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La présente invention a notamment pour objet un nouveau pro- cédé pour la préparation de produits d'oxydation de la série des stéroïdes, en particulier pour la dégradation de la chaîne latérale de composés du prégnane et pour la préparation par voie biochimique de composés non saturés de la série de l'androstane.
Le procédé est caractérisé en ce que l'on fait agir, sur des composés saturés ou non saturés de l'androstane ou du prégnane ayant en position 3 et en position 17 ou 20 un hydroxyle ou un oxo libre ou protégé, la culture d'un eumycète ou les enzymes qu'elle renferme.
Pour la culture des champignons, par exemple des phycomycètes comme des mucoracées (Rhizopus suinus et analogues), des ascomycè- tes ou des Fungi imperfecti comme des tuberculariacées, par exemple des espèces de Fusaria (F.Solani, F. caucasicum et analogues), sont appropriés les milieux connus en soi comme idoines, par exemple ceux qui renferment des sucres tels le glucose ou le lactose, des peptones, de l'eau de gonflement du mais, des produits du soja et analogues, ainsi que les milieux renfermant des sels minéraux ou des solutions nutritives synthétiques. On travaille en particulier dans des conditions aérobies, par exemple dans une culture d'agitation ou dans une culture immergée avec agitation et amenée d'air.
Les eumycètes se distinguent des autres microorganismes, par exemple des bactéries, par une bonne croissance dans des conditions de culture relativement simples. La réaction du procédé selon l'invention s'effectue dans la culture de champignons décrite ou à l'aide des enzymes qu'elle renferme, le cas échéant enrichis ou séparés, ou plus simplement dans une suspension du mycelium séparé du champignon, dans une suspension du mycélium de champignon homogénéisé ou dans des filtrats desdites suspensions ou des extraits aqueux du mycélium.
Les substances de départ du nouveau procédé sont des composés saturés ou non saturés de la série du prégnane et de l'androstane, par exemple la progestérone, la 11-déhydroprogestérone, les 11-, 12-
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ou 14-hyàroxy-progestérones, les A - ou A 4-prégnène-3-ol-20-ones, les -prégnéne-3,20-diols, la 11-désoxy orticostrone, la corticostérone, la 11-déhydrocorticoséronee la 6 - ou 0 -androstène-3el7dione, la testostérone, la A -androstène-3-ol-17-one, l'adrénostérone, la prégnane-3,20-diDne, la prégnane-3-ol-20-one, l'androstane- 3,17-dione, l'alloprégnane-3,20-dione, la 3 ss -acétoxy-alloprégnane- 20-one et les composés correspondants avec des hydroxyles ou des oxo protégés.
Dans les substances de départ, l'hydroxyle protégé se trouve être estérifié, par exemple par un acide carboxylique aliphatique, aromatique ou hétérocyclique comme l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide benzoïque ou l'acide furanne-carboxylique, ou éthérifié, par exemple sous forme de tétrahydropyrannyloxy, de benzyloxy, ou de triphénylméthoxy.
Le groupe oxo protégé est avantageusement un groupe oxo cétalisé, dérivant notamment d'un alcool divalent, comme le groupe éthy- lène-dioxy. En outre, les substances de départ peuvent renfermer des doubles liaisons, par exemple en position 4, 5, 6, 7, 8, 9:11, 11 ou 14, ou porter des substituants supplémentaires, comme des hydroxyles, des oxo ou des carboxyles libres ou protégés, ainsi que des époxy ou des atomes d'halogène, par exemple en position 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15 ou 21. Les substances de départ indiquées ci-dessus sont d'une configuration stérique quelconque et englobent aussi celles appartenant aux séries dites Nor- et/ou Homo-.
Le procédé peuttaussi être effectué
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avec des mélanges qui renferment une ou plusieurs des substances de départ indiquées ci-dessus. Ainsi,par exemple, en partant de la fraction neutre formé lors de l'oxydation de la cholestérine, et après déshydrogénation de l'hydroxyle en position 3 notamment, on obtient
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entre autres la A '-anàrostaàiène-3,17-dione*
L'isolement des produits du procédé peut être entrepris suivant des méthodes connues.
