CH285944A - Process for preparing pure salts of antibiotics of a basic character, in particular antibiotics of the streptomycin type. - Google Patents

Process for preparing pure salts of antibiotics of a basic character, in particular antibiotics of the streptomycin type.

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CH285944A
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Sons E R Squibb
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Squibb & Sons Inc
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07H15/00Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20Carbocyclic rings
    • C07H15/22Cyclohexane rings, substituted by nitrogen atoms
    • C07H15/238Cyclohexane rings substituted by two guanidine radicals, e.g. streptomycins

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Description

  

  Procédé de préparation de sels purs d'antibiotiques de caractère basique,  notamment d'antibiotiques du type de la streptomycine.         L'invention    concerne un procédé de prépa  ration de sels purs, solubles dans     l'eau,    d'anti  biotiques de caractère basique, notamment  d'antibiotiques du type de la     streptomycine,     c'est-à-dire du genre - se composant de la       streptomycine    et de composés basiques à ac  tion antibiotique, qui (comme la     st.repto-          myeine)    peuvent former des sels solubles dans  l'eau avec des acides, tels que l'acide sulfuri  que, et des sels insolubles dans l'eau avec des  réactifs organiques précipitant les bases.  



  En     19-14,        Schatz,        Bugie    et     Waksman        (Proe.     toc.     Exp.        Biol.    lied.

       1944,    57,     2-1-1)    ont mon  tré qu'un antibiotique puissant appelé      Strepto-          mycine     se forme au cours de la croissance de  l'organisme       Actinomyces        Griseus     (appelé       maintenant.     Streptomyces     Griseus ),    et on a  constaté depuis que cet antibiotique est     extré-          wement    utile en thérapeutique.  



  On a découvert, ensuite, que plusieurs   streptomycines  se forment en même temps.  La première     streptomycine    obtenue sous forme  cristallisée, pure (à l'état de     reineekate)    et       complètement.    caractérisée est appelée mainte  nant  Streptomycine A , et la seconde strepto  mycine caractérisée est appelée maintenant   Streptomycine B . De plus, on possède des  indications d'après lesquelles d'autres strepto  mycines se forment et/ou peuvent se former  en même temps en changeant les conditions  de la     culture;    au cours du présent exposé,  chacun de ces antibiotiques et leurs mélanges    seront dénommés  streptomycine , à moins  d'indications contraires.  



  La streptomycine et d'autres antibiotiques  de caractère basique ont été purifiés jusqu'à  présent par divers procédés tous compliqués  et/ou inefficaces (et, par conséquent, coû  teux). Par exemple, un procédé appliqué dans  une large mesure antérieurement comporte, en  principe, les opérations suivantes: 1  On traite  un liquide primaire contenant la strepto  mycine avec du charbon de bois activé qui  absorbe sélectivement la streptomycine; 2  on  extrait la streptomycine du charbon de bois  par un acide minéral aqueux soluble dans  l'eau, de préférence en élevant.     légèrement    la  température (par exemple à environ 30 à       50     C);

   3  on traite l'extrait avec un réactif  acide de précipitation des bases organiques,  de préférence l'acide     phosphotungstique,    pour  former un complexe de nature saline, et 4  on       décompose    le complexe, par exemple avec un  acide minéral, pour former un sel purifié, so  luble dans l'eau, de la streptomycine.

   L'ex  pression  liquide primaire  doit être entendue  comme désignant en particulier: a) le liquide  de culture obtenu en faisant proliférer un  micro-organisme apte à. fournir un antibiotique  basique, par exemple le      Streptomyces    "     Gri-          seus ,    dans des conditions et dans un milieu  de culture convenant. à. la formation de la  streptomycine et en séparant les matières so  lides du milieu;

       b)    le liquide de culture de      <B>pouvoir</B> amélioré, obtenu par acidification de  la culture (par exemple par l'acide     chlor-          hydrique   <B>ou sulfurique),</B> le liquide étant neu  tralisé, et c) le liquide obtenu par extraction  par un acide des matières solides séparées de  la culture, le liquide étant neutralisé.    La présente invention vise à. un     perfee-          tionnement    de ce procédé de purification  connu, par le choix de réactifs acides préci  pitant les bases     particuliers    qui donnent de  bien meilleurs résultats en ce qui concerne la  pureté finale des antibiotiques obtenus que les  réactifs utilisés jusqu'à présent. dans ce but.

