trihydroxy-4-pregnadiene.
A culture of Nocardia gardneri (ATCC 9604) on soybean is washed with trypticase and agar-agsr, in a test tube, with 5 cm3 of sterile saline solution, and the suspension of vegetative cells thus obtained is used to inoculate. 100 cm3 of sterile medium containing 1% cerealose, 0.1% yeast extract, 0.25% sodium chloride, 0.4% beef extract (Difco) and 0.4% peptone, at pH 7 (medium 13) in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. The flask is shaken on an alternating shaker.
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It was kept for 16 hours at 32 ° C., and at the end of this time 2 cm3 of the culture obtained was used to inoculate a further 100 cm3 of sterile medium No. 13 in a 500 cm3 Erlenmeyer flask.
The latter flask is incubated, with shaking, for 24 hours at 32 ° C., and at
EMI13.1
At the end of this time, 20 mg of 3,20-diketo-llbeta, l7alpha, 21-trihydroxy -, '- pregnene dissolved in 2 cm3 of 70% aqueous ethanol are added. The incubation is continued, and 10 cc portions are removed after 2, 4, 7, 23 and 72 hours.
Each portion is extracted 4 times with 40 cm3 of methylene chloride each time. The extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo.
The residue is taken up in 2 cm3 of acetone and an appropriate sample is analyzed by the paper strip techniques described above. The chromatograms on a paper strip indicate the presence of 3,20-diketo-llbeta,
EMI13.2
alpha, 21-trihydroxy-a, *. pregnadiene. EXAMPLE 5 Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 16alpha, 17alpha, 21-te-,
EMI13.3
trahydroxy-, L \ 1,4¯pre-nadiene.
A culture of Nocardia gardneri (ATCC 9604) was washed on potato dextrose and agar-agar in a test tube, with 5 cm3 of sterile saline and 1 cm3 portions of the cell suspension were used. vegetatives obtained to inoculate 10 cm3 portions of sterile medium n 13 adjusted to pH 7, each portion being in a 100 cm3 shaker tube.
The tubes are shaken on an alternating shaker at 32 C for 40 hours, and at the end of this time, add to
EMI13.4
each tube 2 mg of 3,20-diketo-11bgta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy-'-pregnene, dissolved in 0.2 cm3 of 70% aqueous ethanol. The tubes are collected after 6, 24,
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72 hours of additional incubation after addition of the substrate.
Each of the fermented liquors is extracted four times, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts of each liquor are combined and concentrated until a dry residue is obtained, under reduced pressure. Each residue is taken up in 2 cm3 of pyridine, and 0.5 cm3 of acetic anhydride is added. These mixtures are heated on a steam cone for 10 to 15 minutes, then concentrated in vacuo to dryness. Each residue is dissolved in 2 cc of acetone and the appropriate volumes of the resulting solutions are chromatographed. The chromatograms show that the substrate has been converted
EMI14.1
in 3,20-diketo-llbeta, 16alPha, 17alpha, 21-tetrahYdroxy¯1'4 -pregnadiene.
EXAMPLE 6
EMI14.2
Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 21-dihydroxy.µls'-pregnadiene.
This fermentation is carried out in a manner similar to Example 1, using Nocardia corallina (ATCC 999) except that the fermentation is continued for 72 hours after the addition of the steroid substrate which.
EMI14.3
is 3,20-diketo-llbeta, 21-dihydroxy-4-pregnene. The product is 3,20-diketo-llbeta, 21-dihydroxy - / "- pregnadiene, which is identified by chromatography on paper as in Example 1. Example 7
EMI14.4
Preparation of 3,20-aiketo-llbeta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy-L, 1,4-pre, -nadiene.
A culture of Nocardia leishmanii (ATCC 6855) is washed on potato dextrose and test tube agar with 5 cc of sterile saline, and 1 cc portions of the suspension are used.
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pension of vegetative cells obtained to inoculate. in 10 cm3 portions of sterile, yellowed No. 13 medium, pH 7, each portion being in a 100 cm3 shaker tube.
The tubes are shaken on an alternative shaker at 32 C for 40 hours, and at the end of this time is added to each tube 2 mg of substrate consisting of 3,200 diketo.
EMI15.1
11beta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy -'.- Pregnene dissolved in 0.2 cc of 70% aqueous ethanol. Tubes are harvested after an additional 6, 24 and 72 hours of incubation after addition of substrate.
Each fermented liquor is extracted four times, each time with 40 cc of methylene chloride. The extracts of each liqueur are combined and con-. center to dry residue under reduced pressure. Each residue is taken up in 2 cm3 of pyridine and 0.5 cm3 of acetic anhydride is added. These mixtures are heated on a steam cone for 10-15 minutes, and then concentrated to a dry residue. under vacuum. Each residue was dissolved in 2 cm3 of acetone, and the resulting solutions chromatographed in appropriate volumes. The chroma- tograms indicate that the substrate has converted to
EMI15.2
3, 20-αiceto-llbeta, l6alpha, l7alpha, 21-tetrahydroxy.-l '-. pregnadiene.
EXAMPLE 8
EMI15.3
Breparation of 3,20-diketo-llbgta, 17alpha, 21-trihydroxy-lj4¯pregnadiene.
A culture of Nocardia leishmanii (ATCC 6655) on soybean is washed with trypticase and agar, in a test tuba, with 5 cm3 of sterile saline solution, and the suspension of vegetative cells obtained is used to inoculate. 100 cm3 of sterile medium 13 in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. Shake the bottle on a
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shaker for 16 hours at 32 ° C, and at the end of this time, 2 cc of the resulting culture is used to inoculate another 100 cc portion of sterile medium No. 13 in a 500 cc Erlenmeyer flask. We do. incubate the latter flask with shaking for 24 hours at 32 ° C., and at the end of this time, 20 mg of substrate consisting of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-
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4-trihydroxypregnene dissolved in 2 cm3 of 70% aqueous ethanol.
The incubation is continued, and 10 cc portions are removed after 2, 4, 7, 23 and 72 hours.
Each portion is extracted four times - each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue is taken up in 2 cm 3 of acetone and an appropriate sample is analyzed by the paper strip technique described above. Paper strip chromatograms indicate the presence of 3,20-diketo.
EMI16.2
llbta, 17alpha, 21-trihydxoxyl '"- pregnadiene.
EXAMPLE 9 Preparation of 3,20-diketo-11beta, 2l-dihydroxy- / '-.prregnadiene.
Another experiment is carried out in a manner similar to Example 1, except that the 3,20-
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diketo-llbta, 17alpha, 21-trihydroxy .. f '. pregnene by 3,20-diketo-llbta, 21-dihydroxy-f'-pregnene, and that the organism used is Nocardia sp. (ATCC 12483). When the product obtained is tested by chromatographic methods on paper strips, it indicates the presence
EMI16.4
3,20-diketo-11beta, 21-dihydroxy- (1 '' - pregnadiene.
EXAMPLE 10 Preparation of 3,20-diketo-17-alpha, 21-dihydroy-1 "-pegnadiene.
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The fermentation and identification of the product are carried out as described in Example 1, using the fungus Nocardia Corallina (ATCC 999) except that 3,20-diketo-17alpha, 21-dihydro is used as substrate. -
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xy-4¯pregnèRe, and that the product obtained is 3,20-di keto-l 'alpha, 1-dihydroxyvl' '..pregnadiene.
