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*Procédé pour introduire de l'oxygène dans des stéroïdes."
On sait qu'on peut introduire des groupes hydroxyles dans des stéroïdes, notâmment en position 21, à l'aide d'enzymes de surrénales, en particulier avec des homogénéisais ou par passage à travers ces organes Ou des tranches de ces organes.
Pour aussi intéressante que soit cette fonction des enzymes animales du point de vue théorique, elle ne peut donner satis- faction pour l'obtention, spécialement Industrielle, de
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l-hydroxr-stéroi'dea. La ract-jon indiquée n'a pas pu être exécutée jusqu'à prêtent par des méthodes mlcrob101ogiquea qui peuvent aussi être utilisées en grand.
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La présente invention est relative à un procédé permettant d'introduire de l'oxygène dans des stéroïdes, caractérise par le fait que, sur des composés de la série du prégnane, non substitués en position 21, on fait agir des enzymes produites par des cultures aérobies de champignons de l'ordre Ophiobolus ou de l'ordre Solérotina, puis qu'on isole les stéroïdes hydroxylés en position 21.
Des substances de départ pour le nouveau procédé sont en général des composés de la série du prégnane, non substitués en position 21, parmi lesquels il y a lieu d'entendre les dérivés de n'importe quel genre de substitution et de n'importe quelle configuration, saturés et non saturés, du 10,13-diméthyl-17-éthyl-cyclopentano- polyhydrophénanthrène, ainsi que de ses homologues supérieurs et inférieurs, par exemple les A-nor-, D-homo- et 19-nor- composée correspondants. Des doubles liaisons se trouvent, par exemple, en position 1, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 15 et/ou 16.
La configuration des substances de départ est, de préférence, celle du prégnane, du 5a-prégnane, du 17a-prégnane ou de racémates correspondants, tels qu'on les obtient par synthèse totale. Comme substituants, on envisage en particulier des groupes hydroxyles, oxo ou carboxyliques, libres ou fonctionnel- lement modifiés, tels des groupes ester, éther, thio-ester, thio-éther, thiol- et thlon-ester, acétal, mercaptal, cétal, hydrazone, semi-carbazone et des groupes énoliques, par exemple en position 2, 3, 6, 7. 11, 12, 16, 17, 18, 19 et 20, de plus
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des atomes d'halogène, en particulier de chlore ou de fluoré, par exemple en position 9 et 17.
Des substances de départ spécifiques sont, entre autres, la progestérone, la 17a-
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progestérone, la 16a-hydrocy-progestérone, la 17a-hydroxy- progestérone, la 11-céto-progestérone, la lla- ainsi que la 110-hydroxy-progei3t6rone là 9,11- ou la 11,12-déhydro- progestérone, la 19-oxo-progestérone, la 11-céto-17a-hydroxy- progestérone, la lia- ainsi que la llp-hydroxy-17a-hydroxy- progestérone, la 9-ohloro- ou la 9-fluoro-llp,17a-dihydroxy- progestérone, la 11fl,18-dlhydroxy-progestérone, la 11fl,17,18- trihydroxy-progestërone, la 11-hydroxy-18-oxo-progestérone, la 9-chloro- ou la 9-fluoro-110-hydroxy-18-oxo-progestérone, la 11,18-dioxo-progestérone, la 19-nor-progestérone, la
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a3nor-1.-hydroxy-18-o:o-pragestérone, la prégnénolone ou leurs dérivés fonctionnels.
Les enzymes utilisées sont de provenance microbiolo- gique et sont produites par des cultures aérobies de champignons de l'ordre Ophiobolus ou de l'ordre Sclérotinia, en particulier par des souches actives de l'Ophiobolus herpotrichus ou du
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Solérotinla tüetloola. Pour l'introduction d'oxygène, on in- cube en général directement les substances de départ avec des cultures immergées des champignons Indiqués, croissant dans des conditions aérobies connues.
