Procédé de préparation de sels purs d'antibiotiques de caractère basique, notamment d'antibiotiques du type de la streptomycine. L'invention concerne un procédé de prépa ration de sels purs, solubles dans l'eau, d'anti biotiques de caractère basique, notamment d'antibiotiques du type de la streptomycine, c'est-à-dire du genre - se composant de la streptomycine et de composés basiques à ac tion antibiotique, qui (comme la st.repto- myeine) peuvent former des sels solubles dans l'eau avec des acides, tels que l'acide sulfuri que, et des sels insolubles dans l'eau avec des réactifs organiques précipitant les bases.
En 19-14, Schatz, Bugie et Waksman (Proe. toc. Exp. Biol. lied.
1944, 57, 2-1-1) ont mon tré qu'un antibiotique puissant appelé Strepto- mycine se forme au cours de la croissance de l'organisme Actinomyces Griseus (appelé maintenant. Streptomyces Griseus ), et on a constaté depuis que cet antibiotique est extré- wement utile en thérapeutique.
On a découvert, ensuite, que plusieurs streptomycines se forment en même temps. La première streptomycine obtenue sous forme cristallisée, pure (à l'état de reineekate) et complètement. caractérisée est appelée mainte nant Streptomycine A , et la seconde strepto mycine caractérisée est appelée maintenant Streptomycine B . De plus, on possède des indications d'après lesquelles d'autres strepto mycines se forment et/ou peuvent se former en même temps en changeant les conditions de la culture; au cours du présent exposé, chacun de ces antibiotiques et leurs mélanges seront dénommés streptomycine , à moins d'indications contraires.
La streptomycine et d'autres antibiotiques de caractère basique ont été purifiés jusqu'à présent par divers procédés tous compliqués et/ou inefficaces (et, par conséquent, coû teux). Par exemple, un procédé appliqué dans une large mesure antérieurement comporte, en principe, les opérations suivantes: 1 On traite un liquide primaire contenant la strepto mycine avec du charbon de bois activé qui absorbe sélectivement la streptomycine; 2 on extrait la streptomycine du charbon de bois par un acide minéral aqueux soluble dans l'eau, de préférence en élevant. légèrement la température (par exemple à environ 30 à 50 C);
3 on traite l'extrait avec un réactif acide de précipitation des bases organiques, de préférence l'acide phosphotungstique, pour former un complexe de nature saline, et 4 on décompose le complexe, par exemple avec un acide minéral, pour former un sel purifié, so luble dans l'eau, de la streptomycine.
L'ex pression liquide primaire doit être entendue comme désignant en particulier: a) le liquide de culture obtenu en faisant proliférer un micro-organisme apte à. fournir un antibiotique basique, par exemple le Streptomyces " Gri- seus , dans des conditions et dans un milieu de culture convenant. à. la formation de la streptomycine et en séparant les matières so lides du milieu;
b) le liquide de culture de <B>pouvoir</B> amélioré, obtenu par acidification de la culture (par exemple par l'acide chlor- hydrique <B>ou sulfurique),</B> le liquide étant neu tralisé, et c) le liquide obtenu par extraction par un acide des matières solides séparées de la culture, le liquide étant neutralisé. La présente invention vise à. un perfee- tionnement de ce procédé de purification connu, par le choix de réactifs acides préci pitant les bases particuliers qui donnent de bien meilleurs résultats en ce qui concerne la pureté finale des antibiotiques obtenus que les réactifs utilisés jusqu'à présent. dans ce but.
(acide phosphotunbstique par exemple). L'in vention a pour but. de réaliser de façon simple, efficace et avantageuse la purification des antibiotiques de caractère basique, notamment de la, streptomycine. Il a été découvert que l'on peut, utiliser, comme réactifs acides précipitant les bases, des agents tensioactifs (ou agents de mouil lage) du type des acides inorganiques polF- basiques organiquement substitués, qui réagis sent.
avec des antibiotiques de caractère basi que en formant certaines combinaisons ou com plexes de nature saline peu solubles dans l'eau, et que ces agents tensioactifs acides rempla cent avantageusement les réactifs utilisés jus qu'à présent dans ce but, tels que l'acide phos- photunbstique. Les complexes de nature saline des antibiotiques, obtenus avec ces agents tensioactifs, peuvent être recueillis et trans formés en sels solubles des antibiotiques (le caractère basique.
La présente invention concerne un procédé de préparation de sels purs, solubles dans l'eau, d'antibiotiques de caractère basique, no tamment d'antibiotiques du type de la strepto- myeine, par réaction, dans un solvant, d'un antibiotique impur de caractère basique ou d'un sel impur d'un tel antibiotique, avec un réactif acide précipitant les bases organiques avec formation d'un complexe de nature sa line dudit antibiotique, et décomposition de ce complexe à l'aide d'un acide formant avec l'antibiotique libéré un sel soluble dans ]'eau de cet. antibiotique, à l'état purifié.
Ce procédé est caractérisé en ce qu'on uti lise, comme réactif acide formant ledit com plexe de nature saline, lin agent tensioactif du type des acides inorganiques polybasiques substitués par au moins un reste organique. Le complexe de nature saline ainsi formé est relativement insoluble dans l'eau et. peut être recueilli par filtration, centrifugation ou autre moyen approprié lorsque l'eau sert de solvant.
Lorsque le solvant est -Lui solvant (tel que le méthanol) dans lequel le complexe de nature saline est soluble, on recueille ce com plexe en éliminant le solvant. et en purifiant le résidu, par exemple par lavage avec de l'eau, ou en ajoutant un agent miscible, non solvant du complexe (tel que l'eau). La solu tion dont on part peut être par exemple lui liquide primaire (liquide de culture) conte nant de la streptomycine, ou une solution aqueuse d'une streptomycine partiellement pu rifiée, telle que l'extrait dont. il a été ques tion précédemment.
On peut aussi utiliser un liquide de culture neutre ou acidifié, c'est- à-dire un liquide de culture dont le pH est ajusté à une valeur d'au ph s égale à 7,0 par adjonction d'un acide minéral. Dans ce liquide de culture, l'antibiotique est. présent, totalement. ou en partie, sous forme du sel de l'acide utilisé. Lorsque ce liquide de culture est neutre ou faiblement acide, une partie de l'antibiotique s'y trouve sous forme de sel, mais si ce liquide de culture est fortement acide, la totalité de l'antibiotique s'y trouve sous forme de sel.
Le sel de l'antibiotique régénéré est, beau coup plus pur que l'antibiotique ou le sel de l'antibiotique traité à l'oi-i\;ine et la récupéra tion de l'activité antibiotique, réalisée au cours du traitement (le purification, est d'un ordre élevé. Dans la mise en oeuvre pratique de l'invention, il est. possible d'obtenir ré.-u- lièrement des rendements élevés en sels de la streptomycine relativement purs, possédant (par exemple) un pouvoir antibiotique supé rieur à 400 unités/ni- environ.
Parmi les agents tensioactifs ou agent de mouillage du type des acides inor-ani- ques polybasiques, organiquement substitués, convenant au procédé suivant.
l'invention, on petit citer ceux qui sont représentés par la formule R-0-X-0-Y, dans laquelle R dé signe le radical d'un composé organique hydroxylé ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau, -0-X-0- désigne le radical acide divalent d'un acide inorganique poly- basique soluble dans l'eau (par exemple titi acide sulfurique ou phosphorique) et Y dési gne titi cation du groupe formé par H-f- et les cations donnant des sels solubles dans l'eau avec l'anion R-O-Y-O-. Parmi ces agents de mouillage, on peut.
citer particu lièrement ceux dans lesquels l'acide inorga nique polybasique est l'acide sulfurique, l'acide étant partiellement estérifié avec un alcool aliphatique supérieur, c'est-à-dire les agents de mouillage du groupe formé par les mono-esters aliphatiques supérieurs d'acide sulfurique, et. leurs sels solubles dans l'eau.