    (acide     phosphotunbstique    par exemple). L'in  vention a pour but. de réaliser de façon simple,  efficace et avantageuse la purification des  antibiotiques de caractère basique, notamment  de la, streptomycine.    Il a été découvert que l'on peut, utiliser,  comme réactifs acides précipitant les bases,  des agents tensioactifs (ou agents de mouil  lage) du type des acides inorganiques     polF-          basiques        organiquement    substitués, qui réagis  sent.

   avec des antibiotiques de caractère basi  que en formant certaines combinaisons ou com  plexes de nature saline peu solubles dans l'eau,  et que ces agents tensioactifs acides rempla  cent avantageusement les réactifs utilisés jus  qu'à présent dans ce but, tels que l'acide     phos-          photunbstique.    Les complexes de nature saline  des antibiotiques, obtenus avec ces     agents     tensioactifs, peuvent être recueillis et trans  formés en sels solubles des antibiotiques (le  caractère basique.  



  La présente invention concerne un procédé  de préparation de sels purs, solubles dans  l'eau, d'antibiotiques de caractère basique, no  tamment d'antibiotiques du type de la     strepto-          myeine,    par réaction,     dans    un solvant, d'un  antibiotique impur de caractère basique ou  d'un sel impur d'un tel antibiotique, avec un  réactif acide précipitant les bases organiques  avec formation     d'un    complexe de nature sa  line dudit antibiotique, et décomposition de ce  complexe à l'aide d'un acide formant avec  l'antibiotique libéré un sel soluble dans ]'eau  de cet. antibiotique, à l'état purifié.

      Ce procédé est caractérisé en ce     qu'on    uti  lise, comme réactif acide formant ledit com  plexe de     nature        saline,    lin     agent        tensioactif     du type des acides inorganiques     polybasiques     substitués par au moins un reste     organique.     Le complexe de nature saline ainsi formé  est relativement insoluble dans l'eau et. peut  être recueilli par filtration, centrifugation ou  autre moyen approprié lorsque l'eau sert de  solvant.

   Lorsque le solvant est     -Lui    solvant (tel  que le méthanol) dans lequel le complexe de  nature saline est soluble, on recueille ce com  plexe en éliminant le solvant. et en purifiant  le résidu, par exemple par lavage avec de  l'eau, ou en ajoutant un agent miscible, non  solvant du complexe (tel que l'eau). La solu  tion dont on part     peut    être par exemple lui  liquide primaire (liquide de culture) conte  nant de la streptomycine, ou une solution  aqueuse d'une streptomycine partiellement pu  rifiée, telle que l'extrait dont. il a été ques  tion précédemment.

   On peut aussi utiliser un  liquide de culture neutre ou acidifié,     c'est-          à-dire    un liquide de culture dont le     pH    est  ajusté à une valeur d'au     ph    s égale à 7,0  par adjonction d'un acide minéral. Dans ce  liquide de culture,     l'antibiotique    est. présent,  totalement. ou en partie, sous forme du sel de  l'acide utilisé. Lorsque ce liquide de     culture     est neutre ou faiblement acide, une partie de  l'antibiotique s'y trouve sous forme de sel,  mais si ce liquide de culture est fortement  acide, la totalité de l'antibiotique     s'y    trouve  sous forme de sel.  



  Le sel de l'antibiotique régénéré est, beau  coup plus pur que l'antibiotique ou le sel de  l'antibiotique traité à     l'oi-i\;ine    et la récupéra  tion de l'activité antibiotique, réalisée au  cours du traitement (le purification, est d'un  ordre élevé. Dans la mise en     oeuvre    pratique  de l'invention, il est. possible d'obtenir     ré.-u-          lièrement    des rendements élevés en sels de la  streptomycine relativement purs, possédant  (par exemple) un pouvoir antibiotique supé  rieur à 400     unités/ni-    environ.  



