<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention concerne un procédé particulier de prépara- tion de déhydro-composés de la série des stéroïdes, présentant une double
EMI1.1
liaison en position 1,2 et ., 5,
Le procédé décrit dans la demande de brevet déposée en Belgique par la demanderesse le 20 août 1954 et ayant pour titre : "Procédé de prépa- ration de produits d'oxydation de la série des stéroïdes." concerne la dé- gradation par voie bio-chimique de la chaîne latérale de composés du prégna- ne en composés de l'androstane et, éventuellement, la scission de l'anneau D, avec introduction simultanée d'une double liaison en 1,2 et éventuelle- ment en 4,5.
De cette manière on peut, par exemple, transformer la proges-
EMI1.2
térone, comme d'ailleurs le A 5-33 -hyd.roxy'^20 -oo-prégène,.a 11-désoxycor- ticostérone ou le 3,20-dioxo-alloprégnane, en un stade opératoire, enAl,4- 3,17-dioxo-androstadiène ou en 1,2-déhydro-testolactone.
La présente invention est relative à un procédé qui permet d'in-
EMI1.3
troduire une double liaison en 1,2 et/ou en Q., 5 par voie biochimique, dans des stéroïdes, notamment dans ceux de la série du prégnane, sans dégradation de la chaîne latérale ni ouverture d'anneau, ledit procédé étant caractéri- sé par le fait qu'il consiste à soumettre des stéroïdes saturés en position 1,2 et/ou en position 4,5, à l'action aérobie d'enzymes de Didymella lycoper- sici, de Calonectria décora, d'Alternaria passiflorae, d'Ophiobolus heteros- trophus ou d'Ophiobolus Miyabeanus.
Les stéroïdes utilisés comme substances de départ sont, par exem- ple, des dérivés du spirostane, de l'allospirostane, du furostane, de l'allo- furastane, du cholane, de l'allocholane, du prégnane, de l'alloprégnane, de l'androstane et du testane et ils présentent un groupe hydroxyle ou oxo, libre ou fonctionnellement modifié, de préférence en position 3.
Ils peuvent être saturés ou renfermer des doubles liaisons, par exemple en position 1 ou 4,
EMI1.4
ainsi qu'en position 5, 6, 7e 8, 9:lle 14 ou 16, ou renfermer encore des sub- stituants, par exemple des groupes hydroxyles, oxo ou carboxyliques, libres ou modifiés; de plus, des groupes époxy ou des atomes d'halogène, par exem- ple en position 6, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20 ou 21, ou des grou-
EMI1.5
pes méthyliques, par exemple en position 17a ou 17j3< Les substances de dé- part indiquons oi-dessus sont de :.-;.' importe quelle configuration stérique et peuvent aussi se présenter à l'état de raoémates.
Elles embrassent égale- ment les composés des séries dites noir- et/ou homo-, en particulier les 1- nor- et les D-homo-compcscs. Des substances de départ particulièrement im-
EMI1.6
portantes sont les comrC88S de la série du prêgnane renfermant en positions 3 et 20 des groupes hydro:
cyles ou oxo, libres ou fonctionnellement modifiés, par exemple la progestérone, la 11-dêhydro-pr.agestérone, les 11-., 12-, 14-e 15-, 16-, 17- ou 1.8-hydraxyprogestêrones9 lesd 5- ou /4-prégr-ène-3-ol-20- ones, les à 5-prëgnène-, 2U-d2ols la 11-désoxycorticostérone, la cortisone, l'hydrocortisone, la 11-opihydrooortisone, l'aldostérone, la 18-hydroxycorti- costérone, la 11-épi-18-hydroxycorticostérone, la 18-oxocorticostérone, la l7amhydroxy-al do,tcrone, la 18-hydroxyhydrocortisone, la 18-hydroxy- et la 18-oxo-cortisone, la 18-hydroxy et la 18-oxo-cortexone, la substance S de , Reichstein, la 18-hydroxy# et la 18-oxo-substance S (Reiahs.in, des com- posés correspondants non saturés en position 1 au lieu de l'être en position 4, la prégnane-3,20-dione, la prégnane-3-ol-20-one, l'alloprégnane-3,20-dio- ne, le prégnane et 1.
r alloprégnanew3 17,., 2Ci-tr.one-l7et, 21-dïol, le prégnane- et 1 alloprégnane-3,0-diane-ll(3,.1,21-triol, le prégnane- et l'alloprégna- ne-3,18,20-trione-llp,21-diol, le prégnane- et l'alloprégnane-3,20-dione-11(3, 18,21-triol, le prégnane- et l'alloprégnane-3,20-dione-18,21-diol, les 21- oxo-composes correspondants et/ou les 9a-fJ.uaro- et .-chloro.dêrivês, par exemple la 9<X-fluoro-oortisone, la 9'x-fluoro-hydrocortisone, la 9-luoro-al- dostérone et la 9a-fluoro.l8-hydroxycorticostêxone! de plus des composés de l'androstane saturés en position 1,2 et/ou en position .4>5> par exemple la
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
A 4# ou la 5-audrostène="3,l"7-=d.îone, la testostérone, la h 5-androstène 30? l7 ona 1'adrénos'cérone, l'axidrostane-3el7-dîone, les acides étiani- ques, par exemple les acides 4 4- ou 5-étlëniques,
les acides allo- étianiques présentant des groupes hydroxyles ou oxo notamment en position 3, 11 et/ou 18, des dérivés fonctionnels des composés indiqués, c'est-à-dire des composés correspondants comportant des groupes hydroxyles ou oxo fonc- tionnellement modifiés.
Dans les substances de départ, le groupe hydroxyle fonctionnellement modifié est par exemple un groupe hydroxyle estérifié par un acide carboxylique aliphatique, aromatique ou hétérocyclique, par exem- ple par les acides acétique, propionique, benzoique ou furanne-carboxylique, ou un groupe hydroxyle éthérifié, par exemple le groupe tétrahydropyranny# loxy, le groupe benzyloxy ou le groupe triphénylméthoxy. Le groupe oxo fonctionnellement modifié est avantageusement un groupe oxo cétalisé, déri- vant notamment d'un alcool divalent, par exemple le groupe éthylènedioxy.
Selon le procédé conforme à l'invention, on fait réagir les sub- stances initiales indiquées sur des enzymes de Didymella lycopersici, Calo- nectria décora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus ou Ophio- bolus Miyabeanus. Pour leur obtention on peut utiliser les cultures de ces champignons dans les milieux connus en soi comme appropriés, par exemple ceux qui renferment des sucres tels le glucose ou le lactose, des peptones, de l'eau de gonflement du mais, des produits provenant du soya et analogues, ainsi que des sels minéraux, ou les solutions nutritives synthétiques. On travaille en particulier dans des conditions aérobies, par exemple dans une culture agitée ou dans une culture immergée avec agitation et amenée d'air.
Les champignons indiqués se distinguent d'autres microorganismes, par exem- ple des bactéries, par une bonne croissance dans des conditions de culture relativement simples. La réaction du procédé selon l'invention s'effectue dans la culture de champignons décrite ou à l'aide des enzymes qu'elle ren- ferme, le cas échéant enrichis ou séparés, ou plus simplement dans une sus- pension du mycélium séparé du champignon, dans une suspension du mycélium de champignon homogénéisé ou dans des filtrats desdites suspensions ou des ex- traits du mycélium, contenant de l'eau.
On peut isoler les produits du procédé suivant des méthodes con- nues. Leur séparation peut être effectuée par exemple par extraction du mélange réactionnel avec un solvant organique, par exemple avec du chloru- re de méthylène ou de l'acétate d'éthyle. Pour une purification plus pous- sée de l'extrait ainsi obtenu, les opérations qui conviennent particuliè- rement bien, sont entre autres la chromatographie, par exemple sur de l'oxyde d'aluminium ou sur du gel de silice, l'emploi de méthodes de répar- tition, par exemple le procédé à contre-courant, ou la séparation à l'aide de réactifs de Girard, tel l'hydrazide de l'acide triméthylammonium# ou de
EMI2.2
l'acide pyridinium-acétiquee A la suite de cette purification ou à sa pla- ce, on effectue, de préférence,
une recristallisation dans des solvants or- ganiques ou dans des solvants organiques aqueux.
Par introduction de la double liaison en 1,2 et/ou en 4,5, on parvient à de précieux médicaments de la série des stéroïdes, en particulier de la série du prégnane qui, comparés aux composés thérapeutiquement actifs saturés en position 1,2, se caractérisent par une efficacité accrue.
Parmi
EMI2.3
les produits du procédé, il y a lieu de citer en particulier le Lu ly4-3ellg 20-trioxo-17a,, 21-dihydroxy-prégnadiène, le 14-320d.ioolli'I7as21tri hydroxy-prégnadiène, le l'4 3I1f20=triogo-2lmhydroxy=prégn.adiène le 1,4¯3,20=dioxo-ll,2l-dihydroxy-prégnadiène, le l'4-320diogo-17a21-di- hydroxy-prégnadiène, Ie 14-3,20.-dioxo-21 hydrogy prégnadiéne' le ! 14- 3,l8,20-trioxo-ll,21-dihydroxy-prégnadiène, le 14-3111820-têtrao$o- 21-hydroxy-prégnadiène, le,6 l'4 320=.dioxo113,18-21-trïhydroxy prégnadiè- ne , le194¯3,18s20-trioxoG11317a21trihydraxy prégnadzènei le14-311
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
18' 20tétraoxol7a' 21d.hydroxyvprégnadièney le± 1 4-3 20dioxo-113a l7ocy 18 21-tétrahydroxymprëgnadséney le,l4-3920-dioxo-.821-dihyâroxy-prégnadi:ne le A 1 4¯3Ji8,20-trioxo-21 liydroxy-prégnadiène, le 1,4-3,20-dioxo-17, 18'2ltrihyd:
oxy=prêgnadiène9 le a 1,4¯3,18,20-trioxo-17,21-dihydroxy-pré- gnadiène, les 21-oxo- ainsi que les 2idésoxy-composés correspondants, de plus des dérivés fonctionnels correspondants tels que les esters, les éthers, les dérivés halogènes, par exemple les composés 9<X-halogénés, notamment les composés fluorés et chlorés. Lorsque les produits du procédé ne présen- tent pas la configuration et les substituants de stéroïdes thérapeutiquement utilisables, ils peuvent servir de produits intermédiaires pour leur prépara- tion, par exemple pour la préparation des composés indiqués ci-dessus.
Les produits réactionnels obtenus conformément au procédé peuvent être transformés en leurs dérivés fonctionnels d'une manière en elle-même connue, par exemple en dérivés oxygénés, soufrés ou azotés, par exemple en esters, éthers, esters énoliques, éthers énoliques, cétals, thio-éthers, et thio-cétals, ainsi qu'en hydrazones, oximes et énamines. Dans ces com- posés, les groupes hydroxyles et/ou oxo peuvent être totalement ou partiel- lement modifiés du point de vue fonctionnel.
