Verfahren zur Herstellung von 21-Oxy-steroiden Es ist bereits bekannt, mittels Enzymen aus Ne bennieren, insbesondere mit deren Homogenaten oder auch bei ihrer Durchströmung Hydroxylgruppen, u. a. in 21-Stellung von Steroiden einzuführen. So interes sant diese Funktion tierischer Enzyme vom theore tischen Standpunkt aus ist, so vermag sie zur präpa- rativen und speziell industriellen Gewinnung von 21- Oxy-steroiden nicht zu befriedigen.
Mit mikrobiolo gischen Methoden, die sich auch in grösstem Stile anwenden lassen, ist die genannte Reaktion bisher nicht durchführbar gewesen.
Es wurde nun gefunden, dass man 21-Oxy-steroide erhält, wenn man auf Steroide, die in 21-Stellung ein unsubstituiertes C-Atom aufweisen, durch aerobe Kulturen von Pilzen der Art Ophiobolus herpotrichus produzierte Enzyme einwirken lässt.
Als Ausgangs stoffe für das neue Verfahren kommen allgemein Verbindungen der Pregnan-, Allopregnan- oder Iso- pregnanreihe, wie 14- oder 17-Isopregnane, in Be tracht sowie Homo- und Nor-pregnane, z. B. A-Nor-, D-Homo- und 19-Nor-pregnane, die in 21-Stellung unsubstituiert sind.
Die Verbindungen können gesät tigt oder ungesättigt sein und beliebige Substituenten aufweisen. Doppelbindungen befinden sich z. B, in 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 11-, 14-, 15- und/oder 16-Stel- lung. Die Konfiguration der Ausgangsstoffe ist vor zugsweise diejenige des Pregnans, 5a-Pregnans, 17a- Pregnans oder entsprechender Racemate, wie sie bei der Totalsynthese erhalten werden.
Als Substituenten kommen besonders in Frage freie bzw. funktionell ab gewandelte Hydroxyl-, Oxo- oder Carboxylgruppen, wie Ester-, Äther-, Thioester-, Thioäther-, Thiol- und Thionester-, Acetal-, Mercaptal-, Ketal-, Hydrazon-, Semicarbazon- und Enolgruppen, z.
B. in 2-, 3-, 6-, 7-, 11-, 12-, 16-, 17-, 18-, 19- und 20-Stellung, ferner Halogenatome, insbesondere Chlor oder Fluor, z. B. in 9- und 17-Stellung. Spezifische Ausgangs- Stoffe sind u. a.
Progesteron, 17a-Progesteron, 16a- Oxy-progesteron, 17a-Oxy-progesteron, 11-Keto-pro- gesteron, 11a- sowie llss-Oxy-progesteron, 9,11- oder 11,12-Dehydro-progesteron, 19-Oxo-progesteron, 11- Keto-17a-oxy-progesteron, 11a- sowie llss-Oxy-17a- oxy-progesteron, 9-Chlor- oder 9-Fluor-11ss,
17a-di- oxy-progesteron, l l ss,18-Dioxy-progesteron, 11ss,17, 18-Trioxy-progesteron, 11ss-Oxy-18-oxo-progesteron, 9-Chlor- oder 9-Fluor-llss-oxy-18-oxo-progesteron, 11,18-Dioxo-progesteron, 19-Nor-progesteron, 19 Nor-llss-oxy-18-oxo-progesteron, Pregnenolon, bzw. ihre funktionellen Derivate.
Die verwendeten Enzyme sind mikrobiologischer Herkunft und durch aerobe Kulturen von Pilzen der Art Ophiobolus herpotrichus produziert.
Zur Einfüh rung der Oxygruppe inkubiert man meist direkt die Ausgangsstoffe mit den unter an sich bekannten aeroben Bedingungen submers wachsenden Kulturen der genannten Pilze. Diese werden zweckmässig be wegt, d. h.
geschüttelt oder gerührt, und enthalten assimilierbaren Kohlenstoff, insbesondere Kohlen hydrate sowie gegebenenfalls Wuchsstoffe, beispiels weise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorga nische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. Im folgenden ist das praktisch einfachste Verfahren ge schildert: Man züchtet die Organismen in Appara turen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotika-Fabrikation als sog. Tieftankverfah- ren bekannt sind.
Nach Entwicklung der Kulturen gibt man einen der genannten Ausgangsstoffe in fei ner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Me thanol, Aceton oder Äthylenglykol zu und inkubiert weiter. Schliesslich trennt man vom Mycel ab, extra hiert das Filtrat und/oder die Mycehnasse und iso liert aus dem Extrakt das Reaktionsprodukt in an sich bekannter Weise, z.