  Parmi les agents     tensioactifs    ou  agent  de     mouillage     du type des acides     inor-ani-          ques        polybasiques,        organiquement    substitués,      convenant au procédé suivant.

   l'invention, on  petit citer ceux qui sont représentés par la  formule     R-0-X-0-Y,    dans laquelle R dé  signe le     radical    d'un composé organique       hydroxylé    ne se mélangeant sensiblement pas  avec l'eau, -0-X-0- désigne le radical  acide divalent d'un acide inorganique     poly-          basique    soluble dans l'eau (par exemple     titi     acide sulfurique ou phosphorique) et Y dési  gne     titi    cation du groupe formé par     H-f-    et les  cations donnant des sels solubles dans l'eau  avec l'anion     R-O-Y-O-.    Parmi ces  agents de mouillage, on peut.

   citer particu  lièrement ceux dans lesquels l'acide inorga  nique     polybasique    est l'acide sulfurique,  l'acide étant partiellement estérifié avec un    alcool aliphatique supérieur, c'est-à-dire les  agents de mouillage du groupe formé par les       mono-esters    aliphatiques     supérieurs    d'acide       sulfurique,    et. leurs sels solubles dans l'eau.  



  D'autres agents de mouillage utilisables du  type des acides inorganiques     polybasiques        or-          ganiquement    substitués sont ceux du groupe       formé    par les acides     sul.foniques        aromatiques.     les huiles sulfonées, les dérivés d'acides gras su  périeurs     sulfonés    et leurs sels solubles dans l'eau.  



  Parmi les     alcoyl-esters        supérieurs    partiels  d'acide sulfurique pouvant être utilisés     daiLs     la mise en     aeuvre    de l'invention, on petit citer:  le groupe des sels de sodium des sulfates des  alcools aliphatiques supérieurs synthétiques,  tels que         C-1H9CH(C'=H5)C"H-ICH(S04    Sa)     C2H-ICH(C2H5)'=,          C-IH')CH        (C2H5)        C22H-ICH        (S04Na)    C     EI2CH        (CI13        )-',     et     C4H9CH(C2115)CH2S04Na,

         et le groupe des esters partiels d'acide sulfu  rique des alcools aliphatiques supérieurs et leurs  sels, tels que les sulfates     d'octyl-sodium,        d'oléy        1-          sodium,    de e     éty        1-sodium,    de     stéaryl-sodiuni    et  (le     lauryl-sodiuni.    Parmi les acides     sulfoniques     aromatiques, les huiles sulfonées et les dérivés  d'acides gras supérieurs     sulfonés    qui peuvent  servir comme agents     tensioactifs,

      on petit  citer les     sulfonates    de sodium des esters  d'acides     gras    supérieurs et (les amides, tels  que le sel de sodium     d'oléate    d'éthyle sulfoné  (ou autre     oléate        d'alcoyle),    par exemple       Ct7H33CONFIC2H4S03Na,    les     sulfonates    de       sodium    (les     hydrocarbures    de pétrole, le sel       (le        sodium    d'un acide     polyalco.0-benzi'lne-sul-          fonique    contenant 10 atomes de carbone, d'au  tres     aleoyl-iii,%,

  I-sulfonates    de sodium et. l'huile   < le rouge turc (c'est-à-dire l'huile de ricin sul  fonée). Parmi les esters partiels des acides  phosphoriques qui peuvent être utilisés, on  petit. citer le phosphate     dierésylique,    la léci  thine et un alcool supérieur phosphoré repré  senté     par    la formule     (capryle)         )        iÇa5p602O.       Parmi les acides solubles dans l'eau,     reha-          tiveiiient        forts,    qui peuvent servir à transfor  nier le complexe de nature saline     eir    sel     Soluble,

       on peut citer les acides     sulfurique,    chlor-    hydrique, phosphorique, oxalique,     citrique,          sulfainique    et nitrique.  



  Pour réaliser un rendement maximum, il  convient que l'agent de mouillage soit. sensi  blement en excès par rapport à la quantité  qui est nécessaire pour combiner la totalité  de l'antibiotique contenu dans la solution  traitée, la proportion la plus avantageuse de  l'agent de mouillage dépendant par suite de  la concentration de la solution traitée et du       pouvoir    de l'antibiotique. En employant la.

    quantité stoechiométrique de l'agent de mouil  lage (par rapport à l'activité antibiotique de  la solution traitée), on peut     recueillir        utie     proportion     pratiquement    quantitative de  l'antibiotique sous forme de complexe de na  ture saline; celui-ci est sensiblement pur et  permet de recueillir plus facilement l'anti  biotique sous forme de sel soluble dans l'eau.  