Dans les esters et dans les esters énoliques, les restes d'acide sont ceux d'acides organiques et inorganiques quelconques, par exemple ceux d'acides carboxyliques, thion-carboxyliques, thiol-carboxyliques ou sulfoni- ques aliphatiques, alicycliques, araliphatiques, aromatiques ou hétérocycli- ques, de préférence ceux des acides formique, acétique, chloracétique, tri-
EMI3.2
fluoracétique, propionique, butyriques, valériques, diéthylacétique, caproi- ques, oenanthiques, caprylique, palmitiques,crotonique, undécanique, undécy- lénique, oxalique, succinique, pimélique, maléïque, lactique, carbamiques,
EMI3.3
alcoxycarboxyliques, 3-cyclopentylpropioniqu.e hexahydrobenzoïque, benzoïque phénylacétique, cyclohexylacétique,
phénylpropioniques, triméthylgallique, phtalique, furanne-2-carboxylique, iso-nicotinique, méthane-sulfonique, to-
EMI3.4
luëne-sulfonique, sulfurique, des hydracides halogénés ou des acides phospho- riques.
Dans les composés obtenus, on peut, si on le désire, transformer en groupes libres les groupes hydroxyles ou oxo fonctionnellement modifiés.
De cette manière, on peut aussi mettre partiellement en liberté les groupes fonctionnellement modifiés, en particulier dans des dérivés polysubstitués.
Cela a lieu, par exemple, par une hydrolyse effectuée par voie chimique ou enzymatique, par exemple en utilisant des agents acides ou basiques, en pro- cédant à une alcoolysé ou à une acétalisation. A partir des dérivés seule- ment partiellement modifiés que l'on obtient de cette manière ou aussi di- rectement, par exemple à partir des dérivés estérifiés ou éthérifiés, on peut préparer des dérivés polysubstitués par modification fonctionnelle sub- séquente, par exemple par estérification ou éthérification, en particulier aussi des esters ou des éthers mixtes ou des esters-éthers.
Les produits du présent procédé peuvent être utilisés comme médi- caments ou comme produits intermédiaires pour la préparation de produits précieux.
La présente invention concerne également, à titre de produits industriels nouveaux, les produits définis ci-dessus.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non li- mitatifs qui suivent. Dans ces exemples, les températures sont indiquées en degrés centigrades.
Exemple l.
Dans un récipient agitateur, on stérilise 4 litres de moût de biè-
<Desc/Clms Page number 4>
re à 70% (pH 5,1) et ensemence avec 150 cm3 d'une culture d'agitation, âgée de 2 jours, de Calonectria decora dans du moût de bière à 70%. On agite le récipient pendant 24 heures à 27 ; la culture se développe bien. On ajou- te alors dans des conditions stériles une solution de 1 g de cortexone dans 25 cm3 d'acétone et continue d'agiter à 27 . Au bout de deux jours, on sé- pare le mycelium et le lave bien à l'eau et à l'acétate d'éthyle. Après avoir réuni les filtrats, on les extrait jusqu'à épuisement avec au total 4 litres d'acétate d'éthyle, lave les extraits à l'eau, les sèche et les évapore sous vide.
L'extrait brut ainsi obtenu (1,1 g) est chromatographié sur une colonne de 30 g de gel de silice suivant la méthode par passage, en éluant avec du chloroforme et avec des mélanges de chloroforme et d'acé- tone d'une teneur croissante en acétone. On examine les diverses fractions (chacune de 100 cm3) en les soumettant à une chromatographie sur papier.
Les fractions éluées avec du chloroforme ne renferment que des impuretés, tandis que, dans les fractions obtenues avec un mélange de chloroforme et d'acétone (9:1) se trouve une nouvelle substance qui, au chromatogramme sur papier (système propylèneglycol-toluène) migre un peu moins loin que la cortexone. Les fractions obtenues avec une teneur en acétone plus grande ne renferment que peu de matière hautement polaire. On réunit les fractions renfermant la nouvelle substance indiquée et les évapore sous vide. Par recristallisation du résidu dans des mélanges d'acétone et d'éther de pétro- le, on obtient avec un rendement presque quantitatif et à l'état pur la 1-dé hydro-cortexone qui fond à 185 - 192 .
Ce composé réduit rapidement et fortement une solution alcaline d'argento-diammine, L'analyse concorde avec la formule brute C21H2803 (calculé : C 76,79, H 8,59%, trouvé : C 76,67, H 8,84 %). Le spectre ultra-violet du composé libre montre une for- te bande avec un maximum à 244 m (¼ = 14,200), le spectre ultra-violet de la dinitro-phénylhydrazone présente une bande avec un maximum à 388 m ( ¼= 39,000). Les bandes correspondantes de la cortexone se situent respec- tivement à 240 m (¼ = 16,200) et à 378 m (¼= 39,000).
Exemple 2.
Si l'on utilise de la même manière, à la place de la culture de Calonectria décora décrite à l'exemple 1, des cultures d'Alternaria passi- florae, d'Ophiobolus heterostrophus ou d'Ophiobolus Miyabeanus pour la dés- hydrogénation de la cortexone, on obtient alors, après le traitement décrit à l'exemple 1, la 1-déhydro-cortexone avec un rendement élevé.
Exemple 3.
On cultive, comme décrit dans l'exemple 1, dans un récipient agi- tateur, 4 litres d'une culture de Calonectria decora et ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 1 g de cortisone dans 25 cm3 de métha- nol. On secoue ensuite le récipient à 27 . Au bout de quatre jours, on sé- pare le mycelium et extrait le filtrat de culture jusqu'à épuisement avec au total 3 litres d'acétate d'éthyle. Les extraits réunis sont lavés à l'eau, séchés et évaporés sous vide. Le résidu brut ainsi obtenu est chro# matographié, comme décrit à l'exemple 1, sur 30 g de gel de silice, suivant la méthode par passage. Les fractions éluées avec des mélanges de chloro- forme et d'acétone (6:4) sont constituées essentiellement par une substance qui est un peu plus polaire que la matière de départ.
On réunit ces frac- tions et les évapore sous vide. On recristallise la 1-déhydro-cortisone dans des mélanges d'acétone et d'éther. Elle fond à 231 - 234 ' Cette sub- stance réduit rapidement et fortement une solution alcaline d'argento-diam- mine et montre dans le spectre ultra-violet une forte absorption à 240 m (¼ = 15,800). Par acétylation avec un mélange de pyridine et d'anhydride acétique, on obtient le 21-acétate correspondant qui fond à 224-230 C.
D'une manière analogue, on peut préparer par exemple l'oenanthate ou l'un-,
<Desc/Clms Page number 5>
décylénate.
EMI5.1
Exem 1 s A 4 litres d'une culture bien développée de Calonectria décora, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 1 g d hydrocorti- sone dans 25 cm3 de méthanol. Après avoir agité pendant 4 jours à 27 , on extrait et chromatographie comme décrit à l'exemple 1. Les fractions éluées avec des mélanges de chloroforme et d'acétone (1:1) renferment une substance qui est un peu plus polaire que 1 hydrocortisone. On réunit ces fractions et les évapore. On recristallise la 1-déhydro-hydrocortisone dans le métha-
EMI5.2
nol ou dans des mélanges d'acétone et d'éther. Elle fond à 238 # 2410. El- le réduit rapidement et fortement une solution alcaline d'argento-diammine
EMI5.3
et montre dans le spectre ultraviolet une forte absorption à 244 ml.4-(Î 15,100
Exemple 5.
Dans une fiole conique d'une capacité de 500 cm3, on stérilise 150 cm3 de moût de bière à 70% et ensemence avec du Calonectria décora. On agite deux jours à 27 et ajoute à la culture alors bien développée, dans des conditions stériles, une solution de 30 mg d'aldostérone dans 1,5 cm3 d'acétone. On continue de secouer à 27 et au bout de 38 heures sépare le mycélium par filtration. On extrait le filtrat de culture jusqu'à épuise- ment à l'acétate d'éthyle, lave les extraits à l'eau, les sèche,et les évapo- re. Comme décrit à l'exemple 1, on chromatographie le résidu sur 1 g de
EMI5.4
gel de silice, en examinant les diverses fractions (chacune de 20 cm3), par chromatographie sur papier.
Dans les fractions éluées avec des mélanges de chloroforme et d'acétone (1:1) se trouve une substance qui est un peu plus polaire que l'aldostérone et qui réduit une solution alcaline d'argento-diam- mine. On la cristallise dans des mélanges d'acétone et d'éther et obtient la 1-déhydro-aldostérone. Dans le spectre ultra-violet elle montre une for- te absorption à 244 m
EMI5.5
Ee:;1J:1l e 0 1
On utilise 14 fioles coniques d'une capacité de 200 cm3 chacune et stérilise dans chacune d'elle 50 cm3 de moût de bière à 70%, qu'on ensemen- ce avec du Calonectria décora. Après avoir agité deux jours à 27 , les cul- tures se sont bien développées.
Dans des conditions stériles, on ajoute à chacune des 14 cultures l'un des 14 composés suivant (10 mg de chacun en so- lution dans 0,5 cm3 de méthanol) g la cortexone, la cortisone, l'hydrocor-
EMI5.6
tisone, la 17a=hydroxy-cortexone, la corticostérone,, la 11-épi-corticostér- ne, la 11épihydrocortisoneg l'aldostérone, la l'ahdroxraldostërone9 la progestérone, la prégnénolone, la 21-hydroxy-prégnénolone, la 5 an= drrsténe3ohl7one et I'androstène 3jl7-dione.
On continue d'agiter deux jours à 27 et extrait alors les cultures à l'acétate d'éthyle. L'exa- men chromatographique sur papier des divers extraits montre que toutes les
EMI5.7
substances de départ ont été transformées en l=-déhydro¯composés correspon-, dants possédant, par rapport aux substances de départ, une polarité légè- . rement accrue et se différenciant par leurs spectres de façon caractérisai- que des substances de départ indiquées.
Exemple 7.
Si l'on utilise pour déshydrogéner les substances indiquées à l'exemple 6, à la place des cultures de Calonectria decora décrites dans cet exemple, des cultures d'Alternaria passiflorae, d'Ophiobolus heteros- trophus ou d'Ophiobolus Miyabeanus, l'examen chromatographique sur papier des extraits montre alors que les produits formés sont les mêmes que ceux décrits à l'exemple 6.
<Desc/Clms Page number 6>
Exemple 8.
A 4 litres d'une culture bien développée de Calonectria décora,
EMI6.1
on ajoute dans des conditions stériles une solution de 1 g de 311,20-tri- céto# 17a,21-dihydroxy-alloprégnane dans 25 cm3 de méthanol. On agite 3 jours à 27 et sépare alors le mycelium. On exécute, de la même manière que celle décrite dans l'exemple 1, l'extraction des filtrats de culture et la chromatographie de l'extrait brut. Les fractions éluées avec des mé- langes de chloroforme et d'acétone (1:1) renferment la 1-déhydrocortisone que l'on obtient à l'état cristallin au moyen de mélanges d'acétone et d'é- ther. Elle fond à 230 - 233 et possède les propriétés décrites à l'exemple 3.
EMI6.2
Si, à la place de la solution de 3,11,20-tricéto-17tx,21-dihydroxy- alloprégnane, on ajoute une solution de 3ll,20-tricéto-17a,21-dihydroxy- prégnane, dans 25 cm3 de méthanol, aune culture analogue de Calonectria de- cora et traite de la manière décr±téy on obtient alors également la 1-dêhy- dro-cortisone avec un bon rendement.
Exemple 9.