EXAMPLE 11 Preparation of 3,20diketo-11beta, 17alpha, 21-trihydroxy-A '-pregnadiene.
A culture of Nocardia caviae (ATCC 6404) on soybean was washed with trypticase and agar-agar in a test tube, with 5 cm3 of sterile saline, and the resulting vegetative cell suspension was used to inoculate 100 cm3 of medium. sterile # 13 in a 500 cc Erlenmeyer flask. The flask is shaken on an alternating shaker for 16 hours at 32 ° C, and at the end of this time 2 cm3 of the resulting culture is used to inoculate another 100 cm3 portion of sterile medium No. 13 in a 500 Erlenmeyer flask. cm3. The latter flask is incubated with shaking for 24 hours at 32 ° C., and at the end of this time 20 mg of substrate, consisting of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-tri-.
EMI17.2
4-hydroxypregnene, dissolved in 2 cm3 of 70% aqueous ethanol.
Incubation was continued, and 10 cc portions were removed after 2, 4, 7.23 and 72 hours.
Each portion is extracted four times with 40 cm3 of methylene chloride each time. The extracts are combined and evaporated to dryness under vacuum. The residue is taken up in 2 cc of acetone and a suitable sample is analyzed by the paper strip techniques described above. Chromatography on a paper strip indicates the presence of 3,20-diketo-llbeta,
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l7alpha, 21-trihydroxy-1 '' -pregnadi, ene
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TEMPLE 12
EMI18.1
Preparation of 3,2U-diketo-llbta, 16a1pha, 17alpha, 21-tetrahydroxy-1 f-pregnadiene.
A culture of Nocardia caviae (ATCC 6848) was washed on potato dextrose and test tube agar with 5 cm3 of sterile saline, and 1 cm3 portions of the cell suspension were used. vegetatives obtained to inoculate 10 cm3 portions of sterile medium No. 13 adjusted to pH 7, each portion in a 100 cm3 shaker tube. The tubes are shaken on a rotary shaker at 32 ° C. for 40 hours, and at the end. of this time we add, in each tube, 2 mg of
EMI18.2
substrate consisting of 3j20¯diketo-> llbeta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy- / y-pregnene, dissolved in 0.2 cm3 of 70% aqueous ethanol. Tubes are harvested after an additional 6, 24 and 72 hours of incubation after addition of substrate.
Each of the fermented liquors is extracted four times, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts of each liquor are combined, and concentrated to dryness under reduced pressure.
Each residue is taken up in 2 cm3 of pyridine, and 0.5 cm3 of acetic anhydride is added. These mixtures are heated on a steam cone for 10-15 minutes, then concentrated to dry residue in vacuo. Each residue was dissolved in 2 cm3 of acetone, and the resulting solutions chromatographed appropriate volumes. The chromatograms show that the substrate has converted
EMI18.3
320-diketo-llbtaJlbalpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy- / "14-pregnadiene.
EXAMPLE 13 Preparation of 3,20-diketo-17alpha, 21-dihydroxy-1, -pregnadiene.
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Fermentation is carried out using the method and method of product identification described - in Example 1, except that the fungus is Nocardia sp ..
(ATCC 12483), instead of Nocardia corallina, and that the
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substrate is 3,20-d3-keto-alpha, 2-dihydroxy - ,,, '- pregnene, instead of 3,20-diketo-llbµta, 17alpha, 21-trihydro-xy-4¯pregnene.
EXAMPLE 14 Preparation of 3,20-diketo-llalpha, 17alpha, 21-trihydroxy'-
EMI19.2
/ '\ 1,4 - Pregnadiene.
A fermentation experiment was carried out using the method described in Example 6, except that one
EMI19.3
uses as substrate, 20-diketo-llalpha = 17a1pha, 21-trihydroxy -'- pregnene, instead of 20-diketorllbeta 17alpha, 21-trihydroxy.-'-pregnene. The paper strip chromatogram indicates the presence of 3,20-diketo-llalpha, 17alpha, 21-trihydroxy-A le4-prregnadiene.
EXAMPLE 15 Preparation of 3,20-diketo-11beta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy-34-pregnadiene.
A culture of Nocardia convoluta (ATCC 4275) was washed on potato dextrose and test tube agar with 7 cm3 of sterile saline, and 1 cm3 of the resulting vegetative cell suspension was used for inoculate 10 cm3 of sterile medium No. 13 adjusted to pH 7, before autoclaving (pH 6.75 after autoclaving), in a 100 cm3 shaker tube. The tube was shaken on an alternating shaker for 16 hours at 32 ° C. 1 cc portions of the resulting culture were used to inoculate five 10 cc portions of sterile # 13 medium into 100 cc shaker tubes. .
These tubes are incubated on a
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shaker for 16 hours at 32 C, and at the end of this time, is added to each tube 2 mg of substrate consisting of 3,20-diketo-llbeta, 16alpha, 17alpha,
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21-tetrahydroxy -'-pregnene in 0.2 cm3 of 70% aqueous ethanol. Tubes are harvested after additional incubation times of 1/2, 2, 7, 24 and 72 hours.
Each of the fermented liquors is extracted four times, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts of each liquor are combined and concentrated to a dry residue under reduced pressure.
Each residue is taken up in 2 cm3 of pyridine, and 0.5 cm3 of acetic anhydride is added. These mixtures are heated on a steam cone for 10 to 15 minutes and then concentrated to dry residue in vacuo. Each residue is dissolved in 2 cm3 of acetone, and the appropriate volumes of solutions obtained are chromatographed. The chromatograms show that the substrate has converted to 3,20-dike-
EMI20.2
to-llbeta, l6alpha, l7alpha, 21-tetrahydroxy.ül'-pregnadiene.
EXAMPLE 16
EMI20.3
Preparation of 3, 20-diketo-llbêija, 17alpha, 21-trihydroxy- l, 4¯pregnadiene.
A culture of Nocardia convoluta (ATCC 4275) on soybean is washed with trypticase and agar-agar in a test tube, using 5 cm3 of sterile saline solution, and the suspension of vegetative cells obtained is used to inoculate 100 cm3 of medium. sterile # 13 in a 500 cc Erlenmeyer flask. The flask is shaken on an alternating sewer for 16 hours at 32 ° C, and at the end of this time 2 cm3 of the culture obtained is used to inoculate another 100 cm3 portion of sterile medium No. 13 in an Erlenmeyer flask of 500 cm3. The latter vial is incubated with shaking for 24 hours at
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32 C, and at the end of this time we add 20 mg of substrate
EMI21.1
consisting of 3'20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy-4¯pregnene dissolved in 2 cm3 of 70% aqueous ethanol.
Incubation is continued and 10 cc portions are removed after 2, 4, 7.23 and 72 hours.
Each portion is extracted four times with 40 cm3 of methylene chloride each time. The extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo.
The residue is taken up in 2 cm 3 of acetone, and an appropriate sample is analyzed by the paper strip techniques described above. Strip chromatograms
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paper indicate the presence of 3i20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy.-l '' -prêgnadiene.
. EXAMPLE 17 Preparation of 3,20-diketo-llalpha, 17alpha, 21-trihydroxy-
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Li.l, 4¯pregnadiene.
