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La présente invention concerne,, de manière générale, la production de composés stéroides de valeur par fermentation.
Plus particulièrement, elle est relative à un nouveau procédé microbiologique pour introduire une double liaison entre les atomes de carbone c-1 et C-2 du noyau stéroide à l'aide de
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microorganismes du genre No cardia. Conformément à une forme d'exécution préférée de l'invention, des 4 -3-céto-stéroides tels que le / '-prégnén-3, 11,20-trione-17 ,21-diol et le Q '-prégnène-3,0-dione-11391? c{ ,21-triol sont convertis en fa ' -3-céto-stéroïdes correspondants, à savoir le 1,4¯pré- gnadiéne-3,11, 20-trione-1? c ,21-diol et le fa j., &-prégnadiène- 20-dione-1.1/3, .? o( , .-trio3. respectivement .
Ces, derniers composés possèdent une activité cortisonale, mais diffèrent de la cortisone par le fait qu'ils sont sensiblement exempts d'ef- fets secondaires indésirables, tels que l'oedème, étant donné qu'ils ne possèdent pas d'action appréciable décrètent ion de sodium ou d'eau.
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La préparation des /il,43 't ., -d pax des La préparation des fa ' '-.3-céto-stéroïdes par des moyens chimiques n'a pas donné satisfaction, en raison du fait que les réactions chimiques produisent des mélanges de plusieurs composés. La séparation des produits intermédiaires et finaux désirés à partir de ces mélanges est coûteuse et ne permet
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d'obtenir que des rendements faibles en composés /j 1,4¯3-céto- stéroïdes désirés .
La présente invention a pour objet un procédé en un stade pour introduire une double liaison 1 dans des composés stéroïdes et la réalisation de cette non saturation en ¯1 par/un procédé sélectif donnant lieu à la formation du / 1 sté roide désiré non contaminé par des sous-produits son désirés.
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L'invention a encore pour objet un procédé grâce
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auquel des composés de à -3-céto-prégnènes peuvent être coin- vertis directement, et avec un rendement élevé, en composés de à l'-3-céto-prégnadiène correspondants .
L'invention a encore pour objet la production de 1,4¯.3-céto-stéroides de la série du prégnane, directement et avec un rendement élevé, à partir des composée de 3-céto- prégnanes et de 3-hyd.roxy-prégnanes correspondants* découvert que la 1-déshydrôgénation compo. On a découvert que la /} -déshydrogénation de compo- sés stéroïdes peut être accomplie par un nouveau processus de déshydrogénation microbiologique, qui consiste à mettre un
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composé stéroide,.
en particulier un composé stéroïde non statu- ré en c-5 et 3-oxygéné en contact avec l'activité déshydrogé- nante de microorganismes du genre Nocardia, de préférence de
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microorganismes de l'espèce Nocardia blaelniellii, Nocardia astenides, Nocardia minima, Nocardia globerulaNocardia leish- manii, Nocardia formica, Nocardia oonvoluta!t Nocardia coral- lina.Ces microorganismes du genre Nocardia peuvent être obtenus à partir de sources connues, telles que 1' american Type Culture Collection de Washington ou bien ils peuvent être isolés de sources naturelles, telles que le sol ou des processus morbides, par des procédés connus .
La déshydrogénation peut s'effectuer par contact du composé stéroide avec les microorganismes du genre Nocardia eux-mêmes ou, si on le préfère, avec des systèmes enzymatiques des microorganismes du type Nocardia, de façon que l'hydrogène attaché aux atomes de carbone c-1 et C-2 soit sélectivement éliminé, de manière à produire le /\ -stéroïde désiré sensible- ment non contaminé par des sous-produits indésirables . Lorsque le composé de /\ -3-céto-prégnène est soumis à l'activité déshy- drogénante de microorganismes du genre Nocardia, le composé ¯1,4
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prégnadiénique est obtenu directement et avec un rendement élevé .
Bien que le nouveau procédé de déshydrogénation microbiologique soit applicable à la -déshydrogénation de
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composés 3-céta-sGéraides en général, quels que soient les
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substituants attachés aux noyaux B, C et D ou le degré de
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non saturation de ces noya"ux, on préfère ordinairement utiliser,
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comme matière de départ dans ce procédé, des composés stéroïdes
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non saturés en 0-5 et 3-oxygéués de' la série du prégnane, tels que par exemple les / "-3-céto-prégnèneSj comme la f\ -prégnène 3,20-dione, le /\ -prégnène-3,20-dione-17 0-0l, le ( 4¯prégnène" 3,20-dione-21-ol, le 21-acylate de 4¯prégnène -3,20-dione-21- ol, le 21-acétate de / -prégnéyze-3,2fl-dione-21-oL, le -pré- gl1ène -3,20-diozze-l'7 c(,2ldio, le 21- acylate de /\ 4¯prégnène- 3,20-dione-17 ,21-diol,
le 21-acétate de /[ -prégnène-3?20-dio- ne-17c(,21-diol, le /, -prégzaè??e-3, 20-diozze-.7 -ol-21-al, la (j -prégnène-3,ll,20-trione, le , -prégzzèz?e-3,11,20=criozze-î? c( -ol, le '--prégnèzxe-3,11,20-tr3one-.2'..-ol, le 21-acylate de 6 4- .prégnène-3,1.1.,2Q-trio:xe-21-ol, le 21-acétate de % iF.picg:z.2xe4, 3, 11¯, 20- trio11e-l-ol le '.-prégnèzxe-â,1.,2fl--tiohze-17 c't 321-dio3a le 21-acylate de ' -nrégzxEZZ.e-3,1.,.!.triorze-1721d.o., le 21- acétate de -pr ég:zne:
, .., 20-trione-l ,2:!-diol, le /J. 4¯pré- gzZêne--3,1.,2Q-trzone-1? c(-ol-21¯al, le /\-prGgnène-3,2O-dione- 11/3 -ol, le f '-prégzzéixe-.3, 2fl-dïone-1 , 2.-di oi, le 21-acylate... de -prégnène-3, 20-dione-ll,21-diol, le 21-acéSate de Li4¯p1"é- ânèrze--3,0-diozxe-,..,/ ,l d3.ola le s^., pre néne¯3,z0-d.ozxe-lI - .Ge Qy -pre ,ncne.,,J-o..one .,3., ,3.'!r -d.ol, o1-al, e '-prégszéne-3, 20-dione.-li/'.5 , l'% c( , 2ldtrio;
le 21-acy- late de L\ -.pré;aën,e.3, 20.d.one-11,17, 2'Z-'rio3., le IJ 4¯prégnène@ 3,20--dio;.e-llg.7 c-d.oL-21-a1, le 21 acétate de (j 4¯p1"égnène-3, 20-dione-ll, l7 c,?Z..trioi, les dérivés 9-halogénés de ces L1 4-3-céto-prégnènes, conutte le 9¯halo-/\ -prégnène-3, 20-dione-17}
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21-diol, le -fluoro- -prégnëne-3, 20-dione-17 c( , 21-diol, le 21-acylate de 9¯halo¯± -prégnène-3,2fl-dione-.17,21-d3.ol, le 21-acétate de 9-fluoro..L1 '-prgnène-3,2t-dione-1? c(,21-diol le 9-halo -/3 -prégnène-,11,20-trione -17, 21-diol, le 9-fluo- ra-/-prégnëne-3,11,:-trzone-17 d,21-diol , le 21-acylate de 9-h.àlo-A 4o¯prégnèna-3,11,20-trione-17,2l-diol, le 21-acétate de 9-fluoro- "-prégz:
ène-,3.Z,2t-trione-li d 21-diol, le 9-halo. 4¯prégnène-J,20-dione-ll,17,21-trio1, le 9-fluoro-à 4¯prégnè- ne-3,20-dîone-il..Al?o(,21-triol, le 21-acylate de 9-halo- 4 prégnéne-3,2ü-d3.one-.1,17,21-triol, le 21-acétate de 9-fluoro-.
'¯prégnène-3,23-dion s-11391' 4,21-triol et analogues . Au lieu de -3-céto-prêgaène% on peut employer, comme matières
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de départ, d'autres composés stéroldes non saturés en C-5 et
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3-oxygénés ,tels que les /\ ¯3..lydroxy-prég>xèrzes, comme le- / 5 -prégnène-20-one-3-ol, le -prégnène-20-one-3 , 17 c(-diol, le 5-prégnène-2D-one-3,21-diol, le 21-acylate de -prégnè- ne-20-one-3,21-diol, le 21-acétate de /\ -prégnène-20-one-3,2i- Jt diol,f,l -prégnène- 20-one-3,17 4,21-triol, le 21-acylate de j 5-prégnéne-2t-one-3,1?,21-triol, le 21-acétate de ±15 -prégnè- ne -20-one-3,17o(,21-triol, la 5¯prégnèna-ll,20-dione-3-o1, le 5-prégnène-ll-,20-dione- 3tel7 4 -diol, le /\ -prégnène-11, 20-dione-3,21-diol, le 21-acylate de '-prégnène-11,20-dmone- 3,21-diol, le 21-acétate de 5-pz gzxène-.1,20-dione-3321-di.oli le L1 -prégnène-11,
2-dione-3,.'l a(,21-triol, le 21-acylate de 5-prégnène-11,20-dione-3,1-7,21-trîol, le 21-acétate da 5. prêgnèzae-11,2(3-dione-.,17 c,2.-triol le /\ -prégnène-20-one- 3,11/3 -diol, le -prégnène-2-one-3,I13;21-triol,le 21-acylate de à 5-prégnène-20-one-3,11,21-triol, le 21-acêtate de 5¯pré- gnène-20-one-3,11/1 ,21-triol, le j 5-prégnèrze-20-one-3,11 ,170 -triol; le 5 -prégnène-20-one-.3 ,11.8 ,17 4 21-tetrol, le 21 - acylate de fa -prégnène-20-oae-3,ll,17,21-tetrol, le 21-acétate
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de /, -prégtiène-20-one-â , lly l 7 d , 21-tebroi, le s dérivés 9-halo- génés de ces 5 tels que le 9-halo-j 5- prégnène -20-one-3Slaê-triol, le 9 fluoro-'r,-prêgnène-20-. one-3.17 d,21-triol, le 21 acylate de 9-halo-5-prégnène-20- otle, , :i , 2:.t::
.cal, le 1-acétate de 9-fluoro - -prégnène-20- one-3,17 c,2. :r.1, le 9-halo- .-prêgnèzwe-11,2û-dson.e-,1r,21 '-triol, le 9-.fluoz.o- -prégnène-11!/3, 20-diozze-3,17 c(,21-triol, le 21-acylâte de 9-halo-/ 5-prégnèî).9-llî20-dione-3, 17,21- triol, le 21-acétate de 9-f luoro 5¯prégnène-11j3 ,20-dione-i3,17 c{ , 21w triol, le 9-halo-a le 9-flu- oro-d, -prëgnène-20-orae.,l. ,.i o{,21-tëtroi., le 21-acylate de 9-halo-â 5 -prégnène 207-one-3,11,17,21-tétrc)l, le 21-acétate de 9-fluoro- 5-pW gnëne-20-one-.$,11 ,1' t,21.-tétrol, et les -3-(alcanoyloxy inférieur,}.prégnènes tels que les 3-(alcano- ates inférieurs) de 5-prégznzze20-.one-3-ol, le 3-acétate de Li 5-prégnène-20-oiie-3-ol, les 3- (a.lcanoates inférieurs). de /( - prégnène-20-one-3,17-diol, le 3-acétate de ± -pré;
tzèazc..z0-,ona- 3,17 c(-diol, les 3-(alcanoates inférieurs) de 3 5¯prégnène-20- one-3,21-diol, le 3-acétate de /\ -prégnène-20-oae-3,21-diol, les 3,21-bis (alcanoates inférieurs) de t -pz êgtaènem2t3-ozae-,, 21-diol, le 3,21-diacétate de /3 y;rgaaeFt-20-..or'e-,21-diol, les 3- (alcanoates inférieurs) de ' ..>p;
êgnèPZ-2Q-ozze-3,17, .-trioZ, le 3-acétate de L1 5 -prégnène-20-.one-3 , 17 c{,2..-trJ.oZ, les 3,21- bie(alcanoates inférieurs) de ) . 5 -prégnène -20-one-3,17,21-tri- ol, le 3,21-diacétate de -régzzène-?0-one-3,.'Î c,21--t iol, -/'les 3-(alcanoates inférieurs) de j 5-nrégnène-11,20-dione-3-ol- le 3-acétate de (1 -pré;nène sl ? , 20-diozze-.â-ol, le 3- ( alaanoates inférieurs)de -prégnène-ll,20-dioae-3,17-diol, le 3-acétate de 5-prégnène ll}20-dione-3,17 ct-diol, les 3-(alcanoates infé- rieurs) de 5¯prégnène-ll,20-dione-J,21-diol, le 3-acétate de /j -prégnène-ll,20-dione-3,21-diol, les 3,21-bis(alcanoates infé- rieurs) de à 5¯ préguëne-1.,20¯dion.e-3,21-diol, le ;
,21-diacétte
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de / -prégnène-11,2-dione-3,a.-diol, les 3-(alcanoates inférieurs) de tl-prégnène-ll,20-dione-3,17,2l-triol, le 3- acétate de /-prégnène-11,2J-dioiae-3,17 ci,21-triol, les. 3, 21- bis(alcanoates inférieurs) de -prégnètze-7.1, 20-diotie-3,17, 21-triol, le 3,21-diacétate de -prégnêne-ll,20-dione-3,17 4 ]2l-triol, les .3-(alcanoates inférieurs) de/prégnène-20-one-3, 11-diol) le 3-acétate de /¯prégnèzie-2fl-one-3?113 -dioL, les 3-(aloanoates inférieurs) de f-20-one-3,1l,17-trPl le 3- acgtate de J -20-one-.3,.1Jj3 ,17 d -triol, les 3-(alcauoates in- férieurs) de /-prégnène-20-one-3,11,21-triol, le 3-acétate de /JS.:prégnène-0-one-3,11,3 ,21-triol, les 3,21-bis{alcanoates inférieurs) de Il-prégnène-20-one,3 ,ll,Zl-triol, le 3,23:
-diacé- tate de 'i5 (prégnène-20-otxe-3,113 ,21-triol, lés 3-(alcanoates inférieurs) .de /15-préglène.-20-otxe-3 ,11 c( ,17,21-tétrol, le 3- acétate de -prégtiène-wtJ-one-3,ZZf3 ,17 Q ,21-tétrol, les 3, 2l-pis(alkauoates inférieurs) de /!5-prégnène-20-one,3,11,17,21- tétrol,' le 3,21-diacétate de /5-prêgciène..20-one-3,1133 ;
17 d , 21-tétrol, les dérivés 9-halogénés de ces /5-3-alanoylox3r inférieurs)-prégnènes, tels que l.e s. 3- { alcanoates inférieurs) de 9-halo--prégtiène-20-one-3,17,21-trial, le 3-acétate de 9- fluoro--prégnène-2d-one-3,17 c{,1-triol, les 3-(alcanoates inférieurs) de 9-halo-f-prégnène-ll,20-dione-.3,17,2l-triol, le 3-acétate de 9-f luoro--prégnène-Zl, 20-dione-3, L7 .d , 2l-triol, les 3,21-bis{alcanoates inférieurs) de 9-halo-/j -pré gnène- 11,20- dioxe-3,17,21-triol, le 3,21-diacétate de 9-fluoro-/j -prégnène- ,
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ll,20-dione-3,17 d ,21-triol, les 3-(alcanoates inférieurs) de
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9-halo-/-prégnène-?0¯orie-3,11,17,21-tétrol, le. 3-acétate de 9-f iuoro-/-prégrrène-20-one-3 ,11 , ,17 d ,2i# tétro.i;
les s 3 , 21- ' bis (alcanoates inférieurs) de -halo--pgiène-2Q.-otte-3,11, 17,21-tétrol, le 3,21-diacétate de 9-fluôro-/f-prégnène-20-one- .31j1/.3 ,17 ci ,21-tétrol et analogues.Ces'prégnènes /) 5-3-oxygétié
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de départ sont convertis directement par l'activité déshydrQgé-
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nante de ces microorganismes du genre Nocardia en / '-3-eéto-
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prégnadiènes correspondants, cette conversion pouvant s'opérer, suppose-t-on, par formation intermédiaire du compose. - -ce-
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tonique.