B. durch Entmischungsver- fahren, Adsorption, Chromatographie, Kristallisation, Überführung in funktionelle Derivate, wie Girard- Verbindungen und dergleichen. Dieselben Umsetzun gen lassen sich aber auch durchführen, indem man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden aeroben Kulturen von Pilzen der Art Ophiobolus herpotrichus zuerst abtrennt und unter Ausschluss der wachsenden Kulturen verwendet.
Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zu ihrer Herstellung dienen. Von grösstem praktischem Interesse sind z. B. Cortison, Hydrocortison, Reich steins Substanz S, Aldosteron sowie die z. B. aus Pro gesteron, Pregnenolon und 11-Keto-progesteron ent stehenden entsprechenden 21-Oxy-Verbindungen.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Tempe raturen in Celsiusgraden angegeben.
<I>Beispiel 1</I> 4 Liter 70proz. Bierwürze werden in einem Schüt telgefäss sterilisiert (pu 5,6) und mit einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus beimpft. Nach 3tägigem Schütteln bei 26 gibt man zur gut entwickelten Kul tur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1,0 g Progesteron in 25 cm- Aceton und schüttelt weiter bei der gleichen Temperatur. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt. Man schüttelt das Kulturfiltrat dreimal mit je 1 Liter Essigester aus und wäscht die Extrakte mit In Salzsäure, In Natriumhydrogencar- bonat-Lösung und Wasser.
Die über Natriumsulfat getrocknete Essigester-Lösung wird im Vakuum bei 40 eingedampft. Der Rückstand (1,2 g) wird an 15g Silicagel chromatographiert, wobei zuerst mit Methylenchlorid, dann mit Chloroform und schliess lich mit Chloroform-Aceton-Gemischen mit steigen dem Acetongehalt eluiert wird. Die einzelnen Frak tionen (je 100 ems) werden eingedampft und papier- chromatographisch untersucht.
Die Methylenchlorid- Fraktionen und die ersten mit Chloroform eluierten Fraktionen enthalten neben Verunreinigungen nur Ausgangsmaterial, während in den letzten Chloro- form-Fraktionen sowie in den Chloroform-Aceton- Eluaten (95:5 und 90: 10) Cortexon (11-Desoxy- corticosteron) anwesend ist. Diese Fraktionen werden vereinigt und eingedampft.
Der zur Hauptsache aus Cortexon bestehende Rückstand (0,8l g) wird aus Äther umkristallisiert, wobei farblose Platten vom F. = 140-142 erhalten werden. Diese Kristalle be sitzen eine optische Drehung von -E-175 und zeigen im Gemisch mit authentischem Material keine Schmelzpunktserniedrigung. Ebenso sind ihre Infra rot- und Ultraviolett-Spektren identisch mit denjeni gen von Cortexon.
<I>Beispiel 2</I> 150 cm?, einer Nährlösung, enthaltend im Liter 50 g Rohglukose, 20 cm3 Maisquellwasser (Corn- steep-liquor) und 10 g Ammoniumtartrat und im übrigen Leitungswasser, werden in einem Erlen meyerkolben von 500 cm3 Fassungsvermögen sterili siert und mit einer Kultur von Ophiobolus herpo- trichus beimpft.
Nach 2tägigem Schütteln bei 26 hat sich die Kultur gut entwickelt, und man gibt unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg 11- Keto-progesteron in 1,5 cm?- Aceton zu, worauf wei tere 3 Tage bei der gleichen Temperatur geschüttelt wird. Dann wird das Mycel abgetrennt. Man schüttelt das Kulturfiltrat dreimal mit je 50 cm?, Essigester aus und arbeitet die Extrakte wie in Beispiel 1 be schrieben auf. Der Rückstand (40 mg) wird papier- chromatographisch untersucht und besteht zur Haupt sache aus 17-Dehydro-corticosteron (Kendalls Com- pound A).
Dieses kann nach chromatographischer Reinigung in kristalliner Form erhalten werden.
<I>Beispiel 3</I> Gibt man zu einer analogen Schüttel-Kultur von Ophiobolus herpotrichus, wie sie in Beispiel 2 be schrieben wurde, an Stelle des 11-Keto-progesterons eine Lösung von 30 mg 17a-Oxy-progesteron in 1,5 cm3 Aceton, so erhält man nach analoger Inku bation und Extraktion ein rohes Reaktionsprodukt, das zu Hauptsache aus 17u-Oxy-cortexon (Reich steins Substanz S) besteht. Dieses kann nach chro- matographischer Reinigung in kristalliner Form er halten werden.