An experiment similar to Example 14 was carried out except that the fungus Nocardia sp.
(ATCC 12483) in fermentation, instead of Nocardia corallina. The product obtained, examined by chromatography on a paper strip, is identical to that of Example '14.
EXAMPLE 18
EMI21.4
Preparation of 3,20¯diketo-llbeta, 16alpha, 17alphas21-tetra = - hydroxy-1,4¯pregnadiene.
A culture of Nocardia corallina (ATCC 999) is washed on yeast extract and agar-agar in a test tube, using 7 cm3 of sterile saline solution. The suspension obtained is added to 100 cm3 of soybean broth with trypticase without glycerol in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. The mixture is incubated with shaking at 32 ° C for 40 hours. 20 mg of
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3,20-diketo-llbeta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy..Lf-pregnene dissolved in 2 cc of ethanol. The flasks are then incubated with shaking at 32 ° C. for 8 1/2 hours.
A pooled the contents of the vials to give a liquor at pH 7.3. After harvesting, the liquors are combined and extracted in the usual manner, to give 352 mg of crude crystals. Crystallization from acetone-petroleum ether gives 145 mg, melting point 216-218 C. Recrystallization from acetone-petroleum ether mixture raises the melting point to 229-231 C. The infra spectrum -red is the same as a sample
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authentic 3,20-diceto-llbeta, l6alpha, l7alpha, 21-tetrahydroxy-1,4¯pregnadiene.
EXAMPLE 1S Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy-1'f-prêgnadiene.
We wash a culture of! Nocardia globerula (ATCC 9356) on trypticase and agar-agar soybean in a test tube, using 5 cm3 of sterile saline solution and the resulting vegetative cell suspension is used to inoculate 100 cm3 of sterile medium No. 13 in a fla - con Erlenmeyer of 500 cm3. The flask is shaken on an alternating sewer for 16 hours at 32 ° C, and at the end of this time 2 cm3 of the resulting culture is used to inoculate another 100 cm3 portion of sterile medium No. 13 in a 500 Erlenmeyer flask. cm3. The latter vial is incubated with stirring for 24 hours at 32 ° C., and at the end of this time 20 mg of substrate are added.
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consisting of 3,20-diketo-11bê "ta, 17alpha, 21-trihydroxy-4¯pregnene dissolved in 2 cm3 of 70% aqueous ethanol.
The incubation is continued and 10 cc portions are removed after 2, 4, 7, 23 and 72 hours.
Each portion is extracted four times,
<Desc / Clms Page number 23>
each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue is taken up in 2 cm3 of acetone and a suitable sample is analyzed by the paper strip techniques described above. Paper strip chromatograms indicate the presence of 3,20-diketo.
EMI23.1
llbetal7alpha, 21-trihyd-rox.y- 1''vp-reggnadiene.
Example 20 Preparation of 3,20-diketo llbta, l6alpha, lialpha, 21-te-. trahydroxy-b 1,4 -prég- '
A culture of Nocardia globerula (ATCC 9356) is washed on potato dextrose and agar-agar in a test tube, with 5 cm3 of sterile saline and 1 cm3 portions of the cell suspension are used. Vegetative obtained to inoculate 10 cm3 portions of sterile medium No. 13 adjusted to pH 7, each portion in a 100 cm3 shaker tube. The tubes are shaken on a rotary shaker for 40 hours. 23 C, and at the end of this time is added, in each tube, 2 mg of substrate consisting of 3,20-diketo.
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llbcta9: 6alphayl7alpha'21-tetrahydroxywpregnene, dissolved in 0.2 cc of 70% aqueous ethanol.
Tubes are harvested after 6, 24 and 72 hours of additional incubation after addition of substrate.
Each of the fermented liquors is extracted four times, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts from each liquor are combined and concentrated to dryness under reduced pressure. Each residue is taken up in 2 cm3 of pyridine and 0.5 cm3 of acetic anhydride is added. These mixtures are heated on a steam cone for 10 to 15 minutes, then concentrated to dry residue in vacuo. Each residue is dissolved in 2 cm3 of acetone and the volumes are chromatographed.
<Desc / Clms Page number 24>
appropriate lumes of solutions obtained. The chromatograms show that the substrate has converted to 3,20-dike-
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to-llbta, l6alpha,? alpha, 21-tetrahydroxp-.1'-pregnadiene.
EXAMPLE 21
EMI24.2
Preparation of 3,20-diketorllbeta, 16a1pha, alpha, 21-tetrahydroxy-1,4¯pregnadiene.
A culture of Nocardia corallina (ATCC 999) on yeast extract and agar is washed with 7 cm3 of sterile saline solution and the resulting suspension is used to inoculate 100 cm3 of sterile medium No. 13 in a. 500 cm3 Erlenmeyer flask. The mixture is incubated with shaking for 7 1/2 hours at 37 ° C.
1 cc portions of this culture are used to inoculate 10 cc portions of the sterile medium in 100 cc tubes. The tubes are incubated at 32 C for 40 hours, and at the end of this time are added to
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each tube 2 mg of 16alpha, 21-diabetate-3,20-diketo-llbeta, 17alpha-.dihydroxy-, f-pregnene dissolved in 0.2 cm3 of ethanol. The tubes are then incubated for 24 hours. The contents of one tube (10 cm3) are extracted four times with 40 cm3 of methylene chloride each time. The extracts are combined and concentrated to a dry residue under pressure. The residue is taken up in 2 cm3 of pyridine and 0.5 cm3 of acetic anhydride is added. This mixture is heated on a steam cone for 10-15 minutes, then concentrated to a dry residue in vacuo.
The residue is dissolved in 2 cm3 of acetone and an appropriate volume of the resulting solution is chromatographed. The chromatogram shows that the substrate has converted to
EMI24.4
3,20-diketo-llbta, l6alpha, l7alpha, 21-tetrahydroxy -, (ln 'pregnadiene.
EXAMPLE 22 Preparation of 3,20-diketo-llbeta, l6alpha, 17alpha, 21-tê-
<Desc / Clms Page number 25>
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trahydroxy-L it4-pregnadiene.
A fermentation experiment such as that described in Example 18 is carried out with Nocardia sp.
(ATCC 12483) instead of Nocardia corallina. When the product is tested on a chromatogram on a strip of paper,
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3,20-diketo-llbeta, 16alpha, l '(alpha, 21-tetra-hydroxy-1,4-prregnadiene is obtained which is identical to the product of Example l.
EXAMPLE 23 Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 16alpha, 17alpha, 21-te-
EMI25.3
trahydroxY-1,4-prregnadien.
A culture of polychromogenic Nocardia (ATCC 3409) was washed on potato dextrose and test tube agar with 5 cc of sterile saline, and 1 cc portions of the solution were used. A vegetative cell suspension obtained for inoculating 10 cc portions of sterile medium No. 13 adjusted to pH 7, each portion in a 100 cc shaker tube. The tubes are shaken on an alternative shaker at 32 C for 40 hours, and at the end of this time is added to each tube 2 mg of substrate consisting of 3,20-dice.
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to-llbeta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy -'- pregnadiene dissolved in 0.2 cc of 70% aqueous ethanol. Tubes are harvested after an additional 6.24 and 72 hours of incubation after addition of substrate.