D'autres agents de mouillage utilisables du type des acides inorganiques polybasiques or- ganiquement substitués sont ceux du groupe formé par les acides sul.foniques aromatiques. les huiles sulfonées, les dérivés d'acides gras su périeurs sulfonés et leurs sels solubles dans l'eau.
Parmi les alcoyl-esters supérieurs partiels d'acide sulfurique pouvant être utilisés daiLs la mise en aeuvre de l'invention, on petit citer: le groupe des sels de sodium des sulfates des alcools aliphatiques supérieurs synthétiques, tels que C-1H9CH(C'=H5)C"H-ICH(S04 Sa) C2H-ICH(C2H5)'=, C-IH')CH (C2H5) C22H-ICH (S04Na) C EI2CH (CI13 )-', et C4H9CH(C2115)CH2S04Na,
et le groupe des esters partiels d'acide sulfu rique des alcools aliphatiques supérieurs et leurs sels, tels que les sulfates d'octyl-sodium, d'oléy 1- sodium, de e éty 1-sodium, de stéaryl-sodiuni et (le lauryl-sodiuni. Parmi les acides sulfoniques aromatiques, les huiles sulfonées et les dérivés d'acides gras supérieurs sulfonés qui peuvent servir comme agents tensioactifs,
on petit citer les sulfonates de sodium des esters d'acides gras supérieurs et (les amides, tels que le sel de sodium d'oléate d'éthyle sulfoné (ou autre oléate d'alcoyle), par exemple Ct7H33CONFIC2H4S03Na, les sulfonates de sodium (les hydrocarbures de pétrole, le sel (le sodium d'un acide polyalco.0-benzi'lne-sul- fonique contenant 10 atomes de carbone, d'au tres aleoyl-iii,%,
I-sulfonates de sodium et. l'huile < le rouge turc (c'est-à-dire l'huile de ricin sul fonée). Parmi les esters partiels des acides phosphoriques qui peuvent être utilisés, on petit. citer le phosphate dierésylique, la léci thine et un alcool supérieur phosphoré repré senté par la formule (capryle) ) iÇa5p602O. Parmi les acides solubles dans l'eau, reha- tiveiiient forts, qui peuvent servir à transfor nier le complexe de nature saline eir sel Soluble,
on peut citer les acides sulfurique, chlor- hydrique, phosphorique, oxalique, citrique, sulfainique et nitrique.
Pour réaliser un rendement maximum, il convient que l'agent de mouillage soit. sensi blement en excès par rapport à la quantité qui est nécessaire pour combiner la totalité de l'antibiotique contenu dans la solution traitée, la proportion la plus avantageuse de l'agent de mouillage dépendant par suite de la concentration de la solution traitée et du pouvoir de l'antibiotique. En employant la.
quantité stoechiométrique de l'agent de mouil lage (par rapport à l'activité antibiotique de la solution traitée), on peut recueillir utie proportion pratiquement quantitative de l'antibiotique sous forme de complexe de na ture saline; celui-ci est sensiblement pur et permet de recueillir plus facilement l'anti biotique sous forme de sel soluble dans l'eau.
L'agent de mouillage peut être ajouté à une solution de l'antibiotique à l'état solide ou sous forme de solution, ou encore l'anti- biot.ique et l'agent de mouillage peuvent. être toits deux ajoutés à l'état solide à de l'eau (ou autre solvant des réactifs).
Le complexe de nature saline de l'anti biotique et de l'agent (le mouillage peut se séparer dit solvant sous diverses formes: pal, exemple sorts forme de substance huileuse. cireuse ou gélatineuse, ou ne pas se séparer du tout, mais rester à l'état. de suspension clans le solvant (toutes ces formes insoluble, devant être considérées eontme englobées ci après par le terme précipité ).
Suivant sa foiane, on sépare le précipité par filtration, centrifugation, traitement à. l'aide d'un auxi liaire de filtration suivi d'une filtration oa par d'autres moyens ordinaires connus des spécialistes.
La précipitation du complexe de nature saline dépend de la concentration des réac tifs et de la valeur du pli du milieu de la réaction, la précipitation étant niaximuni lorsque la concentration est forte et la valeur du<B>pH</B> comprise entre environ 5 et environ 8 et, de préférence, voisine de 7.
La transformation du complexe de nature saline en un sel soluble dans l'eau de l'anti biotique peut s'effectuer, entre autres, par les moyens suivants: on dissout le complexe dans tin solvant (par exemple le méthanol), on traite la solution avec un acide relativement fort, soluble dans l'eau, et on recueille le sel soluble dans l'eau ainsi foriiié de l'antibioti que, par exemple en ajoutant un agent. misci ble non solvant du sel soluble dans l'eau, tel que l'acétone, ou bien on amène le complexe (en solution) en contact.
intime avec un absor bant (par exemple l'alumine), ou une résine à échange d'anion ayant été antérieurement traitée avec l'acide relativement fort, soluble dans l'eau, choisi, et on recueille le sel soluble dans l'eau ainsi formé de l'antibiotique dans la solution traitée (par exemple en éliminant le solvant) ;
ou bien on dissout le complexe de nature saline dans un solvant organique des savons ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau (par exemple le n-butanol ou l'alcool amylique obtenu par fermentation et raffinage), on amène en contact intime le! solution avec une solution z < < -lueu@e d'un acide relativement fort, soluble dans l'eau, on re cueille la phase aqueuse et on la dessèche (de préférence<I>par</I> congélation,
c'est-à-dire qtt'ou la congèle et on la\souinet à lui vide poussé pour chasser l'eau par sublimation j :
ou bien on dissout le complexe loirs tui solvant dans lequel le sel soluble dans l'eau qu'on désire obtenir est insoluble (par exemple un n ié- lange de méthanol et d'acétone), on traite la solution avec une solution aqueuse d'un acide relativement fort, soluble dans l'eau.
et on re cueille le sel, soluble clans l'eau, précipité de l'antibiotique; on bien on traite une solution du eoniplexe de nature saline avec une solu tion aqueuse d'un acide relativement fort, soluble dans l'eau, en présence d'une résine à échange d'anion, ou par divers autres nio,,
-ens permettant de réaliser lin contact intime et (le faire réagir le complexe av ee l'acide relative ment fort, soluble clans l'eau.
L'invention est. illustrée par les exemples suivants (toutes les solutions on dilution dont. il est question étant des solutions ou des dilutions dans l'eau, à. moins que 'le solvant on le diluant ne soit spécialement indiqué): E,.c.iii.ph <I>1:</I> (i.) _1 :
ï00 ciii'3 d'tin filtrat (le culture con tenant de la streptomycine (obtenu en fai sant proliférer le streptomvces griseus en culture submergée en milieux aqueux conte nant de la farine de soja, du dextrose et dit chlorure de sodium, en acidifiant la culture ensemencée et en la filtrant)
a@-ant un pou- voir antibiotique de ?5(i et -Lui )iii de 6,5 sont ajoutés 1? emS, d'une solution à '15 11/o de C4H9CFI(C'2[-15)(y'2FI4CF1(SOi@#ja )C_2IICI3(C2115 i'-. en agitant, et on continue à. agiter pendant une demi-heure.
L'huile qui se sépare est titi complexe de nature saline de streptomycine et de l'agent. de mouillae et contient envi- r, ron 94 % de l'activité du filtrat de culture. Le complexe de nature saline ainsi obtenu est dissous dans le méthanol, puis re- précipit.é encore une fois en ajoutant un vo lume égal d'eau:
on le redissont dans le mé- thanol à. 80 % et on le fait passer dans une colonne d'alumine, antérieurement lavée avec l'acide chlorlivdridne ,jusqu'à un pli de -1,
1. On reetieille le liquide effluent (environ 250 cni.3, v compris le méthanol de lavage), on ajoute un volume égal d'eau, on chasse le méthanol par distillation dans le vide, on éli mine le complexe de nature saline éventuelle ment. non décomposé, on règle le pH de la solution aqueuse restante 'a une valeur de 5,5 et on la sèche par congélation. On obtient environ 1,:
i5 g- de elilorhydrate de strepto- nivcine ayant un pouvoir de 320 unités/iul- (avec mi rendement d'environ 40 11!o).