Dans iesbatières dl départ susmentionnées, le substi- tuant ester préféré dans lepositions 3 et/ou 21 est ordinai- rement l T acé1:;a:e 1 b:i.ell cure d'autres esters,acides carboxyliques
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d'hydrocarbures inférieurs, tels que le propionate , le butyra-
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te, le t .er.t. -butylacétate ,fbenzoa'Ge et analogues puissent être #employésAu lieu de l'acétate, j.i on le désire.
Au lieu de ces prégnènes C-5 non saturés et 3-oxygénés, on peut aussi utiliser, comme matières de départ des composés 3-céto-prégnanes, 3-hy- droxy-prégnanes ou 3-hydrox5=ull.opa c ;zxaes, qui sont sélective-
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ment déshydrogénés par les microorganismes du genre Nocardia,.
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de manière à produire une - eû 4 non-saturation ( et dans le cas des composés 3-hydroxy-prégaanesj, une oxydation da radai-
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cal 3-hydroxy en substituant 3-céto), en sorte que l'on obtient
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le composé l''-3-céto-prégnadiènique correspondant. Les 3céto-prégnanes et 3-hydroxy-prégnalies que l'on utilise ordinai-
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rement comme matières de départ pour ce procédé de déshydrogéna-
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tion microbiologique à l'aide de microorganismes du genre Nocar- dia comprennent la pré ;tzatae-3,<-dzoae, le. irégzme-3,?Omdioge-.
170(-0l, le prégnane-3,20-diozïe-21-ol, lei prégiaz?ev,0¯dione- 17 ci ,21-diol, la prêgnane-.â 9113 9-. trioae, le prégnane-3, 11,20- trione-17 d-ol, le prégnane-3, 11, 20-"trione-21-01, le préggane- 3,ll,20-trione-17,21-diol, le pr.êgnane.-.,L1¯d,Ole-1.-0l, le prégnane-3,20-dione- 11p, ,1' c(-dio1, le prëgztarxe-3,--diorae-11/3 21-diol, le prégnane.,3 ).O-.diOl1e-l/3 ,.7 d, 21-trio1, le prégnane...
20-one-3-ol, le prégnane-20-one-3 ,17 d..diol, .a ¯pr;gnazie-20-o:e- 3,21-diol, le prégnane¯20-one-3,17 ci ,21-triol, .Le prégnane-11,20--. dione-3-ol, le prégnane -11,20- dïone-3 , I' -d,iol, le prégnane- ll,20-dione-3,21-diol, le prégnane- 111,20-di.oiie-3,'Lee 4,21-trlol, le prégnane-.0¯one-,î..disl le prégzlane-?.-one-3,1./3 ,17 c(-
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triol, le prégnane-20-one-3,11ss,21-triol le prégnane-20-one- 3.11-3,17Ó ,21-tétrol et, pour les matières de départ énumé- rées plus haut, qui contiennent des radicaux hydroxy dans les positions 3 et/ou 21, leurs 3- et/ou 21-esters avec des acides carboxyliques d'hydrocarbures inférieurs, tels que l'acide adé- tique, l'acide propionique, l'acide tert-butyl-acétique l'aci- de benzoïque et analogues .
Le présent procédé de déshydrogénation microbiologi- que consiste à mettre le'composé,stéroïde 3-oxygéné en contact avec l'activité déshydrogénante de microroganismes du genre Nocardia . Ceci peut se faire en ajoutant, dans des conditions stériles, le composé stéroïde, sous forme de solide ou sous forme d'une solution dans un solvant, tel qu'une dialcoylcétone comme l'acétone, une dialcoyl-formamide comme la diméthylforma- mide et analogues, à une culture du microorganisme dans un mi- lieu nutritif, et en agitant le mélange résultant, de manière à assurer la croissance du microorganisme et la déshydrogénation du composé stéroïde.
Le stéroide peut être ajouté au moment où le milieu nutritif est inoculé à l'aide de la culture de micro- organismes du genre Nodardia ou bien il peut être ajouté à une culture établie. Au lieu dajouter le composé stéroïde à la culture établie dans le milieu nutritif, les cellules de cette culture peuvent être séparées par filtration du bouillon , la- vées à l'eau distillée et mises en suspension dans une solution aqueuse tamponnée contenant le composé stéroïde 3-oxygéné, le mélange résultant étant agité de manière à opérer la déshydro- génation du composé stéroide, de façon à former le stéroïde 1 ¯ "3-oxygéné correspondant.
Ge dernier est récupéré plus fa- cilement de ce milieu que du mélange obtenu, lorsque le stéroide est incubé avec le microorganisme dans le milieu nutritif ori- ginel, tandis que des rendements plus élevés en -stéroïdes sont obtenus avec ce milieu, lorsqu'on fait usage de 3-hydroxy- prégnanes comme matières de départ. Le stéroïde 3-oxygéné peu
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aussi être mis en contact, 1I'C des préparations enzymatiques
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déshydrogénantes provenait :.e la croissance: de microorganismes
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du genre Nocardia, de 5.5. sre à former le composé stérol.de Al3 'é LI -.3-oxygaé oorres>enc".a< '.
Í:,E'1=,..:t. 'J';:; --.-.-.# ils utilisés pour l'exécution de cette dé !shydl'og;, .<;.:.J '.0[' [1:. :eobiologique sont ceux ordinairement
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utilisés pour la propagation des microorganismes du genre No-
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cardia. Les matières RU'c:riti7es usuelles comprennent une source d'azote et de carbone, des ?3ls Inorganiques et des facteurs
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de croissance lorsque ceux-ci sont nécessaires .
Le carbone
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peut être fourni par des l'v: ,'c,..:;ùz rels que acétates, et lacta-
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tes, ce qui assure une croissance accrue et des rendements plus
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élevés dans le cas de (i0!.'S,:oj n033 espèces, telles que le Nocardia blackwel1ii et analogues , --"2.zo'G':' peut être fourni par un sel ammonique, des a:zTaomac:s 0'.1 des protéines, telles que les graines de soja, les avoines ':',2. levure, les extraits de levure les produits de ,j1.;sest,Ü,u t:. T;'¯,r:w.s,.u de caséine., les extraits de viande, les farines 1..10 8,"W:: les '1[!':taades protéiniques et les fragments da,r, le..Marine de oé':'.1.Ti!Ollt les farines de pois- son, les solubles d 00 1. "3 ,?,,}Ü, 1; s':<.Lole3 de distillateur et analogues.
Si on le c,4-'il:/-î '... 0\ n::'.\-, 'ooa:ii.'3es du gtnre Nocar- dia peuvent être ¯¯. #;. c ' . -># #-#'cilii j.;.t. -:.is protéines (or. des amino-acides) s#' ùo :.a T'"f''?'-?:,¯ de ç; '3..(' '::0;';:: en présence dans le milieu auquel sa-j ,2S ':'\.2:i. c"'-:':\ .'.:!? oxacide servent de sour- ces de carbone tâ- ¯ .'.,c ' }:;.j,11.: ###;.:-" Z.-3& FIILiOZ'gaEI3.;11185 Bien q1!$, C'."'-::- '-"¯: :. - ¯. v d,: plus îls Lt2 la déshydro- génation du compris*, fi : I-.'''-"1 .1 =¯:f 9'.w suisse se faire en uti- lisant des prép? . ¯ ::û'::..:....',.:
(¯C'..5 cl;::;11)dro'bfmD.ntes provenant de la croissance de ;.,lCI''-::';'-;'',-.,:,Ü5me:,> du genre Bocard ou en mettant le composé 1:'(.0:;, ;);;'.110 'è..U ct-iitaet :';\" une suspension d fune culture établie "::t1.'.[:;:' -5.::; l' S-ôH1. c v..:;;i 11 : . 3 ",. préfère ordinaire ment ajouter le frFaf.a.¯.: ,:;i:'S2. ,)},i."k: 3 r'"îr%eûë il un milieu nutritif
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contenant une culture de 24 heures de microorganismes du genre Nocardia. La proportion de composé stéroïde, qui peut être ajoutée au milieu, varie selon le substrat particulier à déshydrogéner, mais on préfère ordinairement employer une con- centration d'environ 0,005% à 0,2% de composé stéroïde 3-oxy- géné, bien que des concentrations plus élevées ou moins éle- vées puissnt être utilisées, si on le désire.
La culture con- tenant le composé stéroïde 3-oxygéné ajouté est alors incubée, de préférence en, agitant et en aérant, pendant une période supplémentaire qui varie ordinairement entre environ 10 heures et 50 heures, bien que des durées de fermentation plus courtes ou plus longues puissent être, avantageuses pour la déshydrogé- nation de substrats 3-céto-stéoides particuliers. En raison du fait que des fermentations prolongées peuvent adonner lieu à la destruction d'une partie du composé /\ 1-3-céto-stéroide on pré fère ordinairement appliquer une durée de fermentation d'envi- ron 10 à 24 heures, qui, selon le substrat stéroïde utilisé,, donne des rendements maxima en produit stéroide -déshydrogê- né .
Lorsque le processus de déshydrogénation est terminé, le produit est avantageusement récupéré du bouillon fermenté par extraction à l'aide d'un solvant non miscible dans l'eau, tel qu'un hydrocarbure chloré, comme le choroforme, une cétone, comme la méthylisobtylcétone, un alcanoate d'alcoyle, comme l'acétate d'éthyle, etc.... L'extrait contenant le produit stéroïde /\ -déshydrogéné et éventuellement de la matière de dé- part qui n'a pas réagi, est avantageusement purifié par chroma- tographie, en utilisant du gel de silice, dé l'alumine activée, etc.. ou bien, si on le désire, par des chromatogrammes sur pa- pier descendant.
Après séparation du produit déshydrogéné de la matière de départ qui n'a pas réagi, le produit peut être purifié davantage, si on le désire, par recristallisation dans un solvant, tel que l'acétate d'éthyle, les mélanges acétate
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d'éthyle-ether de pétrole et analogues .