Each of the fermented liquors is extracted four times, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts of each liquor are combined and concentrated to dryness under reduced pressure.
Each residue is taken up in 2 cm3 of pyridine, and 0.5 cm3 of acetic anhydride is added. These mixtures are heated on a steam cone for 10-15 minutes, then
<Desc / Clms Page number 26>
it is concentrated to dryness in vacuo. We dissolve; each residue in 2 cm3 of acetone and chromatographed appropriate volumes of the resulting solutions. The chromatograms show that the substrate has converted
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into 3,20-diketo-llbeta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy- 1,4¯pregnadiene.
EXAMPLE 24 Preparation of 3,20-diketo-11beta, 17alpha, 21-trihydroxy-124-pregnadiene.
A culture of polychromogenic Nocardia (ATCC 3409) on soybean was washed with trypticase and agar-agar in a test tube with 5 cm3 of sterile saline and the suspension of vegetative cells obtained was used to inoculate 100. cm3 of sterile medium No. 13 in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. This flask is shaken on an alternating shaker for 16 hours at 32 ° C, at the end of which time 2 cm3 of the resulting culture is used to inoculate another 100 cm3 portion of sterile medium No. 13 in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. .
The latter flask is incubated with shaking for 24 hours at 32 ° C., and at the end of this time 20 mg of
EMI26.2
substrate, consisting of 3,20-diketo-llbùta, 17alpha, 21-trihydroxy - / '- pregnene, dissolved in 2 cm3 of 70% aqueous ethanol. The incubation is continued and 10 cc portions are removed after 2, 4, 7, 23 and 72 hours.
Each portion is extracted four times, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue is taken up in 2 cm3 of acetone, and a suitable sample is analyzed by the paper-strip techniques described above. Chromatograms on paper strips indicate the presence of 3,20-diketo.
EMI26.3
llbeta, 17a1pha, 21-trihydroxy -, (l '' -pregnadiene.
<Desc / Clms Page number 27>
EXAMPLE 25 Preparation of 3,20-diketo-9alpha-fluoro-llbeta, 16alpha,
EMI27.1
lidlpha, 21-tetrahpdroxy-, '.-prégnadi: ne.
A culture of Nocardia corallina (ATCC 999) is washed on yeast extract and agar-agar with 7 cm3 of sterile saline solution and the resulting suspension is used to inoculate 100 cm3 of medium No. 13 in an Erlenmeyer flask of 500 cm3. This mixture is incubated with stirring at 37 ° C. for 71/2 hours.
1 cc portions of this culture were then used to inoculate 10 cc portions of sterile medium # 13 into 100 cc fermentation tubes. The inoculated tubes were incubated for 40 hours at 32 C. At the end of this time. , is added to each tube 2 mg of
EMI27.2
3, 20-diketo-9alpha-f.uoro-llhéta, .balpha, l7alpha., 21-tetrahydroxy-4¯pregnene dissolved in 0.2 cm3 of ethanol.
The tubes are incubated for 72 hours. At the end of this time, the contents of a tube are extracted four times, each time with 40 cm3 of methylene chloride.
The extracts are combined and concentrated to a dry residue in vacuo. The residue is taken up in 2 cm3 of pyridine and 0.5 cm3 of acetic anhydride is added. This mixture is heated on a steam cone for 10 to 15 minutes, then concentrated to dry residue in vacuo. The residue is dissolved in 2 cm3 of acetone, and an appropriate volume of the resulting solution is chromatographed. Chromatography gives significant amounts of 16,21-dia-
EMI27.3
keto-3,20-diketo-9alpha-fluoro-llbeta, 16alpha, 17alpna-21-tetrahYdroxy-1,4¯pregnadiene. It is thus seen that 3, zo-dikétoa9alpha-.fluo-ra-llbéta.l6alpria, 17a1hha, 21-etra hYdroxy-l, 4¯pregnadiene was formed in decalable amounts during fermentation.
<Desc / Clms Page number 28>
EXAMPLE 26
EMI28.1
Preparation of 1b, 21-diaceto-3,20-diketo9alpha-fluoro-llbeta-16alpha, 17alpha, 21-tstrahydroxy-.1 '-. Pregnadiene.
7 cm3 of sterile saline solution is used to wash a culture of Nocardia corallina (ATCC 999) on yeast extract and agar-agar in a test tube, and the suspension obtained is used to inoculate 100 cm3 of sterile medium No. 13 in a flask. 500 cm3 Erlenmeyer flask.
The mixture was incubated for 8 hours at 37 ° C. and 1 cc portions of this culture were used to inoculate 100 cc portions of sterile medium into 32 500 cc vials. These flasks are incubated at 32 ° C. for 40 hours, and at the end of this time are added to each
EMI28.2
as vial 25 mg of 16,21-diaceto-3,20-diketo-llbâta, lalpha, l7alpha, 21-tetrahyaroxy -'- pregnene dissolved in 2.5 cm3 of ethanol. The vials are incubated for 53 hours. The contents of the vials are combined, and an equal volume of acetone is added. The solution is filtered through diatomaceous earth and the acetone evaporated under reduced pressure. The aqueous phase is saturated with salt and extracted five times with 500 cm 3 portions of n-butanol. The butanol extract is evaporated under reduced pressure to dryness.
The residue is stirred with about 1 liter of boiling acetone to separate the organic residue from the inorganic salts, then filtered through diatomaceous earth. The acetone is evaporated off and the residue is dissolved in pyridine, then acetylated with acetic anhydride (at room temperature overnight). Methanol is added and the solution is evaporated under reduced pressure to dryness (weight 1.17 g). Partition chromatography (solvent system * 3 parts of ethyl acetate, 2 parts of petroleum ether to 90-100 C, 3 parts of methanol and 2 parts of water) gives
<Desc / Clms Page number 29>
0.50 g of the desired crude product which is 16,21-diaceto
EMI29.1
3, 2Wdiketo9a3.phafluoro-llbta, 16alpha, 1. "Iaâpha s 21 - tetrahydroxy-1,4¯pregnadiene.
When the residue is crystallized from a mixture of acetone and petroleum ether, 341 mg, mp 153-233 ° C. with prior softening are obtained. The wide melting point range is probably a result of solvation.
EXAMPLE 2?
EMI29.2
Preparation of 3, 20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy-, 14-pregnadienea
A culture of Nocardia sylvodifera (ATCC 7372) on soybean is washed with trypticase and agar-agar in a test tube, with 5 cm3 of sterile saline solution and the suspension of vegetative cells obtained is used to inoculate 100 cm3 of sterile medium. n 13 in a 500 cc Erlenmeyer flask. The flask is shaken on an alternating shaker for 16 hours at 32 ° C, and at the end of this time 2 cm3 of the resulting culture is used to inoculate another 100 cm3 portion of sterile medium No. 13 in a 500 Erlenmeyer flask. cm3.
The latter flask is incubated with shaking for 24 hours at 32 ° C., and at the end of this time 20 mg of
EMI29.3
substrate consisting of 3,2Q.-dicëi; o-l2bwta, l alpha, 21-trihydroxy-L-4pregnene, dissolved in 2 cm3 of 70% aqueous ethanol. The incubation is continued and 10 cc portions are removed after 2, 4, 7, 23 and 72 hours.