Ces cultures sont avantageusement remuées, c'est-à-dire secouées ou agitées, et elles renferment du carbone assimilable, en particulier des hydrates de carbone,
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ainsi quelle cas échéant, des substances de croissance, par exemple de l'eau de gonflement du maïs ou du moût de bière, et des sels inorganiques. On peut donc utiliser des solutions nutritives naturelles, synthétiques ou aemi-synthétiques. Un procédé pratiquement simple est décrit dans ce qui suit sans que l'invention se trouve pour autant limitée par les indica- tions fournies : On cultive les organismes dans des appareils et dans des conditions analogues à ceux qui sont connus pour les cultures immergées, dans la fabrication des antibiotiques.
Lorsque les cultures sont bien développées, on ajoute les substances de départ indiquées, à l'état de fine dispersion ou de solution, par exemple dans le méthanol, l'acétone ou l'éthylèneglycol, et poursuit l'incubation. Finalement, on sépare le mycélium, extrait le filtrat et/ou la masse de mycélium et Isole les produits réactionnels de l'extrait, d'une manière en elle-même connue, par exemple par répartition entre solvants ou mélanges de solvants non miscibles l'un avec l'autre, par adsorption, chromatographie, cristallisation, transformation en dérivés fonctionnels tels que les composés de Girard ou par d'autres.procédés appropriés.
Ces mêmes réactions peuvent toutefois aussi être exécutées en séparant d'abord les enzymes actives des cultures aérobies correspondante de champignons de l'ordre des Sphériales, puis en les utilisant, à l'exclusion des cultures en croissance.
Les produits du présent procédé peuvent être utilisés
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comme médicaments ou comme produits, Intermédiaires pour leur préparation. D'un grand intérêt pratique, sont, par exemple, la cortisone, 1'hydrocortisone, la 1-déhydro-cortisone, la
1-déhydro-hydrocortisone, la substance S de Reichstein, l'aldostérone, ainsi que les dérivés polyoxygénés 3e formant par exemple à partir de la progestérone, de la 'prégnénolone , et de la 11-céto-progestérone.
L'invention concerne également, à titre de produits
Industriels nouveaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procéda ci-dessus défini.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent. Les températures sont inoiquées en degrés centigrades.
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Dans un récipient pourvu d'un agitateur, on stéril @ 4 litres de moût de bière à 70% (pH 5,6) et les ensemence avec une culture d'Ophiobolus herpotrichus. Après avoir agité pendant 3 jours à 26 , on ajoute, dans des conditions stérile, à la culture bien développée, une solution de 1,0 g de .progestérone dans 25 cm3 d'acétone, et continue d'agiter à la même température. Au bout de 4 jours, on sépare le mycélium.
On extrait le filtrat de culture à trois reprises avec chaque fois 1 litre d'acétate d'éthyle et lave les extraits avec de l'acide chlorhydrique normal, avec une solution normale de bicarbonate de sodium et à l'eau. Après avoir séché la solution d'acétate d'éthyle sur du sulfate de sodium, on l'évapore sous vide à 400. On chromatographie le résidu (1,2 g) sur 15 g de gel de silice en éluant d'abord avec du chlorure de méthylène, puis avec du chloroforme, et finalement avec des mélanges de chloroforme et d'acétone d'une teneur croissante en acétone.
Cn évapore les diverses fractions (de 100 cm3 chacune) et les soumet à un examen par chromatographie sur papier. Les fractions éluées au chlorure de méthylène et les premières fractions éluées au chloroforme ne renferment, à c8té d'impuretés, que de la matière.de départ, tandis que dans les dernières obtenus fractions chloroformiquesainsi que dans les éluats/avec les mélanges de chloroforme et d'acétone (95 : 5 et 90 : 10) se trouve présente de la cortexone (11-désoxycorticostérone).