Leur séparation peut par exemple être effectuée par extraction du mélange réactionnel avec un solvant organique, par exemple avec du chlorure de méthylène ou de l'acétate d'é- thyle. Pour une purification plus poussée de l'extrait ainsi obtenu, conviennent particulièrement bien :la chromatographie, par exemple sur de l'oxyde d'aluminium ou sur du gel de silice, l'emploi de méthodes de répartition, par exemple le procédé à contre-courant, ou la séparation à l'aide de réactifs de Girard, tel l'hydrazide de l'acide trimêthylammonium- ou pyridinium-acétique. A la suite de cette purification ou à sa place, on opère de préférence une recristallisation dans des solvants organiques ou des solvants organiques aqueux.
Avec ce nouveau procédé biochimique, on peut.en utilisant
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par exemple des Gunfi imperfecti, transformer en L1 ,4-androstadiène- 3,17-dione, en un seul stade opératoire et avec un rendement élevé, par exemple la progestérone, de même que la #5-prégnène-3 ss -ol-20-
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one, la 11-désoxy-corticostérone ou la â 4-androstène-3,I7-dione.
Cette transformation n'est possible par voie chimique que suivant un procédé en plusieurs stades et d'ailleurs avec un rendement global no-
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tablement plus bas. Le produit "réactionnel indiqué est une matière de départ importante pour la synthèse de l'oestrone en un stade opératoire unique. A partir des composés du prégnana saturés dans les positions 4,5 et 5,6 et portant en position 3 un hydroxyle ou un oxo libre ou protégé, on peut obtenir, suivant la durée d'incubation, les 17-cétones saturées correspondantes¯=ou leurs dérivés déshydrogénés dans le
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cycle A, par exemple les ls l'4- androstadiène-3,I7-diones.
De ma- nière analogue, on obtient à partir de composés de l'androstane saturés correspondants, les dérivés déshydrogénés dans le cycle A. Avec une incubation plus longue, on obtient, à partir de la progestérone, de
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la A le 4-androstadiène-3,17-dione et à partir des autres substances de départ indiquées, un nouveau composé, à savoir la 1,2-déhydro-testolactone, fondant à 219-220 et ayant un pouvoir rotatoire spécifique
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1 L] 2= - 49 ¯+ 3 ( e = 1,025 dans le chloroforme). Ce composé pré- sentedans le spectre ultra-violet, à 242 m , également une forte ban- de (log . = 4,23) et il renferme 75,70 % de carbone et 8,05% d'hy- drogène (calculé pour C19H2 0 ; C = 75,97%; H =. 8,05%).
En utilisant d'autres champignons, pa exemple les phycomycètes, on obtient à la place de ce composé la testolactone déjà connue.
L'invention concerne également à titre de produits indus- triels nouveaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé défini plus haut.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent.
Exemple 1.
On répartit en quantités égales dans 13 fioles coniques de 1 litre de capacité chacune, 4 litres d'une solution nutritive constituée
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par 30 cm3 d'eau de gonflement de mais, 50 grammes de peptone, 200 mg de glucose brut et de l'eau du robinet, puis stériliseo Le pH de ces solutions est de 6,4. On les incube avec une culture du champignon Fusarium solani et agite mécaniquement à 25 . Au bout de 48 heures, le champignon s'est fortement multiplié. Dans des conditions stériles, on répartit entre les 13 fioles coniques, une solution de 1,0 g de progestérone dans 45 cm3 c'acétone. On agite encore 48 heures à 25 et sépare alors le mycélium par filtration.
Le pH du filtrat de culture atteint maintenant 7,90
On agite la solution avec une fois 1500 cm3, à deux reprises avec chaque fois 1000 cm3 et finalement à deux reprises avec chaque fois 500 cm3 de chlorure de méthylène On lave l'extrait à deux reprises avec chaque fois 300 cm3 d'acide chlorhydrique décinormal, à deux reprises avec chaque fois 300 cm3 d'une solution à 1% de bicarbonate de sodium et à trois reprises avec chaque fois 300 cm3 d'eau, le sèche sur du sulfate de sodium et l'évapore sous vide. On chromatographie, suivant la méthode par traversée, le résidu partiellement cristallisé (1,14 g), dissous dans un mélange 6:4 de benzène et d'éther de pétrole, sur une colonne contenant 30 g d'oxyde d'aluminium.