Par ce procédé de déshydrogénation microbiologique, en utilisant les composés stéroïdes 3-oxygénés et non saturés en C-5, les 3-céto-prégnanes et les 3-hydroxy-prégnanes énu-
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mères plus haut, on obtient des /} ' -3-céto-prégnadiènes, tels que la 6 1 ' -prégtadiène-3 c 20-dione , le 6 l' '-prégnadiène-3 , 20- dione-17 c(-o., le ± 1s -rrêgnadiène-3,2-dione-2l-ol, le d 1,4. prégnadiène-3,20-diflnee1? c(,21-diol, le Q l'"-prégnadiène-3,20- pdione-1? c(-ol-21-al, le- 1,4:
prégnadiène -3,11,20-trione, le fa 1'*-prégnadiène-3-1.,20-trivne-7.7 c(-ol, le /jl,4¯prégne.diène- 3,ll,20-trione-21-ol, le l''=prégnadiène-31?,20-trioze-17 21-diol, le /\ -prégMdiene-3,ll,20-.trione-17 d-o?-21-a., le / l''-prêgnadiènr-3,û0-dionei E 11 -ol, le n Z''- prégnadiène-3, 20-dione-11,-01-21-al, le /11,4¯Drégnadiène-3,20-dione-1 21- diol, le '' '-prégnadiène;.3 20¯dione-lll3 , 17 4 -diol, le (\ 1> - prégnadiène-3,20-diozze-1./3,1r c(,21-triol;
des 1,4¯3-Cét- prégnadiènes 9-halogénés, tels que les 9-halo- #!- ¯prégnadiène- 3,20-dione 17,21-diols, le 9-flLCro-/ Z''- prégnadiùne-3,20-d-i.oni 17 c{ ,21-diol, les -halo- ''-préguadière-3,20-dione-.'I,11321- triol, les 9-halo- l'-prégnadiène-3,11,20-trione-17,21-dio3, le 9-. luoro-1'' '-pré gnadzène-3,11, 20-trione-7.7 c , 21-diol, le 9-fluoro-./j '' -prégnadiëne-3, 20-diozle-113,17 ((,21-trio ou les composés / 4¯prégnéniqUes correspondants et analogues .
Les exemples suivants illustrent des modes d'exécu- tion de la présente invention, mais il est entendu que ces exem- ples sont donnés à titre illustratif et non limitatif.
EXEMPLE 1.-
On prépare 50 cc d'un milieu nutritif de composition suivante:
EMI11.2
<tb> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Eda.mine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb>
EMI11.3
Eau distillée q.s.a3; 50 ce .
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Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH, stéri- lisé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 cc d'une culture de Nocardia astéroïdes ma 272; ATCC 9970) et la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 C, en agitant, pen- dant 48 heures.
A la culture résultante, on ajoute une solution contenant 10 mgr d'hydrocortisone ¯ 4-prégnène-11,3,17 d ,21-tri- ol-3,20-dione) dissous dans 0,1 ce de diméthylformamide* La cul- ture contenant le composé stéroide est incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 ce d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jusqu'à un volume d'environ 5 ce. La solution concentrée est alors uti- lisée pour préparer des chromatogrammes sur papier, qui sont développés en utilisant de la formamide comme phase liquide stationnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile.
On obtient deux bandes dont l'une ( qui correspond au constituant le plus mobile) présente la caractéristique maximum d'absorp- tion d'ultra-violet de l'hydrocortisone et dont l'autre (qui correspond au constituant le moins mobile) présente un maximum d'absorption d'ultra-violet à environ 242 mu Le chromatogram- me sur papier est séché et la bande correspondant à l'adsorption de 242 mu est découpée et extraite à l'aide de méthanol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une chromatographie sur papier, en utilisant du papier, qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de méthanol, et en fai- sant usage du système chloroforme-formamide précédemment employé.
Le chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de départ, tandis que la bande principale a un maximum d'absorption d'ultra-violet à 242 mu .
.Le chromatogramme sur papier est séché à fond,et la bande cor- respondant au maximum d'adsorption de 242 m .est découpée et
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extraite au méthanol. L'extrait méthanolique est évaporé sous
EMI13.1
vide jusqu'à siccité, eu sorte qu'on obtient de la A 1,4 -prégnadiène-lL6 17 d,1-tri.oL-3,0-c?iozae. EXEMPLE 2.-
Ou prépare 50 ce d'un milieu nutritif de composition suivante :
EMI13.2
<tb> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad <SEP> 50 <SEP> cc.
<tb>
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH ,stéri-
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lisé et inoculé-à l'aide d'environ 2,5 à 5 ce d'une culture de Nocardia minima (ICi. 292; i11CJ 8674) et la culture inoculée est alors incubée à une température de 2ë C , en agitant, pendant lu8 heures.
A la. culture résultante, on ajoute une solution contenant 10 mgr d'hydrocortisone (/ '-prégnène-1J./3 ,1.7 d 9f 1- triol-3,0-d.iote j dissous dans 0,1 cc de dinzéthy3 formâani de< La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ. 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de
EMI13.4
quatre fractions de 50 ce d?acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jusque un volume d'environ 5 cc. La solution concentrée est alors uti- lisée pour préparer des chromatogrammes sur papier , qui sont
EMI13.5
développés en utilisant de la forJ;!3.I!1ide COI,lTI10 phase liquide stationnaire et du chloroforme cornue phase liquide mobile.
On obtient deux bandes , dont l'une (qui correspond au constituant le plus mobile) présente la caractéristique maximum d'absorption d'ultra-violet di l'hydrocortisone et dont l'autre ( qui corres- pond au constituant le moins mobile) présente un maximum d'ad-
EMI13.6
sorption d'ultra-violet à environ 242 fil . Le chromatogramme sur papier est séché et la bande correspondant à l'absorptior
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de 242 mu est découpée et extraite à l'aide de méthanol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une chromatographie sur papier, en utilisant du papier,' qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de méthanol, et en fai- sant usage du système chloroforme-formamide précédemment em- ployé.
Le chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de départ, tandis que la bande principale a un maximum d'absorption d'ultra-violet à 242 mu Le chromatogramme sur papier est séché à -fond et la bande correspondant au maximum d'absorption de 242 mu est dé- coupée et extraite au méthanol. L'extrait méhanolique est éva- poré sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtiant de la ¯ 1,4 prégnadièbe-11,3,17 Ó 21-triol-3,20-dione
EXENPLE 3
On prépare 50 ce d'un milieu nutritif de composition suivante:
EMI14.1
<tb> . <SEP> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 0,25 <SEP> cc
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q:s:ad <SEP> 50 <SEP> ce.
<tb>
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH, stéili sé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 ce d'une culture de Nocardia astéroïdes MA 289; ATCC 100,04)et la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 C en agitant, pen- dant 48 heures. A la culture résultante, on ajoute une solution contenant 10 mgr d'hydrocortisone ¯ 4-prégnène-11ss 17 Ó 21 triol-3,20-dione) dissous dans 0,1 cc de diméthylformamide. La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 ce dtacétate d'éthyle et Les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jusqu'à un volume d'environ 5 cc.
La solution concentrée est alors uti-
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lisée pour préparer des chromatogrammes sur papier, qui sont développés en utilisant de la formamide comme, phase liquide stationnaire et du chloroforme comme! phase liquide mobile.On obtient deux bandes, dont l'une qui correspond au constituant le plus mobile) présente la caractéristique maximum d'absorption dultra-violet de l'hydrocortisone et dont 1-' autre (qui corres- pond au constituant le moins mobile),
présente un maximum d'ab- sorption d'ultra-violet à environ 242 muLe chromatogramme sur papier est séché et la bande correspondant à l'absorption de
242 mu est découpée et extraite à l'aidp de méthanol. la matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une chro=- matographie sur papier, en utilisant du papier, qui a été ex- trait pendant 48 heures à l'aide de méthanol, et en faisant usa- ge du système chloroforme-formamide précédemment employé .Le.
chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande cor- respondant à L'hydrocortisone de départ, tandis que la bande principale a un maximum d'absorption d'ultra-violet à 242
Le chromatogramme sur papier est séché à fond et la bande --or- respondant au maximum d'absorption de 242 mu est découpée et extraite au méthanol.
L'extrait méthanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient de la 1,4 prégna diène-11ss ,17 Ó,21-triol-3,20-dione EXEMPLE 4.- On prépare 50 ce d'un milieu nutritif de composition suivante:
EMI15.1
<tb> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q. <SEP> s. <SEP> ad <SEP> 50 <SEP> ce.
<tb>
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérili- sé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 ce d'une culture de Nocardia globerulaMA 280 ATCC 9356) et la culture est alors
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incubée à une température de 28 C en agitant, pendant 48 heu- res. A la culture résultante, on ajoute une solution contenant
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10 mgr d'hydrocortisone (LI 4¯prégnène-l1j3 ,17 c( ,21- trio 1-3, 20- dione) dissous dans 0,1 cc de diméthylformamide. La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 ce d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jus- qu'à un volume d'environ 5 ce.
La solution concentrée est alors
EMI16.2
utilisée pour préparer des chromatogramrues sur papier, qui sont développés en utilisant de la i'ormamide comme phase liquide stai tionnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile. On ob- tient deux bandes, dont l'une (qui correspond au constituant le plus mobile) présente la caractéristique maximum d'absorption d'ultra-violet de l'hydrocortisone et dont l'autre (qui cor- respond au constituant le moins mobile) présente un maximum d'adsorption d'ultra-violet à environ 242 mu Le chromatogram- me sur papier est séché et la bande correspondant à l'a sorp- tion de 242 mu est découpée et extraite à l'aide de méthanol.
La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une ahromatographie sur papier en utilisant du papier, qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de méthanol, et en fai- sant usage du système chloroforme-formamide précédemment employé Le chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de départ,t andis que la bande principal a un maximum d'absorption d'ultra-violet à 242 mu .
Le chromatogramme sur papier est séché à fond et la bande cor-
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respondant au maximum d'absorption de 242.ra.ukst découpée et extraite au méthanol. L'extrait méthanolique'est évaporé sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient de la /\ 1,4-prégna
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diène JIP, 17 c(,zl-triol-3,20-dione.
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EXEMPLE 5. -
On prépare 50 ce d'un milieu nutritif de composition suivante :
Cérélose 1 gr
Edamine 1 gr -Liqueur do macération, de mais 0,25 ce
Eau distille q,s,ad, 50 ce
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH sté- rilisé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 cc d'une culture de Nocardia leishmaii MA 281; ATCC 6855) et la culture inocu- lée est alors incubée à une température de 28 c en agitant, pendant 48 heures.
A la culture résultante, on ajoute une so- lution contenant 10 mgr d'hydrocortisone ¯ 4-prégnène-11/3 17 d ,21-triol-3,20-dione) dissous dans 0,1 cc de diméthylfor- mamide La culture contenant le composé stéroide est incubée , en agitent, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 ce d'acétate d'éthyle et lesextraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jus- qu'à un volume d'environ 5 ce.
La solution concentrée est alors utilisée pour préparer des chromatogrammes sur papier, qui sont. développés en utilisant de la formamide comme phase liquide stationnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile. On obtient deux bandes, dont l'une (qui correspond au consti- tuant le plus mobile) présente la caractéristique maximum d'ab- sorption d'ultra- violet de l'hydrocortisone et dont l'autre (qui correspond au constituant le moins mobile) présente un maximum d'absorption d'ultra-violet à environ 242 mu.
Le chro- matogramme sur papier est séché et la. bande correspondant à l'absorption de 242 mu est découpée et extraite à l'aide de mé
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thanol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une chromatographie sur papier, en utilisant du pa- pier, qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de méthanol, et en faisant usage du système chloroforme-formamide précédem- ment employé. Le chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de départ, tan dis que la bande principale a un maximum d'absorption d'ultra- violet à 242 mu.
Le chromatogramme sur papierst séché à fond et la bande correspondant au maximum d'absorption de 242 mu est découpée et extraite au méthanol. L'extrait méthanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient
EMI18.1
de la -prégnadièMe-11 , 17 c( ,21-trlol-3,20-dione.
EXEMPLE 6,- On prépare 50 ce d'un mulieu nutritif de composition suivante :
EMI18.2
<tb> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> mais <SEP> 0,25 <SEP> cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad <SEP> 50 <SEP> ce
<tb>
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH stérile -se et inooulé à l'aide d'environ 2,5 à 5 cc d'une culture de Nocardia formica MA 143; NRRL 2470) et la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 c en agitant, pendant 48 heures.
A la culture résultante, on ajoute une solo
EMI18.3
tion contenant 10 mgr d'hydrocortisone (/j'-prégnëne-11,3 ,17 du 21-triol-3,20-dione dissous dans 0,1 cc de diméthylformamide.
La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agi- tant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aida de quatre fractions de 50 cc d'acétate d'éthyle et les extraits
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à l'acétate d'éthyle son combinés- et évaporés sous vide jus qu'à un volume d'environ 5 ce. La solution' concentrée est alors utilisée pour préparer des chromatogrammes sur papier, qui sont développés en utilisant de la formamide comme phase liquide stationnaire.et du chloroforme comme phase liquide mobile.
On obtient deux bandes, dont l'une(qui correspond au constituant le plus mobile) présente la caractéristique max- imum d'absorption d'ultra-violet de 1 'hydrocortisone et dont l'autre (qui correspond au constituant le moins mobile) présen- te un maximum d'absorption d'ultra-violet à environ 242 mu.
Le chromatogramme sur papier est séché et la bande correspon- dant à l'absorption de 242 mu est découpée et extraite à l'aide de métha nol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une chromatographie sur papier, en utilisant du papier, qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de métha- nol, et en faisant usage du système chloroforme-formamide pré- cédemment employé. Le chromatogramme résultant ne présente- qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de dé- part, tandis que la bande principale a un maximum d'absorption d'ultra-violet à 242 mu.
Le chromatogramme sur papier est sé- ché à fond et la bande correspondant au maximum d'absorption de 242 mu est découpée et extraite au méthanol. l'extrait mé- thanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient de la ¯ 1,4-prégnadiène-11.3 ,17 Ó ;21-triol- 3t20-dione.