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On réunit ces fractions et les évapor.. Le résidu (0,81 g) constitué essentiellement par de la cortexone est recristallité dans de l'éther, ce qui donne des cristaux en plaques, in- colores, fondant à 140 - 142 . Ces cristaux possèdent un pouvoir rotatoire spécifique de 4 1750 et ne provoquent pas, en mêlant avec de la cortexone d'une autre provenance, d'abaissement du ,point de fusion. De même leurs spectres dans l'infra-rouge et dans l'ultra-violet sont identiques avec ceux de la cortexone.
Exemple 2.
Dans une fiole conique d'une contenance de 500 cm3, on stérilise 150 cm3 d'une solution nutritive renfermant par litre 50 g de glucose brut, 20 cm3 d'eau de gonflement du maïs (cornsteep-liquor) et 10 g de tartrate d'ammonium, et par ailleurs de l'eau du robinet, puis ensemence avec une culture d'Ophiobolus herpotrichus. Après avoir agité 2 jours à 26 , la culture s'est bien développée, et l'on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 30 mg de 11-céto-proges- trone dans 1,5 cm3 d'acétone, puis on agite encore 3 jours à la même température. On sépare alors le mycélium.
On extrait le filtrat de culture à trois reprises avec chaque fois 50 cm3 d'acétate d'éthyle et traite les extraits comme décrit dans l'exemple 1. On soumet le résidu (40 mg) à un examen ahromato- graphique sur papier. Il est constitué essentiellement par de la 11-déhydro-corticostérone (composé A de Kendall). Après
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purification par chromatographie, on peut l'obtenir sous forme cristalline-
Exemple 3.
Si à une culture d'agitation d'Ophlobolus herpo- trichus, telle qu'elle a été décrite dans l'exemple 2, on ajoute, à la place de la 11-céto-progestérone, une solution de 30 mg de 17a-hydroxy-progestérone dans 1,5 cm d'acétone, on obtient alors, après incubation et extraction analogues, un produit réactionnel brut formé essentiellement de 17a-hydroxy- cortexone (substance S de Reichstein). Après purification par chromatographie, on peut l'obtenir sous forme cristalline.
¯Exemple 4.
A 4 litres d'une culture d'agitation d'Ophiobolus herpotrichus qui a été obtenue comme décrit dans l'exemple 1, on ajoute, dans des conditions stériles, une solution de 1 g de 1-déhydro-progestérone dans 25 cm d'acétone. On agite trois jours a 27 et sépare alors le mycélium. On extrait le filtrat de culture à plusieurs reprises avec au total 3 litres d'acétate d'éthyle. On lave.les extraits avec de l'acide chlorhydrique décinormal, avec une solution normale de bicarbonate de sodium et à l'eau.
Après l'avoir séchée sur du sulfate de sodium, on ' évapore sous vide la solution d'acétate d'éthyle et chromatogra- phie le résidu ainsi obtenu (1,1 g) sur 30 g de gel de silice, en éluant avec du chloroforme et avec des mélanges de chloro- forme et d'acétone d'une,teneur croissante an acétone. On
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évapore- les divergea fr<.lon8 (zîc looc2a3 chacune) et leu soumet à un examen par cimot;v;aLnr. nply3e sur papier. Dansa les fractions chloroformiqueu, on trouve, six coté d'impuretés, un peu de la matière de départ, tandis que les fractions éludes avec les mélanges de chloroforme et d'acétone (95:5) (710 mg)
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sont essentiellement constituées par de la 1-déhydro-cortexonc.
On cristallise cette dernière dans un mélange d'acétone et d'éther de pétrole. Elle fond à 185 - 192 et présente un
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pouvoir rotatoire spécifique ta]22 + 120o (dans le chlore- forme).
Exemple 5.
Si dans l'exemple ci-dessus, on ajoute à la culture, au lieu de la solution de 1-déhydro-progestérone, une solution
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de 1 g de 1-déliydro-11-céto-17a-hydroxy-,progestérone dans 25 cm3 d'acétone et que l'on traite de la manière décrite et chromatographie,, les fractions obtenues avec un mélange de chloroforme et d'acétone (1:1) sont alors essentiellement formées de 1-déhydro-cortisone que l'on cristallise dans des mélanges d'acétone et d'éther. Elle fond à 231 - 233 .