On réunit les éluats obtenus avec le benzène et le mélange d'éther de pétrole et de benzène et opère une cristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole. On obtient des paillettes rhombiques incolores, appartenant à une seule substance, d'après la
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chromatographie sur papier, et fondant à 145 - 14 ;jdJ D = + 110 + 4 (dans le chloroforme); -n = + 112 ¯+ 4 (dans l'alcool). Ce composé est la A l4-androstadiène-3,,17-dione, substance connue. Le rendement est de 80 % environ.
Si, à la place de la solution de progestérone, on ajoute à une culture identique de Fusarium solani une solution de 1 g de
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11-dêsoxy-corticostérone ou de 1 g de 4 '-androstène-3,17-dione dans 45 cm3 d'acétone, traite la culture de la manière décrite cidessus et isole le produit de réaction, on obtient alors, également
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avec un rendement élevé, la à ' -andros-tène-317-dione.
Si l'on remplace la culture de Fusarium solani par une culture de Fusarium caucasicum ensemencée sur le même fond nutritif, la progestérone est alors transformée, avec un rendement identique , en
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0 l'4-androstadiène-3,7-dioneo Exemple 2.
A 4 litres d'une culture de Fusarium solani préparée comme dans l'exemple 1, on ajoute dans des conditions stériles une solution de 1,0 g de # 5¯prégnène-3 -ol-20-one dans 37 cm3 de méthanol. On agite encore la culture pendant 48 heures à 26 , sépare ensuite le mycélium par filtration et extrait le filtrat de culture avec du chlorure de méthylène, comme décrit dans l'exemple 1.
On chromatographie, suivant la méthode par traversée, le résidu d'extraction, dissous dans un mélange 8 :2 benzène et d'é- ther de pétrole, sur une colonne contenant 30 g d'oxyde d'aluminium.
On réunit les premières fractions (environ 140 mg) obtenues à partir du mélange de benzène et d'éther de pétrole et opère une cristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole. Les paillettes rhombiques obtenues, fondant à 145 - 146 , sont constituées par de la
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# 1,4-androstadiène-3,17-dione. D'autres fractions du chromatogramme renferment, en plus petite quantité , de la 1 -androstène-3 ss -ol- 17-one.
Exemple 3.
A 40 litres d'une culture de Fusarium solani préparée sui- vant l'exemple 1 dans un récipient de culture usuel, en agitant et en aérant, on ajoute une solution, dans 700 cm3 d'acétone, de 20 g de la fraction neutre obtenue par oxydation à l'acide chromique du dibromure d'acétate de cholestéryle, suivie d'une débromation, d'une hydrolyse puis d'une déshydrogénation selon Oppenauer. Après l'incubation, com- me elle est décrite dans l'exemple 1, puis isolement du produit réactionnel, on obtient 52 g de # @, -androstadiène-3,17-dione.
Exemple 4.
A 4 litres d'une culture de Fusarium caucasicum préparée suivant l'exemple 1, on ajoute une solution de 1 g de # -andro- stadiène-3,17-dione dans 35 cm3 d'acétone. Après une incubation de 7 jours, on poursuit le traitement comme décrit dans l'exemple 1 et purifie l'extrait obtenu suivant la méthode de démixtion. Par re- cristallisation dans l'acétone, on obtient finalement environ 60% d'un nouveau composé, la 1,2-déhydro-testolactone, fondant à 219-220 , de pouvoir rotatoire spécifique [[alpha]]22D = - 49 # 3 (c = 1,025 dans le chloroforme). Spectre ultra-violet: # max. = 242 m ; log # =4,23.
Microanalyse : C = 75.70% ; H = 8,05 %.
On obtientle même composé en travaillant dans les conditions de l'exemple,-!, à partir de progestérone, de -prégnène- 3,20-dione, de 4# 5-prégnène-3ss -ol-20-one, de 11-désoxy-corticostérone ou de # 4-androstène-3,17-dione, lorsqu'on incube pendant six à dix jours au lieu de deux jours.