Dans des conditions stériles, on ajoute, à 4 litres d'une culture
EMI6.3
de Calonectria décora, une solution de 1 g de 3,20-dicéto-llp,17a,21-trihy- droxy-alloprégnane dans 25 cm3 de méthanol, puis agite le mélange pendant 4 jours à 27 . On sépare alors le mycélium et effectue l'extraction du fil- trat de culture et la séparation chromatographique de l'extrait, comme on l'a décrit à l'exemple 1. A partir des fractions éluées avec des mélanges de chloroforme et d'acétone (1:1), on obtient, avec un bon rendement et à
EMI6.4
l'état cristallisé, la 1-déhydro-hydro-cort2sone qui fond à 239-242 et pos- sède les propriétés décrites à l'exemple 4.
Exemple 10.
A 4 litres d'une culture de Calonectria décora, on ajoute une so- lution de 1 g d'androstane-3,17-dione dans 25 cm3 d'acétone, dans des con- ditions stériles. Après avoir agité 36 heures à 27 , on sépare le mycelium et extrait le filtrat de culture jusqu'à épuisement avec du chlorure de mé- thylène. On lave l'extrait à deux reprises, chaque fois avec de l'acide chlorhydrique décinormal et avec une solution à 1% de bicarbonate de sodium, puis trois fois à l'eau, le sèche et l'évapore sous vide. On crhomatographie le résidu (1,2 g) sur 30 g d'oxyde d'aluminium suivant la méthode par passa- ge, en éluant avec des mélanges d'éther de pétrole et de benzène, avec du benzène, avec des mélanges de benzène et d'éther, et avec de l'éther.
Les fractions éluées avec le mélange d'éther de pétrole et de benzène et avec le
EMI6.5
benzène, renferment la V ls°-androstad.ièns-3,17-dione coxiue qui cristal- lise, dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole en paillettes rhombi-
EMI6.6
ques fondant à 145-146 ; [a]D = + 110 (chloroforme).
Exemple 11.
- f 22 A une solution de 40 mg de 1-déhydro-cortexone (rqq2 = + 120 dans le chloroforme) dans 2 cm3 de pyridine, on ajoute 2 cm3 d'anhydride acétique et laisse reposer à la température ambiante. Au bout de 16 heures, on évapore la solution sous vide à 30 et reprend le résidu dans un mélange de chloroforme et d'éther (1:4). On lave la solution à trois reprises, @ chaque fois avec de l'acide chlorhydrique décinormal, avec une solution à 2% de bicarbonate de sodium et à l'eau, la sèche et l'évaporé sous vide.
En recristallisant le résidu obtenu dans un mélange d'acétone et d'éther
EMI6.7
de pétrole, on obtient à l'état pur le 21-acétate de la 1-déhydro-cQrtexonei, qui fond à 203 - 205aaD = + 1340 (.dans le chloroforme).
<Desc/Clms Page number 7>
Exemple 12.
A 4 litres d'une culture de Calonectria decora obtenue comme dé- crit à l'exemple 1, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution
EMI7.1
de 1 g de ll-=déhydro-corticostérone dans 25 cm3 d'acétone. On agite pen- dant 3 jours à 27 et sépare alors le mycelium par filtration. L'extraction du filtrat de culture et la chromatographie de l'extrait brut sur du gel de silice sont exécutées comme décrit à l'exemple 1.
Les fractions obtenues
EMI7.2
au moyen de chloroforme et d'un mélange de chloroforme et d'acétone (955) renferment des impuretés et un peu de la substance de départ, tandis que les fractions obtenues avec un mélange de chloroforme et d'acétone (90sl0), sont essentiellement constituées par une substance qui, dans le chromato- gramme sur papier, migre un peu plus lentement que la matière de départ.
EMI7.3
Cette substance est le 19°31120-tricéto-21-hydroxyprégnadiène que l'on cristallise dans un mélange d'acétone et d'éther. Les cristaux se décompo- sent entre 200 et 220 , plus ou moins rapidement suivant la rapidité avec laquelle on les chauffe. Ce produit présente en ultra-violet, une absorption
EMI7.4
de 240 mjet montre dans l'infra-rouge, à 59 99 /-d- ' 6,14}-l- et 6,22JA- les ban- des caractéristiques du groupement A 1,4-3-cétonique. Par acétylation de ce produit au moyen de pyridine et d'anhydride acétique, on obtient le 21-acé- tate correspondant, fondant à 188-191 . On peut préparer d'une manière ana- logue l'oenanthate ou l'undécylénate.
Exemple 13.
EMI7.5
Lu..° litres d'une culture de Calonectria decora obtenue comme dé- crit à l'exemple 1, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 1 g de corticostérone dans 25 cm3 d'acétone. On agite 4 jours à 27 , puis sépare le mycélium par filtration. L'extraction du filtrat de culture et la chromatographie de l'extrait brut sur du gel de silice sont exécutées comme décrit à l'exemple 1. Les fractions éluées au moyen de chloroforme
EMI7.6
et d'un mélange de chloroforme et d'acétone (95s5) renferment des impuretés et de la matière de départ. Avec des mélanges de chloroforme et d'acétone
EMI7.7
(90sl0) et (80µ20)s on élue essentiellement une substance qui, dans le chro- matogramme sur papier, migre un peu plus lentement que la matière de départ.
Il s'agit de la 1-débydro-cortiGostérone que l'on recristallise dans l'acé- tone. Elle fond à 216=220 en se décomposant, #D = + 1580 (dans l'alcool).
Dans l'ultra-violet, cette substance présente une absorption à 244 mJi-( é 15300) et elle montre dans l'infra-rouge des bandes à 2,76, 2,86, bzz 5,99, 6,14, 6,22,7,44,8,73, 9,22, 9,38/, et 9,63-.
Le 21-acétate préparé à 20 à l'aide d'un mélange de pyridine et d'anhydride acétique, fond à 159-16"!0; cxl D = + 1510 (dans le dioxanne); absorption dans le spectre ultra-violet À m 243 mfL(t::; 14800)-
Exemple 14.
A 4 litres d'une culture de Calonectria décora obtenue comme dé- crit à l'exemple 1, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de
EMI7.8
1 g de 17'X'=hydroxy'-cortexone (substance S de Reichstein) dans 25 om3 de méthanol. On secoue 3 jours à 27 et sépare alors le mycélium par filtra- tion. L'extraction du filtrat de culture et la chromatographie de l'extrait brut sur gel de silice s'effectuent comme décrit à l'exemple 1. Les frac- tions obtenues au moyen de chloroforme et d'un mélange de chloroforme et d'acétone (97,5;2,5) renferment des impuretés, tandis qu'avec un mélange de chloroforme et d'acétone (95:5) on élue un peu de la matière de départ.
Les fractions obtenues avec un mélange de chloroforme et d'acétone (90sl0) sont constituées par un mélange renfermant, à côté d'un peu de matière de départ et de produits d'une polarité plus élevée, essentiellement de la 1-
EMI7.9
déhydro 17a-hydroxy-cortexone. On obtient cette dernière à l'état pur par
<Desc/Clms Page number 8>
cristallisation dans l'acétone; elle fond à 227-233 en se décomposant;
EMI8.1
hX1D = + 76 (éthanol); spectre d'absorption dans l'ultra-violet 1 max 244 21 /*-((± = 16200). Dans 1'infra-rouge, on observe des bandes, notamment à 2,761'Lg 2,85/c, 5,84-, 6,00-, 6el5,p4 6,23, 9,01, 9,20, 9,55. et 10,04. Le 21-acétate préparé à l'aide d'un mélange de pyridine et d'anhydride acétique fond à 216-222 , JD = + 86Q (dioxanne); spectre d'ab- sorption ultra-violet : y max 244 m fi- (l = 15400).
Exemple 15.
A 4 litres d'une culture de Calonectria décora obtenue comme dé- crit à l'exemple 1, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 1 g de progestérone dans 25 cm3 d'acétone. On secoue 24 heures à 27 et sépare alors le mycélium par filtration. On effectue l'extraction du
EMI8.2
filtrat de culture comme décrit à 1.,exemple 1. On chromatographie l'extrait brut sur une colonne de 30 g d'oxyde d'aluminium exempt d'alcali, en sou- mettant les diverses fractions (de chacune 100 cm3) à un examen par chroma- tographie sur papier. Les fractions obtenues avec un mélange d'éther de pétrole et de benzène renferment de la matière de départ, tandis qu'avec du
EMI8.3
benzène on élue principalement de la 1-déhydro-pxogestérone.
On cristalli- se cette dernière dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole; elle fond
EMI8.4
à 151-152 ; al D3 - + 120 (éthanol); spectre d'absorption ultra-violet À max 245 m e D ( 16150). Dans le spectre infra-rouge, on observe des bandes notamment à 5,$6 f.t., 5,99 t' , 6,14, 6,23 , 7,23, 7,38 f'-, 8,33 r- 856214,1 10 55 fe. et 12,24.f"-.
Exemple 16.
Dans un récipient agitateur, on met 1 litre d'une solution nutritive renfermant 15 g de peptone, 10 cm3 d'eau de gonflement du maïs (Corn-
EMI8.5
steep-liquor, 0,1 g de glucose brut et quant au reste de l'eau du robinet, amène à un pH de 6,8 et stérilise. On ensemence alors avec une culture de Calonectria decora. On secoue 48 heures à 27 et ajoute alors à la culture bien développée, dans des conditions stériles, une solution de 250 mg de cortisone dans 8 cm3 de méthanol. On continue d'agiter à 27 , sépare le mycélium par filtration au bout de 3 jours et extrait le filtrat de culture' au moyen d'acétate d'éthyle comme décrit à l'exemple 1.
L'examen'de l'ex- trait brut, effectué par chromatographie sur papier, montre qu'à part une faible quantité de fraction d'une polarité plus élevée, il n'y a que de la 1-déhydro-cortisone et plus de matière de départ. Par cristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther et dans le méthanol, on obtient la 1-déhydr'o- cortisone à l'état pur.
Exemple 17.
Dans 1 litre d'eau du robinet, on dissout 2 g de nitrate de so- dium, 1 g d'orthophosphate primaire de potassium, 0,5 g de sulfate de ma- gnesium heptahydrate 0,5 g de chlorure de potassium et 1 g d'extrait de le- vure Difoo, amène à un pH de 5 en ajoutant une solution d'hydroxyde de so-' dium et stérilise. On ensemence la solution nutritive obtenue avec 50 cm3 d'une culture d'agitation de Didymella lypopersici agée de 4 jours et la se-
EMI8.6
coue 48 heures à 27e ce qui fait que la culture se développe bien. On ajou te alors, dans des conditions stériles, une solution de 250 mg de cortexone dans 10 cm3 d'acétone. On agite encore deux jours à 27 , sépare alors le mycélium par essorage, le lave à l'eau et à l'acétate d'éthyle et extrait les filtrats réunis à l'acétate d'éthyle.