<I>Beispiel 4</I> Zu 4 Liter einer Schüttelkultur von Ophiobolus herpotrichus, die wie in Beispiel 1 beschrieben ge züchtet wurde, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 1-Dehydro-progesteron in 25 cm3 Aceton. Man schüttelt 3 Tage bei 27 und trennt dann das Mycei ab. Das Kulturfiltrat wird mehrere Male mit insgesamt 3 Liter Essigester ausge schüttelt. Die Extrakte wäscht man mit 1/1()n Salz säure, In Natriumhydrogencarbonatlösung und Was ser.
Die über Natriumsulfat getrocknete Essigester lösung wird im Vakuum eingedampft und der so er haltene Rückstand (1,1 g) an 30 g Silicagel chromato- graphiert, wobei mit Chloroform und mit Chloro- form-Aceton-Gemischen steigenden Acetongehaltes eluiert wird. Die einzelnen Fraktionen (je 100 cm?,) werden eingedampft und papierchromatographisch untersucht.
In den Chloroform-Fraktionen befindet sich neben Verunreinigungen etwas Ausgangsmate rial, während die mit Chloroform-Aceton-(95:5)- Gemischen eluierten Anteile (710 mg) zur Haupt sache aus 1-Dehydro-cortexon bestehen. Dieses wird aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch kristallisiert. F. = 185-192 , [a]22 = -E-120 (CHC13).
<I>Beispiel 5</I> Wird im obigen Beispiel an Stelle der Lösung von 1-Dehydro-progesteron eine solche von 1 g 1- Dehydro-ll-keto-17a-oxy-progesteron in 25 cm3 Aceton zur Kultur zugegeben und wird in der be schriebenen Weise aufgearbeitet und chromatogra- phiert, so bestehen die Chloroform-Aceton-(1:1)- Fraktionen zur Hauptsache aus 1-Dehydro-cortison, das aus Aceton-Äther-Gemischen kristallisiert wird. F. = 231-233 .
<I>Beispiel 6</I> Wird im Beispiel 4 an Stelle der Lösung von 1-Dehydro-progesteron eine solche von 1 g 1-De- hydro-llss,17a-dioxy-progesteron in 25 cm3 Metha nol zur Kultur zugegeben und wird in der beschrie benen Weise aufgearbeitet und chromatographiert, so bestehen die Chloroform-Aceton-(1 : 1)-Fraktionen zur Hauptsache aus 1-Dehydro-hydrocortison. Es wird aus Aceton-Äther-Gemischen kristallisiert.
F. = 239-242 .
<I>Beispiel 7</I> In einem Erlenmeyerkolben von 500 cm3 Fas sungsvermögen werden 120 cm3 Bierwürze sterilisiert und mit Ophiobolus herpotrichus beimpft. Nach 4- tägigem Schütteln bei 26 gibt man zur gut entwickel ten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,1-44-3,20-Diketo-llss-oxy-pregnen-18- säure-lakton-(18-@ l 1ss) in 1,5 cm3 Aceton zu und lässt weitere 3 Tage bei 26 schütteln.
Dann wird, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, mit Essigester extrahiert. Der Rohextrakt wird an Papier präparativ chromatographiert (System Propy- lenglykol-Toluol), wobei eine Substanz abgetrennt wird, die im Vergleich zum Ausgangsmaterial höher polar ist und alkalische Silberdiamin-Lösung rasch und stark reduziert. Sie wird aus Aceton-Äther kri stallisiert und stellt das d,1-44-3,20-Diketo-11ss,21- dioxy-pregnen-18-säure-lakton-(18->llss) dar.
Process for the preparation of 21-oxy-steroids It is already known to renal using enzymes from Ne, in particular with their homogenates or even with their flow through hydroxyl groups, u. a. to introduce in the 21 position of steroids. As interesting as this function of animal enzymes is from a theoretical point of view, it cannot be satisfactory for the preparative and especially industrial production of 21-oxy-steroids.
With microbiological methods, which can also be used on a large scale, the reaction mentioned has not yet been feasible.
It has now been found that 21-oxy-steroids are obtained if enzymes produced by aerobic cultures of fungi of the species Ophiobolus herpotrichus are allowed to act on steroids which have an unsubstituted carbon atom in the 21-position.
The starting materials for the new process are generally compounds of the Pregnan-, Allopregnan- or Isopregnane series, such as 14- or 17-isopregnane, in consideration as well as homo- and nor-pregnanes, eg. B. A-nor-, D-homo- and 19-nor-pregnane, which are unsubstituted in the 21-position.