Exemple 5.
En ensemence de Fusarium solani trois fioles coniques de 200 cm3, renfermant chacune 50 cm3 de la solution nutritive stérile décrite dans l'exemple 1, agite mécaniquement, à 26 ,pendant 48 heu- res. On ajoute alors à chaque culture une solution de 10 mg d'allo- prégnane-3,20-dione dans 0,5 cm3 d'acétone et continue d'agiter à 26 .
Après 24 heures, 48 heures et 7 jours, on filtre chaque fois une des cultures et extrait comme décrit dans l'exemple 1. On examine les trois résidus d'extraction (1-3) par chromatographie sur papier. Les extraits 1 e t2 renferment de l'androstane-3,17-dione et l'extrait 3 de la # 1,4-androstadiène-3,17-dione.
Si, au lieu d'alloprégnane -3,20-dione, on ajoute une so- lution analogue de 3ss -acétoxy-alloprégnane-20-one, on trouve éga- lement dans les extraits, après 24 et 48 heures d'incubation, de l'androstane-3,17-dione, et après 7 jours d'incubation, de la # 1,4- androstadiène-3,17-dione. Si l'on remplace l'alloprégnane-3,20-dione par de l'androstane-3,17-dione, on trouve alors dans les extraits, après 24 heures et 48 heures d'incubation, simplement la matière.de départ inchangée, et après sept jours d'incubation, de la # ,4-an- drostadiène-3,17-dione.
Exemple 6.
Dans deux récipients agitateurs, on répartit en quantités
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égales 4 litres d'une solution nutritive dite de Czapek et Dox, sté- rilise et ensemence avec une culture du champignon Rhizopus suinus.
Après une agitation à 26 pendant deux jours, le champignon s'est bien développé et l'on ajoute dans chaque récipient, dans des conditions stériles, une solution de 500 mg de 11-désoxy-corticostérone dans 15 cm3 d'acétone. On agite encore pendant 4 jours à 26 et sépare alors le mycélium par filtration. Le filtrat de culture est extrait par agi- tation comme déjà décrit et l'extrait est lavé, séché et évaporé, On fractionne le résidu (1,0 g) par le procédé à contre-courant. Pour ce- la, on le dissout dans 50 cm3. d'éthanol absolu et 150 cm3 d'eau et l'extrait avec 200 cm3 de benzène. On sépare la couche inférieure et la fait passer au travers de quatre entonnoirs séparateurs contenant chacun 200 cm3 de benzène saturé d'éthanol à 25%.
On répète cette fa- çon de procéder à quatre reprises, avec chaque fois 200 cm3 d'éthanol à 25% saturé de benzène, de sorte qu'on est finalement en présence de 5 phases benzéniques et de 5 phases alcooliques aqueuses. On les éva- pore sous vide. L'examen chromatographique sur papier indique que les phases alcooliques aqueuses contiennent peu de sous-produits fortement polaires, tandis que les trois premières phases beezéniques renferment 650 mg d'un composé qui est un peu plus fortement polaire que la ma- tière de départ et qui ne possède pas de pouvoir réducteur.
Par cristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole, on obtient la testolactone sous forme d'aiguilles fondant à 203 - 206 ; [[alpha]]D = + 40 ( c = 1,065 dans le chloroforme); bandes d'absorption dans l'infrarouge à 5,81 , 5,98 et 6,17 (nujol).
Microanalyse: trouvé C = 75,26%, H = 8,80 %.
Calculé pour : C19H2603 ' C = 75,46%, H = 8,67 %.
REVENDICATIONS.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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A subject of the present invention is in particular a new process for the preparation of oxidation products of the steroid series, in particular for the degradation of the side chain of pregnant compounds and for the biochemical preparation of unsaturated compounds. from the Androstane series.
The method is characterized in that one causes to act, on saturated or unsaturated compounds of androstane or pregnane having in position 3 and in position 17 or 20 a hydroxyl or a free or protected oxo, the culture of an eumycete or the enzymes it contains.