       L'agent    de mouillage peut être ajouté à       une    solution de l'antibiotique à l'état solide  ou sous forme de solution, ou     encore        l'anti-          biot.ique    et l'agent de mouillage peuvent. être       toits    deux ajoutés à l'état solide à de l'eau  (ou autre solvant des réactifs).  



  Le complexe de nature saline de l'anti  biotique et de l'agent (le mouillage peut se  séparer dit solvant sous     diverses    formes:     pal,         exemple     sorts    forme de substance     huileuse.     cireuse ou gélatineuse, ou ne pas se séparer  du tout, mais rester à l'état. de suspension  clans le solvant (toutes ces formes insoluble,  devant être considérées     eontme    englobées ci  après par le terme  précipité ).

   Suivant sa       foiane,    on sépare le précipité par     filtration,     centrifugation,     traitement    à. l'aide d'un auxi  liaire de filtration suivi d'une filtration     oa     par d'autres     moyens    ordinaires connus des  spécialistes.  



  La précipitation du complexe de     nature     saline dépend de la concentration des réac  tifs et de la valeur du     pli    du milieu de la  réaction, la précipitation étant     niaximuni     lorsque la concentration est forte et la     valeur     du<B>pH</B> comprise entre environ 5 et environ 8  et, de préférence, voisine de 7.  



  La transformation du complexe de nature  saline en un sel soluble dans l'eau de l'anti  biotique peut s'effectuer, entre     autres,    par les  moyens suivants: on dissout le complexe dans       tin    solvant     (par    exemple le méthanol), on  traite la solution avec un acide relativement  fort, soluble dans l'eau, et on recueille le sel  soluble dans l'eau ainsi     foriiié    de l'antibioti  que, par exemple en ajoutant un agent. misci  ble non solvant du sel soluble dans l'eau, tel  que l'acétone, ou bien on amène le complexe  (en solution) en contact.

   intime avec un absor  bant (par exemple     l'alumine),    ou une résine  à échange d'anion ayant été antérieurement  traitée avec l'acide relativement fort, soluble  dans l'eau, choisi, et on recueille le sel soluble  dans l'eau ainsi formé de     l'antibiotique    dans  la solution traitée (par exemple en éliminant  le solvant) ;

   ou bien on dissout le complexe de  nature saline dans un solvant     organique    des  savons ne se mélangeant sensiblement pas  avec l'eau (par exemple le     n-butanol    ou    l'alcool     amylique    obtenu par fermentation et  raffinage), on amène en contact     intime    le!  solution avec     une        solution        z <  < -lueu@e        d'un    acide  relativement fort, soluble     dans        l'eau,    on re  cueille la phase     aqueuse    et     on    la dessèche (de  préférence<I>par</I>     congélation,

          c'est-à-dire        qtt'ou     la congèle et on     la\souinet    à     lui        vide        poussé          pour        chasser    l'eau par     sublimation        j    :

   ou bien  on     dissout    le     complexe        loirs        tui        solvant    dans  lequel le sel soluble     dans        l'eau        qu'on    désire  obtenir est insoluble (par     exemple    un n     ié-          lange    de méthanol et d'acétone), on traite la  solution avec une solution     aqueuse        d'un    acide  relativement     fort,    soluble dans l'eau.

   et on re  cueille le sel, soluble     clans        l'eau,    précipité de       l'antibiotique;    on bien on traite une     solution     du     eoniplexe    de nature saline avec une solu  tion aqueuse d'un acide     relativement    fort,  soluble     dans    l'eau, en présence d'une résine à       échange    d'anion, ou par     divers    autres     nio,,

  -ens     permettant de réaliser lin contact intime et (le       faire    réagir le     complexe        av        ee    l'acide relative  ment fort, soluble clans l'eau.  