Exemple <I>2:</I> Un ajoute<B>0,5</B> < , d'un ester partiel d'acide sulfurique d'un alcool aliphatique supérieur dans 20 eniS d'eau à .500 em@ d'un extrait contenant de la streptomycine impure ayant un pouvoir de 300 unit:
és/em3 et un pH de 6,5 (obtenu en traitant un filtrat de culture con tenant de la streptomvcineavec un, charbon de bois activé et en extra@ ant la strepto- ni.-cine du charbon de bois par l'acide chlor- 1ivdrique, sulfurique ou nitrique dilué), on agite la solution trouble pendant une heure et on sépare par filtration le précipité floculant formé.
Le complexe ainsi obtenu, de nature saline, de streptomycine et de l'agent de mouillage, contiens- environ 701/o de l'activité de l'extrait; on le transforme en un sel soluble dans l'eau de streptomycine, par exemple de la manière décrite dans l'exemple 4 ci-après.
<I>Exemple<B>à,:</B></I> <I>(1</I>) 7.6 d'une solution à 2:"> <B>14</B> de (_'-1H9CI-I ( ('22115 ) t "-I-l.@t'1-I (0@@; a ) ( @@lI@CII ( ( ' @IIS ) @, sont ajoutés en agitant, en une heure. à 7 litres d'un extrait contenant du nitrate de streptomycine ayant un pouvoir de 195 uni- tés/em3 et un pH de 7,0;
on laisse le précipité formé reposer pendant 1 à '? heures à 5 C environ et on le filtre. Le complexe de nature saline ainsi obtenu de streptomycine et de l'agent de mouillage contient. environ 93 % de l'activité de l'extrait.
b) On comprime, ou traite de toute auire manière pour éliminer l'eau entraînée, le co@n- plexe obtenu et on le dissout dans une quan tité de méthanol à 90-1001/o suffisante (sui vant la teneur en eau du complexe ainsi pai-- tiellenient déshydraté)
pour foi-nier une solu- tion dans 100 eni3 de méthanol à 90%; puis on fait passer la. solution dans une colonne de 2,5 X 2:5 cni de résine à éclianbe d'anion dont. le pli a été antérieurement réglé à une valeur de ',:5 par addition d'acide clilorlivdrique dilué.
On recueille le liquide effluent en deux portions de 125 e nia (v compris le méthanol de lavage) et on traite chaque portion en ajou tent un volume d'eau égal, en chassant le mé- tlianol par distillation dans le vide, en ré glazit le pli de la solution aqueuse restante à une valeur de<B>5,5</B> par un traitement avec une résine à échange d'anion neutre, en la filtrant et en la séchant par congélation.
On obtient, avec la, première et avec la seconde portion du liquide effluent respectivement environ 0,8 g de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 679 nrlltés/mg et environ 0,1. g d'un pouvoir d'environ 425 unités/mg, avec un rendement total d'environ 73,1%.
b) (variante) : Un complexe de nature sa line ainsi obtenu en partant d'une charge d'extrait d'une activité de<B>860000</B> unités (pe sant environ 4 g) est. dissous dans 150 eni3 de méthanol à 90%;
la solution est agitée avec 50 g d'une résine à échariT e d'anion, dont le pH a été antérieurement réglé par addition (l*aeide elilorhvdi-ique dilué.
Après filtration et séchage par congélation du filtrat, on ob tient environ 0,8\<B>-</B> de elilorhvdrate de streptoniveine d'un pouvoir d'environ 616 uni tés/mg et on peul, obtenir un supplément d'en viron 0,
14 g de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir de 635 unités/mg dans le métha- nol à 90 % de lavage de la. résine, avec un rendement total de 68 0/0.
Exemple <I>1:</I> 1,5 g d'un complexe de nature saline de streptomycine et d'un ester partiel. d'acide sulfurique d'un alcool aliphatique supérieur, obtenu par exemple de la manière décrite dais l'exemple 2 (dont la streptomycine a Une acti vité de 376 000 unités déterminée par un essai chimique) est dissous dans 25 cnis de métha nol, et on ajoute 25 em3 d'acétone.
Puis on ajoute 0,5 cm-3 d'acide chlorhydrique concen.. tré (jusqu'à un pH = environ 1,2) et ensuite 50 cms de plus d'acétone. On filtre le préci pité obtenu (chlorhydrate de streptomycine) et on le dissout dans l'eau.
On règle la valeur du pH de la solution à 6,8 par addition d'Une résine neutre à échange d'anion et on la sèche par congélation. On obtient ainsi environ 0,7 g de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 425 uni tés/mg (rendement, environ 79 0/0). Exei3Lp/f @: <B><U>'</U></B>80 em3 d'une solution à<B><U>'</U></B>5 /o d'un ester partiel d'acide sulfurique d'un alcool alipha tique supérieur sont ajoutés lentement à. une solution de 50 g de sulfate de :
streptomycine partiellement. purifiée dans ?4- litres d'eau distillée, d'un pouvoir de 1000 unités/em3: le précipité floculant blanc, qui s'est formé, est isolé par centrifugation et séché dans le vide (10 mm) à la température ambiante pen dant 13 heures. Le complexe de nature saline ainsi obtenu pesant environ 57 g a un pou voir d'environ 221 unités/mg.
En employant <B>310</B> cm-', d'unie solution clarifiée (traitée par le carbone) à 25 % de l'agent de mouillage C4H9CH(C2H5)C2H4CH(S04Na)C2H4CH(C2H5 )2, à titre de solution de l'agent de mouillage de l'exemple précédent, on obtient un complexe de nature saline d'un pouvoir d'environ 293 unités/mg avec un rendement d'environ 50 g.
Exeynple <I>6:</I> On ajoute, en agitant, 2,1 cm- d'une solu- tion à 25 % de C4H9CH(C2H5)C2H4CH(S04Na)C2H4CH(C'2H5 )2, à une solution de 0,5 g de sulfate de dihydro- streptomycine dans ?50 eni3 d'eau, ayant un pouvoir de 1210 unités/cm?,,
et on recueille par filtration le complexe de nature saline précipité (contenant plais de 83 % de l'acti- vité de la solution traitée).
En traitant de la même manière une solu tion aqueuse de chlorhydrate de streptothri- cine d'un pouvoir de 500 unités/mg, on obtient le complexe de nature saline correspondant de streptothricine. En transformant ces com plexes en sels solubles de dihy drostreptom @-- cine et de streptothricine respectivement, on obtient ces sels à l'état purifié.
Exemple <I>i</I> 60 g d'un complexe de streptomycine et de l'agent de mouillage obtenu de la manière dé crite dans le paragraphe a) de l'exemple 1, ayant un pouvoir de 243 unités/mg, sont dis sous dans 400 cms d'acétate de méthylamyle (acétate-2 de 4-méthylpentyle); on ajoute 40 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et on agite vigoureusement le mélange. Puis on ajoute 40 cm3 d'eau et on continue à. agiter pendant 10 minutes.
On recueille la couche aqueuse qui se forme en se séparant, on la neutralise avec Une résilie neutre à éclian-e d'anion et on la filtre. Le filtrat et le liquide de lavage d'un volume total d'environ 190 eni ont un pouvoir d'environ 65 000 unités/em3 (avec un rendement d'eilviron 85%). En lavant la couche d'acétate de métliylam@-le avec 60 em3 d'eau, en neutralisant le liquide de lavage et en filtrant,
on obtient un filtrat supplémentaire d'un pouvoir de 16 000 uni tés/cm3 (le rendement total étant d'environ 970/0). Le chlorhydrate de streptomycine so lide obtenu par séchage par congélation a Un pouvoir d'environ 575 unités/mg.