For the cultivation of fungi, for example phycomycetes such as mucoraceae (Rhizopus suinus and the like), ascomycetes or Fungi imperfecti such as tuberculariaceae, for example species of Fusaria (F. Solani, F. caucasicum and the like), suitable are media known per se to be suitable, for example those which contain sugars such as glucose or lactose, peptones, corn swelling water, soybean products and the like, as well as media containing salts minerals or synthetic nutrient solutions. Work is carried out in particular under aerobic conditions, for example in an agitation culture or in an immersed culture with agitation and supplied with air.
Eumycetes are distinguished from other microorganisms, for example bacteria, by good growth under relatively simple culture conditions. The reaction of the process according to the invention is carried out in the culture of fungi described or using the enzymes which it contains, enriched or separated where appropriate, or more simply in a suspension of the mycelium separated from the fungus, in a suspension of the homogenized fungal mycelium or in filtrates of said suspensions or aqueous extracts of the mycelium.
The starting substances of the new process are saturated or unsaturated compounds of the pregnane and androstane series, for example progesterone, 11-dehydroprogesterone, 11-, 12-
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or 14-hyàroxy-progesterones, A - or A 4-pregnen-3-ol-20-ones, -pregne-3,20-diols, 11-deoxy orticostrone, corticosterone, 11-dehydrocorticoserone la 6 - or 0 -androstene-3el7dione, testosterone, A -androstene-3-ol-17-one, adrenosterone, pregnan-3,20-diDne, pregnan-3-ol-20-one, androstane - 3,17-dione, allopregnan-3,20-dione, 3s -acetoxy-allopregnan-20-one and the corresponding compounds with hydroxyls or protected oxo.
In the starting materials, the protected hydroxyl is found to be esterified, for example by an aliphatic, aromatic or heterocyclic carboxylic acid such as acetic acid, propionic acid, benzoic acid or furan-carboxylic acid, or etherified, for example in the form of tetrahydropyranyloxy, benzyloxy, or triphenylmethoxy.
The protected oxo group is advantageously a ketalised oxo group, deriving in particular from a divalent alcohol, such as the ethylene-dioxy group. In addition, the starting substances may contain double bonds, for example in position 4, 5, 6, 7, 8, 9:11, 11 or 14, or carry additional substituents, such as hydroxyls, oxo or carboxyls free or protected, as well as epoxies or halogen atoms, for example in position 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15 or 21. The starting substances indicated above are of any steric configuration and also include those belonging to the so-called Nor- and / or Homo- series.
The process can also be carried out
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with mixtures which contain one or more of the starting substances indicated above. Thus, for example, starting from the neutral fraction formed during the oxidation of cholesterin, and after dehydrogenation of the hydroxyl in position 3 in particular, one obtains
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including A '-anàrostaàiene-3,17-dione *
The isolation of the products of the process can be carried out according to known methods.
Their separation can, for example, be carried out by extracting the reaction mixture with an organic solvent, for example with methylene chloride or ethyl acetate. For further purification of the extract thus obtained, the following are particularly suitable: chromatography, for example on aluminum oxide or on silica gel, the use of distribution methods, for example the process against -current, or separation using Girard reagents, such as hydrazide of trimethylammonium or pyridinium-acetic acid. Following this purification or in its place, a recrystallization is preferably carried out from organic solvents or aqueous organic solvents.
With this new biochemical process, we can.
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for example Gunfi imperfecti, transforming into L1, 4-androstadiene-3,17-dione, in a single stage and with a high yield, for example progesterone, as well as # 5-pregnene-3 ss -ol- 20-
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one, 11-deoxy-corticosterone or -4-androstene-3, I7-dione.
This transformation is only possible chemically by following a process in several stages and moreover with an overall yield no
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table lower. The indicated reaction product is an important starting material for the synthesis of estrone in a single stage. From the pregnant compounds saturated in positions 4,5 and 5,6 and bearing in position 3 a hydroxyl or a hydroxyl. free or protected oxo, depending on the incubation period, the corresponding saturated 17-ketones ¯ = or their dehydrogenated derivatives can be obtained in the
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ring A, for example ls-4-androstadiene-3, I7-diones.