  L'invention est. illustrée par les exemples  suivants (toutes les solutions on dilution  dont. il est question étant des solutions ou des  dilutions     dans    l'eau, à. moins     que    'le solvant on  le diluant ne soit spécialement     indiqué):          E,.c.iii.ph   <I>1:</I>       (i.)        _1        :

  ï00        ciii'3        d'tin    filtrat (le     culture    con  tenant de la     streptomycine        (obtenu    en fai  sant proliférer le     streptomvces        griseus    en  culture submergée en     milieux        aqueux    conte  nant de la farine de soja, du dextrose et dit  chlorure de sodium, en acidifiant la culture  ensemencée et en la filtrant)

       a@-ant    un     pou-          voir        antibiotique        de        ?5(i     et     -Lui        )iii     de 6,5 sont ajoutés 1?     emS,    d'une solution à       '15        11/o    de         C4H9CFI(C'2[-15)(y'2FI4CF1(SOi@#ja        )C_2IICI3(C2115        i'-.       en agitant, et on continue à. agiter pendant  une demi-heure.

   L'huile qui se sépare est     titi     complexe de nature saline de streptomycine  et de l'agent. de mouillae et contient     envi-          r,          ron    94 % de l'activité du filtrat de     culture.     Le complexe de nature saline ainsi    obtenu est dissous dans le méthanol, puis     re-          précipit.é    encore une fois en ajoutant un vo  lume égal d'eau:

   on le     redissont    dans le     mé-          thanol        à.        80        %        et        on        le        fait        passer        dans        une     colonne d'alumine,     antérieurement    lavée avec  l'acide     chlorlivdridne        ,jusqu'à    un     pli    de     -1,

  1.         On     reetieille    le liquide effluent (environ  250     cni.3,    v compris le méthanol de lavage),  on ajoute un volume égal d'eau, on chasse le  méthanol par distillation dans le vide, on éli  mine le     complexe    de nature saline éventuelle  ment. non décomposé, on règle le pH de la  solution aqueuse restante 'a une valeur de 5,5  et on la sèche par     congélation.    On obtient       environ        1,:

  i5        g-    de     elilorhydrate    de     strepto-          nivcine    ayant un pouvoir de     320        unités/iul-          (avec        mi    rendement d'environ 40     11!o).     



       Exemple   <I>2:</I>  Un ajoute<B>0,5</B>      < ,    d'un ester partiel d'acide       sulfurique        d'un    alcool aliphatique     supérieur     dans     20        eniS    d'eau à     .500        em@    d'un extrait         contenant    de la streptomycine impure ayant  un pouvoir de 300     unit:

  és/em3    et un pH de 6,5  (obtenu en traitant un filtrat de culture con  tenant de la     streptomvcineavec    un,     charbon     de bois     activé    et en     extra@ ant    la     strepto-          ni.-cine    du charbon de bois par     l'acide        chlor-          1ivdrique,    sulfurique ou nitrique dilué), on  agite la solution trouble pendant une heure et  on sépare par filtration le précipité     floculant     formé.

   Le     complexe    ainsi obtenu, de nature  saline, de streptomycine et de l'agent de       mouillage,    contiens- environ     701/o    de l'activité  de l'extrait; on le transforme en un sel soluble  dans l'eau de     streptomycine,    par exemple de  la manière décrite dans l'exemple 4 ci-après.

      <I>Exemple<B>à,:</B></I>  <I>(1</I>) 7.6     d'une    solution à     2:">   <B>14</B> de       (_'-1H9CI-I    (     ('22115    ) t     "-I-l.@t'1-I        (0@@;    a ) (     @@lI@CII    (     (    '     @IIS    )     @,       sont ajoutés en agitant, en une heure. à  7 litres d'un     extrait    contenant du nitrate de  streptomycine     ayant    un pouvoir de 195     uni-          tés/em3    et un pH de 7,0;

   on laisse le précipité  formé reposer pendant 1 à     '?    heures à     5         C     environ et on le filtre. Le complexe de nature  saline ainsi obtenu de streptomycine et de       l'agent        de        mouillage        contient.        environ        93        %        de     l'activité de l'extrait.  



       b)    On comprime, ou traite de toute     auire     manière pour éliminer l'eau entraînée, le     co@n-          plexe        obtenu    et on le dissout     dans    une quan  tité de méthanol à     90-1001/o    suffisante (sui  vant la teneur en eau du     complexe    ainsi     pai--          tiellenient        déshydraté)

      pour foi-nier une     solu-          tion        dans        100        eni3        de        méthanol    à     90%;        puis     on fait passer la.     solution    dans une colonne de  2,5 X     2:5        cni    de résine à     éclianbe    d'anion dont.  le     pli    a été antérieurement réglé à une valeur  de     ',:5    par addition d'acide     clilorlivdrique     dilué.