Each portion is extracted four times with 40 cm3 of methylene chloride each time. The extracts are collected and evaporated to dryness in vacuo. The residue is taken up in 2 cc of acetone, and a suitable sample is analyzed by the paper-strip techniques described above. Chromatograms on
<Desc / Clms Page number 30>
EMI30.1
strip of paper indicates the presence of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy- "-pregnadiene.
EXAMPLE 28 Preparation of 3 $ 20-diketo-galpha-fluoro-llbeta, 16alpha, 17a1pha, 21-tetrahydroxy.- '' -pregnadiene.
In another fermentation experiment using the conditions of Example 1, with the fungus Nocardia sp. (ATCC 12483) instead of the nocardia fungus
EMI30.2
corallina, and with 3,20-diketo-9alpha-fluoro-llbgta, l6alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy -'- pregnene instead of 3t20-diketo-llbeta, l7alpha, 21-trihydroxy -, '- pregnene the chromatogram on strip of paper indicates the presence of 3,20-diketo-galpha-fluoro-llbeta, lbalpha'l7alpha, 21-tetra hydroXy-L11,4¯pregnadiene.
EXAMPLE 29 Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy- '
EMI30.3
1.4¯Pregnadiene.
A culture of Nocardia asteroids, strain A-3163 (ATCC 3308) isolated on yeast extract and agar-agar, is washed with 6 cm3 of sterile saline solution.
1 cm3 of the resulting vegetative cell suspension is used to inoculate 10 cm3 of sterile medium 13 in. a 100 cc shaker tube, and the tube is incubated on an alternating shaker at 32 ° C for 40 hours. At the end of this time, 2 mg of 3,20-di-
EMI30.4
keto-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy .., i-pregnene dissolved in 0.2 cm3 of ethanol, and fermentation continued.
When samples taken after 2 to 24 hours from the new fermentation are determined by the paper strip methods described above, the
EMI30.5
presence of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy- 1,4¯pradiene.
<Desc / Clms Page number 31>
EXAMPLE 30
EMI31.1
Preparation of 3,20diketo-11'aétG., 16alpha, ¯7alpha, 21-tetrahydroxy.- -pregnadiene.
A culture of Nocarfia asteroides (ATCC 3308) was washed on potato dextrose and agar-agar in a test tube with 5 cc of sterile saline, and 1 cc portions of the suspension were used. resulting vegetative cells to inoculate 10 cc portions of sterile # 13 medium adjusted to pH 7, each portion in a 100 cc shaker tube. The tubes are shaken on an alternating shaker at 32 ° C. for 40 hours, and at the end of this time, 2 mg of 3,20-diketo-substrate are added to each tube.
EMI31.2
ll.beta, 16ü1pha ,, 'alpha, 21-tetrGhydroxy --'- pregnene dissolved in 0.2 cc of 70% aqueous ethanol. Tubes were harvested after an additional 6, 24 and 72 hours of inhalation. - cubation after addition of the substrate.
Each of the fermented liquors is extracted four times, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts of each liquor are combined and concentrated to dryness under reduced pressure. Each residue is taken up in 2 cm3 of pyridine, and 0.5 cm3 of acetic anhydride is added. These mixtures are heated on a steam cone for 10-15 minutes, then concentrated to dry residue in vacuo. Each residue was dissolved in 2 cm3 of acetone, and the resulting solutions chromatographed appropriate volumes. The chromatograms show that the substrate has converted to
EMI31.3
3,20-diketo-llbeta, l6alpha, a7alpha, 21-tetrahydroxy-1 '"- pregnadiene.
EXAMPLE 31
EMI31.4
Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21¯trihydroxy- 1,4 ... pregnadiene.
<Desc / Clms Page number 32>
A culture of Nocardia asteroids, isolated strain n E-20 (ATCC 3308) is washed on yeast extract and agar-agar, with 6 cm3 of sterile saline solution.
1 cm3 of the resulting suspension is used to inoculate 10 cm3 of sterile medium # 13 in a 100 cm3 shaker tube, and the tube is incubated on an alternate shaker at 32 ° C for 40 hours. At the end of this
EMI32.1
Time, 2 mg of 3,20-diketo-llbeta, l7alpha-2ltri-hydroxy-4¯pregnene, dissolved in 0.2 cm3 of ethanol, are added, and the fermentation is continued. When titrating, by the paper strip methods described above, samples taken at the end of. 2-24 hours of new fermentation
EMI32.2
tion, there is the-presence of ', 20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy 1'a'-pregnadiene.' EXAMPLE 32 Preparation of 3,2U-diketo-llba, alpha, 21-.trihydroxy-41) 4-pregnadiene.
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯,
A culture of Nocardia farcinica (ATCC 3318) on soybean was washed with trypticase and agar-agar in a test tube, with 5 cm3 of sterile saline solution, and the suspension of vegetative cells obtained was used to inoculate 100. cm3 of sterile medium # 13 in a 50 cm3 Erlenmeyer flask. The flask is shaken on an alternating shaker for 16 hours at 32 ° C, and at the end of this time 2 cm3 of the resulting culture is used to inoculate another 100 cm3 portion of sterile medium No. 13 in a 500 Erlenmeyer flask. cm3. The latter flask is incubated with shaking for 24 hours at 32 ° C., and at the end of this time 20 mg of
EMI32.3
substrate, consisting of 3,20-diketo-llbeta, 17alPha $ 21-trihydroxy-4¯pregnene, dissolved in 2 cm3 of 70% aqueous ethanol.
The incubation is continued, and 10 cc portions are removed after 2, 4,, 23 and 72 hours.
<Desc / Clms Page number 33>
Each portion is extracted four times, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue is taken up in 2 cm3 of acetone, and a suitable sample is analyzed by the paper-strip techniques described above. Paper strip chromatograms indicate the presence of 3,20-diketo.
EMI33.1
llbeta, l7alpha, 21-trihydroxy-1 '' - pregnadiene.
EXAMPLE 33 Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 1.7.lpha, 2l-trihydroxy- / \ '-prregnadiene.
A culture of Nocardia erthropolis, strain A-4045 '(ATCC 4277) isolated on yeast extract and agar-agar, is washed with 6 cm3 of sterile saline.
1 cm3 of the resulting suspension is used to inoculate 10 cm3 of sterile medium # 13 in a 100 cm3 shaker tube, and the tube is incubated on an alternate shaker at 32 ° C for 40 hours. At the end of this
EMI33.2
time, 2 mg of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihYdroxy-4¯pregnene dissolved in 0.2 cm3 of ethanol are added, and the fermentation is continued. When titrating, by the paper strip methods described above, samples taken after 2-24 hours of further fermentation
EMI33.3
mentation, there is the presence of 3,20-diketo-llbgta, l7alpha, 21-.trihydroxy- jl '' -pregnadiene.
EXAMPLE 34 Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy-1,4¯pregnadiene.
A culture of Nocardia blackwelii (ATCC 6846) on soybean is washed with prypticase and agar-agar in a test tube, with 5 cm3 of sterile saline solution, and the suspension of vegetative cells obtained is used.
<Desc / Clms Page number 34>
naked to inoculate 100 cm3 of sterile medium No. 13 in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. The flask is shaken on an alternating shaker for 16 hours at 32 ° C, and at the end of this time 2 cm3 of the resulting culture is used to inoculate another 100 cm3 portion of sterile pill No. 13 in a 500 Erlenmeyer flask. cm3.