<I>Exemple 8:</I> 20 g d'un complexe de nature saline de streptomycine et de l'agent de mouillage ob tenu de la manière décrite dans le paragra phe a) de l'exemple 1 (la streptomycine de ce complexe ayant une activité de .12-10 000 uni tés) sont dissous dans 100 ems de méthanol. et on ajoute Lille hoitillie de 40 g d'une résine à échange d'anion dans 300 em3 d'eau, avec un pll de 6,5. Puis, tout en agitant, et mainte- tiant le mélange à une température de 50 à.
55 C, on '- ajoute de l'acide chlorhydrique concentré goutte à goutte dans des conditions de nature à maintenir le pl, à une valeur de 3,0 à 3,5. (On peut déterminer le moment où la décomposition est terminée en observant l'augmentation du précurseur de inaltol dan: la solution aqueuse).
Au bout d'une heure, pendant. laquelle on a ajouté environ 3,5 em3 d'acide chlorhydrique concentré, on laisse le pH atteindre une valeur de 5,0 à 5 ,5, on filtre la solution, on élimine le méthanol du filtrat par évaporation dans le vide et. on sèche par congélation la solution résiduelle en obtenant environ 6,5 g de chlorhydrate de strepto- inycine d'un pouvoir d'environ<B>578</B> unités/m2# avec un rendement d'environ 901/o. <I>Exemple 9:
</I> 15 g d'un complexe de nature saline de streptomycine et d'un agent de mouillage ob tenu de la manière décrite dans le paragra phe a) de l'exemple 1 (la streptomycine du complexe ayant une activité de 2 960 000 uni tés) sont dissous dans 1.00 cln3 de méthanol et on fait passer 1-ICI sec dans la solution, jusqu'à ce qu'il ne se forme plus de précipité. Puis on dilue le mélange avec 500 em3 d'acé tone, et le précipité est séparé par filtration et dissous dans 100 em3 d'eau.
On règle le pli de la solution à une valeur de 5,.5 par addition , d'une résine neutre à échange d'anion, on filtre la solution et on sèche le filtrat par congélation en obtenant environ -1,96 n de elilorliydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 38:î unités/nlg- avec un ren dement de 64,5 0/0.
Exemple <I>10:</I> n) 3785 litres d'un filtrat de culture conte nant (le la streptomycine d'un pouvoir de 100 unités /em3 et dont le pH a une valeur comprise entre 3 et -1 sont chauffés à<B>-')0, C</B> et neutralisés à. une valeur du pli de 7,5 0,:
.' par addition d'une solution de soude causti que à 1011/o (17,0 litres environ étant néces saires à. cet. effet.), et on traite la solution neutralisée avec 1.1.3,7 kg de charbon activé et 9,0 kg de matière filtrante. On agite la bouillie pendant une heure et on la filtre. On lave le tourteau de carbone avec au moins <B>3<U>3</U></B> 78 litres d'eau et on le sèche par un courant d'air.
950 litres du second extrait provenant d'une extraction antérieure, ainsi qu'il est dé crit ci-après, sont amenés à un volume de ''850 litres par addition de l'eau de ville. On ajoute le tourteau de carbone du paragraphe précédent, on maintient la bouillie à une tem pérature de 35 à 40 C en l'agitant. et on règle le pH de la suspension à une valeur de 2,2 0,2 par l'addition d'acide nitrique à. 10 0/0 (une quantité d'environ 6,39 kg étant nécessaire à cet effet). Après avoir agité pendant une heure, on élimine le carbone par filtration et séchage par un courant d'air et on recueille le filtrat (ou premier extrait).
On introduit le carbone ainsi extrait dans 950 litres d'eau fraîche de ville, en vue d'une seconde extraction, que l'on effectue de la ma nière décrite dans le paragraphe précédent cil ajoutant une faible quantité d'acide nitriqué à 10 0/0 (s'il y a lieu) pour régler de nouveau le pli à une valeur de 2,2 0,2. Le second extrait ainsi obtenu sert à la première extrac tion décrite dans le paragraphe précédent. Le rendement total fourni par le filtrat de cul ture est d'environ 82 /o.
On règle le pli du premier extrait à une valeur de 7,5 = 0,1 par addition d'une solu tion de soude caustique à 10% (15,9 litres étant nécessaires à cet effet), tout en mainte nant la température à. 10 C ou au-dessous. On ajoute 3,40 kg d'une matière filtrante et on filtre la bouillie.
On ajoute au filtrat inco lore (exempt de fer), à une température de 10 à 15 C, la moitié du volume total d'une solir- iion à 25 % de C411\)CH(C21-1.' C21I4CH (SO4Na.)C2H-ICH(C2H5)= nécessaire à la précipitation de la strepto mycine (cette quantité étant basée sur l'acti vité de l'extrait, déterminée par un essai chi mique en proportion de 1 cm3 par 92400 imités de streptomycine). Une fois cette por tion de l'agent de mouillage ajoutée, on com mence l'essai de la détermination de la fin de la précipitation.
(On filtre à cet effet un échantillon de la bouillie et on recueille envi ron 2 cm-3 du filtrat, puis on ajoute au filtrat une à deux gouttes d'acide phosphotungstique à 50 % qui forme un précipité, si la précipi- tation par l'agent. de mouillage est incom plète).
On ajoute alors -Lui complément. de la solution de l'agent de mouillage par portions d'un litre, jusqu'à ce que l'essai indique que la précipitation est terminée (environ 13,0 kg ou 22,8 litres d'une solution à 25 % de l'agent de mouillage étant nécessaires à cet effet). On agite la charge pendant -une demi-heure et on recueille la matière solide (qui est le com plexe de nature saline) par centrifugation.
Le rendement fourni par le filtrat de culture est d'environ 73,8 %, le rendement de la pré- cipitation étant d'environ 90 %.
b) Le complexe ainsi obtenu à l'état hydraté est dissous dans lé méthanol à 90 0/0, à une température de 20 à 25 C, en propor tion de 15 g pour 100 cms de solvant (plus de 22,7 litres de méthanol, étant nécessaires à cet effet); on filtre la solution, on ajoute lentement. au filtrat une quantité d'acide chlorhydrique concentrée suffisante pour dé composer le complexe de nature saline et abaisser le pH à une valeur de 0,8 0,1 (0,408 kg d'acide étant nécessaire à cet effet) ; et on verse le mélange dans 87,9 kg d'acétone et on le laisse reposer pendant une heure à une température de 5 à 10 C.
Le précipité (chlorhyrate de streptomycine) est filtré à l'état aussi sec que possible sur un filtre à. vide, puis est dissous dans l'eau avec une pro portion de 100 ems d'eau pour 10 g de com plexe de nature saline traité (22,7 litres d'eau environ étant nécessaires à. cet effet).
On neu tralise la solution en l'agitant avec environ 0,49 kg de résine neutre à échange d'anion, dont. le pH est. 6,5, pour régler le pH du ehlor- hydrate de streptoniyeine à une valeur com prise dans l'intervalle de 6,0 à 6,5, entre les limites duquel il est le plus stable.
On filtre le mélange ainsi obtenu; on distille le filtrat pour le débarrasser du méthanol et de l'acé tone sous une pression de 1<B>5</B> à.20 min et on le filtre, puis on.le sèche par congélation. .Le rendement en chlorhydrate de streptomycine ainsi fourni par le filtrat de culture est d'en- viron 51,
8 % et le rendement de la décom- position d'environ 70%.