--Exemple 6.
Si dans l'exemple 4, on ajoute à la culture, au lieu
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de la solution de 1-déhydro-proge8térone, une solution de 1 g de 1-ddhydro-11;17a-dihydroxy-progestérone dans 25 em3 de méthanol et que 1 on traite et chromatographie.de la manière décrite, les fractions obtenues à l'aide d'un mélange de
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chlorcforme et d'acétone (1;1) sont alors essentiellement formées de 1-déhydro-hydrocortisons. On la cristallisa dans des mélanges d'acétone et d'éther. Elle fond à 239 - 242 .
Exemple 7.¯
Dans une fiole conique, on stérilise 50 cm3 de moût de bière à 70% et ensemence avec une culture de Sclerotinia fruction Apres avoir agité pendant 4 jours à 27 , on ajoute à la culture bien développée, dans des conditions stériles, une solution de 10 mg de progestérone dans 0,5 cm3 d'acétone. On cgite encore 4 jours à la même température et sépare alors le mycélium. On extrait jusqu'à épuisement le filtrat de culture avec de l'acétate d'éthyle. On lave l'extrait à l'eau, le sèche et l'évapore sous vide. Un examen chromatographique sur papier de l'extrait brut ainsi obtenu montre qu'il est essentiellement formé de cortexone (11-désoxy-corticostérone).
Exemple 8.
Si dans l'exemple ci-dessus, on ajoute à la culture agitée de Solerotinia fructicola, au lieu de la solution de progestérone, une solution de 10 mg de 1-déhydro-11-céto-17a- hydroxy-progestérone dans,0,5 cm3 d'acétone et qu'on incube et traite de la même manière, l'extrait brut est alors formé essentiellement de 1-déhydro-cortisone.
Exemple 9.
Dars une fiole conique d'une contenance de 500 cm3, on stérilise 120 cm3 de moût de bière et ensemence avec
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de l'Ophiobolus herpotrichus. Après avoir agité pendant 4 jours à 26 , on ajoute à la culture bien développée, dans des conditions stériles, une solution de 30 mg de
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(18 ---.11)-lactone du d,lOw3,20-diadto-11-hydroxyprégnène-18-oïque dans 1,5 cm3 d'acétone, et agite encore 3 jours à 26 . On extrait alors, comme décrit dans les exemples précédents, avec de l'acétate d'éthyle.
Pour séparer les produits de cet extrait brut on le soumet àune chromato-
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graphie sur papier (système propy1èneg1yco1-to1uène); on sépare ainsi une substance qui, par rapport à la substance de départ, est d'une polarité plus élevée et réduit rapidement et fortement une solution alcaline d'argento-diammine. On la cristallise dans un mélange d'acétone et d'éther; c'est la
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(18 ## ll)-lactone du d,l--3,20-dicéto-11,21-dihydroxy- prégnène-18-oïque, La (18 ##> 110)-lactone du d,i-à'-3,zo-àioéto- llp-hydroxy-prégnene-18-oïque peut être préparée par exemple suivant les Indications données dans la demande de brevet déposée par Monsieur Tadéus REICHSTEIN le 14 Janvier 1955 et ayant pour titre : "Procédé de préparation de stéroïdes oxygénés".
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* Process for introducing oxygen into steroids. "
It is known that hydroxyl groups can be introduced into steroids, in particular in position 21, using adrenal enzymes, in particular with homogenizers or by passage through these organs or slices of these organs.
As interesting as this function of animal enzymes is from a theoretical point of view, it cannot be satisfactory for obtaining, especially industrial,
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1-hydroxr-steroidea. The indicated ract-jon could not be performed until ready by mlcrob101ogiquea methods which can also be used on a large scale.