EXEMPLE
On prépare 50 cc d'un milieu nutritif de composi- tion suivante :
EMI19.1
<tb> Gérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad <SEP> 50 <SEP> ce
<tb>
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Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérilisé et ino- culé à l'aide d'environ 2,5à 5 ce d'une culture de Nocardia
EMI20.1
convoluta (MA 275; ATCC 4275) et la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 C, en agitant, pendant 48 heu- res. A la culture résultante, on ajoute une solution contenant
EMI20.2
10 mgr d 'hydrocortic#lG' (--prégène.,-113 , l? d, 21-triol-3,20- dione) dissous dans G, 1 ce de diméthflforntamide.
La culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 cc d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jus- qu'à un volume d'environ 5 cc. La solution concentrée est a- ,lors utilisée pour préparer des chromatogrammessur 'papier; qu sont développés en utilisant de la formamide comme phase liqui- - de stationnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile.
On obtient deux bandes, dont l'une (qui correspond au consti- . tuant le plus mobile) présente la caractéristique maximum d'ab- sorption d'ultra-violet de l'hydrocortisone et dont l'autre (qui correspond au constituant le moins mobile) présente un maximum d'absorption d'ultra-violet à environ 242 mu. Le chro matogramme sur papier est séché et la bande correspondant à l'adsorption de 242 mu est découpée et'extraite à l'aide de méthanol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nou- veau soumise à une chromatographoe sur papier, en utilisant du papier, qui a été entrait pendant 48 heures à l'aide de mé thanol, et en faisant usage du système chloroforme-formamide précédemment employé.
Le chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de dé- part,tandis que la bai.de principale a un maximum d'absorption d'ultra-violet de 242 4u Le chromatogramme sur papier est sé- ché à fond et la bande correspondant au maximum d'absorption
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de 242 mu est'découpée et extraite au méthanol. -L'extrait mé-
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thanolique est évaporé sous vide jjusqufà siccité, en sorte qu'a 14 obtient de la 1,4¯r,>régnadiène-10 . 7 d ,21-triol-3,20-dione.
ET''-.13'1,E 8.- On prépare 50 ce d'un milieu nutritif, de, c'QmpQsi- tion suivante :
EMI21.2
Gérélose bzz mgr
EMI21.3
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> cc
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q. <SEP> s. <SEP> ad. <SEP> 50 <SEP> cc
<tb>
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérilisé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 ce d'une culture de Nocar- dia corallina MA 277; ATCC 4273),et la cultureinoculée ,est alors incubée à une température de 28 C, en agitant, pendant 48 heures.
A la culture résultante, on ajoute une solution con-
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tenant 10 mgr d'hydrocortisone ('-prgQzléz,e¯llf3 , 17 c( ,21- triol-3,20-dione) dissous dans 0,1 ce de diméthylformamide. la culture contenant le composé stéroïde est incubée, en agitant, pendant une période supplémentaire d'environ 24 heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 cc d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide jus- qu'à un volume d'environ 5 ce. La solution concentrée est a- lors utilisée pour préparer des chromatogrammes sur paoier, qui sont développés en utilisant de la. formamide comme phase liquide stationnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile.
On obtient deux bandes, dont l'une (qui correspond au constituant le plus mobile) présente la caractéristique maxi-
EMI21.5
mum d' absorption d'ultra-violet de l'hydrocortisone et dont l'autre (qui correspond au constituant le moins mobile) pré- sente un maximum d'absorption d'ultra-violet à environ 242 mu.
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Le chromatogramme sur papier est séché et la bande correspon- dant à l'absorption de 242 mu est découpée et extraite à l'aide de méthanol. La matière extraite à l'aide de méthanol est à nouveau soumise à une chromatographie sur papier, en utilisant du papier, qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de mé- thanol et en faisan+-:usage du système chloroforme-formamide précédemment employé. Le chromatogramme résultant ne présente qu'une trace de bande correspondant à l'hydrocortisone de dé- part, tandis que la bande principale a un maximum d'absorption dtultra-violet à 242 mu. Le chromatogramme sur papier est sé- ché à fond et la bande' correspondant au maximum d'absorption de 242 mu est découpée et extraite au méthanol.
L'Extrait mé- thanolique est évaporé sous vide jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient de la ¯1,4-prégnadiène-11.3 17c(,21-triol-3,20- dione.
EXEMPLE 9.-
Six fractions de 50 cc du milieu à base d'édamine décrit dans les exemples 1 à 8 sont amenées à pH 6,5, stéri- lisées par chauffage pendant' 15 minutes dans,un autoclave à environ 120 C et chacun des'milieux stérilisés est inoculé à l'aide d'une culture de microorganismes Nocardia blackwellii (ATCC 6846). Les cultures inoculées sont incubées à une tempé- rature de 28 c en agitant, rendant environ 48 heures et à chacune des six cultures résultantes on ajoute une solution de 10 mgr d'un composé 3-céto-stéroide différent dans 0,1 cc de diméthylformamide.
Les cultures contenant; les composés 3-céto- stéroïdes sont alors incubées, en agitant, pendant une période . supplémentaire d'environ 24 heures.
Chacun des bouillons de fermentation, ainsi obtenus, est individuellement extrait avec 4 fractions de 50 cc d'acé- tate d'éthyle.--Les extraits à l'acétate d'éthyle correspondant à chaque bouillon et dérivés d'un substrat 3-céto-stéroide par-
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ticulier sont combinés et évaporés jusqu'à siccité sous vide.
Chacun des six produits résiduels ainsi obtenus est dissous dans de l'acétone .et soumis à une chromatographie surf.papier. Lei divers chromatogrammes sont développés en utilisant le systè- me solvant indiqué peur la matière de départ particulière dans le tableau donné ci-dessous.
Les bandes supérieures pour cha- que chromatogramme,correspondant aux -déhydro-dérivés, sont découpées,, extraites individuellement à l'aide de méthanol et la matière extraite au méthanol est à nouveau soumise à une La bande supérieure est à nouveau découpée,puis séchée et extraite au métand
EMI23.1
chromatographie sur papier- /"L'extrait méthanolique est évaporé jusqu'à siccité sous vide, en sorte qu'on obtient, pour chaque substrat utilisé comme matière de départ, les composés
EMI23.2
/Jl'"-3-céto-stéroide's( particu.iers indiqués dans le tableau suivant :
EMI23.3
<tb> Système <SEP> solvant <SEP> utilisé <SEP> pour <SEP> chromatographie <SEP> sur <SEP> papier. <SEP> - <SEP>
<tb>
EMI23.4
Essai Substrat Phase stationnaire Phase mobils /1'¯céto-
EMI23.5
<tb> No. <SEP> 'stéroïde
<tb> obtenu
<tb>
EMI23.6
1 '4- -prégnène-l?f ' formamide chloroforme L}l, 1.. -préo-na- 17 0( , 21-triol-3 , 20- dièue-11 3 , diane 17d , z1-iol- 3,20-dione 2 Prégnane-113 ,17 d ;
formamide Chloroforme /1' '-prégtia- 21-triol-3,20-dione diène-1 / , 17d , zl-riol- 3,20-dione 3 21-acétate de prégna- forrnamide l:lchlorofor- Ll1,4-¯prégnacli, ne-17 d ,21-diol-3,ll, me-toluène èe-17e{ 21-
EMI23.7
<tb> 20-trione
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 20-trinne <SEP> diol-3,11,20-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> trione
<tb>
EMI23.8
4 21-acétate de allô- formamide 1:1 chlorofor- L\l,4¯prégna. prégnane-17 et. ,21- me-toluèue diène-17c(,!
EMI23.9
<tb> diol-3,ll,20-trione <SEP> 21-diol-3,
<tb>
<tb> 11,20-trione
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> Prégnane-17c(,21- <SEP> formamide. <SEP> benzène <SEP> /[ <SEP> ' <SEP> -prégna- <SEP>
<tb>
EMI23.10
dioZ-3,zo-diou cTiène-17| ,21.
EMI23.11
<tb> diol-3,20dione
<tb>
EMI23.12
6 21-acétate de formamide benzène Ll,4¯prégna- alloprégnane-l7c( , diè;
le-17d ,21. 21-diol-3,11-dione diol-.3,20-di-
EMI23.13
<tb> one
<tb>
<Desc/Clms Page number 24>
EMI24.1
E::'LE 11.-
On prépare 50 ce d'un milieu, nutritif de composition suivante:
EMI24.2
<tb> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad <SEP> 50 <SEP> ce.
<tb>
Ce milieu est amené à pH 6,5 à l'aide de KOH stérili- sé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 ce d'une culture de Nocardia astéroïdes MA 272; ATCC 9970) et la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 c en agitant, pen- dant 48 heures. A la culture résultante, en ajoute une solution
EMI24.3
contenant 10 mgr de prégnane--.?3,1 ,?l-tr,a'1-3,c-diozae dis- sous dans 0,1 ce de diméthylformamide . La culture contenant le composé stéroïde est incubée , en agitant, pendant une pério- de supplémentaire d'environ: 12, heures à 28 c
Le bouillon de fermentation est extrait à l'aide de quatre fractions de 50 ce d'acétate d'éthyle et les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés et évaporés sous vide Jusque un volume d'environ 5 ce.
La solution concentrée est alors uti- lisée pour préparer des chromât ogre mine sur papier, qui sont développés en utilisant de la formamide comme phase liquide stationnaire et du chloroforme comme phase liquide mobile* La bande principale ainsi formée présente la caractéristique maxi- mum d'absorption d'ultra-violet de l'hydrocortisone; le chroma- togramme sur papier est séché et cette bande est découpée et extraite à l'aide de méthanol. La matière extraite à l'aide du méthanol est à nouveau soumise à une chromatographie sur papier, en utilisant du papier qui a été extrait pendant 48 heures à l'aide de méthanol et en faisait usage du système chloroforme- formamide précédemment employé.
Le chromatogramme résultant est séché à fond et la/ bande présentant la caractéristique maximum
<Desc/Clms Page number 25>
d'absorption d'ultra-violet de l'hydrocortisone est découpée et extraite à l'aide de méthanol. L'extrait méthanolique est -/' évaporé jusqu'à siccité sous vide, en sorte qu'on obtient de l'h
EMI25.1
1 'hydrocortisone à -prégnaze-11/3, Z7 c( , 1-triol-3 , 0-dione ) .
Le procédé décrit ci-dessus est répété, en utilisant le même Mlieu à base d'édamine, la prégnane-l²,17 ,21-t.r:Lol- 3,20-dione comme substrat et une période d'incubation de 12 heures, mais en faisant usage , au lieu de microorganismes du genre Nocardia astéroïdes MA. 272, des, microorganismes suivants: Nocardia minima - (Â 292; ATCG $671) Nocardia globerula - (Ul 2$0; ATGO 9356) Nocardia le5..shIllani - ( M9. 2:81; ATCC 6855) Nocardia formica - li3; NRLL 2470)
EMI25.2
Nocardia astéroïdes - (MA. 289; AïCC 10904)'
L'extraction des bouillons de fermentation résul- tants et la chromatographie sur papier des extraits séchés dans un système formamide-chloroforme donnent, dans chaque cas, une bade sur le chromatogramme correspondant à 1'hydrocortisone.
L'élution de cette bande de la ménière décrite plus haut donne de l'hydrocortisone identifiée par son spectre d'absorption d'ultra-violet comme produit stéroïde principal obtenu.
EXEMPLE 12.-
On prépare 50 cc d'un milieu nutritif de composition suivante:
EMI25.3
<tb> Cérélose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> mais <SEP> 0,25 <SEP> ce
<tb>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> q.s.ad. <SEP> 50 <SEP> ce.
<tb>
Ce milieuest amené à pH 6,5 à l'aide de KOH, stérili- sé et inoculé à l'aide d'environ 2,5 à 5 ce d'une culture de
EMI25.4
Nocardia blackwellii (MA. 273; ATCC 684h) et la culture inoculée est alors incubée à une température de 28 C en agitant, pen-
EMI25.5
dant l$ heures.
A la culture résultante, on ajoute une solution
<Desc/Clms Page number 26>
EMI26.1
contenant 0,64 gr de 1-acêtc.te de prégnane-3/3;17o(,21-triol- 11,20-dione dissous dans de le dizz.éthy:lformautice. , La culture coizt^:;::z le composé stéroïde est incubée en agitant et en aérant, pc une période supplémentaire d'environ 4 heures à 28 C
EMI26.2
Le bouillon ie fer:':?ntation est extrait à l'aide d'acétate d'éthyle et l'extrait est séparé et évaporé jusqu'à sicité. Le produit résiduel séché est réparti entre de l'é .ther de pétrole et du méthanol aqueux à 70% la couche d'éther -de pétrole étant rejetée.
Le méthanol. aqueux contenant le pro- est .duit/ évaporé sous pression réduite, de Manière à chasser le méthanol. La couche aqueuse résultante est extraite plusieurs
EMI26.3
fois à l'aide d'acétate d'éthyle et le eouchff d'acétate d'éthy- le est évaporée jusqu'à siccité, en sorte qu'on obtient de la / l'-prégnadiène-17 c,l.-diol.-3,11,G-;,riotie pa.r'ci3J lement pu- rifiée. Cette matière est dissoute dans de la pyridine et mise en réaction dans un excès d'anhydride acétique, de manière à
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former du 21-acétate de x '--i7âv1li.22 -iÎ -c , ,21-diol-3,11,20. trione, qui est récupéré du mSlane dtacétyls.tion par addition d'eau et récupération de la matière précipitée par filtration.
Le 21-acétate de j le4 prë ;z:adi :.ze.-11 , =' -ûzol.-3,11,0-trione activée est dissous dans de l'éther et cl1romatorephié sur de l'alumine La colonne d'alumine est développée en utilisant, comme solvants de développement, de l'éther et un mélange d'éther et de chloro- forme. Le produit désiré est élue dau2 la colonne avec du chlo- roforme et ltéluat chloroforuique est évaporé, en sorte qu'on
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obtient du 21-acétate de /, 1, 4 -nréLnadièze-17 c(,l-diol-3,11,20- trione cristallin ensiblE'1ftcnt pur .