The compounds can be saturated or unsaturated and have any substituents. Double bonds are z. B, in 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 11-, 14-, 15- and / or 16-position. The configuration of the starting materials is preferably that of the pregnans, 5a-pregnans, 17a-pregnans or the corresponding racemates as obtained in the total synthesis.
Particularly suitable as substituents are free or functionally converted hydroxyl, oxo or carboxyl groups, such as ester, ether, thioester, thioether, thiol and thionester, acetal, mercaptal, ketal, hydrazone , Semicarbazone and enol groups, e.g.
B. in the 2-, 3-, 6-, 7-, 11-, 12-, 16-, 17-, 18-, 19- and 20-position, also halogen atoms, in particular chlorine or fluorine, z. B. in 9 and 17 positions. Specific starting materials are u. a.
Progesterone, 17a-progesterone, 16a-oxy-progesterone, 17a-oxy-progesterone, 11-keto-progesterone, 11a- and llss-oxy-progesterone, 9,11- or 11,12-dehydro-progesterone, 19- Oxo-progesterone, 11-keto-17a-oxy-progesterone, 11a- and llss-Oxy-17a-oxy-progesterone, 9-chloro- or 9-fluoro-11ss,
17a-di- oxy-progesteron, ll ss, 18-dioxy-progesteron, 11ss, 17, 18-trioxy-progesteron, 11ss-oxy-18-oxo-progesteron, 9-chloro- or 9-fluoro-llss-oxy- 18-oxo-progesterone, 11,18-dioxo-progesterone, 19-nor-progesterone, 19-nor-llss-oxy-18-oxo-progesterone, pregnenolone, or their functional derivatives.
The enzymes used are of microbiological origin and produced by aerobic cultures of mushrooms of the species Ophiobolus herpotrichus.
To introduce the oxy group, the starting materials are usually incubated directly with the cultures of the fungi mentioned that grow submerged under known aerobic conditions. These are expediently moved, i.e. H.
shaken or stirred, and contain assimilable carbon, in particular carbohydrates and possibly growth substances, for example corn steep liquor or wort, and inorganic salts. Natural, synthetic or semi-synthetic nutrient solutions can therefore be used. The simplest method in practice is described below: The organisms are grown in apparatus and under conditions similar to those known in the manufacture of antibiotics as the so-called deep-tank process.
After the cultures have developed, one of the starting materials mentioned is added in a fine dispersion or solution, for example in methanol, acetone or ethylene glycol, and the incubation continues. Finally, the mycelium is separated, the filtrate and / or the Mycehnasse are extracted and the reaction product is isolated from the extract in a manner known per se, eg.
B. by segregation processes, adsorption, chromatography, crystallization, conversion into functional derivatives such as Girard compounds and the like. The same implementations can also be carried out by first separating the active enzymes from corresponding aerobic cultures of fungi of the species Ophiobolus herpotrichus and using them to the exclusion of the growing cultures.
The products of the process can be used as medicinal products or serve as intermediate products for their manufacture. Of greatest practical interest are z. B. cortisone, hydrocortisone, rich stone substance S, aldosterone and the z. B. from Pro gesteron, pregnenolone and 11-keto-progesterone arising corresponding 21-oxy compounds.
In the following examples, the temperatures are given in degrees Celsius.
<I> Example 1 </I> 4 liters 70% Beer wort are sterilized in a shaking vessel (pu 5.6) and inoculated with a culture of Ophiobolus herpotrichus. After 3 days of shaking at 26, a solution of 1.0 g of progesterone in 25 cm acetone is added to the well-developed culture under sterile conditions and shaking is continued at the same temperature. The mycelium is separated after 4 days. The culture filtrate is extracted three times with 1 liter of ethyl acetate each time, and the extracts are washed with 1N hydrochloric acid, 1N sodium hydrogen carbonate solution and water.
The ethyl acetate solution, dried over sodium sulfate, is evaporated at 40 in a vacuum. The residue (1.2 g) is chromatographed on 15 g of silica gel, eluting first with methylene chloride, then with chloroform and finally with chloroform-acetone mixtures with increasing acetone content. The individual fractions (100 ems each) are evaporated and examined by paper chromatography.
The methylene chloride fractions and the first fractions eluted with chloroform contain only starting material in addition to impurities, while the last chloroform fractions and the chloroform-acetone eluates (95: 5 and 90:10) contain cortexone (11-deoxycorticosterone) ) is present. These fractions are combined and evaporated.