La résine neutre à échange d'anion petit être préparée de la manière suivante : On intro duit 4,53 kg d'une résine à échange d'anion dans 37,85 litres d'eau de ville. On ajoute une quantité suffisante d'une solution de carbonate de sodium à. 1011/o pour régler le pH à une valeur de 10,5 - 0,2, et on lave la résine alcaline avec de l'eau distillée jusqu'à ce que le pH du milieu aqueux atteigne 6,:5. On conserve la résine neutre dans le milieu aqueux jusqu'à. ce qu'on s'en serve à la neu tralisation, c'est-à-dire qu'on la filtre dans le milieu aqueux un instant avant de s'en servir.
b) (variante) : 6,88 kg du complexe ale nature saline déshydraté sont. dissous dans le méthanol absolu à une température de 20 à 25 C en proportions de 20<B><U>-</U></B> du complexe pour 100 cm3 de méthanol. à 100% (34 litres au moins de méthanol. étant nécessaires à cet effet).
On filtre la solution; on ajoute au filtrat 20,63 kg d'une résine neutre à échange d'anion dont le pH est. 6,5 et on ajoute une quantité d'eau à la bouillie ainsi obtenue, suffisante pour abaisser la concentration du méthanol à. 9_51/o (102,2 litres d'eau environ étant nécessaires à. cet effet.).
La bouillie, dont le volume est d'environ 159 litres, est chauffée à une température de 50 à 55 C et est maintenue à cette température pendant qu'on y ajoute 1,89 litre d'acide chlorhydri que concentré dans des conditions de nature à, maintenir le pH du mélange à une valeur com prise entre 3,0 et 3,5. Puis on agite le mélange jusqu'à ce que le pH atteigne sa valeur maxi mum comprise entre 5,6 et. 6,2 (si le pH est inférieur à 6, on ajoute de faibles quantités de résine neutre à. échange d'anion jusqu'à ce que la valeur finale du 1i11 soit comprise entre 6 et 6,5).
Puis on filtre la bouillie et on lave la résine avec une quantité d'eau suffisante pour éliminer le chlorhydrate de strepto- inveine qui y adhère éventuellement; le filtrat et l'eau de lavage combinés, dont le volume est d'environ<B>179,8</B> litres et le pouvoir d'eji- viron 6500 unités/em3, sont alors concentrés à un volume d'environ 11,3.5 litres et. on re cueille le chlorhydrate de streptomycine par séchage par congélation.
Le rendement. de la décomposition est de 60 à 80%.
Parmi les sels purs d'autres antibiotiques basiques du type de la streptomycine, autres que ïa streptoniveine A et la streptomycine B et qui peuvent être préparés suivant le procédé selon l'invention, on peut citer les sels de la. dihydrostreptomy cine A, de la dihydro- streptomycine B et de la streptothricine.
Les sels purs d'antibiotiques basiques du type de la streptomycine obtenus par le pro cédé suivant l'invention peuvent être purifiés encore eii appliquant. (le nouveau le même procédé de purification. De même, ils peuvent subir une purification préliminaire ou ulté rieure par d'autres procédés, en particulier par un (les procédés suivants:
1" On amène en contact intime une solution aqueuse de l'antibiotique avec un acide carboxylique sen sibleiiient insoluble dans l'eau et un solvant organique de l'acide carboxylique ne se iné- langeant sensiblement pas avec l'eau, on re cueille la phase du solvant organique et on transforme le complexe de nature saline ,1e l'antibiotique qu'elle contient en un sel solu ble dans l'eau de l'antibiotique. 2" On traite une solution aqueuse de l'antibiotique avec un sel soluble dans l'eau d'un acide carboxy lique sensiblement insoluble dans l'eau;
oii recueille le complexe précipité de l'ant.ibio- t.ique et de l'acide carboxylique et on le trans- forine en un sel soluble dans l'eau de l'ant.i- biot.ique. R On amène en contact. intime une solution aqueuse de l'antibiotique avec un agent de mouillage du type d'un acide inorga nique polybasique organiquement substitué et un solvant. organique des savons ne se mélan geant sensibieineiit pas avec l'eau:
on recueille la. phase chi solvant organique et oii trans forme le dérivé obtenu de l'antibiotique qu'elle contient en un sel soluble dans l'eau de l'anti biotique.
Process for the preparation of pure salts of antibiotics of a basic nature, in particular antibiotics of the streptomycin type. The invention relates to a process for the preparation of pure, water-soluble salts of antibiotics of a basic nature, in particular antibiotics of the streptomycin type, i.e. of the genus - consisting of streptomycin and basic antibiotic-acting compounds, which (like st. reptomyein) can form water soluble salts with acids, such as sulfuric acid, and water insoluble salts with organic reagents precipitating bases.
In 19-14, Schatz, Bugie and Waksman (Proe. Toc. Exp. Biol. Lied.
1944, 57, 2-1-1) have shown that a potent antibiotic called Streptomycin is formed during the growth of the organism Actinomyces Griseus (now called Streptomyces Griseus), and it has since been found that this antibiotic is extremely useful in therapy.
It was then discovered that several streptomycins are formed at the same time. The first streptomycin obtained in crystalline form, pure (in the state of Reineekate) and completely. characterized is now called Streptomycin A, and the second characterized streptomycin is now called Streptomycin B. In addition, there is evidence that other streptomycins are formed and / or may be formed at the same time by changing the conditions of the culture; throughout this discussion, each of these antibiotics and mixtures thereof will be referred to as streptomycin, unless otherwise specified.
Streptomycin and other antibiotics of a basic character have heretofore been purified by various methods all of which are complicated and / or ineffective (and therefore expensive). For example, a largely previously applied process involves, in principle, the following steps: 1 Treating a primary liquid containing streptomycin with activated charcoal which selectively absorbs streptomycin; 2 Streptomycin is extracted from charcoal with a water-soluble aqueous mineral acid, preferably with elevation. slightly the temperature (eg about 30 to 50 C);
3 the extract is treated with an acidic reagent for precipitating organic bases, preferably phosphotungstic acid, to form a complex of a saline nature, and 4 the complex is decomposed, for example with a mineral acid, to form a purified salt , soluble in water, streptomycin.
The primary liquid pressure should be understood as designating in particular: a) the culture liquid obtained by causing a microorganism capable of proliferating. providing a basic antibiotic, for example, Streptomyces " Greses, under conditions and in a culture medium suitable for the formation of streptomycin and separating solids from the medium;
(b) the culture liquid of improved <B> potency </B> obtained by acidification of the culture (for example by hydrochloric <B> or sulfuric acid), </B> the liquid being neutralized, and c) the liquid obtained by acid extraction of the solids separated from the culture, the liquid being neutralized. The present invention aims to. an improvement of this known purification process, by the choice of acidic reagents precipitating the particular bases which give much better results as regards the final purity of the antibiotics obtained than the reagents used until now. for this purpose.
(phosphotunbstic acid for example). The aim of the invention is. to carry out the purification of antibiotics of a basic nature, in particular streptomycin, in a simple, efficient and advantageous manner. It has been found that it is possible to use, as acidic base-precipitating reagents, surfactants (or wetting agents) of the type of organically substituted inorganic polF-basic acids, which react.
with antibiotics of a basic character by forming certain combinations or complexes of a saline nature which are sparingly soluble in water, and that these acidic surfactants advantageously replace the reagents hitherto used for this purpose, such as acid phos- photunbstique. The saline complexes of antibiotics, obtained with these surfactants, can be collected and transformed into soluble salts of antibiotics (the basic character.
The present invention relates to a process for preparing pure salts, soluble in water, of antibiotics of a basic character, in particular antibiotics of the type streptomyein, by reacting, in a solvent, an impure antibiotic of basic character or of an impure salt of such an antibiotic, with an acid reagent precipitating organic bases with the formation of a complex of the nature of its line of said antibiotic, and decomposition of this complex using an acid forming with the antibiotic released a water soluble salt thereof. antibiotic, in the purified state.
This process is characterized in that, as acid reagent forming said complex of saline nature, use is made of a surfactant of the type of polybasic inorganic acids substituted by at least one organic residue. The complex of saline nature thus formed is relatively insoluble in water and. can be collected by filtration, centrifugation or other suitable means when water is used as a solvent.