On lave à l'eau les solutions dans l'acétate d'éthyle, les sèche et les évapore sous vide; un examen chromatographique sur papier dans le système Bush B3 (mélange de benzine et de
EMI8.7
ligroïne: benzène : méthanol : eau (6,67 : 3,33 : 8,0 : 2,O)j montre que le résidu cristallin obtenu est constitué par de la 1-déhydro-cortexone presque
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
j;iu.J:'8. POJ12 la purifier on la fait passer en solution chloroformique à travers une couche de gel de silice. Le filtrat chloroformique renferme au pli (i'Uc10 :1't:116 très liquide. On réunit les autres filtrats obtenus au moyc''i do chloroforme avec addition de 1 à 3% de butanol tertiaire, et les ;hr.1por'e..
Le résidu fournit, par recristallisation dans un mélange d'acéto- .e et d'éther isopropylique, 220 mg de 1-déhydrocortexone fondant à 189-195 en se décomposant, E7..:9mple 18.
A un litre d'une culture bien développée de Didymella lycopersici obtenue comme à l'exemple 17, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 250 mg de cortisone dans 10 cm3 de méthanol et secoue 72 heures à 27 , après quoi on traite le liquide de culture comme indiqué à l'exemple 17. Un examen chromatographique sur papier dans le système propylène-gly- col-toluène montre que le résidu des extraits obtenus à l'acétate d'éthyle
EMI9.2
ne renferma pratiquement que de la 1-d6hydro-cortisone comme fraction stéroldique. On filtre le résidu, en solution chloroformique, à travers du gel de silice. Les filtrats chloroformiques fournissent un peu d'une huile très liquide.
Avec un mélange de chloroforme et d'acétone (6:4), on obtient un résidu cristallin qui fournit, après recristallisation dans un mélange d'a- cétone et d'éther, 225 mg de 1-déhydro-cortisone pure, fondant à 231-234 .
Exemple 19.
A un litre d'une culture bien développée de Didymella lycopersioi préparée comme à l'exemple 17, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 250 mg d'hydrocortisone dans 10 cm3 de méthanol., Après avoir agité pendant 10 jours à 27 ,on traite la culture comme indiqué à l'exemple 17. Un chromatogramme sur papier (système propylèneglyool-toluène) montre que le résidu des solutions dans l'acétate d'éthyle est constitué par de la
EMI9.3
1-dêhydrc-hydrocortisone presque pure. Pour éliminer les substances accom- pagnatrices, on reprend le résidu dans le chloroforme et filtre la solution à travers du gel de silice. On jette les éluats ohloroformiques qui renfer- ment une petite quantité d'une huile très liquide.
On réunit les éluats ob- tenus avec un mélange de chloroforme et d'acétone (isl) et les évapore.On recristallise le résidu dans le méthanol ou dans un mélange d'acétone et
EMI9.4
d'éther, et obtient ainsi 210 mg de 1-dêhydro-hydrocortisone pure, fondant à 238=241 .
Exemple 20.
A 120 cm3 d'une culture bien développée de Didymella lycopersici obtenue de la manière indiquée à l'exemple 17, on ajoute, dans des condi-
EMI9.5
tions stériles, une solution de 30 mg de 391120.tricétol7txq21Clihydroxy alloprégnane dans 2 cm3 de méthanol. On agite 10 jours à 27 et traite la culture comme indiqué à l'exemple 1. Un examen chromatographique sur pa-
EMI9.6
pier, dans le système propylèneglyooltaluène9 du résidu des extraits obtenus au moyen d'acétate d'éthyle, montre que ledit résidu renferme, à côté de matière de départ inchangée, de la 1-d6hyclra-cortisone qu'on peut obtenir sous forme pure par chromatographie sur du gel de silice et par cristalli- sation subséquente dans un mélange d'acétone et d'éther.
Exemple 21.
D'une manière analogue, on obtient, à partir de progestérone,
EMI9.7
deÀ8 lallorégnène39 20-d.oneg de prégnane-3i 20m-dïone' de corticostérone, de lldéhydrooorticostéroney de l7cxhydroxy cortexone' de testostérone, de 1 l - ou de Z4 -androstène-3,17-dione, les .ls4diênes correspondants.
Exemple 22.
A 2 litres d'une culture-bien-développée de Didymella-lycopersici
<Desc/Clms Page number 10>
obtenue comme il est indiqué à l'exemple 17, on ajoute, dans des conditions
EMI10.1
stériles, une solution de 500 mg de A °-31120-trioxo-17a-méthyl-21-acé- toxy-=prégnène dans 15 cm3 d'acétone. On agite pendant 3 jours à 27 , puis traite alors comme décrit à l'exemple 1. Un examen chromatographique'sur papier montre que le résidu d'extraction (585 mg) n'est constitué pratique-
EMI10.2
ment que par du 14-31120-trioxo-ï7a-mêthyl-21-hydrox prégnadiène. En recristallisant ce dernier dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole, on l'obtient sous la forme d'aiguilles qui fondent à 183-1860 en se décom-
EMI10.3
posant légèrement. COEID = *# 120 (alcool), absorption en ultra-violet; loi max 240 m- ( 14600).
Le spectre infra-rouge montre à 59 98,%z 3 6 13 y et 6,2l}k les bandes caractéristiques pour les Ll1,4-3-cétones. Le 21-acé- tate préparé au moyen d'anhydride acétique et de pyridine fond à 198-201 ; [Ó]24D = + 1350 (chloroforme); spectre d'absorption dans l'ultra-violet
EMI10.4
max 240 m/i(± 14800).
Exemple 23.
A 4 litres d'une culture bien développée de Didymella lycopersici obtenue comme on l'a indiqué à l'exemple 17,on ajoute, dans des conditions
EMI10.5
stériles, une solution de 1 g de I7 éthinyl-testostérone dans 25 cm3 d'acé- tone. On agite 8 jours durant à 27 , puis traite la culture suivant les in- dications données à l'exemple 17. L'examen chromatographique sur papier du résidu d'extraction montre que ledit résidu n'est pratiquement constitué
EMI10.6
que par de la 1-déhydro# 17oc-éthinyl-testostérone On obtient ce produit à l'état pur par recristallisation dans un mélange d'acétone et d'éther. Il fond à 228-233 et possède un pouvoir rotatoire spécifique [Ó]D = -17 ( chl orof orme ) .
Exemple 24,
A 2 litres d'une culture bien développée de Didymella lycopersi# ci obtenue comme il est indiqué à l'exemple 17, on ajoute, dans des condi- tions stériles, une solution de 180 mg de 21-acétate de 6-déhydro-cortexone dans 10 cm3 d'acétone et agite pendant 3 jours à 27 . On traite la culture de la manière décrite à l'exemple 17. Un examen chromatographique sur papier montre que le résidu d'extraction (190 mg) est pratiquement exclusivement constitué par la 1,6-bis-déhydro-cortexone libre que l'on cristallise dans un mélange d'acétone et d'éther. Dans le spectre infra- rouge, on observe, .
EMI10.7
à 5 98 f 6913 ft et 6e22 Jc- les bandes caractéristiques pour les 46 le4-3- cétones.
Ce composé fond à 166-168 , [Ó]D = + 112 (acétone), Le 21-acéta- te de ce composé préparé au moyen d'anhydride acétique et de pyridine fond à 158-162 [Ó]25D = + 123 (éthanol). Spectre d'absorption dans l'ultra-
EMI10.8
violet max 223 mfc ( = 11600), 256 mf' (±. = 9900) et 300 myc (<f= 12800),
Exemple 25.
A 4 litres d'une culture bien développée de Didymella lycopersici obtenue de la manière indiquée à l'exemple 17, on ajoute, dans des condi- tions stériles, une solution de 1 g de 11-déhydro-progestérone dans 20 cm3 d'acétone, On agite 8 jours à 27 et traite alors de la manière décrite à l'exemple 17. En procédant à un examen chromatographique sur papier, on ne peut déceler dans le résidu d'extraction, que de la 1,11-bisdéhydro-proges- térone. On l'obtient sous forme cristalline au moyen d'un mélange d'acétone et d'éther de pétrole; elle fond à 166-168 ; dans le spectre infra-rouge, on
EMI10.9
observe des bandes à 5,98/<, 6,17<- et 6,22/k. ? ; a7 24 = 112 (acétone); spectre d'absorption dans l'ultra-violet, A max 245 mf,a. ( = 17750).
Exemple 26.
A 2 litres d'une culture bien développée de Didymella lycopersici obtenue suivant les indications de l'exemple 17, on ajoute, dans des condi-
<Desc/Clms Page number 11>
tions stériles, une solution de 500 mg de 17a-méthyl-testostérone dans 15 cm3 d'acétone. On agite pendant 3 jours à 27 , puis traite la culture sui- vant les indications de l'exemple 1. On dissout le résidu d'extraction dans
EMI11.1
un peu d'acétone. Par addition d'éther, on obtient la 1dêhydro-l'tx-mêthyl- testostérone sous la forme de cristaux compacts. Ils fondent à 163-164 .
EMI11.2
L-7 D 0 (chloroforme). Spectre d'absorption dans l'ultra-violet Xmax 245 myL ( :: 15600).
Exemple 27.
Dans 1 litre d'eau du robinet, on dissout 2 g de nitrate de so-
EMI11.3
dium, 1 g d8 orthophosphate primaire de potassium, 0,5 g de sulfate de ma- gnésium-heptahydrate, 0 5 g de chlorure de potassium, 50 g de glucose et 1 g d'extrait de levure Difco, amène le pH à 5 en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium et stérilise. On ensemence la solution obtenue avec 50 cm3 d'une culture d'agitation de Didymella lycopersici âgée de 4 jours et l'agite 48 heures à 27 ; la culture se développe bien. A 120 cm3 de cet- te culture de Didymella lycopersici, on ajoute, dans des conditions stériles,
EMI11.4
une solution de 30 mg de 9'X#fluoro-hydrooortisone dans 2 cm3 de méthanol.
On agite 5 jours à 27 , sépare alors le mycelium par essorage, le lave à l'eau et à l'acétate d'éthyle et extrait à l'acétate d'éthyle les filtrats réunis. On lave à l'eau les solutions dans l'acétate d'éthyle, les sèche et les évapore sous vide. Un examen chromatographique sur papier montre
EMI11.5
qu.3 le résidu d'extraction renferme de la 1-déhydro-ga-fluoro-hydrocortiso- ne que l'on sépare de la matière de départ inchangée à l'aide d'un chromatogramme de préparation sur papier (système propylèneglycol-toluène). Recristallisé dans de l'acétone, le produit obtenu est sous forme de cristaux fondant à 263-266 (en se décomposant); [Ó]23D240 = + 108 (éthanol); spectre
EMI11.6
d'absorption dans l ult avv.alet9 max 240 m ( m 15800).
On sèche ce produit sous -Lui vide poussé et l'acétyle à la température ambiante, de ma- nière usuelle, à l'aide de 4 cm3 d'un mélange d.e pyridine et d'anhydride acé-
EMI11.7
tique (181). Le 21-acétate de la I-dêrdrQ-9a-fluoro-hydrocortisone que l'on obtient ainsi est rscristallisé dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole, il fond à 244 '246 (avec décomposition), /K/ 23 =+ 108 (dioxan- ne); spectre d'absorption dans 1 ultra-vioJ.et max 240 m&(± = 16250).
Exemple 28.