The latter flask is incubated with stirring for 24 hours at 32 ° C., and at the end of this time 20 mg of substrate are added,
EMI34.1
consisting of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy- / \ -pregnene dissolved in 2 cm3 of aqueous 7010 ethanol.
The incubation is continued and 10 cc portions are removed after 2, 4, 7, 23 and 72 hours.
Each portion is extracted four times, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo.
The residue is taken up in 2 cm3 of acetone, and an appropriate sample is analyzed by the paper strip techniques described above. The chromatograms on a paper strip indicate the presence of 3,20-diketo-llbeta,
EMI34.2
1? Alpha, 21-trihydroxy-l '' - pregnadiene.
EXAMPLE 35 'Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy-
EMI34.3
1.4¯Pregnadiene.
A culture of Nocardia transvalensis, isolated strain E-42 (ATCC 12485) is washed on yeast extract and agar-agar, using 6 cm3 of sterile saline solution.
1 cc of the resulting suspension is used to inoculate 10 cc of sterile medium # 13 into a 100 cc shaker tube, and the tube is incubated on an alternate shaker at 32 ° C for 40 hours. At the end of
EMI34.4
this time, 2 mg of 3,20-diketo-llb8ta, 17-alpha, 21-trihydroxy-, -pregnene dissolved in 0.2 cm3 of ethanol are added
<Desc / Clms Page number 35>
and we continue the fermentation. When titrating, by the paper strip methods described above, samples taken after 2 to 24 hours from the new close '
EMI35.1
tation, the presence of 3,20-diketo-llb8ta) l7alpha, 21-trihydrdxy-al '' - pregnadiene is observed.
EXAMPLE 36 Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahYdroxy¯l, 4¯pregn8diene.
A culture of Nocardia cuniculi (ATCC 6864) was washed on potato dextrose and agar-agar in a test tube, using 7 cm3 of sterile saline, and 1 cm3 of the resulting vegetative cell suspension was used to inoculate 10 cm3 of sterile medium n 13 adjusted to pH 7 before autoclaving (pH 6.75 after autoclaving), in a 100 cm3 shaker tube. The tube was shaken on an alternating shaker for 16 hours at 32 ° C. Portions of 1 cm3 of the resulting culture were used to inoculate five 10 cm3 portions of sterile medium No. 13 in 100 cm3 shaker tubes.
These tubes are incubated on the alternating shaker for 16 hours at 32 ° C, and at the end of this time 2 mg are added to each tube.
EMI35.2
of substrate, consisting of 3,20-diketo-llbâta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy - / \ "- pregnene in 0.2 cm3 of 70% aqueous ethanol. The tubes are harvested after further times. incubation of 1/2, 2, 7, 24 and 72 hours.
Each of the fermented liquors is extracted four times, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts of each liquor are combined and concentrated to a dry residue under reduced pressure.
Each residue is taken up in 2 cm3 of pyridine, and 0.5 cm3 of acetic anhydride is added. These mixtures are heated on a steam cane for 10-15 minutes and then
<Desc / Clms Page number 36>
concentrate to dryness in vacuo. Each residue is dissolved in 2 cm3 of acetone, and the appropriate volumes of the resulting solutions are chromatographed. Chromatograms show that the substrate has converted to 3.20-
EMI36.1
Diketo-llbeta, lbalpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy 1 '' - pregnadiene.
EXAMPLE 37
EMI36.2
Preparation of 320-.diketo-llbeta, 7alpha, 21-trihydroxy. 4-Pregnadiene.
A culture of Nocardia kerstolyticus, isolated strain E-43 (ATCC 12484) is washed on yeast extract and agar-agar, using 6 cm3 of sterile saline solution.
1 cm3 of the resulting suspension was used to inoculate 10 cm3 of sterile medium No. 13 in a 100 cm3 shaker tube, and the tube was incubated on an alternating shaker at 32 ° C for 40 hours. At the end of this
EMI36.3
In time, 2 mg of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihyroxy-i-pregnene dissolved in 0.2 cm3 of ethanol are added, and the fermentation is continued. When the samples taken after 2-24 hours of further fermentation are assayed by the paper strip methods described above, the presence of 3,20-diketo is observed.
EMI36.4
Ileta, 17 alpha, 21-trihydroxy-19 * -pregnad, ene.
EXAMPLE 38 Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy-
EMI36.5
, 4¯pregnadiene ..
A culture of Nocardia cuniculi (ATCC 6864) on soybean is washed with trypticase and agar-agar in a test tube, using 5 cm3 of sterile saline solution, and the resulting vegetative cell suspension is used to inoculate 100 cm3 of medium. sterile # 13 in a 500 cc Erlenmeyer flask. Shake the bottle on a
<Desc / Clms Page number 37>
alternate shaker for 16 hours at 32 ° C, at the end of this time 2 cm3 of the culture obtained is used to inoculate another 100 cm3 portion of sterile medium No. 13 in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. The latter flask is incubated with shaking for 24 hours at 32 ° C., and at the end of this time 20 mg of sub-
EMI37.1
stratum consisting of 3,20-dione-llbgta, 17alpha.21-trihy-droxy-4¯pregnene, dissolved in 2 cm3 of 70% aqueous ethanol.
The incubation is continued, and 10 cc portions are removed after 2, 4, 7, 23 and 72 hours.
Each portion is extracted four times, each time with 40 cm3 of methylene chloride. The extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue is taken up in 2 cm 3 of acetone and an appropriate sample is analyzed by the paper strip technique described above. The chromatograms on a paper strip indicate the presence of 3,20-diketo-llbeta,
EMI37.2
17alpha, 21-trihydroxy-1 * -pregnadiene.
EXAMPLE 39 Preparation of 320-keto-11beta, 17 alpha, 21-trihydroxy-A. '-pregnadiene.
A culture of Nocardie corallina, isolated strain No. 13 (ATCC 999) is washed on yeast extract and agar-agar, using 6 cm3 of sterile saline solution.
1 cm3 of the resulting suspension is used to inoculate 10 cm3 of sterile medium # 13 in a 100 cm3 shaker tube, and the tube is incubated on an alternate shaker at 32 ° C for 40 hours. At the end of this time, 2 mg of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy- # 4-pregnene dissolved in 0.2 cm3 of ethanol are added and the fermentation is continued. When samples taken after 2-24 hours of further fermentation are determined by the paper band methods described above, we observe
<Desc / Clms Page number 38>
EMI38.1
te the presence of 3j20-αiceto-llbêtā17alpha, 21-trihydroxy- '-pregnadiene.
EXAMPLE 40
EMI38.2
Preparation of 3'20-diketo-llbeta, alpha, 21¯trihydroxy-Lil, 4.pregnadiene.
A culture of Nocardia opaca (ATCC 4276) on soybean was washed with trypticase and agar-agar in a test tube, with 5 cm3 of sterile saline solution, and the suspension of vegetative cells obtained was used to inoculate 100 cra3. of sterile medium No. 13 in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. Shake the bottle on a shaker. alternate for 16 hours at 32 ° C., and at the end of this time 2 cm3 of the resulting culture is used to inoculate another 100 cm3 portion of sterile medium No. 13 in a 500 cm3 Erlenmeyer flask.