When the solvent is a solvent (such as methanol) in which the complex of saline nature is soluble, this complex is collected by removing the solvent. and purifying the residue, for example by washing with water, or adding a miscible, non-solvent for the complex (such as water). The solution from which one starts can be, for example, a primary liquid (culture liquid) containing streptomycin, or an aqueous solution of a partially purified streptomycin, such as the extract from which. it was previously questioned.
It is also possible to use a neutral or acidified culture liquid, that is to say a culture liquid whose pH is adjusted to a value of at ph s equal to 7.0 by adding a mineral acid. In this culture fluid, the antibiotic is. present, totally. or in part, in the form of the salt of the acid used. When this culture fluid is neutral or weakly acidic, part of the antibiotic is in the form of salt, but if this culture fluid is strongly acidic, all of the antibiotic is in the form of salt. .
The salt of the regenerated antibiotic is much purer than the antibiotic or the salt of the drug treated with alcohol and the recovery of antibiotic activity, achieved during treatment ( The purification is of a high order In the practical practice of the invention, it is possible to obtain really high yields of relatively pure streptomycin salts having (for example) an antibiotic power greater than approximately 400 units / ni.
Among the surfactants or wetting agents of the type, organically substituted polybasic inor-anic acids suitable for the following process.
the invention, one can quote those which are represented by the formula R-0-X-0-Y, in which R denotes the radical of a hydroxylated organic compound which does not substantially mix with water, -0- X-0- denotes the divalent acid radical of a water-soluble polybasic inorganic acid (for example titi sulfuric or phosphoric acid) and Y denotes the titi cation of the group formed by Hf- and the cations giving soluble salts in water with the ROYO- anion. Among these wetting agents, one can.
cite in particular those in which the polybasic inorganic acid is sulfuric acid, the acid being partially esterified with a higher aliphatic alcohol, that is to say the wetting agents of the group formed by aliphatic monoesters higher sulfuric acid, and. their water soluble salts.
Other suitable wetting agents of the organically substituted polybasic inorganic acid type are those from the group consisting of aromatic sulphonic acids. sulfonated oils, sulfonated fatty acid derivatives and their water soluble salts.
Among the partial higher alkyl esters of sulfuric acid which can be used in the implementation of the invention, there may be mentioned: the group of sodium salts of sulfates of synthetic higher aliphatic alcohols, such as C-1H9CH (C ' = H5) C "H-ICH (S04 Sa) C2H-ICH (C2H5) '=, C-IH') CH (C2H5) C22H-ICH (S04Na) C EI2CH (CI13) - ', and C4H9CH (C2115) CH2S04Na ,
and the group of sulfuric acid partial esters of higher aliphatic alcohols and their salts, such as octyl-sodium, oley-sodium, ethyl 1-sodium, stearyl-sodiuni and (the lauryl-sodiuni. Among the aromatic sulfonic acids, sulfonated oils and sulfonated higher fatty acid derivatives which can serve as surfactants,
we can mention sodium sulfonates of higher fatty acid esters and (amides, such as the sodium salt of sulfonated ethyl oleate (or other alkyl oleate), for example Ct7H33CONFIC2H4S03Na, sodium sulfonates ( petroleum hydrocarbons, salt (sodium of a polyalco. 0-benzine-sulphonic acid containing 10 carbon atoms, other aleoyl-iii,%,
Sodium I-sulfonates and. oil <Turkish red (i.e. sulphonated castor oil). Among the partial esters of phosphoric acids which can be used, one small. cite dieresyl phosphate, lecithine and a higher phosphorus alcohol represented by the formula (capryl)) iÇa5p602O. Among the soluble acids in water, there are strong enhancers, which can be used to transform the complex from saline nature to Soluble salt,
there may be mentioned sulfuric, hydrochloric, phosphoric, oxalic, citric, sulphainic and nitric acids.
To achieve maximum yield, the wetting agent should be. substantially in excess of that which is required to combine all of the antibiotic contained in the treated solution, the more advantageous proportion of the wetting agent depending on the concentration of the treated solution and the potency antibiotic. By using the.
stoichiometric amount of the wetting agent (relative to the antibiotic activity of the treated solution), a practically quantitative proportion of the antibiotic can be collected in the form of a natural salt complex; this is substantially pure and allows the anti-biotic to be collected more easily in the form of a water-soluble salt.
The wetting agent can be added to a solution of the antibiotic in solid state or as a solution, or the antibiotic and the wetting agent can. both be added in the solid state to water (or other solvent for the reagents).
The complex of saline nature of the anti-biotic and of the agent (the wetting can separate said solvent in various forms: pal, for example in the form of an oily substance. Waxy or gelatinous, or not to separate at all, but remain in the form of a suspension in the solvent (all these insoluble forms, to be considered as included hereinafter by the term precipitate).
Depending on its foiane, the precipitate is separated by filtration, centrifugation, treatment with. the aid of a filtration auxiliary followed by filtration by other ordinary means known to specialists.
The precipitation of the complex of saline nature depends on the concentration of the reagents and the value of the fold of the reaction medium, the precipitation being niaximuni when the concentration is high and the value of <B> pH </B> between approximately 5 and about 8 and, preferably, close to 7.
The transformation of the complex of saline nature into a water-soluble salt of the anti-biotic can be carried out, inter alia, by the following means: the complex is dissolved in a solvent (for example methanol), the mixture is treated. solution with a relatively strong, water-soluble acid, and the water-soluble salt thus formed from the antibiotic is collected, for example by adding an agent. miscible non-solvent for the water-soluble salt, such as acetone, or else the complex (in solution) is brought into contact.
intimate with an absorber (e.g. alumina), or anion exchange resin that has been previously treated with the relatively strong, water-soluble acid selected, and the water-soluble salt is collected thus formed antibiotic in the treated solution (eg by removing the solvent);
or else the complex of saline nature is dissolved in an organic solvent for the soaps which do not substantially mix with water (for example n-butanol or amyl alcohol obtained by fermentation and refining), it is brought into intimate contact! solution with a z <<-lueu @ e solution of a relatively strong acid, soluble in water, the aqueous phase is collected and dried (preferably <I> by </I> freezing,
that is to say qtt'or freezes it and it is \ souinet to him a deep vacuum to expel the water by sublimation j:
or else the complex dormouse is dissolved in a solvent in which the water-soluble salt which is desired to be obtained is insoluble (for example a mixture of methanol and acetone), the solution is treated with an aqueous solution of 'a relatively strong acid, soluble in water.
and collecting the salt, soluble in water, precipitated from the antibiotic; a solution of the saline eoniplex is well treated with an aqueous solution of a relatively strong acid, soluble in water, in the presence of an anion exchange resin, or with various other nio ,,
-ens making it possible to achieve intimate contact and (make the complex react with the relatively strong acid, soluble in water.
The invention is. illustrated by the following examples (all solutions or dilution referred to being solutions or dilutions in water, unless the solvent being diluted is specially indicated): E, .c.iii. ph <I> 1: </I> (i.) _1:
ï00 ciii'3 d'tin filtrate (the culture containing streptomycin (obtained by making streptomvces griseus proliferate in submerged culture in aqueous media containing soybean meal, dextrose and sodium chloride, by acidifying the seeded culture and filtering it)
a @ -ant an antibiotic power of? 5 (i and -He) iii of 6.5 are added 1? emS, of a 15 11% solution of C4H9CFI (C'2 [-15) (y'2FI4CF1 (SOi @ # ja) C_2IICI3 (C2115 i'-. with stirring, and stirring is continued for a period of half an hour.
The oil which separates is a complex of saline nature of streptomycin and the agent. of wetness and contains approximately 94% of the activity of the culture filtrate. The complex of saline nature thus obtained is dissolved in methanol, then precipitated again by adding an equal volume of water:
it is redissolved in methanol. 80% and is passed through an alumina column, previously washed with chlorlivdridne acid, to a fold of -1,
1. The effluent liquid is reetieille (approximately 250 cni. 3, including the washing methanol), an equal volume of water is added, the methanol is removed by vacuum distillation, the complex of possible saline nature is removed. is lying. undecomposed, the pH of the remaining aqueous solution is adjusted to a value of 5.5 and dried by freezing. We obtain approximately 1:
15 g of streptoevcin hydrofluoride having a potency of 320 units / µl (with a half yield of about 40%).