EÍ.: 1 :J-'lli 13.- Deux fractions de 50 ce du milieu à base d'édamine décrit dans les exemples 1 à ># sont ar:.exz:2s à pH 6,5 à l'aide
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'de KOH, stérilisées par chauffage,pendant 15 minutes dans un autoclave à 120 C et chacun des milieux stérilisés est inoculé à l'aide d'une culture de Nocardia blackwellii (ATCC 6846).
Les cultures inoculées sont incubées à une température de 28 c en agitant, pendant environ 48 heures. A la fin de la période d'incubation, les cultures sont centrifugées, les cellules étant retenues et.le liquide, surnageant est jeté. Les cellules retenues sont lavées à l'aide d'eau distillée et additionnées d'eau tamponnée à pH 7,0 jusqu'à un volume de 25CC A une des suspensions de cellules, on ajoute une solution de 5 mgr de 21 acétate de prégnane-3,17 Ó,21-triol-11,20-dione dans 0,1 cc de diméthylformamdide à l'autre suspension de cellules on ajoute une solution de 5 mgr de 21-acétate de prégnane-17 d ,21-diol- 3,11,20-trione dans 0,1 cc de diméthylformamide.
Les suspension de cellules contenant les composés prégnaniques sont alors in- cubées, en agitant, pendant une période d'environ 12 à 15 heu- res.
Chacun des bouillons de fermentation ainsi obtenus est .extrait individuellement à l'aide de quatre fractions de
50 ce d'acétate d'éthyle. Les extraits à l'acétate d'éthyle correspondant à chacun desdeux bouillons sont combinés et évaporés jusqu'à siccité sous vide, en sorte qu'on obtient, dans chaque cas, de la ¯ 1,4-prégnadiène-17 ¯,21-diol-3,11029 trione. Dans chaque cas, le rendement, déterminé par analyse polographique des produits, excède 85% du rendement théorique.
REVENDICATIONS.-.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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The present invention relates generally to the production of valuable steroid compounds by fermentation.
More particularly, it relates to a new microbiological process for introducing a double bond between the c-1 and C-2 carbon atoms of the steroid nucleus using
EMI1.1
microorganisms of the genus No cardia. According to a preferred embodiment of the invention, 4 -3-keto-steroids such as / '-pregnen-3, 11,20-trione-17, 21-diol and Q' -pregnene-3 , 0-dione-11391? c {, 21-triol are converted to the corresponding fa '-3-keto-steroids, namely 1,4¯prregnadiene-3,11,20-trione-1? c, 21-diol and fa j., & -Pregnadiene-20-dione-1.1 / 3,.? o (,.-trio3. respectively.
These latter compounds possess cortisone activity, but differ from cortisone in that they are substantially free from undesirable side effects, such as edema, since they have no appreciable effect. sodium or water ion.
EMI1.2
The preparation of / il, 43 't., -D pax des The preparation of fa' '-.3-keto-steroids by chemical means has not been satisfactory, due to the fact that the chemical reactions produce mixtures of several compounds. The separation of the desired intermediates and final products from these mixtures is expensive and does not allow
EMI1.3
to obtain only low yields of the desired 1,4¯3-keto-steroids / d compounds.
The present invention relates to a one-step process for introducing a 1-double bond into steroid compounds and the achievement of this ¯1 unsaturation by / a selective process resulting in the formation of the desired steroid uncontaminated by by-products are desired.
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Another subject of the invention is a method
EMI2.1
to which α-3-keto-pregnadiene compounds can be coinverted directly, and in high yield, to the corresponding α-3-keto-pregnadiene compounds.
A further subject of the invention is the production of 1,4¯.3-keto-steroids of the pregnane series, directly and in high yield, from the compounds of 3-keto-pregnans and of 3-hydroxy. -Pregnans corresponding * discovered that the 1-dehydrogenation compo. It has been found that the /} -dehydrogenation of steroid compounds can be accomplished by a novel microbiological dehydrogenation process, which consists of putting a
EMI2.2
steroid compound ,.
in particular a steroid compound not statured in c-5 and 3-oxygenated in contact with the dehydrogenating activity of microorganisms of the genus Nocardia, preferably of
EMI2.3
microorganisms of the species Nocardia blaelniellii, Nocardia astenides, Nocardia minima, Nocardia globerula Nocardia leishmanii, Nocardia formica, Nocardia oonvoluta! t Nocardia coral- lina These microorganisms of the genus Nocardia can be obtained from known sources, such as American Type Culture Collection from Washington or they can be isolated from natural sources, such as soil or disease processes, by known methods.
The dehydrogenation can be carried out by contact of the steroid compound with the microorganisms of the genus Nocardia themselves or, if preferred, with enzyme systems of the microorganisms of the Nocardia type, so that the hydrogen attached to the carbon atoms c- 1 and C-2 is selectively removed, so as to produce the desired steroid substantially uncontaminated with unwanted by-products. When the compound of / \ -3-keto-pregnene is subjected to the dehydrogenating activity of microorganisms of the genus Nocardia, the compound ¯1,4
<Desc / Clms Page number 3>
EMI3.1
Pregnadienic is obtained directly and with a high yield.
Although the new microbiological dehydrogenation process is applicable to the dehydrogenation of
EMI3.2
3-keta-sGeraides compounds in general, regardless of the
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substituents attached to rings B, C and D or the degree of
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unsaturation of these nuclei, it is usually preferred to use,
EMI3.5
as starting material in this process, steroid compounds
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unsaturated 0-5 and 3-oxygenates of the pregnane series, such as for example / "-3-keto-pregneneSj such as f \ -pregnene 3,20-dione, / \ -pregnene-3, 20-dione-17 0-0l, (4¯Pregnene-3,20-dione-21-ol, 4¯prregnene -3,20-dione-21-ol 21-acylate, 21-acetate / -pregnene-3,2fl-dione-21-ol, -pregnene -3,20-diozze-7c (, 2ldio, 21-acylate of / \ 4¯pregnene-3,20-dione- 17, 21-diol,
/ [-Pregnene-3? 20-dione-17c (, 21-diol, /, -prégzaè ?? e-3, 20-diozze-.7 -ol-21-al, la (i -pregnene-3, 11, 20-trione, le, -pregzzeze-3,11,20 = criozze-î? c (-ol, le '- prégnèzxe-3,11,20-tr3one-. 2 '..- ol, 6 4- .Pregnene-3,1.1., 2Q-trio: xe-21-ol, 21-acetate% iF.picg: z.2xe4, 3, 11 ¯, 20-trio11e-1-ol le '.-Prégnèzxe-â, 1., 2fl - tiohze-17 c't 321-dio3a 21-acylate of' -nrégzxEZZ.e-3,1.,.! .triorze-1721d.o., 21- acetate of -preg: zne:
, .., 20-trione-l, 2:! - diol, le / J. 4¯pr- gzZene - 3,1., 2Q-trzone-1? c (-ol-21¯al, / \ - prGgnene-3,2O-dione- 11/3 -ol, f '-prégzzéixe-.3, 2fl-dïone-1, 2.-di oi, on 21 -pregnene-3, 20-dione-11, 21-diol-acylate, Li4¯p1 "etherze-3,0-dione-21-aceSate -, .., /, l d3. ola le s ^., pre nénē3, z0-d.ozxe-lI - .Ge Qy -pre, ncne. ,, Jo..one., 3.,, 3. '! r -d.ol, o1 -al, e '-pregszene-3, 20-dione.-li /'. 5, l '% c (, 2ldtrio;
L \ -.pré; aen 21-acylate, e.3, 20.d.one-11,17, 2'Z-'rio3., IJ 4¯pregnene @ 3.20-dio; .e-llg.7 cd.oL-21-a1, the 21 acetate of (j 4¯p1 "enene-3, 20-dione-11, 17 c,? Z..trioi, the 9-halogenated derivatives of these L1 4-3-keto-pregnenes, conutte 9¯halo - / \ -pregnene-3, 20-dione-17}
<Desc / Clms Page number 4>
EMI4.1
21-diol, -fluoro- -pregnene-3, 20-dione-17 c (, 21-diol, 9¯halō ± -pregnene-3,2fl-dione-.17,21-d3 .ol, 9-fluoro..L1 '-prgnene-3,2t-dione-1? c (, 21-diol 9-halo - / 3 -pregnene-, 11,20-trione -17 , 21-diol, 9-fluo- ra - / - pregnen-3,11,: - trzone-17 d, 21-diol, 21-acylate of 9-h.àlo-A 4ōprégnèna-3,11 , 20-trione-17,2l-diol, 9-fluoro- "-pregz 21-acetate:
ene-, 3.Z, 2t-trione-li d 21-diol, 9-halo. 4¯Pregnene-J, 20-dione-11, 17,21-trio1, 9-fluoro-4¯Pregnene-3,20-dion-il..Al? O (, 21-triol, on 21 Pregne-3,2ü-d3.one-.1,17,21-triol 9-halo-4-acylate, 9-fluoro- 21-acetate.
¯Pregnene-3,23-dion s-11391 '4,21-triol and the like. Instead of -3-keto-pregaene% we can use, as materials
EMI4.2
starting, other steroid unsaturated C-5 compounds and
EMI4.3
3-oxygenates, such as / \ ¯3..lydroxy-prég> xerzes, such as- / 5 -pregnene-20-one-3-ol, -pregnene-20-one-3.17c (-diol , 5-Pregnene-2D-one-3,21-diol, -Pregnene-20-one-3,21-diol 21-acylate, / \ -Pregnene-20-one- 21-acetate 3,2i- Jt diol, f, 1-pregnene-20-one-3,17 4,21-triol, 5-Pregne-2t-one-3,1-21-acylate, 21-triol, 21-acetate of ± 15-Pregnene -20-one-3,17o (, 21-triol, 5¯pregnene-11, 20-dione-3-o1, 5-pregnene-11-, 20-dione - 3tel7 4 -diol, / \ -Pregnene-11, 20-dione-3,21-diol, 21-acylate of '-Pregnene-11,20-dmone-3,21-diol, 21-acetate 5-pz gzxene-.1,20-dione-3321-di.oli L1 -pregnene-11,
2-dione-3,. 'La (, 21-triol, 5-pregnene-11,20-dione-3,1-7,21-triol 21-acylate, 5-prégnèzae-11-21-acetate , 2 (3-dione -., 17 c, 2.-triol / \ -pregnene-20-one- 3,11 / 3 -diol, -pregnene-2-one-3, I13; 21-triol, 5-Pregnene-20-one-3,11,21-triol 21-acylate, 5-Pregnene-20-one-3,11 / 1, 21-triol 21-acetate, j 5 -Pregnene-20-one-3,11, 170 -triol; 5-prregnene-20-one-.3, 11.8, 17 4 21-tetrol, 21 - acylate of fa -pregnene-20-oae-3, ll, 17,21-tetrol, 21-acetate
<Desc / Clms Page number 5>
EMI5.1
de /, -pregtiene-20-one-â, lly l 7 d, 21-tebroi, the 9-halogenated derivatives of these 5 such as 9-halo-j 5-pregnene -20-one-3Slaê- triol, 9 fluoro-'r, -prêgnene-20-. one-3.17 d, 21-triol, 21-halo-5-pregnene-20-otle acylate,,: i, 2: .t ::
.cal, 9-fluoro - -pregnene-20-one-3.17c 1-acetate, 2. : r.1, 9-halo-.-prêgnèzwe-11,2û-dson.e-, 1r, 21 '-triol, 9-.fluoz.o- -pregnene-11! / 3, 20-diozze- 3,17 c (, 21-triol, 9-halo- / 5-pregnèî 21-acylate) 9-llî20-dione-3, 17,21-triol, 9-fluoro 5¯ 21-acetate Pregnene-11j3, 20-dione-13,17c {, 21w triol, 9-halo-a, 9-flu-oro-d, -prenene-20-orae., l. , .io {, 21-tetri., 9-halo-α 5 -pregnene 21-acylate 207-one-3,11,17,21-tetrc) 1, 9-fluoro-5- 21-acetate pW genene-20-one -. $, 11, 1 't, 21.-tetrol, and -3- (lower alkanoyloxy,}. pregnenes such as 3- (lower alkano- ates) of 5-prégznzze20-. one-3-ol, Li 3-acetate 5-pregnene-20-oiie-3-ol, 3- (lower a.lcanoates). of / (- pregnene-20-one-3,17-diol, ± -pré 3-acetate;
tzèazc..z0-, ona- 3,17 c (-diol, the 3- (lower alkanoates) of 3 5¯pregnene-20-one-3,21-diol, the 3-acetate of / \ -pregnene-20 -oae-3,21-diol, 3,21-bis (lower alkanoates) of t -pz egtaènem2t3-ozae- ,, 21-diol, 3,21-diacetate of / 3 y; rgaaeFt-20- .. or'e-, 21-diol, 3- (lower alkanoates) of '..> p;
êgnèPZ-2Q-ozze-3,17,.-trioZ, L1-3-acetate 5 -Pregnene-20-.one-3, 17 c {, 2 ..- trJ.oZ, the 3,21- bie ( lower alkanoates) of). 5 -Pregnene -20-one-3,17,21-tri-ol, -regzzene- 3,21-diacetate -O-one-3,. Î c, 21 - tiol, - / 'les 3-(lower alkanoates) of 5-nregnene-11,20-dione-3-ol-3-acetate of (1 -pré; nene sl ?, 20-diozze-.â-ol, 3- (alaanoates lower) of -Pregnene-11,20-dioae-3,17-diol, 5-pregnene-3-acetate} 20-dione-3,17 ct-diol, 3- (lower alkanoates) of 5 ¯Pregnene-11,20-dione-J, 21-diol, ¯-prregnene-11-3-acetate, 20-dione-3,21-diol, 3,21-bis (lower alkanoates) to 5¯ preguene-1., 20¯dion.e-3,21-diol, le;
, 21-diacete
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of / -Pregnene-11,2-dione-3, a.-diol, 3- (lower alkanoates) of tl-Pregnene-11, 20-dione-3,17,2l-triol, 3-acetate of / -Pregnene-11,2J-dioiae-3,17 ci, 21-triol, les. 3, 21- bis (lower alkanoates) of -pregnetze-7.1, 20-diotie-3,17, 21-triol, -pregnene-11,21-diacetate, 20-dione-3,17 4] 2l- triol, the .3- (lower alkanoates) of / pregnene-20-one-3, 11-diol) / ¯pregneze-2fl-one-3? 113 -dioL 3-acetate, the 3- (lower aloanoates) of f-20-one-3,1l, 17-trP1, 3-acgtate of J -20-one-.3, .1Jj3, 17 d -triol, 3- (lower alkauoates) of / -pregnene- 20-one-3,11,21-triol, /JS.:Pregnene-0-one-3,11,3,21-triol, 3-acetate, Il- 3,21-bis (lower alkanoates) Pregnene-20-one, 3, ll, Zl-triol, 3.23:
-diacetate of 'i5 (pregnene-20-otxe-3,113, 21-triol, 3- (lower alkanoates). of /15- preglene.-20-otxe-3,11 c (, 17,21-tetrol , 3-prégtiene-wtJ-one-3, ZZf3,17 Q, 21-tetrol, 3, 2l-udders (lower alkauoates) of /! 5-pregnene-20-one, 3,11,17 , 21-tetrol, β-pregciene 3.21-diacetate 20-one-3.1133;
17 d, 21-tetrol, 9-halogenated derivatives of these lower / 5-3-alanoylox3r) -pregnenes, such as I.e s. 9-halo - pregnene-20-one-3,17,21-trial 3- (lower alkanoates), 9-fluoro-pregnene-2d-one-3,17 c {, 1- 3-acetate triol, 3- (lower alkanoates) of 9-halo-f-pregnene-11,20-dione-.3,17,2l-triol, 9-fluoro-3-acetate - pregnene-Zl, 20- dione-3, L7 .d, 2l-triol, 3,21-bis (lower alkanoates) of 9-halo- / j -pregnene-11,20-dioxe-3,17,21-triol, 3, 9-fluoro- / j -pregnene- 21-diacetate,
EMI6.2
11,20-dione-3,17 d, 21-triol, 3- (lower alkanoates) of
EMI6.3
9-halo - / - pregnene-? 0¯orie-3,11,17,21-tetrol,. 9-Fluoro 3-acetate - / - Pregrrene-20-one-3, 11,, 17 d, 2i # tetro.i;
-halo - pgiene-2Q.-otte-3,11, 17,21-tetrol s 3, 21- 'bis (lower alkanoates), 9-fluoro- / f-pregnene- 3,21-diacetate 20-one- .31j1 / .3, 17 ci, 21-tetrol and the like. These prepregs /) 5-3-oxygenated
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starting are converted directly by the dehydrated activity
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nante of these microorganisms of the genus Nocardia in / '-3-eéto-
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corresponding pregnadienes, this conversion being able to take place, it is supposed, by intermediate formation of the compound. - -this-
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tonic.