The latter flask is incubated with shaking for 24 hours at 32 ° C., and at the end of this time 20 mg of substrate, consisting of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21-trihydroxy- # 4- are added. Pregnene dissolved in 2 cm3 of 70% aqueous ethanol.
Intubation was continued, and 10 cc portions were withdrawn after 2, 4, 7, 23 and 72 hours.
Each portion is extracted four times with 40 cm3 of methylene chloride each time. The extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue is taken up in 2 cc of acetone, and a suitable sample is analyzed by the paper strip techniques described above. Strip chromatograms
EMI38.3
of paper indicate the presence of 3,20-diketo-llbgta, l7alpha, 21-trihydroxy..l '' ¯pregnadiene.
EXAMPLE 41 Preparation of 3,20-diketo-Ilbeta, 17alpha, 21-trihydroxy-1,4-pregadiene.
We wash a culture of Nocardia corallina,
<Desc / Clms Page number 39>
isolated strain 228 (ATCC 4273) on yeast extract and agar-agar, using 6 cm3 of sterile saline solution.
1 cc of the resulting suspension was used to inoculate 10 cc of sterile # 13 medium into a 100 cc shaker tube, and the tube was incubated on an alternating shaker at 32 ° C for 40 hours. At the end of this time, we
EMI39.1
2 mg of 3,20-diketo-11bgta, 17alpha-21-trihydroxy- # 4-pregnene, dissolved in 0.2 cm3 of ethanol, are added and the fermentation is continued. When samples taken after 2-24 hours of additional fermentation are assayed by the paper strip methods described above, the presence of 3,20-diketo-llbeta, 17alpha, 21- 'is observed.
EMI39.2
trihydroxy-A, 4-pregnadiene.
EXAMPLE 42 Preparation of 3,20-diketo-llbeta, 16alpha, 17alpha, 21-tetra-hydroxy-1,4-prepregnadiene.
A culture of Nocardia sylvodifera (ATCC 4919) is washed on potato dextrose and agar-agar in a test tube, with 5 cm3 of sterile saline solution, and 1 cm3 portions of the suspension are used. vegetative cells obtained to inoculate 10 cm3 portions of sterile medium No. 13 adjusted to pH 7, each portion in a 100 cm3 shaker tube. We
EMI39.3
shake the tubes on an alternative shaker at 32 ° C for 40 hours, and at the end of this time, 2 mg of substrate consisting of 3,20-diketo-
EMI39.4
llbgta, lb alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy - * - pregnene dissolved in 0.2 cc of 70% aqueous ethanol. Tubes were harvested after an additional 6, 24 and 72 hours of incubation after addition of substrate.
Each of the fermented liquors was extracted four times, each time with 40 cc / of methylene chloride. We combine the extracts of each liqueur and we
<Desc / Clms Page number 40>
Concentrate them to a dry residue under reduced pressure.
Each residue is taken up in 2 cm3 of pyridine, and 0.5 cm3 of acetic anhydride is added. These mixtures are heated on a steam cone for 10-15 minutes, then concentrated to dry residue in vacuo. Each residue is dissolved in 2 cm3 of acetone and the appropriate volumes of the solutions obtained are chromatographed. Chromatograms show that the substrate has converted to 3.20-
EMI40.1
diketo-llbeta-lbalpha'.7alphü, 21-tetrahydroxy-fl '.- pre-. gnadiene.
EXAMPLE 43
EMI40.2
Preparation of 3,20-diketo-llbeta, lôalpha, 17alpha, 21-tetrahYdrQxy¯l, 4¯pregnadiene.
A culture of Nocardia corallina (ATCC 999) is washed on yeast extract and agar-agar, using sterile saline solution. The resulting vegetative cell suspension is used to inoculate a vial
500 cc Erlenmeyer flask containing 100 cc of No. 13 sterile medium. This flask is placed on an alternating shaker at 37 ° C for 7 1/2 hours. 1 cm3 of the resulting culture was used to inoculate each of the five 100 cm3 shaker tubes containing 10 cm3 of sterile # 13 medium. Tubes were incubated on an alternating shaker at 32 C for 40 hours, and after this this time,
EMI40.3
mg of I6,21-diaceto-3j20-diceto, llbeta, lô.alpha, 17r.pha, 21.-têtrahydroxy- -.prégtènps dissolved in 0.2 cm3 of ethanol are added to each tube.
Tubes were harvested after 2.7 1/2, 24, 48, and 72 hours longer. The titrations, on a strip of paoier, of the extracted fermentation liquor indicate that an appreciable quantity of the material
EMI40.4
first transformed into 3,20-diketo-llbµta, l6alpha, 1.'ala-2ltêtrahydroxyw '!' - pregnadien.
<Desc / Clms Page number 41>
EXAMPLE 44
EMI41.1
Preparation of 3,20-diketo-llbgta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahYdroxy1,4¯pregnadiene.
A culture of Corynebacterium simplex on soybean is washed with trypticase and agar-agar in a test tube, with 5 cm3 of sterile water, and the resulting cell suspension is used to inoculate 100 cm3 of sterile soy broth. with trypticase in a 500 cm3 Erlenmeyer flask. This mixture is incubated with shaking at 37 ° C. for 8 hours. 25 Erlenmeyer flasks of 500 cm3, each containing 100 cm3 of sterile trypticase soy broth, without glycerol, are taken and each inoculated with 1 cm3 of the 8 hour old inoculum. These flasks are incubated at 32 ° C for 40 hours. At the end of this time, 40 mg of
EMI41.2
3,20-diketo-llbeta, l6alpha, l7alpha, 21-tetrahydroxy -'- pregnene dissolved in 4 cm3 of ethanol, and fermentation continued for 8 hours at 32 ° C.
The contents of the twenty-five flasks are combined to give a liquor at pH 8.1.
The liquors are combined after harvesting, extracted once with 3 liters of methylene chloride and three times with two liters each time of methylene chloride. Once the extract is combined, the extract is washed with saturated salt solution, and evaporated to dryness under reduced pressure. 509 mg of oily residue is obtained, dissolved in 1.5 cm3 of the stationary phase of the system, 3 parts of ethyl acetate, 2 parts of petroleum ether (90-100 C), 3 parts of methanol , 2 parts water, and mix with 3 g of diatomaceous earth. ' This impregnated diatomaceous earth is then piled on top of a 1.5 x 35 cm glass column containing 25 g of diatomaceous earth impregnated with 12.5 cm3 of the stationary phase of the above system.
The desired compound is eluted
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d with the mobile phase of the above system, and 207 g of crude solid are obtained. The latter is crystallized: in a mixture of acetone and petroleum ether (60-7000) to obtain. nir 56 mg of product with a melting point of 195-200 C (Kofler block). Recrystallization from the same couple of solvents raises the melting point to 202-205 C (block); melting point (by capillary method) 229-231 C. Ultraviolet spectrum:
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A max. 241 m / "# (r 14,500). Spectrum: infra-red: Max 34l2, 1718e 1667, 1622, 1612 (level), 1098, 1072 cm" 1.
Analysis: Calculated for G2lH2.0 (375, .t.j ë CB¯ 67.00%:
21-28H = 7.50% Effective: c- 66.80%;
H-7.62%.