Example <I> 2: </I> Un adds <B> 0.5 </B> <, of a partial sulfuric acid ester of a higher aliphatic alcohol in 20 eniS of water at .500 em @ of an extract containing impure streptomycin having a power of 300 units:
es / em3 and a pH of 6.5 (obtained by treating a culture filtrate containing streptomycin with activated charcoal and extracting streptoni- cine from the charcoal with chloric acid. - 1ivdrique, sulfuric or nitric dilute), the cloudy solution is stirred for one hour and the flocculating precipitate formed is separated by filtration.
The complex thus obtained, of saline nature, of streptomycin and the wetting agent, contains approximately 701% of the activity of the extract; it is converted into a water-soluble salt of streptomycin, for example as described in Example 4 below.
<I>Example<B>à,:</B> </I> <I> (1 </I>) 7.6 of a solution to 2: "> <B> 14 </B> of (_ ' -1H9CI-I (('22115) t "-Il. @ T'1-I (0 @@; a) (@@ lI @ CII ((' @IIS) @, are added with stirring, over one hour. to 7 liters of an extract containing streptomycin nitrate having a potency of 195 units / em3 and a pH of 7.0;
the precipitate formed is left to stand for 1 to '? hours at about 5 C and filtered. The saline complex thus obtained of streptomycin and the wetting agent contains. about 93% of the activity of the extract.
b) The complex obtained is compressed, or treated in any way to remove the entrained water, and dissolved in a sufficient quantity of 90-1001% methanol (depending on the water content of the complex thus pai-- tiellenient dehydrated)
to faith-deny a solution in 100 eni3 of 90% methanol; then we pass it. solution in a 2.5 X 2 column: 5 cni of anion flash resin including. the fold has previously been adjusted to a value of: 5 by addition of dilute clilorlivdric acid.
The effluent liquid is collected in two portions of 125 e nia (including the washing methanol) and each portion is treated by adding an equal volume of water, removing the metlianol by vacuum distillation, in reglazit. the remaining aqueous solution folded to a value of <B> 5.5 </B> by treatment with a neutral anion exchange resin, filtering it and freeze drying it.
With the first and second portions of the effluent liquid are obtained, respectively, approximately 0.8 g of streptomycin hydrochloride with a power of approximately 679 nrlltés / mg and approximately 0.1. g of a potency of about 425 units / mg, with a total yield of about 73.1%.
b) (variant): A complex of nature sa line thus obtained starting from an extract charge with an activity of <B> 860,000 </B> units (weighing approximately 4 g) is. dissolved in 150 eni3 of 90% methanol;
the solution is stirred with 50 g of an anion scavenging resin, the pH of which has previously been adjusted by addition (dilute elilorhvdi-ic aeide.
After filtration and freezing drying of the filtrate, approximately 0.8 \ <B> - </B> of streptonivein elilorhvdrate with a potency of about 616 units / mg is obtained and additional around 0,
14 g of streptomycin hydrochloride with a potency of 635 units / mg in 90% methanol wash. resin, with a total yield of 68%.
Example <I> 1: </I> 1.5 g of a complex of saline nature of streptomycin and a partial ester. sulfuric acid from a higher aliphatic alcohol, obtained for example as described in Example 2 (of which streptomycin has an activity of 376,000 units determined by a chemical test) is dissolved in 25 cnis of methanol, and 25 em3 of acetone are added.
Then added 0.5 cm-3 of concentrated hydrochloric acid (up to a pH = about 1.2) and then 50 cms more acetone. The precipitate obtained (streptomycin hydrochloride) is filtered off and dissolved in water.
The pH value of the solution is adjusted to 6.8 by adding neutral anion exchange resin and freeze dried. In this way, approximately 0.7 g of streptomycin hydrochloride is obtained with a potency of approximately 425 units / mg (yield, approximately 79%). Exei3Lp / f @: <B><U>'</U> </B> 80 em3 of a solution at <B> <U> '</U> </B> 5 / o of a partial ester of sulfuric acid of a higher aliphatic alcohol are added slowly to. a solution of 50 g of sulphate of:
streptomycin partially. purified in? 4- liters of distilled water, with a capacity of 1000 units / em3: the white flocculant precipitate, which has formed, is isolated by centrifugation and dried in vacuum (10 mm) at room temperature pen from 1 p.m. The thus obtained salt complex weighing about 57 g has a power of about 221 units / mg.
Using <B> 310 </B> cm- ', a 25% clarified (carbon treated) solution of the wetting agent C4H9CH (C2H5) C2H4CH (S04Na) C2H4CH (C2H5) 2, as of solution of the wetting agent of the preceding example, a complex of saline nature with a potency of about 293 units / mg is obtained with a yield of about 50 g.
Example <I> 6: </I> 2.1 cm- of a 25% solution of C4H9CH (C2H5) C2H4CH (S04Na) C2H4CH (C'2H5) 2 are added with stirring to a solution of 0.5 g of dihydro-streptomycin sulphate in? 50 eni3 of water, having a potency of 1210 units / cm? ,,
and the precipitated salt complex (containing 83% of the activity of the treated solution) was collected by filtration.
By treating in the same manner an aqueous solution of streptothricin hydrochloride with a potency of 500 units / mg, the corresponding salt complex of streptothricin is obtained. By converting these complexes into soluble salts of dihydrostreptom® - cine and streptothricin respectively, these salts are obtained in a purified state.
Example <I> i </I> 60 g of a complex of streptomycin and the wetting agent obtained as described in paragraph a) of Example 1, having a potency of 243 units / mg, are said in 400 cms of methylamyl acetate (2-acetate of 4-methylpentyl); 40 cm3 of concentrated hydrochloric acid are added and the mixture is stirred vigorously. Then 40 cm3 of water are added and the process continues. stir for 10 minutes.
The aqueous layer which forms on separation is collected, neutralized with a neutral anion-flashing terminus and filtered. The filtrate and washing liquid with a total volume of about 190 eni have a potency of about 65,000 units / em3 (with a yield of about 85%). By washing the layer of methyl acetate with 60 em3 of water, neutralizing the washing liquid and filtering,
an additional filtrate is obtained with a capacity of 16,000 units / cm3 (the total yield being about 970%). The solid streptomycin hydrochloride obtained by freeze drying has a potency of about 575 units / mg.
<I> Example 8: </I> 20 g of a complex of saline nature of streptomycin and the wetting agent obtained as described in paragraph a) of Example 1 (streptomycin from this complex having an activity of .12-10,000 units) are dissolved in 100 ems of methanol. and Lille hoitillie 40 g of an anion exchange resin in 300 em3 of water is added, with a pll of 6.5. Then, while stirring, and maintaining the mixture at a temperature of 50 to.
55 ° C., concentrated hydrochloric acid is added dropwise under conditions such as to maintain the pl at a value of 3.0 to 3.5. (The point at which decomposition is complete can be determined by observing the increase in the precursor of inaltol in the aqueous solution).
After an hour, during. which was added about 3.5 em3 of concentrated hydrochloric acid, the pH is allowed to reach a value of 5.0 to 5.5, the solution is filtered, the methanol is removed from the filtrate by evaporation in vacuo and. the residual solution was dried by freezing, obtaining approximately 6.5 g of streptoinycin hydrochloride with a potency of approximately <B> 578 </B> units / m2 # with a yield of approximately 901 / o. <I> Example 9:
</I> 15 g of a complex of saline nature of streptomycin and a wetting agent obtained as described in paragraph a) of Example 1 (the streptomycin of the complex having an activity of 2960 000 units) are dissolved in 1.00 cln3 of methanol and dry 1-ICI is passed through the solution, until no more precipitate forms. Then the mixture is diluted with 500 em3 of acetone, and the precipitate is filtered off and dissolved in 100 em3 of water.