Similarly, the dehydrogenated derivatives in ring A are obtained from the corresponding saturated androstane compounds. With a longer incubation, progesterone is obtained from progesterone.
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A, 4-androstadiene-3,17-dione and from the other starting substances indicated, a new compound, namely 1,2-dehydro-testolactone, melting at 219-220 and having specific optical rotation
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1 L] 2 = - 49 ¯ + 3 (e = 1.025 in chloroform). This compound shows in the ultra-violet spectrum, at 242 m, also a strong band (log. = 4.23) and it contains 75.70% carbon and 8.05% hydrogen (calculated for C19H20; C = 75.97%; H =. 8.05%).
By using other fungi, eg phycomycetes, we obtain instead of this compound the already known testolactone.
The invention also relates, as new industrial products, to the compounds obtained by carrying out the process defined above.
The invention is described in more detail in the non-limiting examples which follow.
Example 1.
Distribute in equal quantities in 13 conical flasks of 1 liter capacity each, 4 liters of a nutrient solution made up of
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per 30 cm3 of corn swelling water, 50 grams of peptone, 200 mg of raw glucose and tap water, then sterilized. The pH of these solutions is 6.4. They are incubated with a culture of the fungus Fusarium solani and shaken mechanically at 25. After 48 hours, the fungus multiplied strongly. Under sterile conditions, a solution of 1.0 g of progesterone in 45 cm3 of acetone is distributed among the 13 conical vials. Stirred for another 48 hours at 25 hours and the mycelium is then separated by filtration.
The pH of the culture filtrate is now 7.90
The solution is stirred with once 1500 cm3, twice with 1000 cm3 each time and finally twice with 500 cm3 of methylene chloride each time.The extract is washed twice with 300 cm3 of decinormal hydrochloric acid each time , twice with 300 cm3 of a 1% solution of sodium bicarbonate each time and three times with 300 cm3 of water each time, dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo. The partially crystallized residue (1.14 g), dissolved in a 6: 4 mixture of benzene and petroleum ether, is chromatographed by the pass-through method on a column containing 30 g of aluminum oxide.
The eluates obtained are combined with benzene and the mixture of petroleum ether and benzene and crystallization is carried out from a mixture of acetone and petroleum ether. Colorless rhombic flakes are obtained, belonging to a single substance, according to the
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chromatography on paper, and melting at 145 - 14; jdJ D = + 110 + 4 (in chloroform); -n = + 112 ¯ + 4 (in alcohol). This compound is A 14-androstadiene-3 ,, 17-dione, known substance. The yield is approximately 80%.
If, instead of the progesterone solution, an identical culture of Fusarium solani is added to a solution of 1 g of
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11-desoxy-corticosterone or 1 g of 4'-androstene-3,17-dione in 45 cm3 of acetone, treat the culture as described above and isolate the reaction product, then, also obtained
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in high yield, α -andros-tene-317-dione.
If the culture of Fusarium solani is replaced by a culture of Fusarium caucasicum sown on the same nutrient background, progesterone is then transformed, with an identical yield, into
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0 4-androstadiene-3,7-dioneo Example 2.
To 4 liters of a Fusarium solani culture prepared as in Example 1, a solution of 1.0 g of # 5¯pregnene-3 -ol-20-one in 37 cm3 of methanol is added under sterile conditions. The culture is further stirred for 48 hours at 26, then the mycelium is filtered off and the culture filtrate extracted with methylene chloride, as described in Example 1.
The extraction residue, dissolved in an 8: 2 mixture of benzene and petroleum ether, is chromatographed by the pass-through method on a column containing 30 g of aluminum oxide.
The first fractions (approximately 140 mg) obtained from the mixture of benzene and petroleum ether are combined and crystallization is carried out from a mixture of acetone and petroleum ether. The rhombic flakes obtained, melting at 145 - 146, consist of
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# 1,4-androstadiene-3,17-dione. Other fractions in the chromatogram contain smaller amounts of 1 -androstene-3 ss -ol-17-one.
Example 3.