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The present invention relates to a process for introducing oxygen into steroids, characterized in that, on compounds of the pregnane series, unsubstituted in position 21, enzymes produced by cultures are made to act. aerobic fungi of the order Ophiobolus or of the order Solerotina, then that the hydroxylated steroids are isolated in position 21.
Starting materials for the new process are in general compounds of the Pregnane series, unsubstituted at the 21-position, among which are to be understood the derivatives of any kind of substitution and of any configuration, saturated and unsaturated, of 10,13-dimethyl-17-ethyl-cyclopentano-polyhydrophenanthrene, as well as its higher and lower homologs, e.g. the corresponding A-nor-, D-homo- and 19-nor- compound . Double bonds are found, for example, in position 1, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 15 and / or 16.
The configuration of the starting materials is preferably that of pregnan, 5α-pregnan, 17α-pregnan or corresponding racemates, as obtained by total synthesis. As substituents, hydroxyl, oxo or carboxylic groups, free or functionally modified, such as ester, ether, thio-ester, thio-ether, thiol- and thlon-ester, acetal, mercaptal, ketal, etc. hydrazone, semi-carbon and enolic groups, for example in position 2, 3, 6, 7. 11, 12, 16, 17, 18, 19 and 20, in addition
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halogen atoms, in particular chlorine or fluorine atoms, for example in position 9 and 17.
Specific starting substances are, among others, progesterone, 17a-
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progesterone, 16a-hydrocy-progesterone, 17a-hydroxy-progesterone, 11-keto-progesterone, lla- as well as 110-hydroxy-progei3t6rone l 9,11- or 11,12-dehydro-progesterone, 19-oxo-progesterone, 11-keto-17a-hydroxy-progesterone, lia- as well as llp-hydroxy-17a-hydroxy-progesterone, 9-ohloro- or 9-fluoro-llp, 17a-dihydroxy- progesterone, 11fl, 18-dlhydroxy-progesterone, 11fl, 17,18-trihydroxy-progesterone, 11-hydroxy-18-oxo-progesterone, 9-chloro- or 9-fluoro-110-hydroxy-18- oxo-progesterone, 11,18-dioxo-progesterone, 19-nor-progesterone,
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a3nor-1.-hydroxy-18-o: o-pragesterone, pregnenolone or their functional derivatives.
The enzymes used are of microbiological origin and are produced by aerobic cultures of fungi of the order Ophiobolus or of the order Sclerotinia, in particular by active strains of Ophiobolus herpotrichus or of the order Sclerotinia.
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Solérotinla tüetloola. For the introduction of oxygen, the starting substances are usually directly infused with submerged cultures of the fungi Indicated, growing under known aerobic conditions.
These cultures are advantageously stirred, that is to say shaken or agitated, and they contain assimilable carbon, in particular carbohydrates,
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as well as which, if appropriate, growth substances, for example corn swelling water or beer wort, and inorganic salts. It is therefore possible to use natural, synthetic or semi-synthetic nutrient solutions. A practically simple process is described in what follows without the invention being limited by the indications provided: The organisms are cultivated in apparatus and under conditions similar to those which are known for submerged cultures, in the manufacture of antibiotics.
When the cultures are well developed, the starting substances indicated are added in the form of a fine dispersion or solution, for example in methanol, acetone or ethylene glycol, and the incubation continues. Finally, the mycelium is separated, the filtrate and / or the mass of mycelium are extracted and the reaction products are isolated from the extract, in a manner known per se, for example by partitioning between solvents or mixtures of immiscible solvents. 'with each other, by adsorption, chromatography, crystallization, transformation into functional derivatives such as Girard compounds or by other suitable methods.
These same reactions can, however, also be carried out by first separating the active enzymes from the corresponding aerobic cultures of fungi of the order Spherical and then using them, to the exclusion of the growing cultures.