Dans 1 litre d'eau du robinet, on dissout 2 g de nitrate de sodium, 1 g d'orthophosphate primaire de potassium, 0,5 g de sulfate de magnésium heptahydrate, 0,5 g de chlorure de potassium, 50 g de glucose et 1 g d'ex- , trait de levure Difco, amène le tout à un pH de 5 en ajoutant une solution d'hydroxyde de sodium, puis stérilise. On ensemence la solution nutritive obtenue avec 50 cm3 d'une culture d'agitation de Didymella lycopersici âgée de 4 jours et l'agite à 27 pendant 48 heures, ce qui fait que la culture se développe bien. A 120 cm3 de cette culture de Didymella lycopersici,.on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 30 mg de 21-acétate
EMI11.8
de lliépox 1;'a,hydrax-cortexone dans 2 cm3 de méthanol.
On agite pen- dant 5 jours à 27 , sépare ensuite le mycélium par essorage, le lave à l'eau et à l'acétate d'éthyle, puis extrait les filtrats réunis à l'acétate d'é- ' thyle. On lave à l'eau les solutions dans l'acétate d'éthyle, les sèche et les évapore sous vide. Un examen chromatographique sur papier montre que
EMI11.9
le résidu d'extraction renferme de la l-déhydro-9'll j3-=époxy-17ct-hydroxy- cortexone qu'on sépare de la matière de départ inchangée à l'aide d'un chromatogramme de préparation sur papier (système propylèneglycol-toluène).
On sèche le produit brut sous un vide poussé et l'acétyle, à la température ambiante, de manière usuelle à l'aide de 4 cm3 d'un mélange de pyridine et d'anhydride acétique (1:1).
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
On dissout dans 5 cm de dioxanne le 21-acétate de l-déhydro-9,ll- époxy=17#=hydroxy-cortexone (30 mg) obtenu, ajoute 1,25 em3 d'acide fluorhy- drique 2,5 fois normal dans le chloroforme et laisse reposer une heure à la température ambiante. On ajoute alors de l'eau et extrait avec un mélan- ge de chloroforme et d'éther (1:1). Après lavage à l'eau, séchage et évapo-
EMI12.2
ration du solvant sous vide, on obtient le 21-acétate de 1-déhydro-9a-fluo- ro-hydrocortisone, qui fond à 235-237 :
REVENDICATIONS.
1.- Un procédé de préparation de déhydro-composés de la série des stéroïdes, caractérisé par le fait qu'il consiste à soumettre des composés stéroidiques saturés en position 1,2 et/ou en position 4,5, à l'action aé- robie d'enzymes de Didymella lycopersici, de Colonectria décora, d'Alterna- ria passiflorae, d'Ophiobolus heterostrophus ou d'Ophiobolus Miyabeanus, puis à transformer le cas échéant en leurs dérivés fonctionnels les produits réactionnels obtenue.
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants
1) On utilise comme substances de départ des composés stéroidi- ques saturés en position 1,2 et/ou en position 4,5 et présentant en posi- tion 3 un groupe hydroxyle ou oxo libre ou fonctionnellement modifié.
2) On utilise comme substances de départ des composés du prégna- ne, saturés en position 1,2 et/ou en position 4,5.
3) On utilise la cortisone comme substance de départ.
4) On utilise l'hydrocortisone comme substance de départ.
EMI12.3
5) On utilise la 11#épi-hydrocortisone comme substance de départ.
6) On utilise la corticostérone comme substance de départ.
7) On utilise la 11-désoxy-corticostérone comme substance de départ.
8) On utilise le 5-3i-hydro 20-o$o-prégnène comme substance de départ.
9) On utilise l'aldostérone comme substance de départ.
EMI12.4
10) On utilise la l8-hydroocy-corticostérone comme substance de dé- part.
11) On utilise la 18-hydroy-I1-d.éhd.ro-corticostérone comme sub- stance de départ.
12) On utilise la 18-hydroxy-cortexone comme substance de départ.
EMI12.5
13) On utilise la 18-oxo-cortexone comme substance de départ.
@
14) On utilise la progestérone comme substance de départ.
15) On utilise comme substance de départ ceux des composés indi- qués sous 3) à 7) et 9) à 14) qui possèdent la double liaison en 1,2 au lieu d'en 4,5.
16) On utilise comme substance de départ des alloprégnane-3,20- diones.
17) On utilise comme substance de départ le prêgnange-ou l'allo-
EMI12.6
prégnange-3 , 11 , 20-trione-17<x> 21-diol .
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
<Desc / Clms Page number 1>
The present invention relates to a particular process for the preparation of dehydro-compounds of the steroid series having a dual
EMI1.1
bond in position 1,2 and., 5,
The process described in the patent application filed in Belgium by the applicant on August 20, 1954 and entitled: "Process for the preparation of oxidation products of the steroid series." concerns the biochemical degradation of the side chain of pregnant compounds into androstane compounds and, optionally, the cleavage of the D ring, with simultaneous introduction of a 1,2 double bond and possibly in 4.5.
In this way one can, for example, transform the progress
EMI1.2
terone, as moreover A 5-33 -hyd.roxy '^ 20 -oo-pregene, .a 11-deoxycorticosterone or 3,20-dioxo-allopregnane, in an operative stage, in Al, 4- 3 , 17-dioxo-androstadiene or 1,2-dehydro-testolactone.
The present invention relates to a method which makes it possible to
EMI1.3
produce a 1,2 and / or Q double bond biochemically, in steroids, in particular in those of the pregnane series, without degradation of the side chain or ring opening, said process being characteristic. se by the fact that it consists in subjecting steroids saturated in position 1,2 and / or in position 4,5, to the aerobic action of enzymes of Didymella lycoper- sici, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, of Ophiobolus heteros- trophus or of Ophiobolus Miyabeanus.
The steroids used as starting substances are, for example, derivatives of spirostan, allospirostan, furostan, allofurastan, cholan, allocholan, pregnan, allopregnan, androstane and testane and they have a hydroxyl or oxo group, free or functionally modified, preferably in position 3.
They can be saturated or contain double bonds, for example in position 1 or 4,
EMI1.4
as well as in position 5, 6, 7e 8, 9: 11-14 or 16, or further contain substitutes, for example hydroxyl, oxo or carboxylic groups, free or modified; in addition, epoxy groups or halogen atoms, for example in position 6, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 20 or 21, or groups
EMI1.5
Methyl pes, for example in position 17a or 17j3 <The starting substances indicated above are: .- ;. ' any steric configuration and can also occur as raoemates.
They also encompass compounds of the so-called black- and / or homo- series, in particular 1- nor- and D-homo-compounds. Particularly im-
EMI1.6
bearing are the comrC88S of the prêgnane series containing in positions 3 and 20 of the hydro groups:
cycles or oxo, free or functionally modified, for example progesterone, 11-dehydro-pr.agesterone, 11-., 12-, 14-e 15-, 16-, 17- or 1.8-hydraxyprogesterone9 lesd 5- or / 4-pregr-en-3-ol-20- ones, 5-pregen-, 2U-d2ols 11-deoxycorticosterone, cortisone, hydrocortisone, 11-opihydrooortisone, aldosterone, 18-hydroxycorti - costone, 11-epi-18-hydroxycorticosterone, 18-oxocorticosterone, l7amhydroxy-al-do, tcrone, 18-hydroxyhydrocortisone, 18-hydroxy- and 18-oxo-cortisone, 18-hydroxy and 18 -oxo-cortexone, substance S of, Reichstein, 18-hydroxy # and 18-oxo-substance S (Reiahs.in, corresponding compounds unsaturated in position 1 instead of in position 4, pregnan-3,20-dione, pregnan-3-ol-20-one, allopregnan-3,20-dione, pregnan and 1.
r allopregnanew3 17,., 2Ci-tr.one-17et, 21-dïol, pregnane- and 1 allopregnan-3,0-diane-ll (3, .1,21-triol, pregnane- and allopregna- ne-3,18,20-trione-llp, 21-diol, pregnan- and allopregnan-3,20-dione-11 (3, 18,21-triol, pregnan- and allopregnan-3, 20-dione-18,21-diol, the corresponding 21-oxo-compounds and / or the 9a-fJ.uaro- and.-Chloro derivatives, for example 9 <X-fluoro-oortisone, 9'x- fluoro-hydrocortisone, 9-luoro-al-dosterone and 9a-fluoro.l8-hydroxycorticostêxone! in addition to androstane compounds saturated in position 1,2 and / or in position 4> 5> for example the
<Desc / Clms Page number 2>
EMI2.1
Has 4 # or 5-audrostene = "3, 1" 7- = d.ione, testosterone, 5-androstene 30? there are adrenoscerone, axidrostane-3el7-dionone, etianic acids, for example 4 4- or 5-etlenic acids,
alloetianic acids having hydroxyl or oxo groups, in particular in the 3, 11 and / or 18 position, functional derivatives of the compounds indicated, that is to say corresponding compounds comprising hydroxyl or oxo groups which are functionally modified.
In the starting materials, the functionally modified hydroxyl group is, for example, a hydroxyl group esterified by an aliphatic, aromatic or heterocyclic carboxylic acid, for example by acetic, propionic, benzoic or furan-carboxylic acids, or an etherified hydroxyl group. , for example the tetrahydropyranny # loxy group, the benzyloxy group or the triphenylmethoxy group. The functionally modified oxo group is advantageously a ketalized oxo group, deriving in particular from a divalent alcohol, for example the ethylenedioxy group.
According to the process according to the invention, the initial substances indicated are reacted with enzymes of Didymella lycopersici, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus or Ophio-bolus Miyabeanus. To obtain them, the cultures of these fungi can be used in media known per se as suitable, for example those which contain sugars such as glucose or lactose, peptones, corn swelling water, products from corn. soy and the like, as well as mineral salts, or synthetic nutrient solutions. Work is carried out in particular under aerobic conditions, for example in an agitated culture or in an immersed culture with agitation and supplied with air.
The fungi shown are distinguished from other microorganisms, eg bacteria, by good growth under relatively simple growing conditions. The reaction of the process according to the invention is carried out in the culture of fungi described or with the aid of the enzymes which it contains, enriched or separated where appropriate, or more simply in a suspension of the mycelium separated from the. fungus, in a suspension of the homogenized fungal mycelium or in filtrates of said suspensions or extracts of the mycelium, containing water.
The products of the process can be isolated by known methods. Their separation can be effected, for example, by extracting the reaction mixture with an organic solvent, for example with methylene chloride or ethyl acetate. For a more thorough purification of the extract thus obtained, the operations which are particularly suitable are, inter alia, chromatography, for example on aluminum oxide or on silica gel, the use of distribution methods, for example the countercurrent process, or separation using Girard reagents, such as trimethylammonium acid hydrazide # or
EMI2.2
pyridinium-acetic acid Following this purification or at its place, one preferably carries out
recrystallization from organic solvents or from aqueous organic solvents.
By introducing the 1,2 and / or 4,5 double bond, valuable drugs of the steroid series, in particular of the pregnane series, are obtained which, compared to therapeutically active compounds saturated at the 1,2 position , are characterized by increased efficiency.