To 40 liters of a Fusarium solani culture prepared according to Example 1 in a usual culture vessel, with stirring and aeration, a solution, in 700 cm3 of acetone, of 20 g of the neutral fraction is added. obtained by chromic acid oxidation of cholesteryl acetate dibromide, followed by debromination, hydrolysis and then dehydrogenation according to Oppenauer. After incubation, as described in Example 1, followed by isolation of the reaction product, 52 g of # @, -androstadiene-3,17-dione are obtained.
Example 4.
To 4 liters of a Fusarium caucasicum culture prepared according to Example 1, a solution of 1 g of # -androstadiene-3,17-dione in 35 cm3 of acetone is added. After an incubation of 7 days, the treatment is continued as described in Example 1 and the extract obtained is purified according to the demixing method. By recrystallization in acetone, we finally obtain about 60% of a new compound, 1,2-dehydro-testolactone, melting at 219-220, specific optical rotation [[alpha]] 22D = - 49 # 3 (c = 1.025 in chloroform). Ultra-violet spectrum: # max. = 242 m; log # = 4.23.
Microanalysis: C = 75.70%; H, 8.05%.
The same compound is obtained by working under the conditions of the example, - !, from progesterone, from -pregnene-3,20-dione, from 4 # 5-pregnene-3ss -ol-20-one, from 11- deoxy-corticosterone or # 4-androstene-3,17-dione, when incubated for six to ten days instead of two days.
Example 5.
Inoculated with Fusarium solani, three conical flasks of 200 cm3, each containing 50 cm3 of the sterile nutrient solution described in Example 1, stirred mechanically at 26 for 48 hours. A solution of 10 mg of allopregnan-3,20-dione in 0.5 cm3 of acetone is then added to each culture and stirring is continued at 26.
After 24 hours, 48 hours and 7 days, one of the cultures is filtered each time and extracted as described in Example 1. The three extraction residues (1-3) are examined by chromatography on paper. Extracts 1 and t2 contain androstane-3,17-dione and extract 3 of # 1,4-androstadiene-3,17-dione.
If, instead of allopregnan -3,20-dione, an analogous solution of 3ss -acetoxy-allopregnan-20-one is added, one also finds in the extracts, after 24 and 48 hours of incubation, androstane-3,17-dione, and after 7 days of incubation, # 1,4-androstadiene-3,17-dione. If allopregnan-3,20-dione is replaced by androstan-3,17-dione, then one finds in the extracts, after 24 hours and 48 hours of incubation, simply the unchanged starting material. , and after seven days of incubation, #, 4-an-drostadiene-3,17-dione.
Example 6.
In two stirring vessels, distribute in quantities
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equal 4 liters of a nutrient solution known as Czapek and Dox, sterilize and inoculate with a culture of the fungus Rhizopus suinus.
After stirring at 26 for two days, the fungus had grown well and to each vessel, under sterile conditions, a solution of 500 mg of 11-deoxy-corticosterone in 15 cm3 of acetone was added. Stirred for another 4 days at 26 and then the mycelium is separated by filtration. The culture filtrate is extracted by stirring as already described and the extract is washed, dried and evaporated. The residue (1.0 g) is fractionated by the countercurrent method. For this, it is dissolved in 50 cm3. of absolute ethanol and 150 cm3 of water and the extract with 200 cm3 of benzene. The lower layer is separated and passed through four separating funnels each containing 200 cm3 of benzene saturated with 25% ethanol.
This procedure is repeated four times, each time with 200 cm 3 of 25% ethanol saturated with benzene, so that there are finally 5 benzene phases and 5 aqueous alcohol phases. They are evaporated under vacuum. Chromatographic examination on paper indicates that the aqueous alcohol phases contain few strongly polar by-products, while the first three beezene phases contain 650 mg of a compound which is somewhat more highly polar than the starting material and which has no reducing power.
By crystallization from a mixture of acetone and petroleum ether, testolactone is obtained in the form of needles, melting at 203-206; [[alpha]] D = + 40 (c = 1.065 in chloroform); absorption bands in the infrared at 5.81, 5.98 and 6.17 (nujol).
Microanalysis: found C = 75.26%, H = 8.80%.
Calculated for: C19H2603 'C = 75.46%, H = 8.67%.
CLAIMS.
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