The products of the present process can be used
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as medicaments or as products, Intermediates for their preparation. Of great practical interest are, for example, cortisone, hydrocortisone, 1-dehydro-cortisone,
1-dehydro-hydrocortisone, Reichstein's substance S, aldosterone, as well as polyoxygenated derivatives 3e forming for example from progesterone, pregnenolone, and 11-keto-progesterone.
The invention also relates, by way of products
New industrialists, the compounds obtained by the implementation of the process defined above.
The invention is described in more detail in the non-limiting examples which follow. The temperatures are specified in degrees centigrade.
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In a container fitted with a stirrer, 4 liters of 70% beer wort (pH 5.6) are sterilized and inoculated with a culture of Ophiobolus herpotrichus. After stirring for 3 days at 26, a solution of 1.0 g of progesterone in 25 cm3 of acetone is added to the well-grown culture under sterile conditions, and stirring is continued at the same temperature. After 4 days, the mycelium is separated.
The culture filtrate is extracted three times with 1 liter of ethyl acetate each time and the extracts washed with normal hydrochloric acid, with normal sodium bicarbonate solution and with water. After having dried the ethyl acetate solution over sodium sulphate, it is evaporated in vacuo at 400. The residue (1.2 g) is chromatographed on 15 g of silica gel, eluting first with methylene chloride, then with chloroform, and finally with mixtures of chloroform and acetone with increasing acetone content.
The various fractions (100 cm3 each) are evaporated off and subjected to examination by chromatography on paper. The fractions eluted with methylene chloride and the first fractions eluted with chloroform contain, besides impurities, only the starting material, while in the last obtained chloroform fractions as well as in the eluates / with the mixtures of chloroform and acetone (95: 5 and 90: 10) is found present in cortexone (11-deoxycorticosterone).
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These fractions are combined and evaporated. The residue (0.81 g) consisting essentially of cortexone is recrystallized from ether, which gives plaque crystals, colorless, melting at 140-142. These crystals have a specific rotary power of 4 1750 and do not cause, by mixing with cortexone from another source, a lowering of the melting point. Likewise, their infrared and ultra-violet spectra are identical with those of cortexone.
Example 2.
In a conical flask with a capacity of 500 cm3, 150 cm3 of a nutrient solution containing per liter 50 g of raw glucose, 20 cm3 of corn swelling water (cornsteep-liquor) and 10 g of tartrate are sterilized. ammonium, and otherwise tap water, then inoculate with a culture of Ophiobolus herpotrichus. After stirring for 2 to 26 days, the culture developed well, and a solution of 30 mg of 11-keto-progesterone in 1.5 cm3 of acetone is added under sterile conditions, then stirring for another 3 days at the same temperature. The mycelium is then separated.
The culture filtrate was extracted three times with 50 cm 3 of ethyl acetate each time and the extracts were treated as described in Example 1. The residue (40 mg) was subjected to ahromatographic examination on paper. It consists essentially of 11-dehydro-corticosterone (compound A from Kendall). After
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purification by chromatography, it can be obtained in crystalline form -
Example 3.
If to a shaking culture of Ophlobolus herpotrichus, as described in Example 2, a solution of 30 mg of 17α-hydroxy is added instead of 11-keto-progesterone. -progesterone in 1.5 cm of acetone, one then obtains, after analogous incubation and extraction, a crude reaction product formed essentially of 17α-hydroxy-cortexone (substance S of Reichstein). After purification by chromatography, it can be obtained in crystalline form.
¯Example 4.
To 4 liters of a stirring culture of Ophiobolus herpotrichus which was obtained as described in Example 1, is added, under sterile conditions, a solution of 1 g of 1-dehydro-progesterone in 25 cm of acetone. Stirred three days at 27 and then separate the mycelium. The culture filtrate was extracted several times with a total of 3 liters of ethyl acetate. The extracts are washed with decinormal hydrochloric acid, with normal sodium bicarbonate solution and with water.