Among
EMI2.3
the products of the process, mention should be made in particular of Lu ly4-3ellg 20-trioxo-17a ,, 21-dihydroxy-pregnadiene, 14-320d.ioolli'I7as21tri hydroxy-pregnadiene, l'4 3I1f20 = triogo -2lmhydroxy = pregn.adiene 1,4¯3,20 = dioxo-ll, 2l-dihydroxy-pregnadiene, l'4-320diogo-17a21-di-hydroxy-pregnadiene, Ie 14-3,20.-dioxo- 21 hydrogy prégnadiéne 'le! 14-3,18,20-trioxo-11,21-dihydroxy-pregnadiene, 14-3111820-têtrao $ o- 21-hydroxy-pregnadiene, 6,320 = .dioxo113,18-21-trihydroxy prégnadiè - ne, le194¯3,18s20-trioxoG11317a21trihydraxy prégnadzènei le14-311
<Desc / Clms Page number 3>
EMI3.1
18 '20tetraoxol7a' 21d.hydroxyvprégnadièney le ± 1 4-3 20dioxo-113a l7ocy 18 21-tetrahydroxymprëgnadséney le, l4-3920-dioxo-.821-dihyâroxy-prégnadi: ne A 1 4¯3Ji8,20-trioxyo -Pregnadiene, 1,4-3,20-dioxo-17,18'2ltrihyd:
oxy = prêgnadiene9 le has 1,4¯3,18,20-trioxo-17,21-dihydroxy-pregnadiene, the 21-oxo- as well as the corresponding 2ideoxy-compounds, in addition to corresponding functional derivatives such as esters , ethers, halogenated derivatives, for example 9 <X-halogenated compounds, in particular fluorinated and chlorinated compounds. When the products of the process do not have the configuration and the substituents of therapeutically useful steroids, they can serve as intermediates for their preparation, for example for the preparation of the compounds indicated above.
The reaction products obtained in accordance with the process can be converted into their functional derivatives in a manner known per se, for example into oxygenated, sulfur-containing or nitrogen-containing derivatives, for example into esters, ethers, enol esters, enolic ethers, ketals, thio -ethers, and thio-ketals, as well as hydrazones, oximes and enamines. In these compounds, the hydroxyl and / or oxo groups can be functionally fully or partially modified.
In esters and in enolic esters, the acid residues are those of any organic and inorganic acids, for example those of carboxylic, thion-carboxylic, thiol-carboxylic or sulfonic acids, aliphatic, alicyclic, araliphatic, aromatic. or heterocyclic, preferably those of formic, acetic, chloroacetic, tri-
EMI3.2
fluoracetic, propionic, butyric, valeric, diethylacetic, capric, oenanthic, caprylic, palmitic, crotonic, undecanic, undecylenic, oxalic, succinic, pimelic, maleic, lactic, carbamic,
EMI3.3
alkoxycarboxylic, 3-cyclopentylpropioniqu.e hexahydrobenzoic, benzoic phenylacetic, cyclohexylacetic,
phenylpropionics, trimethylgalic, phthalic, furan-2-carboxylic, iso-nicotinic, methanesulfonic, to-
EMI3.4
luene sulfonic acid, sulfuric acid, halogenated hydracids or phosphoric acids.
In the compounds obtained, it is possible, if desired, to convert the functionally modified hydroxyl or oxo groups into free groups.
In this way, the functionally modified groups can also be partially released, in particular in polysubstituted derivatives.
This takes place, for example, by hydrolysis carried out chemically or enzymatically, for example using acidic or basic agents, by carrying out alcoholysis or acetalization. From only partially modified derivatives which are obtained in this way or also directly, for example from esterified or etherified derivatives, polysubstituted derivatives can be prepared by subsequent functional modification, for example by esterification. or etherification, in particular also esters or mixed ethers or ester-ethers.
The products of the present process can be used as drugs or as intermediates for the preparation of valuable products.
The present invention also relates, as new industrial products, to the products defined above.
The invention is described in more detail in the following non-limiting examples. In these examples, temperatures are shown in degrees centigrade.
Example l.
In a stirring vessel, 4 liters of beer wort are sterilized.
<Desc / Clms Page number 4>
70% re (pH 5.1) and inoculated with 150 cc of a 2 day old shaking culture of Calonectria decora in 70% beer wort. The container is stirred for 24 hours at 27; the culture is developing well. A solution of 1 g of cortexone in 25 cm3 of acetone is then added under sterile conditions and stirring is continued at 27. After two days the mycelium is separated and washed well with water and ethyl acetate. After combining the filtrates, they are extracted until exhaustion with a total of 4 liters of ethyl acetate, the extracts washed with water, dried and evaporated in vacuo.
The crude extract thus obtained (1.1 g) is chromatographed on a column of 30 g of silica gel according to the pass method, eluting with chloroform and with mixtures of chloroform and acetone of a increasing acetone content. The various fractions (each 100 cc) were examined by subjecting them to paper chromatography.
The fractions eluted with chloroform contain only impurities, while in the fractions obtained with a mixture of chloroform and acetone (9: 1) there is a new substance which, on the chromatogram on paper (propylene glycol-toluene system) migrates a little less far than cortexone. The fractions obtained with a higher acetone content contain little of the highly polar material. The fractions containing the new substance indicated are combined and evaporated in vacuo. By recrystallization of the residue from mixtures of acetone and petroleum ether, 1-dehydrocortexone is obtained in almost quantitative yield in its pure state, which melts at 185-192.
This compound rapidly and strongly reduces an alkaline solution of argento-diammine, Analysis agrees with the crude formula C21H2803 (calculated: C 76.79, H 8.59%, found: C 76.67, H 8.84% ). The ultraviolet spectrum of the free compound shows a strong band with a maximum at 244 m (¼ = 14,200), the ultraviolet spectrum of dinitro-phenylhydrazone shows a band with a maximum at 388 m (¼ = 39,000) . The corresponding bands of the cortexone are located at 240 m (¼ = 16,200) and 378 m (¼ = 39,000), respectively.
Example 2.
If one uses in the same way, instead of the culture of Calonectria decora described in example 1, cultures of Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus or Ophiobolus Miyabeanus for the dehydrogenation of cortexone, then after the treatment described in Example 1, 1-dehydro-cortexone is obtained in a high yield.
Example 3.
As described in Example 1, 4 liters of a culture of Calonectria decora are cultivated in a shaking vessel and a solution of 1 g of cortisone in 25 cm3 of methanol is added under sterile conditions. The container is then shaken at 27. After four days, the mycelium is separated and the culture filtrate extracted to exhaustion with a total of 3 liters of ethyl acetate. The combined extracts are washed with water, dried and evaporated in vacuo. The crude residue thus obtained is chromatographed, as described in Example 1, on 30 g of silica gel, according to the pass method. The fractions eluted with mixtures of chloroform and acetone (6: 4) consist essentially of a substance which is somewhat more polar than the starting material.
These fractions are combined and evaporated in vacuo. The 1-dehydro-cortisone is recrystallized from mixtures of acetone and ether. It melts at 231 - 234 '. This substance rapidly and strongly reduces an alkaline solution of argento-diamine and shows in the ultra-violet spectrum a strong absorption at 240 m (¼ = 15,800). By acetylation with a mixture of pyridine and acetic anhydride, the corresponding 21-acetate is obtained which melts at 224-230 C.
In an analogous manner, for example oenanthate or un-,
<Desc / Clms Page number 5>
decylenate.
EMI5.1
Example 1 A solution of 1 g of hydrocortisone in 25 cm 3 of methanol is added under sterile conditions to 4 liters of a well-developed culture of Calonectria decora. After stirring for 4 days at 27, extraction and chromatography are carried out as described in Example 1. The fractions eluted with mixtures of chloroform and acetone (1: 1) contain a substance which is a little more polar than hydrocortisone. . These fractions are combined and evaporated. 1-dehydro-hydrocortisone is recrystallized from metha-
EMI5.2
nol or in mixtures of acetone and ether. It melts at 238 # 2410. It quickly and strongly reduces an alkaline solution of argento-diammine.
EMI5.3
and shows in the ultraviolet spectrum a strong absorption at 244 ml. 4- (Î 15,100
Example 5.
In a conical flask with a capacity of 500 cm3, 150 cm3 of 70% beer wort are sterilized and inoculated with Calonectria decora. Stirred for two days at 27 and added to the well-developed culture, under sterile conditions, a solution of 30 mg of aldosterone in 1.5 cm3 of acetone. Shaking is continued at 27 and after 38 hours separates the mycelium by filtration. The culture filtrate is extracted to exhaustion with ethyl acetate, the extracts washed with water, dried, and evaporated. As described in Example 1, the residue is chromatographed on 1 g of
EMI5.4
silica gel, by examining the various fractions (each 20 cm3), by paper chromatography.
In the fractions eluted with mixtures of chloroform and acetone (1: 1) there is a substance which is somewhat more polar than aldosterone and which reduces an alkaline solution of argento-diamine. It is crystallized from mixtures of acetone and ether to obtain 1-dehydro-aldosterone. In the ultra-violet spectrum it shows a strong absorption at 244 m
EMI5.5
Ee:; 1J: 1l e 0 1
14 conical flasks with a capacity of 200 cm3 each are used and each sterilized 50 cm3 of 70% beer wort, which is inoculated with Calonectria decora. After stirring for two days at 27, the cultures developed well.
Under sterile conditions, one of the following 14 compounds (10 mg of each dissolved in 0.5 cm3 of methanol) g cortexone, cortisone, hydrocor-
EMI5.6
tisone, 17a = hydroxy-cortexone, corticosterone ,, 11-epi-corticosterone, 11epihydrocortisoneg aldosterone, ahdroxraldostërone9 progesterone, pregnenolone, 21-hydroxy-pregnenolone, 5 anohl7sténe and androstene 3j17-dione.
Stirring is continued for two days at 27 and the cultures are then extracted with ethyl acetate. Chromatographic examination on paper of the various extracts shows that all
EMI5.7
starting substances have been converted into the corresponding l = -dehydro compounds having, relative to the starting substances, a light polarity. significantly increased and differing in their spectra characteristically from the starting substances indicated.
Example 7.
If the substances indicated in Example 6 are used for dehydrogenation, instead of the cultures of Calonectria decora described in this example, cultures of Alternaria passiflorae, of Ophiobolus heteros- trophus or of Ophiobolus Miyabeanus, chromatographic examination of the extracts on paper then shows that the products formed are the same as those described in Example 6.
<Desc / Clms Page number 6>
Example 8.
Has 4 liters of a well-developed culture of Calonectria decora,
EMI6.1
a solution of 1 g of 311,20-tri-keto # 17a, 21-dihydroxy-allopregnane in 25 cm3 of methanol is added under sterile conditions. Stirred 3 days at 27 and then separate the mycelium. In the same manner as that described in Example 1, the extraction of the culture filtrates and the chromatography of the crude extract are carried out. The fractions eluted with mixtures of chloroform and acetone (1: 1) contain 1-dehydrocortisone which is obtained crystalline by means of mixtures of acetone and ether. It melts at 230-233 and has the properties described in Example 3.
EMI6.2
If, instead of the solution of 3,11,20-triketo-17tx, 21-dihydroxy-allopregnane, a solution of 311,20-triketo-17a, 21-dihydroxy-pregnane in 25 cm3 of methanol is added, With a similar culture of Calonectria decora and treated as described, 1-dethyrocortisone is then also obtained in a good yield.
Example 9.