   On     recueille    le     liquide    effluent en deux  portions de 125     e        nia        (v    compris le méthanol  de lavage) et on traite chaque portion en ajou  tent un volume d'eau égal, en chassant le     mé-          tlianol    par distillation dans le vide, en ré  glazit le     pli    de la solution aqueuse restante à  une     valeur    de<B>5,5</B> par un traitement avec une  résine à échange d'anion neutre, en la filtrant    et en la séchant par congélation.

   On obtient,  avec la, première et avec la seconde portion  du liquide effluent     respectivement    environ  0,8 g de     chlorhydrate    de streptomycine d'un  pouvoir d'environ 679     nrlltés/mg    et environ  0,1. g d'un pouvoir d'environ     425        unités/mg,          avec        un        rendement        total        d'environ        73,1%.     



       b)    (variante) :     Un    complexe de nature sa  line ainsi obtenu en partant d'une charge  d'extrait d'une activité de<B>860000</B> unités (pe  sant environ 4     g)    est.     dissous    dans 150     eni3          de        méthanol    à     90%;

          la        solution        est        agitée     avec 50     g    d'une résine à     échariT    e d'anion, dont  le pH a été antérieurement réglé par addition       (l*aeide        elilorhvdi-ique    dilué.

       Après    filtration  et     séchage    par     congélation    du filtrat, on ob  tient environ 0,8\<B>-</B> de     elilorhvdrate    de       streptoniveine    d'un pouvoir d'environ 616 uni  tés/mg et on     peul,    obtenir un supplément d'en  viron 0,

  14 g de     chlorhydrate    de streptomycine  d'un pouvoir de 635     unités/mg    dans le     métha-          nol    à     90        %        de        lavage        de        la.        résine,        avec        un          rendement    total de 68 0/0.  



       Exemple   <I>1:</I>  1,5     g    d'un complexe de nature saline de  streptomycine et d'un ester partiel. d'acide  sulfurique     d'un    alcool aliphatique supérieur,      obtenu par exemple de la manière décrite     dais     l'exemple 2 (dont la streptomycine a Une acti  vité de 376 000 unités déterminée par un essai  chimique) est dissous dans 25     cnis    de métha  nol, et on ajoute 25     em3    d'acétone.

   Puis on  ajoute 0,5     cm-3    d'acide chlorhydrique     concen..          tré    (jusqu'à un     pH    = environ 1,2) et ensuite  50     cms    de plus d'acétone. On filtre le préci  pité obtenu (chlorhydrate de streptomycine)  et on le dissout dans l'eau.  



  On règle la valeur du pH de la solution à  6,8 par addition d'Une résine neutre à échange  d'anion et on la sèche par congélation. On  obtient ainsi environ 0,7 g de chlorhydrate de  streptomycine d'un pouvoir d'environ 425 uni  tés/mg (rendement, environ 79 0/0).         Exei3Lp/f        @:     <B><U>'</U></B>80     em3    d'une solution à<B><U>'</U></B>5      /o        d'un    ester  partiel d'acide     sulfurique    d'un alcool alipha  tique supérieur sont ajoutés lentement à. une  solution de 50 g de sulfate de     :

  streptomycine     partiellement. purifiée dans     ?4-    litres d'eau  distillée, d'un pouvoir de 1000     unités/em3:     le     précipité    floculant blanc, qui s'est formé,  est isolé par centrifugation et séché dans le  vide (10 mm) à la     température    ambiante pen  dant 13 heures. Le     complexe    de nature saline  ainsi obtenu pesant environ 57     g    a un pou  voir d'environ 221     unités/mg.     



  En     employant   <B>310</B>     cm-',        d'unie    solution       clarifiée        (traitée        par        le        carbone)    à     25        %        de     l'agent de mouillage         C4H9CH(C2H5)C2H4CH(S04Na)C2H4CH(C2H5        )2,       à titre de solution de l'agent de mouillage de  l'exemple précédent, on obtient un complexe  de nature saline d'un pouvoir d'environ 293  unités/mg avec un rendement     d'environ    50 g.