After having dried over sodium sulfate, the ethyl acetate solution is evaporated in vacuo and the residue thus obtained (1.1 g) is chromatographed on 30 g of silica gel, eluting with sodium chloride. chloroform and with mixtures of chloroform and acetone of increasing acetone content. We
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evaporate them divergea fr <.lon8 (zîc looc2a3 each) and submit them to a cimot examination; v; aLnr. nply3e on paper. In the chloroformic fractions, we find, six sides of impurities, a little of the starting material, while the fractions eluded with the mixtures of chloroform and acetone (95: 5) (710 mg)
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consist essentially of 1-dehydro-cortexonc.
The latter is crystallized from a mixture of acetone and petroleum ether. It melts at 185 - 192 and presents a
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specific optical rotation ta] 22 + 120o (in chlorine-form).
Example 5.
If in the example above, one adds to the culture, instead of the solution of 1-dehydro-progesterone, a solution
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of 1 g of 1-deliydro-11-keto-17a-hydroxy-, progesterone in 25 cm3 of acetone and which is treated as described and chromatographed, the fractions obtained with a mixture of chloroform and acetone (1: 1) are then essentially formed from 1-dehydro-cortisone which is crystallized from mixtures of acetone and ether. It melts at 231 - 233.
--Example 6.
If in example 4, we add to the culture, instead
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solution of 1-dehydro-proge8terone, a solution of 1 g of 1-ddhydro-11; 17a-dihydroxy-progesterone in 25 em3 of methanol and which 1 is treated and chromatographed as described, the fractions obtained in l 'using a mixture of
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chlorcforme and acetone (1; 1) are then essentially formed from 1-dehydro-hydrocortisons. It was crystallized from mixtures of acetone and ether. It melts at 239 - 242.
Example 7.¯
In a conical flask, 50 cm3 of 70% beer wort is sterilized and inoculated with a culture of Sclerotinia fruction. After stirring for 4 days at 27, a solution of 10 is added to the well-developed culture, under sterile conditions. mg of progesterone in 0.5 cm3 of acetone. We cgite another 4 days at the same temperature and then separate the mycelium. The culture filtrate is extracted until exhaustion with ethyl acetate. The extract is washed with water, dried and evaporated in vacuo. Chromatographic examination on paper of the crude extract thus obtained shows that it is essentially formed of cortexone (11-deoxy-corticosterone).
Example 8.
If in the above example, to the stirred culture of Solerotinia fructicola is added, instead of the progesterone solution, a solution of 10 mg of 1-dehydro-11-keto-17a-hydroxy-progesterone in, 0, 5 cm3 of acetone and which is incubated and treated in the same way, the crude extract is then formed essentially of 1-dehydro-cortisone.
Example 9.
In a conical flask with a capacity of 500 cm3, 120 cm3 of beer wort are sterilized and inoculated with
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of Ophiobolus herpotrichus. After stirring for 4 days at 26, to the well-developed culture, under sterile conditions, a solution of 30 mg of
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(18 ---. 11) -lactone of d, lOw3,20-diadto-11-hydroxypregnene-18-oic acid in 1.5 cm3 of acetone, and stir a further 3 days at 26. It is then extracted, as described in the preceding examples, with ethyl acetate.
To separate the products of this crude extract, it is subjected to a chromato-chromatography.
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writing on paper (propy1eneg1yco1-toluene system); this separates out a substance which, relative to the starting substance, has a higher polarity and rapidly and strongly reduces an alkaline solution of argento-diammine. It is crystallized from a mixture of acetone and ether; it's here
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(18 ## ll) -lactone of d, l - 3,20-diketo-11,21-dihydroxy-pregnene-18-oic, La (18 ##> 110) -lactone of d, i-to'- 3, zo-ioeto-llp-hydroxy-pregnene-18-oic can be prepared for example according to the indications given in the patent application filed by Mr. Tadéus REICHSTEIN on January 14, 1955 and entitled: "Process for the preparation of oxygenated steroids ".