In the aforementioned starting materials, the preferred ester substituent in positions 3 and / or 21 is usually T acé1:; a: e 1 b: i.ell cures other esters, carboxylic acids
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lower hydrocarbons, such as propionate, butyra-
EMI7.5
te, the t .er.t. -butylacetate, benzoa'Ge and the like may be used in place of acetate, if desired.
Instead of these unsaturated and 3-oxygenated C-5 pregnenes, it is also possible to use, as starting materials, 3-keto-pregnans, 3-hydroxy-pregnans or 3-hydrox5 = ull.opa c; zxaes , which are selective-
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ment dehydrogenated by microorganisms of the genus Nocardia ,.
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so as to produce a - eû 4 unsaturation (and in the case of 3-hydroxy-prégaanesj compounds, an oxidation of radai-
EMI7.8
cal 3-hydroxy substituting 3-keto), so that we obtain
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the corresponding 1''-3-keto-pregnadienic compound. The 3-keto-pregnans and 3-hydroxy-pregnalies which are commonly used
EMI7.10
as starting materials for this dehydrogenation process.
EMI7.11
microbiological tion using microorganisms of the genus Nocar- dia include pre; tzatae-3, <- dzoae, le. irégzme-3,? Omdioge-.
170 (-01, pregnan-3,20-dioze-21-ol, pregiaz? Ev, 0¯dione-17 ci, 21-diol, pregnan-.â 9113 9-. Trioae, pregnan-3, 11,20-trione-17 d-ol, pregnan-3, 11, 20- "trione-21-01, preggan-3, 11, 20-trione-17,21-diol, preggan. ., L1¯d, Ole-1.-01, pregnan-3,20-dione-11p,, 1 'c (-dio1, prëgztarxe-3, - diorae-11/3 21-diol, pregnan ., 3) .O-.diOl1e-l / 3, .7 d, 21-trio1, pregnane ...
20-one-3-ol, pregnan-20-one-3, 17 d..diol, .a ¯pr; gnazie-20-o: e-3,21-diol, pregnanē20-one-3 , 17 ci, 21-triol, Pregnane-11,20--. dione-3-ol, pregnan -11,20-dion-3, I '-d, iol, pregnan-11,20-dione-3,21-diol, pregnan-111,20-di.oiie- 3, 'Lee 4,21-trlol, pregnan-.0¯one-, î..disl, prégzlane -? .- one-3,1. / 3, 17 c (-
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triol, pregnan-20-one-3,11ss, 21-triol, pregnan-20-one-3.11-3,17Ó, 21-tetrol and, for the starting materials listed above, which contain hydroxy groups in positions 3 and / or 21, their 3- and / or 21-esters with lower hydrocarbon carboxylic acids, such as adetic acid, propionic acid, tert-butyl-acetic acid l benzoic acid and the like.
The present method of microbiological dehydrogenation involves contacting the 3-oxygenated steroid compound with the dehydrogenating activity of microorganisms of the genus Nocardia. This can be done by adding, under sterile conditions, the steroid compound, as a solid or as a solution in a solvent, such as a dialkyl ketone such as acetone, a dialkyl formamide such as dimethylformamide. and the like, culturing the microorganism in a nutrient medium, and stirring the resulting mixture, so as to ensure the growth of the microorganism and the dehydrogenation of the steroid compound.
The steroid can be added at the time the nutrient medium is inoculated using the culture of microorganisms of the genus Nodardia or it can be added to an established culture. Instead of adding the steroid compound to the culture established in the nutrient medium, the cells of this culture can be separated by filtration of the broth, washed with distilled water and suspended in a buffered aqueous solution containing the steroid compound 3. -oxygenated, the resulting mixture being stirred so as to operate the dehydrogenation of the steroid compound, so as to form the corresponding 1 ¯ "3-oxygenated steroid.
The latter is recovered more easily from this medium than from the mixture obtained, when the steroid is incubated with the microorganism in the original nutrient medium, while higher yields of steroids are obtained with this medium, when makes use of 3-hydroxy-pregnans as starting materials. The 3-oxygenated steroid little
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also be put in contact, 1I'C of enzymatic preparations
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dehydrogenating originates from: .e growth: of microorganisms
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of the genus Nocardia, from 5.5. Sre to form the compound sterol.de Al3 'é LI -.3-oxygenated oorres> enc ".a <'.
Í:, E'1 =, ..: t. 'J';:; --.-.-. # they used for the execution of this de! shydl'og ;,. <;.:. J '.0 [' [1 :. : eobiological are those usually
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used for the propagation of microorganisms of the genus No-
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cardia. Common RU'c materials include nitrogen and carbon source, inorganic compounds and factors.
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growth when these are needed.
Carbon
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can be supplied by the v :, 'c, ..:; ùz real as acetates, and lacta-
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tes, which ensures increased growth and higher yields.
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bred in the case of (i0!. 'S,: oj n033 species, such as Nocardia blackwel1ii and the like, - "2.zo'G': 'can be supplied by an ammonium salt, a: zTaomac: s 0'.1 proteins, such as soybeans, oats': ', 2. Yeast, yeast extracts, j1.; Sest, Ü, ut :. T;' ¯, r: ws , .u casein., meat extracts, flours 1..10 8, "W :: the '1 [!': protein taades and the fragments da, r, le..Marine de oé ':'. 1.Ti! Ollt fish meal, distiller solubles and the like.
If we c, 4-'il: / - î '... 0 \ n ::'. \ -, 'ooa: ii.'3es of the Nocar- dia gtnre can be ¯¯. # ;. vs ' . -> # # - # 'cilii j.;. t. - :. is proteins (or. amino acids) s # 'ùo: .a T' "f ''? '-?:, ¯ of ç;' 3 .. ('' :: 0; ';: : in the presence in the medium in which sa-j, 2S ':' \. 2: i. c "'-:': \. '.:!? oxacid serve as carbon sources t- ¯.'., c '}:;. j, 11 .: ###;.: - "Z.-3 &FIILiOZ'gaEI3.; 11185 Good q1! $, C'." '- :: -' - "¯::. - ¯. Vd ,: plus îls Lt2 the dehydrogenation of the included *, fi: I -.'''- "1 .1 = ¯: f 9'.w Swiss can be done using preps?. ¯ :: û ':: ..: ....' ,.:
(¯C '.. 5 cl; ::; 11) dro'bfmD.ntes from the growth of;., LCI' '- ::'; '-;' ', -.,:, Ü5me:,> of the genus Bocard or by putting the compound 1: '(. 0:;,;) ;;'. 110 'è..U ct-iitaet:'; \ "a suspension of an established culture" :: t1. '. [:;: '-5. ::; S-6H1. c v ..: ;; i 11:. 3 ",. Ordinarily prefer to add the frFaf.a.¯ .:,:; i: 'S2.,)}, I." K: 3 r' "îr% if it is a nutrient medium
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containing a 24 hour culture of microorganisms of the genus Nocardia. The proportion of steroid compound which can be added to the medium will vary depending on the particular substrate to be dehydrogenated, but it is ordinarily preferred to employ a concentration of about 0.005% to 0.2% of 3-oxygenated steroid compound, although that higher or lower concentrations may be used, if desired.
The culture containing the added 3-oxygenated steroid compound is then incubated, preferably with agitation and aeration, for an additional period which usually varies between about 10 hours and 50 hours, although shorter or longer fermentation times. long can be advantageous for the dehydrogenation of particular 3-keto-stoids substrates. Due to the fact that prolonged fermentations can lead to the destruction of part of the / 1-3-keto-steroid compound, it is usually preferred to apply a fermentation time of about 10 to 24 hours, which, depending on the steroid substrate used, gives maximum yields of steroid-dehydrogenated product.
When the dehydrogenation process is completed, the product is advantageously recovered from the fermented broth by extraction using a solvent immiscible in water, such as a chlorinated hydrocarbon, such as choroform, a ketone, such as methyl isobtyl ketone. , an alkyl alkanoate, such as ethyl acetate, etc. The extract containing the steroid / \ -dehydrogenated product and optionally unreacted starting material is advantageously purified. by chromatography, using silica gel, activated alumina, etc. or, if desired, by descending paper chromatograms.
After separation of the dehydrogenated product from the unreacted starting material, the product can be further purified, if desired, by recrystallization from a solvent, such as ethyl acetate, acetate mixtures.
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ethyl petroleum ether and the like.
By this microbiological dehydrogenation process, using 3-oxygenated and unsaturated C-5 steroid compounds, 3-keto-pregnans and 3-hydroxy-pregnans enu
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mothers above, are obtained /} '-3-keto-pregnadienes, such as 6 1' -prégtadiene-3 c 20-dione, 6 l '-pregnadiene-3, 20-dione-17 c (- o., ± 1s -rregnadiene-3,2-dione-2l-ol, d-1,4. pregnadiene-3,20-diflnee1? c (, 21-diol, Q l '"- pregnadiene-3, 20-pdione-1? C (-ol-21-al, le-1,4:
Pregnadiene -3,11,20-trione, fa 1 '* - pregnadiene-3-1., 20-trivne-7.7 c (-ol, p /jl,4¯pregne.diene- 3, ll, 20-trione -21-ol, l '' = pregnadiene-31 ?, 20-trioze-17 21-diol, / \ -pregMdiene-3, 11, 20-.trione-17 do? -21-a., / l '' - prégnadiene-3, û0-dionei E 11 -ol, n Z '' - pregnadiene-3, 20-dione-11, -01-21-al, / 11,4¯ Dregnadiene-3.20 -dione-1 21- diol, '' '-pregnadiene; .3 20¯dione-lll3, 17 4 -diol, (\ 1> - Pregnadiene-3,20-diozze-1. / 3,1r c ( , 21-triol;
9-halogenated 1,4¯3-Ket- pregnadienes, such as 9-halo- #! - ¯pregnadiene- 3,20-dione 17,21-diols, 9-flLCro- / Z '' - pregnadien- 3,20-di.oni 17 c {, 21-diol, -halo- '' -préguadière-3,20-dione -. 'I, 11321-triol, 9-halo- l'-pregnadiene-3, 11,20-trione-17,21-dio3, 9-. luoro-1 '' '-pre gnadzene-3,11, 20-trione-7.7 c, 21-diol, 9-fluoro-./j' '-pregnadien-3, 20-diozle-113,17 ((, 21-trio or the corresponding / 4¯pregnenic compounds and the like.