The residue (0.8l g), consisting mainly of cortexon, is recrystallized from ether, giving colorless plates with a F. = 140-142. These crystals have an optical rotation of -E-175 and do not show any lowering of the melting point when mixed with authentic material. Likewise, its infrared and ultraviolet spectra are identical to those of Cortexon.
<I> Example 2 </I> 150 cm ?, a nutrient solution containing 50 g of raw glucose, 20 cm3 of corn steep liquor and 10 g of ammonium tartrate and the rest of the tap water, are put in a 500 cm3 Erlen Meyer's flask Capacity sterilized and inoculated with a culture of Ophiobolus herpotricchus.
After 2 days of shaking at 26, the culture has developed well and a solution of 30 mg of 11-keto-progesterone in 1.5 cm? -Acetone is added under sterile conditions, followed by shaking for a further 3 days at the same temperature. Then the mycelium is separated. The culture filtrate is shaken out three times with 50 cm ?, ethyl acetate each time, and the extracts are worked up as described in Example 1. The residue (40 mg) is examined by paper chromatography and consists mainly of 17-dehydrocorticosterone (Kendall's Compound A).
This can be obtained in crystalline form after chromatographic purification.
<I> Example 3 </I> A solution of 30 mg 17a-oxy-progesterone in 1 is added to an analogous shaking culture of Ophiobolus herpotrichus, as described in Example 2, instead of 11-keto-progesterone , 5 cm3 acetone, a crude reaction product is obtained after an analogous incubation and extraction, which mainly consists of 17u-oxycortexon (Reichstein's substance S). This can be obtained in crystalline form after chromatographic purification.
<I> Example 4 </I> To 4 liters of a shaking culture of Ophiobolus herpotrichus, which was cultivated as described in Example 1, a solution of 1 g of 1-dehydro-progesterone in 25 cm 3 of acetone is added under sterile conditions. Shake for 3 days at 27 and then separate the mycei. The culture filtrate is shaken out several times with a total of 3 liters of ethyl acetate. The extracts are washed with 1/1 () N hydrochloric acid, in sodium hydrogen carbonate solution and water.
The ethyl acetate solution, dried over sodium sulfate, is evaporated in vacuo and the residue (1.1 g) obtained in this way is chromatographed on 30 g of silica gel, eluting with chloroform and with increasing acetone content with chloroform-acetone mixtures. The individual fractions (100 cm each) are evaporated and examined by paper chromatography.
In the chloroform fractions, in addition to impurities, there is some starting material, while the fractions (710 mg) eluted with chloroform-acetone (95: 5) mixtures mainly consist of 1-dehydro-cortexon. This is crystallized from an acetone-petroleum ether mixture. F. = 185-192, [α] 22 = -E-120 (CHCl3).
<I> Example 5 </I> In the above example, instead of the solution of 1-dehydro-progesterone, a solution of 1 g of 1-dehydro-II-keto-17a-oxy-progesterone in 25 cm3 of acetone is added to the culture and is used worked up and chromatographed in the manner described, the chloroform-acetone (1: 1) fractions mainly consist of 1-dehydrocortisone, which is crystallized from acetone-ether mixtures. F. = 231-233.
<I> Example 6 </I> In Example 4, instead of the solution of 1-dehydro-progesterone, a solution of 1 g of 1-dehydro-llss, 17a-dioxy-progesterone in 25 cm3 of methanol is added to the culture and is worked up and chromatographed in the manner described enclosed, the chloroform-acetone (1: 1) fractions consist mainly of 1-dehydro-hydrocortisone. It is crystallized from acetone-ether mixtures.
F. = 239-242.
<I> Example 7 </I> In an Erlenmeyer flask with a capacity of 500 cm3, 120 cm3 of wort are sterilized and inoculated with Ophiobolus herpotrichus. After 4 days of shaking at 26, a solution of 30 mg d, 1-44-3,20-diketo-llss-oxy-pregnen-18-acid-lactone- (18- @) is added to the well-developed culture under sterile conditions. l 1ss) in 1.5 cm3 acetone and let shake for another 3 days at 26.
Then, as described in the previous examples, extracted with ethyl acetate. The crude extract is chromatographed preparatively on paper (propylene glycol-toluene system), a substance being separated off which is more polar than the starting material and which rapidly and strongly reduces the alkaline silver diamine solution. It is crystallized from acetone-ether and represents d, 1-44-3,20-diketo-11ss, 21-dioxy-pregnen-18-acid-lactone- (18-> llss).