Under sterile conditions, to 4 liters of a culture is added
EMI6.3
of Calonectria décora, a solution of 1 g of 3,20-diketo-llp, 17a, 21-trihy-droxy-allopregnane in 25 cm3 of methanol, then stir the mixture for 4 days at 27. The mycelium is then separated and the extraction of the culture filtrate and the chromatographic separation of the extract are carried out, as described in Example 1. From the fractions eluted with mixtures of chloroform and acetone (1: 1), we obtain, with a good yield and at
EMI6.4
the crystallized state, 1-dehydro-hydro-cort2sone which melts at 239-242 and has the properties described in Example 4.
Example 10.
To 4 liters of a culture of Calonectria decora is added a solution of 1 g of androstane-3,17-dione in 25 cm3 of acetone, under sterile conditions. After stirring 36 hours at 27, the mycelium is separated and the culture filtrate extracted until exhaustion with methylene chloride. The extract is washed twice, each time with decinormal hydrochloric acid and with a 1% sodium bicarbonate solution, then three times with water, dried and evaporated in vacuo. The residue (1.2 g) is chromatographed on 30 g of aluminum oxide according to the pass method, eluting with mixtures of petroleum ether and benzene, with benzene, with mixtures of benzene. and ether, and with ether.
The fractions eluted with the mixture of petroleum ether and benzene and with the
EMI6.5
benzene, contain the V ls ° -androstad.ièns-3,17-dione coxiue which crystallizes, in a mixture of acetone and petroleum ether in rhombi- flakes.
EMI6.6
ques melting at 145-146; [a] D = + 110 (chloroform).
Example 11.
- f 22 To a solution of 40 mg of 1-dehydro-cortexone (rqq2 = +120 in chloroform) in 2 cm3 of pyridine, 2 cm3 of acetic anhydride are added and left to stand at room temperature. After 16 hours, the solution is evaporated in vacuo to 30 and the residue is taken up in a mixture of chloroform and ether (1: 4). The solution is washed three times, each time with decinormal hydrochloric acid, with 2% sodium bicarbonate solution and water, dried and evaporated in vacuo.
By recrystallizing the residue obtained from a mixture of acetone and ether
EMI6.7
From petroleum, the 21-acetate of 1-dehydro-cQrtexonei is obtained in the pure state, which melts at 203 - 205aaD = + 1340 (in chloroform).
<Desc / Clms Page number 7>
Example 12.
To 4 liters of a culture of Calonectria decora obtained as described in Example 1, a solution is added under sterile conditions.
EMI7.1
of 1 g of II- = dehydro-corticosterone in 25 cm3 of acetone. Stir for 3 days at 27 and then separate the mycelium by filtration. The extraction of the culture filtrate and the chromatography of the crude extract on silica gel are carried out as described in Example 1.
The fractions obtained
EMI7.2
by means of chloroform and a mixture of chloroform and acetone (955) contain impurities and a little of the starting substance, while the fractions obtained with a mixture of chloroform and acetone (90sl0), are essentially consisting of a substance which in the paper chromatogram migrates somewhat more slowly than the starting material.
EMI7.3
This substance is 19 ° 31120-triketo-21-hydroxyprregnadiene which is crystallized from a mixture of acetone and ether. The crystals decompose between 200 and 220, more or less quickly depending on how quickly they are heated. This product has ultra-violet absorption
EMI7.4
of 240 mjet shows in the infrared, at 59 99 / -d- '6.14} -1- and 6.22JA- the characteristic bands of the A 1,4-3-ketone group. Acetylation of this product with pyridine and acetic anhydride gives the corresponding 21-acetate, melting point 188-191. The oenanthate or the undecylenate can be prepared in a similar manner.
Example 13.
EMI7.5
To 1 liter of a culture of Calonectria decora obtained as described in Example 1, a solution of 1 g of corticosterone in 25 cm3 of acetone is added under sterile conditions. Stirred 4 days at 27, then the mycelium is separated by filtration. The extraction of the culture filtrate and the chromatography of the crude extract on silica gel are carried out as described in Example 1. The fractions eluted with chloroform
EMI7.6
and a mixture of chloroform and acetone (95s5) contain impurities and starting material. With mixtures of chloroform and acetone
EMI7.7
(90s10) and (80µ20) if essentially a substance is eluted which, in the chromatogram on paper, migrates a little more slowly than the starting material.
This is 1-debydro-cortiGosterone which is recrystallized in acetone. It melts at 216 = 220 as it decomposes, #D = + 1580 (in alcohol).
In the ultra-violet, this substance shows an absorption at 244 mJi- (é 15300) and it shows in the infrared bands at 2.76, 2.86, bzz 5.99, 6.14, 6 , 22,7,44,8,73, 9.22, 9.38 /, and 9.63-.
21-acetate prepared at 20 using a mixture of pyridine and acetic anhydride, melts at 159-16 "! 0; cxl D = + 1510 (in dioxane); absorption in the ultraviolet spectrum At m 243 mfL (t ::; 14800) -
Example 14.
To 4 liters of a culture of Calonectria decora obtained as described in Example 1 is added, under sterile conditions, a solution of
EMI7.8
1 g of 17'X '= hydroxy'-cortexone (Reichstein's substance S) in 25 µm3 of methanol. Shake 3 days at 27 and then separate the mycelium by filtration. The extraction of the culture filtrate and the chromatography of the crude extract on silica gel are carried out as described in Example 1. The fractions obtained by means of chloroform and a mixture of chloroform and acetone (97.5; 2.5) contain impurities, while with a mixture of chloroform and acetone (95: 5) some of the starting material is eluted.
The fractions obtained with a mixture of chloroform and acetone (90sl0) consist of a mixture containing, alongside a little starting material and products of higher polarity, essentially 1-
EMI7.9
dehydro 17a-hydroxy-cortexone. The latter is obtained in the pure state by
<Desc / Clms Page number 8>
crystallization from acetone; it melts at 227-233 as it decomposes;
EMI8.1
hX1D = + 76 (ethanol); absorption spectrum in the ultraviolet 1 max 244 21 / * - ((± = 16200). In the infra-red, bands are observed, in particular at 2.761'Lg 2.85 / c, 5.84 -, 6.00-, 6el5, p4 6.23, 9.01, 9.20, 9.55. And 10.04. 21-acetate prepared using a mixture of pyridine and anhydride acetic melts at 216-222, JD = + 86Q (dioxane); ultra-violet absorption spectrum: y max 244 m fi- (l = 15400).
Example 15.
To 4 liters of a culture of Calonectria decora obtained as described in Example 1, there is added, under sterile conditions, a solution of 1 g of progesterone in 25 cm3 of acetone. Shake 24 hours at 27 and then separate the mycelium by filtration. The extraction of the
EMI8.2
Culture filtrate as described in 1., Example 1. The crude extract is chromatographed on a column of 30 g of alkali-free aluminum oxide, subjecting the various fractions (each 100 cm3) to a. examination by chroma- tography on paper. The fractions obtained with a mixture of petroleum ether and benzene contain starting material, while with
EMI8.3
benzene elutes mainly from 1-dehydro-pxogesterone.
The latter is crystallized from a mixture of ether and petroleum ether; she melts
EMI8.4
at 151-152; al D3 - +120 (ethanol); ultraviolet absorption spectrum At max 245 m e D (16150). In the infra-red spectrum, bands are notably observed at 5, $ 6 ft, 5.99 t ', 6.14, 6.23, 7.23, 7.38 f'-, 8.33 r- 856214, 1 10 55 fe. and 12.24.f "-.
Example 16.
In a stirred vessel, 1 liter of a nutrient solution containing 15 g of peptone, 10 cm3 of corn swelling water (Corn-
EMI8.5
steep-liquor, 0.1 g of raw glucose and the rest of tap water, brings to a pH of 6.8 and sterilizes. We then inoculate with a culture of Calonectria decora. Shake 48 hours at 27 and then added to the well-developed culture, under sterile conditions, a solution of 250 mg of cortisone in 8 cm3 of methanol. Stirring is continued at 27, the mycelium separated by filtration after 3 days and the culture filtrate extracted with ethyl acetate as described in Example 1.
Examination of the crude extract, carried out by chromatography on paper, shows that apart from a small amount of fraction of a higher polarity, there is only 1-dehydro-cortisone and more of starting material. By crystallization from a mixture of acetone and ether and from methanol, pure 1-dehydr'o-cortisone is obtained.
Example 17.
In 1 liter of tap water, 2 g of sodium nitrate, 1 g of primary potassium orthophosphate, 0.5 g of magnesium sulfate heptahydrate, 0.5 g of potassium chloride and 1 g of potassium chloride are dissolved. g of Difoo yeast extract, bring to pH 5 by adding sodium hydroxide solution and sterilize. The nutrient solution obtained is inoculated with 50 cm3 of a stirring culture of Didymella lypopersici aged 4 days and the se-
EMI8.6
It takes 48 hours to 27th, which makes the culture develop well. We then add, under sterile conditions, a solution of 250 mg of cortexone in 10 cm3 of acetone. Stirred for two more days at 27, then the mycelium is separated by suction, washed with water and ethyl acetate and the combined filtrates extracted with ethyl acetate.
The solutions in ethyl acetate are washed with water, dried and evaporated in vacuo; a chromatographic examination on paper in the Bush B3 system (mixture of benzine and
EMI8.7
ligroin: benzene: methanol: water (6.67: 3.33: 8.0: 2, O) j shows that the crystalline residue obtained consists of almost 1-dehydro-cortexone
<Desc / Clms Page number 9>
EMI9.1
j; iu.J: '8. POJ12 is purified by passing it in chloroform solution through a layer of silica gel. The chloroform filtrate contains at the fold (i'Uc10: 1't: 116 very liquid. The other filtrates obtained are combined using chloroform with the addition of 1 to 3% of tertiary butanol, and the; hr.1por ' e ..
The residue affords, by recrystallization from a mixture of acetone and isopropyl ether, 220 mg of 1-dehydrocortexone, melting at 189-195 with decomposition, E7: 9mple 18.
To one liter of a well-developed culture of Didymella lycopersici obtained as in Example 17, is added, under sterile conditions, a solution of 250 mg of cortisone in 10 cm3 of methanol and shake 72 hours at 27, after which one treats the culture liquid as indicated in Example 17. A chromatographic examination on paper in the propylene-glycol-toluene system shows that the residue of the extracts obtained with ethyl acetate
EMI9.2
essentially contained only 1-dehydro-cortisone as steroid fraction. The residue is filtered in chloroform solution, through silica gel. The chloroform filtrates provide some of a very liquid oil.
With a mixture of chloroform and acetone (6: 4), a crystalline residue is obtained which gives, after recrystallization from a mixture of acetone and ether, 225 mg of pure 1-dehydro-cortisone, melting at 231-234.
Example 19.
To one liter of a well-developed culture of Didymella lycopersioi prepared as in Example 17 is added, under sterile conditions, a solution of 250 mg of hydrocortisone in 10 cm3 of methanol., After stirring for 10 days at 27, the culture is treated as indicated in Example 17. A chromatogram on paper (propylene glycol-toluene system) shows that the residue of the solutions in ethyl acetate consists of
EMI9.3
Almost pure 1-dehydrc-hydrocortisone. In order to remove the accompanying substances, the residue is taken up in chloroform and the solution filtered through silica gel. The chloroform eluates which contain a small amount of a very liquid oil are discarded.