The following examples illustrate embodiments of the present invention, but it is understood that these examples are given by way of illustration and not by way of limitation.
EXAMPLE 1.-
50 cc of a nutrient medium of the following composition is prepared:
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<tb> Cerelose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Eda.mine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liquor <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 0.25 <SEP> this
<tb>
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Distilled water q.s.a3; 50 cc.
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This medium is brought to pH 6.5 with the aid of KOH, sterilized and inoculated with about 2.5 to 5 cc of a culture of Nocardia asteroids ma 272; ATCC 9970) and the inoculated culture is then incubated at 28 ° C, with shaking, for 48 hours.
To the resulting culture is added a solution containing 10 mgr of hydrocortisone (4-pregnene-11,3,17 d, 21-tri-ol-3,20-dione) dissolved in 0.1 cc of dimethylformamide * - ture containing the steroid compound is incubated, with shaking, for an additional period of about 24 hours at 28 ° C
The fermentation broth is extracted with four 50 cc portions of ethyl acetate and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated in vacuo to a volume of about 5 cc. The concentrated solution is then used to prepare paper chromatograms, which are developed using formamide as the stationary liquid phase and chloroform as the mobile liquid phase.
Two bands are obtained, one of which (which corresponds to the most mobile constituent) exhibits the maximum ultraviolet absorption characteristic of hydrocortisone and of which the other (which corresponds to the less mobile constituent) exhibits ultraviolet absorption maximum at about 242 mu. The paper chromatogram is dried and the band corresponding to the adsorption of 242 mu is cut and extracted with methanol. The material extracted with methanol is again subjected to paper chromatography, using paper, which has been extracted for 48 hours with methanol, and using the previously chloroform-formamide system. employee.
The resulting chromatogram shows only a trace of a band corresponding to the starting hydrocortisone, while the main band has an ultraviolet absorption maximum at 242 mu.
The chromatogram on paper is dried thoroughly, and the band corresponding to the adsorption maximum of 242 m. Is cut and
<Desc / Clms Page number 13>
extracted with methanol. The methanolic extract is evaporated under
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vacuum to dryness, so that A 1,4-prregnadiene-lL6 17 d, 1-tri.oL-3,0-c? iozae is obtained. EXAMPLE 2.-
Or prepare 50 cc of a nutrient medium of the following composition:
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<tb> Cerelose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liquor <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 0.25 <SEP> this
<tb>
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> q.s.ad <SEP> 50 <SEP> cc.
<tb>
This medium is brought to pH 6.5 using KOH, steri-
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lized and inoculated with about 2.5 to 5 cc of a culture of Nocardia minima (ICi. 292; i11CJ 8674) and the inoculated culture is then incubated at 2 ° C, with shaking, for. Mon8 hours.
To the. resulting culture, a solution containing 10 mgr of hydrocortisone (/ '-pregnene-1J. / 3, 1.7 d 9f 1-triol-3,0-d.iote j dissolved in 0.1 cc of dinzéthy3 formâani de < The culture containing the steroid compound is incubated, with shaking, for an additional period of about 24 hours at 28 ° C.
The fermentation broth is extracted using
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four 50 cc portions of ethyl acetate and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated in vacuo to a volume of about 5 cc. The concentrated solution is then used to prepare paper chromatograms, which are
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developed using forJ;! 3.I! 1ide COI, lTI10 stationary liquid phase and retort chloroform mobile liquid phase.
Two bands are obtained, one of which (which corresponds to the more mobile constituent) has the maximum absorption characteristic of ultra-violet of hydrocortisone and the other (which corresponds to the less mobile constituent). has a maximum of ad-
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ultraviolet sorption at about 242 threads. The chromatogram on paper is dried and the band corresponding to the absorptior
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of 242 mu is cut and extracted with methanol. The material extracted with methanol is again subjected to paper chromatography, using paper, which has been extracted for 48 hours with methanol, and making use of the chloroform-formamide system. previously employed.
The resulting chromatogram shows only a trace of a band corresponding to the starting hydrocortisone, while the main band has an ultraviolet absorption maximum at 242 mu. The paper chromatogram is dried thoroughly and the band corresponding to the absorption maximum of 242 mu is cut and extracted with methanol. The mehanolic extract is evaporated under vacuum to dryness, so that ¯ 1,4 pregnadièb-11,3,17 Ó 21-triol-3,20-dione is obtained.
EXAMPLE 3
50 cc of a nutrient medium of the following composition is prepared:
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<tb>. <SEP> Cerelose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP> 0.25 <SEP> cc
<tb>
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> q: s: ad <SEP> 50 <SEP> ce.
<tb>
This medium is brought to pH 6.5 with the aid of KOH, sterilized and inoculated with the aid of about 2.5 to 5 cc of a culture of Nocardia asteroids MA 289; ATCC 100.04) and the inoculated culture is then incubated at 28 ° C with shaking for 48 hours. To the resulting culture was added a solution containing 10 mg of hydrocortisone (4-pregnene-11ss 17-21 triol-3,20-dione) dissolved in 0.1 cc of dimethylformamide. The culture containing the steroid compound is incubated, with shaking, for an additional period of about 24 hours at 28 ° C.
The fermentation broth is extracted with four 50 cc portions of ethyl acetate and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated in vacuo to a volume of about 5 cc.
The concentrated solution is then used.
<Desc / Clms Page number 15>
read to prepare paper chromatograms, which are developed using formamide as, stationary liquid phase and chloroform as! mobile liquid phase. Two bands are obtained, one of which corresponds to the more mobile constituent) exhibiting the maximum ultraviolet absorption characteristic of hydrocortisone and of which 1- 'the other (which corresponds to the lesser constituent). mobile),
shows a maximum ultraviolet absorption at about 242 mu The paper chromatogram is dried and the band corresponding to the absorption of
242 mu is cut and extracted with methanol aid. the material extracted with methanol is again subjected to paper chromatography, using paper, which has been extracted for 48 hours with methanol, and using the previously used chloroform-formamide system.
resulting chromatogram shows only a trace of a band corresponding to the starting hydrocortisone, while the main band has an ultraviolet absorption maximum at 242
The paper chromatogram is dried thoroughly and the band - corresponding to the absorption maximum of 242 mu is cut out and extracted with methanol.
The methanolic extract is evaporated in vacuo to dryness, so that 1,4 prégna diene-11ss, 17 Ó, 21-triol-3,20-dione is obtained. EXAMPLE 4. 50 cc is prepared. 'a nutrient medium of the following composition:
EMI15.1
<tb> Cerelose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liquor <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 0.25 <SEP> this
<tb>
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> q. <SEP> s. <SEP> ad <SEP> 50 <SEP> ce.
<tb>
This medium is brought to pH 6.5 with KOH, sterilized and inoculated with about 2.5 to 5 cc of a culture of Nocardia globerula (MA 280 ATCC 9356) and the culture is then
<Desc / Clms Page number 16>
incubated at 28 ° C with shaking for 48 hours. To the resulting culture is added a solution containing
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10 mgr of hydrocortisone (LI 4¯pregnene-l1j3, 17 c (, 21-trio 1-3, 20-dione) dissolved in 0.1 cc of dimethylformamide. The culture containing the steroid compound is incubated, with shaking, for an additional period of approximately 24 hours at 28 c
The fermentation broth is extracted with four 50 cc portions of ethyl acetate and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated in vacuo to a volume of about 5 cc. .
The concentrated solution is then
EMI16.2
used to prepare paper chromatograms, which are developed using i'ormamide as the stationary liquid phase and chloroform as the mobile liquid phase. Two bands are obtained, one of which (which corresponds to the more mobile constituent) exhibits the maximum ultraviolet absorption characteristic of hydrocortisone and the other (which corresponds to the least mobile constituent). mobile) exhibits an ultraviolet adsorption maximum at about 242 mu. The paper chromatogram is dried and the band corresponding to the 242 mu absorption is cut and extracted with methanol.
The material extracted with methanol is again subjected to paper ahromatography using paper, which has been extracted for 48 hours with methanol, and making use of the chloroform-formamide system previously employed. The resulting chromatogram shows only a trace of a band corresponding to the starting hydrocortisone, although the main band has an ultraviolet absorption maximum at 242 mu.
The chromatogram on paper is dried thoroughly and the strip cor-
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corresponding to the maximum absorption of 242.ra.ukst cut and extracted with methanol. The methanolic extract is evaporated in vacuo to dryness, so that / \ 1,4-prégna is obtained.
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diene JIP, 17 c (, zl-triol-3,20-dione.
<Desc / Clms Page number 17>
EXAMPLE 5. -
50 cc of a nutrient medium of the following composition is prepared:
Cerelose 1 gr
Edamine 1 gr -Maceration liquor, corn 0.25 cc
Distilled water q, s, ad, 50 cc
This medium is brought to pH 6.5 with sterilized KOH and inoculated with approximately 2.5 to 5 cc of a culture of Nocardia leishmaii MA 281; ATCC 6855) and the inoculated culture is then incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking, for 48 hours.
To the resulting culture is added a solution containing 10 mgr of hydrocortisone ¯ 4-pregnene-11/3 (17 d, 21-triol-3,20-dione) dissolved in 0.1 cc of dimethylformamide. containing the steroid compound is incubated, shaking, for an additional period of about 24 hours at 28 ° C
The fermentation broth is extracted with four 50 cc portions of ethyl acetate and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated in vacuo to a volume of about 5 cc.
The concentrated solution is then used to prepare paper chromatograms, which are. developed using formamide as the stationary liquid phase and chloroform as the mobile liquid phase. Two bands are obtained, one of which (which corresponds to the most mobile constituent) has the maximum ultraviolet absorption characteristic of hydrocortisone and the other (which corresponds to the least mobile constituent). mobile) exhibits an ultraviolet absorption maximum at approximately 242 mu.
The chromatogram on paper is dried and the. band corresponding to the absorption of 242 mu is cut and extracted with the aid of
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thanol. The material extracted with methanol is again subjected to paper chromatography, using paper, which has been extracted for 48 hours with methanol, and using the above chloroform-formamide system. - ment employee. The resulting chromatogram shows only a trace of a band corresponding to the starting hydrocortisone, so the main band has an ultraviolet absorption maximum at 242 mu.
The chromatogram on thoroughly dried papers and the band corresponding to the absorption maximum of 242 mu is cut out and extracted with methanol. The methanolic extract is evaporated under vacuum to dryness, so that one obtains
EMI18.1
-PregnadièMe-11, 17 c (, 21-trlol-3,20-dione.
EXAMPLE 6 50 cc of a nutrient medium of the following composition is prepared:
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<tb> Cerelose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> but <SEP> 0.25 <SEP> cc
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> q.s.ad <SEP> 50 <SEP> ce
<tb>
This medium is brought to pH 6.5 using sterile KOH -se and inooulé using approximately 2.5 to 5 cc of a culture of Nocardia formica MA 143; NRRL 2470) and the inoculated culture is then incubated at a temperature of 28 ° C. while shaking, for 48 hours.
To the resulting culture, we add a solo
EMI18.3
tion containing 10 mgr of hydrocortisone (/ i-pregnen-11,3,17 of 21-triol-3,20-dione dissolved in 0.1 cc of dimethylformamide.
The culture containing the steroid compound is incubated, with shaking, for an additional period of about 24 hours at 28 ° C.
The fermentation broth is extracted with the aid of four fractions of 50 cc of ethyl acetate and the extracts
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the ethyl acetate is combined and evaporated in vacuo to a volume of about 5 cc. The concentrated solution is then used to prepare paper chromatograms, which are developed using formamide as the stationary liquid phase and chloroform as the mobile liquid phase.
Two bands are obtained, one of which (corresponding to the more mobile constituent) has the maximum ultraviolet absorption characteristic of hydrocortisone and the other (which corresponds to the less mobile constituent). shows maximum ultraviolet absorption at about 242 mu.
The chromatogram on paper is dried and the band corresponding to the absorption of 242 mu is cut and extracted with methanol. The material extracted with methanol is again subjected to paper chromatography, using paper, which has been extracted for 48 hours with methanol, and making use of the pre-chloroform-formamide system. - formerly employed. The resulting chromatogram shows only a trace of a band corresponding to the starting hydrocortisone, while the main band has an ultraviolet absorption maximum at 242 mu.
The chromatogram on paper is dried thoroughly and the band corresponding to the absorption maximum of 242 mu is cut out and extracted with methanol. the methanol extract is evaporated in vacuo to dryness, so that ¯ 1,4-pregnadiene-11.3, 17 Ó; 21-triol-3t20-dione is obtained.
EXAMPLE
50 cc of a nutrient medium of the following composition is prepared:
EMI19.1
<tb> Gerelose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> corn <SEP> 0.25 <SEP> ce
<tb>
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> q.s.ad <SEP> 50 <SEP> ce
<tb>
<Desc / Clms Page number 20>
This medium is brought to pH 6.5 with KOH, sterilized and inoculated with about 2.5 to 5 cc of a culture of Nocardia.
EMI20.1
convoluta (MA 275; ATCC 4275) and the inoculated culture is then incubated at 28 ° C., with shaking, for 48 hours. To the resulting culture is added a solution containing
EMI20.2
10 mgr of hydrocortic # lG '(--pregene., - 113, l? D, 21-triol-3,20-dione) dissolved in G, 1 cc of dimethflforntamide.