The physical and chemical properties of the com-
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posed are those of 320-diketo-11beta, 16alpha; 17alpha 21-tetrahydroxy-, 1 "-prregnadiene.
EXAMPLE 45 Preparation of 3920-diketollbeta, 1balphaal7alpha, 2lté trahydroxy-als4-pre, -nadiene.
The liquors from a fermentation such as that described in Example 1, above, are combined after harvest, and extracted with 7 2 liter portions of methylene chloride, and the combined extracts are evaporated to 'to dryness under reduced pressure. 1.585 g of a crude semi-solid are obtained which are chromatographed. The fractions containing the desired compound are combined, and evaporated to dryness to give 601 mg of crystalline residue. Crystallization from acetone and petroleum ether gives 278 mg of product with a melting point of 229-231 C. Recrystallization from the same pair of solvents raises the melting point to 231-2320 C. [d] D24
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+ 77 C (methanol).
Ultra-violet spectrum
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At 1 ethanol 241-242 mp ((- 14,800). Infra-red spectrum: Max. 3436, 1715, 1664, 162le 1603rd 1129, 1063 cm - Analysis: Calculated for C21H2 $ 06 (376.1.); C = 67.00%; Bzz, 5%; Effective C = 66.82%; H = 7.27.
The product is identical to a sample of
EMI43.2
3, 20-diketo-llbeta, l6alpha, 1'7alpha, 21-tetrahydrocy-Ol '- pregnadiene obtained as in Example 1.
EXAMPLE 46
EMI43.3
16,21-diaceto-20-diketo - llbeta, l, 6alpha, l7alpha, 21-tetra ..
######################################### hYdroxy-1,4¯Pregnadiene.
A mixture of 100 mg of 3,20-diketo-llbeta is left to stand overnight at room temperature,
EMI43.4
16alpha, 7alpha-21-tetrahydroxy-, l '' - prgnadiene in 10 cm3 of pyridine containing 2 cm3 of ecetic anhydride, after which the solution is evaporated to dryness under reduced pressure. The solid residue was crystallized from a mixture of ethyl acetate and petroleum ether (90-100 ° C.), to give 105 mg (86%) of 16,21-diaceto-3,20-dice.
EMI43.5
to-llbeta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy - / \ 1,4-pr6gnadiù- ne, melting point 147-1500C. Recrystallization from the same couple of solvents raises the melting point to 161-163 C. Infra-red spectrum:
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Y KBr: 3456, 175S 1668, 1632, 1612 (bearing) 1234, 1060 cm-1.
Ultraviolet spectrum: \ max: 242 m / u ethanol (14,200) ethanol EXAMPLE 42
EMI43.7
Preparation of 16,21-diaceto-, 20 - .. dxceto-.9alpha-.fluaro .. llbeta, l6alpha, l7alpha, 21-tû'trahydroxy- '' -pregnadiene.
A culture is washed on tube agar agar.
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In tests, using 5 cm3 of sterile saline solution, a suspension of Ccrynebacterium simplex spores is obtained, which is added to 100 cm3 of sterile trypticase soy broth in a 500 cm3 Erlenmeyer flask.
The mixture is incubated at 32 ° C for 8 hours. 1 cc of this culture is used to inoculate each of the ten vials each containing 100 cc of sterile trypticase soy broth. The ten flasks are incubated with shaking at 32 ° C for 16 hours. We add in
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each vial 20 mg of l6,21-diacetob3,20-diketo-9alpha- fl.uoro-llbéta al6alpha alph.a, 21 .-- tetrah ydroxy-d-pregnant, dissolved in 2 cm3 of ethanol, and the contents of the vials are collected. The overall solution is extracted several times with a large volume of methylene chloride, washed with saturated saline solution, and evaporated under reduced pressure.
The residue is dissolved in methanol, treated with activated charcoal, filtered through diatomaceous earth, and again evaporated to give 277 mg of oil, which is acetylated overnight. Chromatography on a paper strip indicates approximately equal amounts of substrate and more
EMI44.2
polaira16,21-diaaeto-3,20-diketo9a3.phafluorollbta l6alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy-1,4¯prègnadiene), as well as very small amounts of two less polar products. By partition chromatography of 0.25 g of the residue (diatomaceous earth column) system: 2 parts of ethyl acetate, 3 parts of petroleum ether (90-100 C), 3 parts of methanol and 2 parts of water), the less polar products and the substrate are separated.
The desired product, at maximum polarity, remains on the column and is eluted with 500 cc of methanol. The residue (90 mg) obtained by evaporation of the methanol is taken, and it is distributed again over diatomaceous earth (system: 3 parts
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ethyl acetate, 2 parts petroleum ether (90-100 C), 3 parts methanol and 2 parts water), and the fraction containing the desired product is evaporated under reduced pressure ( determined by ultraviolet absorption spectrum), to give $ 1 mg of solid.
Crystallization from acetone-petroleum ether gives 13 mg of colorless needles of 16,21-diaceto-3,20-diketo-9alpha-
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fluoro-llbeta, l6alpha-17alpha, 21-tetrahydroxy-U, 1'-pregnadmene; melting point (K / Fler block): about 150-240 C, with apparent loss of solvent at 150 C. Recrystallization from acetone and petroleum ether does not change the melting point. Ultra-violet spectrum:
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Max. mu (15,200); spectrum in acid ale.abs. ' 239 miu ((¯ 20?); Spectrum in sulfuric acid: / \ ma ** 26l, 30 $ i 387 mil.
The 2,4-bis-dinitrophenylhydrazone H2SO4 of the above compound is prepared and
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determines its ultra-violet absorption spectrum: A max. 258) 300 (inflection), 312 (inflection), and 400 m / u.
EXAMPLE 48
EMI45.4
3,20-diketo-9alpha-fluoro-llbeta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy-1,4¯pregnadiene.
100 mg of 16,21-diaceto-3,20-diketo 9alpha-fluoro-11beta, 16alpha, 17alpha, 21-tetrahydroxy-1 'are dissolved. Pregnadiene in 10 cm3 of methanol and cooled to 0 C.
After flushing with nitrogen, a solution of 35 mg of potassium hydroxide in 2 cm 3 of methanol is added to the steroid solution.
Allowed to stand for 1 hour at room temperature) then the solution is neutralized, and the glacial acetic acid is evacuated under a nitrogen atmosphere until:
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obtaining a white solid. Water is added, and after cooling the product is filtered and washed with water.
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to obtain 52 mg of 3,20-diketo-, 9alpha-fl.iioro-llbêta, l6alpha, l7alph, 2ltétra.ydrox5r - ,, 1''pregnadi.ëne, melting point 246-249 C. Three crystallizations in the metal - acetone-petroleum ether mixture gives 29 mg of tetrol, melting point 260-262.5 Analysis:
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Calculated for CZIH2706F: c = 63.94; H = 6.90%; F- 4.82%; Effective C = 6.,19; H = 717%; F = 4.90
CLAIMS 1.
New steroids of the # 1,4-Pregnadiene series having the following general formula:
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in which X is a hydfogen or halogen atom, Y is a methylene, hydrcxymethylene or carbonyl group,
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Z is a methylene, hydroxymethylene or lower alkyloxymethylene group, R 'is a hydrogen atom or a
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hydroxyl group and R is an atom ü s n frûr:; c or a
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