The eluates obtained are combined with a mixture of chloroform and acetone (isl) and evaporated. The residue is recrystallized from methanol or from a mixture of acetone and
EMI9.4
of ether, and thus obtains 210 mg of pure 1-dehydrohydrocortisone, melting at 238 = 241.
Example 20.
To 120 cm3 of a well-developed culture of Didymella lycopersici obtained as indicated in Example 17, is added, under conditions
EMI9.5
sterile tions, a solution of 30 mg of 391120.tricétol7txq21Clihydroxy allopregnane in 2 cm3 of methanol. Agitation is carried out for 10 days at 27 and the culture is treated as indicated in Example 1. Chromatographic examination on pa-
EMI9.6
pier, in the propyleneglyooltaluene9 system of the residue of the extracts obtained by means of ethyl acetate, shows that said residue contains, next to unchanged starting material, 1-d6hyclra-cortisone which can be obtained in pure form by chromatography on silica gel and subsequent crystallization from a mixture of acetone and ether.
Example 21.
In an analogous manner, one obtains, from progesterone,
EMI9.7
of α8 alloregnene39 20-d.oneg of pregnane-3i 20m-dïone of corticosterone, ldehydrooorticosterone, oxhydroxy cortexone 'of testosterone, 1 l - or Z4 -androstene-3,17-dione, the corresponding .ls4diene.
Example 22.
Has 2 liters of a well-developed culture of Didymella-lycopersici
<Desc / Clms Page number 10>
obtained as indicated in Example 17, is added, under conditions
EMI10.1
sterile, a solution of 500 mg of A ° -31120-trioxo-17a-methyl-21-acetotoxy- = pregnene in 15 cm3 of acetone. Stirred for 3 days at 27, then treated as described in Example 1. Chromatographic examination on paper shows that the extraction residue (585 mg) is not practical-
EMI10.2
ment than with 14-31120-trioxo-ï7a-methyl-21-hydrox pregnadiene. By recrystallizing the latter from a mixture of acetone and petroleum ether, it is obtained in the form of needles which melt at 183-1860 while decomposing.
EMI10.3
posing lightly. COEID = * # 120 (alcohol), absorption in ultra-violet; max law 240 m- (14600).
The infra-red spectrum shows at 59 98.% z 3 6 13 y and 6.21} k the characteristic bands for the L1,4-3-ketones. The 21-acetate prepared with acetic anhydride and pyridine melts at 198-201; [Ó] 24D = + 1350 (chloroform); ultraviolet absorption spectrum
EMI10.4
max 240 m / i (± 14800).
Example 23.
To 4 liters of a well-developed culture of Didymella lycopersici obtained as indicated in Example 17, is added, under conditions
EMI10.5
sterile, a solution of 1 g of I7 ethinyl-testosterone in 25 cm3 of acetone. Agitation is carried out for 8 days at 27, then the culture is treated according to the indications given in Example 17. Chromatographic examination on paper of the extraction residue shows that said residue is practically not formed.
EMI10.6
only by 1-dehydro # 17oc-ethinyl-testosterone This product is obtained in the pure state by recrystallization from a mixture of acetone and ether. It melts at 228-233 and has a specific optical rotation [Ó] D = -17 (chl orof elm).
Example 24,
To 2 liters of a well-developed culture of Didymella lycopersi # ci obtained as indicated in Example 17, is added, under sterile conditions, a solution of 180 mg of 6-dehydro-cortexone 21-acetate. in 10 cm3 of acetone and stir for 3 days at 27. The culture is treated as described in Example 17. A chromatographic examination on paper shows that the extraction residue (190 mg) consists almost exclusively of the free 1,6-bis-dehydro-cortexone which is obtained. crystallizes from a mixture of acetone and ether. In the infrared spectrum, we observe,.
EMI10.7
at 5 98 f 6913 ft and 6e22 Jc- the characteristic bands for the 46 le4-3- ketones.
This compound melts at 166-168, [Ó] D = + 112 (acetone), The 21-acetate of this compound prepared with acetic anhydride and pyridine melts at 158-162 [Ó] 25D = + 123 (ethanol). Ultra- absorption spectrum
EMI10.8
violet max 223 mfc (= 11600), 256 mf '(±. = 9900) and 300 myc (<f = 12800),
Example 25.
To 4 liters of a well-developed culture of Didymella lycopersici obtained as indicated in Example 17 is added, under sterile conditions, a solution of 1 g of 11-dehydro-progesterone in 20 cm3 of acetone. Stirred 8 days at 27 and then treated in the manner described in Example 17. By carrying out a chromatographic examination on paper, one can only detect in the extraction residue, 1,11-bisdehydro-proges - terone. It is obtained in crystalline form by means of a mixture of acetone and petroleum ether; it melts at 166-168; in the infra-red spectrum, we
EMI10.9
observes bands at 5.98 / <, 6.17 <- and 6.22 / k. ? ; a7 24 = 112 (acetone); absorption spectrum in the ultraviolet, A max 245 mf, a. (= 17750).
Example 26.
To 2 liters of a well-developed culture of Didymella lycopersici obtained according to the indications of Example 17, one adds, under conditions-
<Desc / Clms Page number 11>
sterile tions, a solution of 500 mg of 17a-methyl-testosterone in 15 cm3 of acetone. The mixture is stirred for 3 days at 27, then the culture is treated according to the indications of Example 1. The extraction residue is dissolved in
EMI11.1
a little acetone. By adding ether, 1dehydro-l'tx-methyl-testosterone is obtained in the form of compact crystals. They melt in 163-164.
EMI11.2
L-7 D 0 (chloroform). Ultraviolet absorption spectrum Xmax 245 myL (:: 15600).
Example 27.
In 1 liter of tap water, 2 g of sodium nitrate are dissolved.
EMI11.3
dium, 1 g of primary potassium orthophosphate, 0.5 g of magnesium sulfate-heptahydrate, 0 5 g of potassium chloride, 50 g of glucose and 1 g of Difco yeast extract, brings the pH to 5 adding sodium hydroxide solution and sterilizes. The solution obtained is inoculated with 50 cm3 of a stirring culture of Didymella lycopersici aged 4 days and stirred for 48 hours at 27; the culture is developing well. To 120 cm3 of this culture of Didymella lycopersici, is added, under sterile conditions,
EMI11.4
a solution of 30 mg of 9'X # fluoro-hydrooortisone in 2 cm3 of methanol.
Stirred 5 days at 27, then separates the mycelium by suction, washed with water and ethyl acetate and extracted with ethyl acetate the combined filtrates. The solutions in ethyl acetate are washed with water, dried and evaporated in vacuo. Chromatographic examination on paper shows
EMI11.5
qu.3 the extraction residue contains 1-dehydro-ga-fluoro-hydrocortisone which is separated from the unchanged starting material using a preparation chromatogram on paper (propylene glycol-toluene system ). Recrystallized from acetone, the product obtained is in the form of crystals melting at 263-266 (decomposing); [Ó] 23D240 = + 108 (ethanol); spectrum
EMI11.6
absorption in the ult avv.alet9 max 240 m (m 15800).
This product is dried under a high vacuum and acetylated at room temperature in the usual manner with 4 cm3 of a mixture of pyridine and acetic anhydride.
EMI11.7
tick (181). The 21-acetate of I-dêrdrQ-9a-fluoro-hydrocortisone which is thus obtained is rscrystallized in a mixture of acetone and petroleum ether, it melts at 244 ° 246 (with decomposition), / K / 23 = + 108 (dioxane); absorption spectrum in 1 ultra-vioJ. and max 240 m & (± = 16250).
Example 28.
In 1 liter of tap water, 2 g of sodium nitrate, 1 g of primary potassium orthophosphate, 0.5 g of magnesium sulfate heptahydrate, 0.5 g of potassium chloride, 50 g of glucose are dissolved and 1 g of Difco yeast extract, brings the whole to a pH of 5 by adding a solution of sodium hydroxide, then sterilizes. The resulting nutrient solution is seeded with 50 cm3 of a 4 day old Didymella lycopersici shake culture and shaken at 27 for 48 hours, whereby the culture develops well. To 120 cm3 of this culture of Didymella lycopersici, is added, under sterile conditions, a solution of 30 mg of 21-acetate
EMI11.8
of llepox 1; a, hydrax-cortexone in 2 cm3 of methanol.
The mixture is stirred for 5 days at 27, then the mycelium is filtered off, washed with water and ethyl acetate, then the combined filtrates are extracted with ethyl acetate. The solutions in ethyl acetate are washed with water, dried and evaporated in vacuo. Chromatographic examination on paper shows that
EMI11.9
the extraction residue contains l-dehydro-9'll j3- = epoxy-17ct-hydroxy-cortexone which is separated from the unchanged starting material using a preparative paper chromatogram (propylene glycol system -toluene).
The crude product is dried under high vacuum and acetylated at room temperature in the usual manner with 4 cm3 of a mixture of pyridine and acetic anhydride (1: 1).
<Desc / Clms Page number 12>
EMI12.1
The 21-acetate of l-dehydro-9, ll-epoxy = 17 # = hydroxy-cortexone (30 mg) obtained is dissolved in 5 cm of dioxane, added 1.25 em3 of 2.5 times normal hydrofluoric acid in chloroform and leave to stand for one hour at room temperature. Water is then added and extracted with a mixture of chloroform and ether (1: 1). After washing with water, drying and evaporating
EMI12.2
ration of the solvent under vacuum, 1-dehydro-9a-fluorohydrocortisone 21-acetate is obtained, which melts at 235-237:
CLAIMS.
1.- A process for preparing dehydro-compounds of the steroid series, characterized in that it consists in subjecting saturated steroid compounds in position 1,2 and / or in position 4,5, to the action of aé - robie of enzymes from Didymella lycopersici, Colonectria decora, Alternaria passivelorae, Ophiobolus heterostrophus or Ophiobolus Miyabeanus, then converting the reaction products obtained, if necessary, into their functional derivatives.
The present process can be further characterized by the following points
1) As starting materials, steroid compounds which are saturated in the 1,2-position and / or the 4,5-position and have a free or functionally modified hydroxyl or oxo group in the 3-position are used.
2) Pregnant compounds saturated in position 1,2 and / or in position 4,5 are used as starting substances.
3) Cortisone is used as the starting substance.
4) Hydrocortisone is used as the starting material.
EMI12.3
5) 11 # epi-hydrocortisone is used as the starting material.
6) Corticosterone is used as the starting substance.
7) 11-deoxy-corticosterone is used as the starting substance.
8) 5-3i-hydro 20-o $ o-pregnene is used as the starting material.
9) Aldosterone is used as the starting substance.
EMI12.4
10) 18-Hydroocy-corticosterone is used as the starting substance.
11) 18-hydroy-I1-d.éhd.ro-corticosterone is used as the starting material.
12) 18-hydroxy-cortexone is used as the starting material.
EMI12.5
13) 18-oxo-cortexone is used as the starting substance.
@
14) Progesterone is used as the starting substance.
15) As starting material, those of the compounds indicated under 3) to 7) and 9) to 14) which have the double bond at 1,2 instead of 4,5 are used.
16) Allopregnan-3,20-diones are used as starting material.
17) We use as starting substance the prêgnange-or allo-
EMI12.6
Pregnange-3, 11, 20-trione-17 <x> 21-diol.
** ATTENTION ** end of DESC field can contain start of CLMS **.