The culture containing the steroid compound is incubated, with shaking, for an additional period of about 24 hours at 28 ° C.
The fermentation broth is extracted with four 50 cc portions of ethyl acetate and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated in vacuo to a volume of about 5 cc. . The concentrated solution is a-, when used to prepare chromatograms on paper; which are developed using formamide as the stationary liquid phase and chloroform as the mobile liquid phase.
Two bands are obtained, one of which (corresponding to the most mobile constituent) exhibits the maximum ultraviolet absorption characteristic of hydrocortisone and the other of which (which corresponds to the constituent the most mobile). less mobile) exhibits an ultraviolet absorption maximum at about 242 mu. The chromatogram on paper is dried and the band corresponding to the adsorption of 242 mu is cut and extracted with methanol. The material extracted with methanol is again subjected to paper chromatography, using paper, which has been entered for 48 hours with methanol, and making use of the chloroform-formamide system. previously employed.
The resulting chromatogram shows only a trace of a band corresponding to the starting hydrocortisone, while the main bay has an ultraviolet absorption maximum of 242 4u The chromatogram on paper is dried fully and the band corresponding to the maximum absorption
<Desc / Clms Page number 21>
of 242 mu is cut and extracted with methanol. -The extract m-
EMI21.1
thanolic is evaporated in vacuo to dryness, so that a 14 obtains 1,4¯r,> regnadiene-10. 7 d, 21-triol-3,20-dione.
ET '' -. 13'1, E 8.- 50 cc of a nutrient medium is prepared, of the following:
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Gerelosis bzz mgr
EMI21.3
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liquor <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 0.25 <SEP> cc
<tb>
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> q. <SEP> s. <SEP> ad. <SEP> 50 <SEP> cc
<tb>
This medium is brought to pH 6.5 with KOH, sterilized and inoculated with about 2.5 to 5 cc of a culture of Nocardia corallina MA 277; ATCC 4273), and the culture inoculated, is then incubated at a temperature of 28 ° C., with shaking, for 48 hours.
To the resulting culture is added a suitable solution.
EMI21.4
holding 10 mgr of hydrocortisone ('-prgQzléz, ēllf3, 17 c (, 21-triol-3,20-dione) dissolved in 0.1 cc of dimethylformamide. the culture containing the steroid compound is incubated, with shaking, for an additional period of approximately 24 hours at 28 c
The fermentation broth is extracted with four 50 cc portions of ethyl acetate and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated in vacuo to a volume of about 5 cc. . The concentrated solution is then used to prepare palm tree chromatograms, which are developed using. formamide as the stationary liquid phase and chloroform as the mobile liquid phase.
Two bands are obtained, one of which (which corresponds to the most mobile constituent) has the maximum characteristic.
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ultraviolet absorption mum of hydrocortisone and the other (which corresponds to the least mobile component) has an ultraviolet absorption maximum at about 242 mu.
<Desc / Clms Page number 22>
The chromatogram on paper is dried and the band corresponding to the absorption of 242 mu is cut and extracted with methanol. The material extracted with methanol is again subjected to paper chromatography, using paper, which has been extracted for 48 hours with methanol and pheasant + -: use of the chloroform-formamide system previously employed. The resulting chromatogram shows only a trace of a band corresponding to the starting hydrocortisone, while the main band has an ultraviolet absorption maximum at 242 mu. The paper chromatogram is dried thoroughly and the band corresponding to the absorption maximum of 242 mu is cut and extracted with methanol.
The methanol extract is evaporated in vacuo to dryness, so that ¯1,4-pregnadiene-11.3 17c (, 21-triol-3,20-dione is obtained.
EXAMPLE 9.-
Six 50 cc fractions of the edamine-based medium described in Examples 1 to 8 are brought to pH 6.5, sterilized by heating for 15 minutes in an autoclave at about 120 ° C and each of the media sterilized. is inoculated with a culture of the microorganisms Nocardia blackwellii (ATCC 6846). The inoculated cultures are incubated at a temperature of 28 ° C with shaking, making about 48 hours and to each of the resulting six cultures a 10 mgr solution of a different 3-keto-steroid compound in 0.1 cc of dimethylformamide.
Cultures containing; the 3-keto-steroid compounds are then incubated, with shaking, for a period. additional about 24 hours.
Each of the fermentation broths thus obtained is individually extracted with 4 fractions of 50 cc of ethyl acetate. - The ethyl acetate extracts corresponding to each broth and derived from a substrate 3- keto-steroid by-
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in particular are combined and evaporated to dryness in vacuo.
Each of the six residual products thus obtained is dissolved in acetone and subjected to surface chromatography on paper. Various chromatograms are developed using the solvent system shown for the particular starting material in the table given below.
The upper bands for each chromatogram, corresponding to the -dehydro-derivatives, are cut out, individually extracted with methanol and the material extracted with methanol is again subjected to a The upper band is cut again, then dried. and extracted with metand
EMI23.1
chromatography on paper - / "The methanolic extract is evaporated to dryness under vacuum, so that, for each substrate used as starting material, the compounds are obtained
EMI23.2
/ Jl '"- 3-keto-steroid's (particulars indicated in the following table:
EMI23.3
<tb> System <SEP> solvent <SEP> used <SEP> for <SEP> chromatography <SEP> on <SEP> paper. <SEP> - <SEP>
<tb>
EMI23.4
Substrate test Stationary phase Mobils / Keto-phase
EMI23.5
<tb> No. <SEP> 'steroid
<tb> obtained
<tb>
EMI23.6
1 '4- -Pregnene-1? F' formamide chloroform L} l, 1 .. -préo-na- 17 0 (, 21-triol-3, 20- diue-11 3, diane 17d, z1-iol- 3 , 20-dione 2 Pregnane-113, 17 d;
formamide Chloroform / 1 '' -prégtia- 21-triol-3,20-dione diene-1 /, 17d, zl-riol- 3,20-dione 3 Pregna-forrnamide 21-acetate 1: lchlorofor- Ll1,4- ¯Pregnacli, ne-17 d, 21-diol-3, ll, me-toluene èe-17e {21-
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<tb> 20-trione
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 20-trinne <SEP> diol-3,11,20-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> trione
<tb>
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4 21-alloformamide acetate 1: 1 chlorofor- L \ 1.4¯pregna. pregnane-17 and. , 21- me-toluèue diene-17c (,!
EMI23.9
<tb> diol-3, 11, 20-trione <SEP> 21-diol-3,
<tb>
<tb> 11,20-trione
<tb>
<tb>
<tb> 5 <SEP> Pregnane-17c (, 21- <SEP> formamide. <SEP> benzene <SEP> / [<SEP> '<SEP> -prégna- <SEP>
<tb>
EMI23.10
dioZ-3, zo-diou cTiene-17 | , 21.
EMI23.11
<tb> 3,20dione-diol
<tb>
EMI23.12
6 21-benzene L1 formamide acetate, 4¯prregna-allopregnan-17c (, di;
on-17d, 21. 21-diol-3,11-dione diol-.3,20-di-
EMI23.13
<tb> one
<tb>
<Desc / Clms Page number 24>
EMI24.1
E :: 'THE 11.-
50 cc of a nutrient medium of the following composition is prepared:
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<tb> Cerelose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liquor <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 0.25 <SEP> this
<tb>
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> q.s.ad <SEP> 50 <SEP> ce.
<tb>
This medium is brought to pH 6.5 with sterilized KOH and inoculated with about 2.5 to 5 cc of a culture of Nocardia asteroids MA 272; ATCC 9970) and the inoculated culture is then incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking, for 48 hours. Add a solution to the resulting culture
EMI24.3
containing 10 mgr of pregnane -.? 3,1,? l-tr, a'1-3, c-diozae dissolved in 0.1 cc of dimethylformamide. The culture containing the steroid compound is incubated, with shaking, for an additional period of about: 12 hours at 28 ° C.
The fermentation broth is extracted with four 50 cc portions of ethyl acetate and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated in vacuo to a volume of about 5 cc.
The concentrated solution is then used to prepare chromate ogre mine on paper, which are developed using formamide as stationary liquid phase and chloroform as mobile liquid phase * The main band thus formed exhibits the maximum characteristic of ultra-violet absorption of hydrocortisone; the chromatogram on paper is dried and this strip is cut and extracted with methanol. The material extracted with methanol is again subjected to paper chromatography, using paper which has been extracted for 48 hours with methanol and made use of the previously employed chloroform-formamide system.
The resulting chromatogram is thoroughly dried and the / band exhibiting the maximum characteristic
<Desc / Clms Page number 25>
ultraviolet absorption absorption of hydrocortisone is cut out and extracted with methanol. The methanolic extract is - / 'evaporated to dryness in vacuo, so that h
EMI25.1
-Pregnaz-11/3, Z7 c (, 1-triol-3, 0-dione) hydrocortisone.
The process described above is repeated, using the same edamine-based medium, pregnan-l², 17, 21-tr: Lol-3,20-dione as a substrate and an incubation period of 12 hours, but by making use, instead of microorganisms of the genus Nocardia asteroids MA. 272, of the following microorganisms: Nocardia minima - (Â 292; ATCG $ 671) Nocardia globerula - (Ul 2 $ 0; ATGO 9356) Nocardia le5..shIllani - (M9. 2:81; ATCC 6855) Nocardia formica - li3; NRLL 2470)
EMI25.2
Nocardia asteroids - (MA. 289; AïCC 10904) '
Extraction of the resulting fermentation broths and paper chromatography of the dried extracts in a formamide-chloroform system in each case gives a bar on the chromatogram corresponding to hydrocortisone.
Elution of this band of the meniere described above gives hydrocortisone identified by its absorption spectrum of ultra-violet as the main steroid product obtained.
EXAMPLE 12.-
50 cc of a nutrient medium of the following composition is prepared:
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<tb> Cerelose <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Edamine <SEP> 1 <SEP> gr
<tb>
<tb> Liquor <SEP> of <SEP> maceration <SEP> of <SEP> but <SEP> 0.25 <SEP> this
<tb>
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> q.s.ad. <SEP> 50 <SEP> ce.
<tb>
This medium is brought to pH 6.5 with KOH, sterilized and inoculated with about 2.5 to 5 cc of a culture of
EMI25.4
Nocardia blackwellii (MA. 273; ATCC 684h) and the inoculated culture is then incubated at a temperature of 28 ° C. while shaking,
EMI25.5
within hours.
To the resulting culture is added a solution
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containing 0.64 gr of Pregnane-3/3 1-acetate; 17o (, 21-triol-11,20-dione dissolved in dizz.éthy: lformautice., The culture coizt ^:; :: z the steroid compound is incubated with shaking and aeration, bw an additional period of about 4 hours at 28 C
EMI26.2
The iron broth is extracted with ethyl acetate and the extract is separated and evaporated to dryness. The dried residual product is partitioned between petroleum ether and 70% aqueous methanol with the petroleum ether layer being discarded.
Methanol. aqueous product containing the product is .duct / evaporated under reduced pressure, so as to remove methanol. The resulting aqueous layer is extracted several
EMI26.3
both with ethyl acetate and the eouchff of ethyl acetate is evaporated to dryness, so that one obtains / l'-pregnadiene-17 c, l.-diol .-3,11, G - ;, riotia pa.r'ci3J lely purified. This material is dissolved in pyridine and reacted in excess acetic anhydride, so as to
EMI26.4
forming x '--i7âv1li.22 -iÎ -c 21-acetate, 21-diol-3,11,20. trione, which is recovered from mSlane dtacétyls.tion by adding water and recovering the precipitated material by filtration.
The activated 21-acetate is dissolved in ether and chlorinated over alumina. The activated 21-acetate is dissolved in ether. The alumina is developed using, as developing solvents, ether and a mixture of ether and chloroform. The desired product is eluted from the column with chloroform and the chloroforuic eluate is evaporated so that one.
EMI26.5
Obtains pure crystalline /, 1,4-nadièze-17 c (, 1-diol-3,11,20-trione 21-acetate).
EÍ .: 1: J-'lli 13.- Two 50 cc fractions of the edamine-based medium described in Examples 1 to> # are ar: .exz: 2s at pH 6.5 using
<Desc / Clms Page number 27>
'of KOH, sterilized by heating, for 15 minutes in an autoclave at 120 ° C. and each of the sterilized media is inoculated using a culture of Nocardia blackwellii (ATCC 6846).
The inoculated cultures are incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking, for approximately 48 hours. At the end of the incubation period, the cultures are centrifuged, the cells being retained and the liquid, supernatant is discarded. The cells retained are washed with distilled water and added with water buffered at pH 7.0 to a volume of 25 ° C. To one of the cell suspensions, a solution of 5 mgr of 21 pregnane acetate is added. -3,17 Ó, 21-triol-11,20-dione in 0.1 cc of dimethylformamdide to the other suspension of cells is added a solution of 5 mgr of pregnant 21-acetate-17 d, 21-diol- 3,11,20-trione in 0.1 cc of dimethylformamide.
The cell suspensions containing the pregnanic compounds are then incubated, with stirring, for a period of about 12 to 15 hours.
Each of the fermentation broths thus obtained is individually extracted using four fractions of
50 cc of ethyl acetate. The ethyl acetate extracts corresponding to each of the two broths are combined and evaporated to dryness in vacuo, so that in each case ¯ 1,4-pregnadiene-17 ¯, 21- is obtained. 3.11029-diol trione. In each case, the yield, determined by polographic analysis of the products, exceeds 85% of the theoretical yield.
CLAIMS.-.
** ATTENTION ** end of DESC field can contain start of CLMS **.