The fold of the solution is adjusted to a value of 5.5 by the addition of a neutral anion exchange resin, the solution is filtered and the filtrate is dried by freezing, obtaining about -1.96 n of elilorliydrate. of streptomycin with a potency of about 38: 1 units / nlg- with a yield of 64.5%.
Example <I> 10: </I> n) 3785 liters of a culture filtrate containing (streptomycin with a power of 100 units / em3 and whose pH has a value between 3 and -1 are heated at <B> - ') 0, C </B> and neutralized at. a fold value of 7.5 0 ,:
. ' by adding a 1011 / o caustic soda solution (approximately 17.0 liters being necessary for this.), and the neutralized solution is treated with 1.1.3.7 kg of activated carbon and 9, 0 kg of filter material. The slurry is stirred for one hour and filtered. The carbon cake is washed with at least <B>3<U>3</U> </B> 78 liters of water and dried by a current of air.
950 liters of the second extract from a previous extraction, as described below, are brought to a volume of '' 850 liters by addition of tap water. The carbon cake from the previous paragraph is added, the slurry is maintained at a temperature of 35 to 40 ° C. while stirring. and the pH of the suspension is adjusted to a value of 2.2 0.2 by the addition of nitric acid to. 10% (an amount of about 6.39 kg being required for this purpose). After stirring for one hour, the carbon is removed by filtration and drying with a stream of air and the filtrate (or first extract) is collected.
The carbon thus extracted is introduced into 950 liters of fresh tap water, with a view to a second extraction, which is carried out in the manner described in the preceding paragraph, adding a small amount of nitric acid to 10 0 / 0 (if applicable) to reset the fold to a value of 2.2 0.2. The second extract thus obtained is used for the first extraction described in the previous paragraph. The total yield from the culture filtrate is about 82%.
The fold of the first extract is adjusted to a value of 7.5 = 0.1 by adding a 10% caustic soda solution (15.9 liters being necessary for this purpose), while maintaining the temperature at . 10 C or below. 3.40 kg of filter material is added and the slurry is filtered.
To the colorless (iron-free) filtrate is added at a temperature of 10 to 15 ° C, half the total volume of a 25% solution of C411) CH (C21-1. C21I4CH (SO4Na. ) C2H-ICH (C2H5) = necessary for the precipitation of streptomycin (this quantity being based on the activity of the extract, determined by a chemical test in proportion of 1 cm3 per 92,400 imitated of streptomycin). Once this portion of the wetting agent has been added, the test for the determination of the end of precipitation is started.
(A sample of the slurry is filtered for this purpose and about 2 cm-3 of the filtrate is collected, then one to two drops of 50% phosphotungstic acid is added to the filtrate which forms a precipitate, if the precipitation by the wetting agent is incomplete).
We then add -He complement. of the wetting agent solution in one-liter portions, until the test indicates that precipitation is complete (approximately 13.0 kg or 22.8 liters of a 25% solution of l (wetting agent being necessary for this). The charge is stirred for half an hour and the solid material (which is the complex of saline nature) is collected by centrifugation.
The yield from the culture filtrate is about 73.8%, the yield from the precipitation being about 90%.
b) The complex thus obtained in the hydrated state is dissolved in 90% methanol, at a temperature of 20 to 25 ° C., in a proportion of 15 g per 100 cms of solvent (more than 22.7 liters of methanol, being necessary for this purpose); the solution is filtered and added slowly. in the filtrate a quantity of concentrated hydrochloric acid sufficient to decompose the complex of saline nature and lower the pH to a value of 0.8 0.1 (0.408 kg of acid being necessary for this purpose); and the mixture is poured into 87.9 kg of acetone and allowed to stand for one hour at a temperature of 5-10 C.
The precipitate (streptomycin chlorhyrate) is filtered as dry as possible on a filter. empty, then dissolved in water with a pro portion of 100 ems of water for 10 g of complex of saline nature treated (approximately 22.7 liters of water being necessary for this purpose).
The solution is neutralized by stirring it with about 0.49 kg of neutral anion exchange resin, including. the pH is. 6.5, to adjust the pH of streptonylyein hydrochloride to a value in the range of 6.0 to 6.5, between the limits of which it is most stable.
The mixture thus obtained is filtered; the filtrate is distilled to free it from methanol and acetone under a pressure of 1 <B> 5 </B> at 20 min and filtered, then dried by freezing. The yield of streptomycin hydrochloride thus supplied by the culture filtrate is about 51%.
8% and the decomposition yield of about 70%.
The neutral anion exchange resin can be prepared as follows: 4.53 kg of an anion exchange resin are introduced into 37.85 liters of tap water. A sufficient amount of sodium carbonate solution is added to. 1011 / o to adjust the pH to a value of 10.5 - 0.2, and the alkaline resin is washed with distilled water until the pH of the aqueous medium reaches 6,: 5. The neutral resin is stored in the aqueous medium until. that it is used for neutralization, that is to say that it is filtered in the aqueous medium for a moment before using it.
b) (variant): 6.88 kg of the dehydrated natural salt ale complex are. dissolved in absolute methanol at a temperature of 20 to 25 C in proportions of 20 <B> <U> - </U> </B> of the complex per 100 cm3 of methanol. at 100% (at least 34 liters of methanol. being necessary for this purpose).
The solution is filtered; 20.63 kg of a neutral anion exchange resin, the pH of which is. 6.5 and an amount of water is added to the slurry thus obtained, sufficient to lower the concentration of methanol to. 9_51 / o (approximately 102.2 liters of water being required for this purpose.).
The slurry, the volume of which is about 159 liters, is heated to a temperature of 50-55 C and is maintained at this temperature while adding 1.89 liters of hydrochloric acid that concentrated under such conditions under natural conditions. à, maintain the pH of the mixture at a value between 3.0 and 3.5. Then the mixture is stirred until the pH reaches its maximum value of between 5.6 and. 6.2 (if the pH is less than 6, small amounts of neutral anion exchange resin are added until the final value of 1111 is between 6 and 6.5).
The slurry is then filtered and the resin washed with a sufficient quantity of water to remove the streptoinvein hydrochloride which may adhere thereto; the combined filtrate and washing water, the volume of which is about <B> 179.8 </B> liters and the power of eji- about 6500 units / em3, are then concentrated to a volume of about 11,3.5 liters and. the streptomycin hydrochloride is collected by freeze drying.
The yield. of the decomposition is 60 to 80%.
Among the pure salts of other basic antibiotics of the streptomycin type, other than streptonivein A and streptomycin B and which can be prepared according to the process according to the invention, there may be mentioned the salts of the. dihydrostreptomy cin A, dihydro-streptomycin B and streptothricin.
The pure salts of basic antibiotics of the streptomycin type obtained by the process according to the invention can be further purified by applying. (the new the same purification process. Likewise, they can undergo a preliminary or subsequent purification by other methods, in particular by a (the following methods:
1. An aqueous solution of the antibiotic is brought into intimate contact with a sensitive water-insoluble carboxylic acid and an organic solvent for the carboxylic acid which does not substantially mix with water, the residue is collected. phase of the organic solvent and the complex of saline nature, the antibiotic it contains is converted into a water soluble salt of the antibiotic. 2 "An aqueous solution of the antibiotic is treated with a soluble salt. in water of a substantially water-insoluble carboxylic acid;
where the precipitated complex of the antibiotic and the carboxylic acid is collected and converted to a water soluble salt of the antibiotic. R We bring in contact. intimate an aqueous solution of the antibiotic with an organically substituted polybasic inorganic acid type wetting agent and a solvent. organic soaps that do not mix sensitively with water:
we collect it. chi phase organic solvent and oii trans forms the derivative obtained from the antibiotic which it contains in a water soluble salt of the antibiotic.