           Exeynple   <I>6:</I>  On ajoute, en     agitant,        2,1        cm-    d'une     solu-          tion    à     25        %        de            C4H9CH(C2H5)C2H4CH(S04Na)C2H4CH(C'2H5    )2,    à une solution de 0,5 g de sulfate de     dihydro-          streptomycine    dans ?50     eni3    d'eau, ayant un  pouvoir de 1210     unités/cm?,,

      et on recueille  par     filtration    le complexe de nature saline       précipité        (contenant        plais        de        83        %        de        l'acti-          vité    de la solution traitée).  



  En traitant de la même manière une solu  tion aqueuse de chlorhydrate de     streptothri-          cine    d'un pouvoir de 500 unités/mg, on obtient  le complexe de nature saline correspondant  de     streptothricine.    En transformant ces com  plexes en sels solubles de     dihy        drostreptom        @--          cine    et de     streptothricine    respectivement, on  obtient ces sels à l'état purifié.  



       Exemple   <I>i</I>  60 g d'un complexe de streptomycine et de  l'agent de mouillage obtenu de la manière dé  crite dans le paragraphe a) de l'exemple 1,  ayant un pouvoir de 243 unités/mg, sont dis  sous dans 400     cms    d'acétate de     méthylamyle          (acétate-2    de     4-méthylpentyle);    on ajoute  40     cm3    d'acide chlorhydrique concentré et on  agite     vigoureusement    le mélange. Puis on    ajoute 40     cm3    d'eau et on continue à. agiter  pendant 10 minutes.

   On recueille la couche  aqueuse qui se forme en se séparant, on la  neutralise avec Une     résilie    neutre à     éclian-e     d'anion et on la filtre. Le filtrat et le liquide  de lavage d'un volume total d'environ 190     eni     ont un pouvoir d'environ 65 000     unités/em3          (avec        un        rendement        d'eilviron        85%).        En     lavant la couche d'acétate de     métliylam@-le     avec 60     em3    d'eau, en neutralisant le liquide  de lavage et en     filtrant,

      on obtient un filtrat  supplémentaire d'un pouvoir de 16 000 uni  tés/cm3 (le rendement total étant d'environ  970/0). Le chlorhydrate de streptomycine so  lide obtenu par séchage par congélation a  Un pouvoir d'environ 575     unités/mg.     



  <I>Exemple 8:</I>  20 g d'un complexe de nature saline de  streptomycine et de l'agent de mouillage ob  tenu de la manière décrite dans le paragra  phe a) de l'exemple 1 (la streptomycine de ce  complexe ayant une activité de     .12-10    000 uni  tés) sont dissous dans 100     ems    de méthanol.      et on ajoute     Lille        hoitillie    de 40     g    d'une résine  à échange d'anion dans 300     em3    d'eau, avec  un     pll    de 6,5. Puis, tout en     agitant,    et     mainte-          tiant    le mélange à une température de 50 à.

         55     C, on     '-    ajoute de     l'acide    chlorhydrique  concentré goutte à goutte dans des conditions  de nature à maintenir le     pl,    à une     valeur    de  3,0 à 3,5. (On peut déterminer le moment où  la décomposition est     terminée    en observant  l'augmentation du     précurseur    de     inaltol    dan:  la solution aqueuse).

   Au bout d'une heure,  pendant. laquelle on a ajouté environ 3,5     em3     d'acide chlorhydrique concentré, on laisse le       pH    atteindre une valeur de 5,0 à 5 ,5, on filtre  la solution, on élimine le méthanol du filtrat  par évaporation dans le vide et. on sèche par  congélation la     solution    résiduelle en obtenant  environ 6,5 g de     chlorhydrate    de     strepto-          inycine    d'un pouvoir d'environ<B>578</B>     unités/m2#     avec un rendement d'environ     901/o.       <I>Exemple 9:

  </I>  15 g d'un complexe de nature saline de       streptomycine    et d'un agent de mouillage ob  tenu de la manière décrite dans le paragra  phe a) de     l'exemple    1 (la streptomycine du  complexe ayant une     activité    de 2 960 000 uni  tés) sont dissous dans 1.00     cln3    de méthanol  et on fait passer     1-ICI    sec dans la solution,  jusqu'à ce qu'il ne se forme plus de précipité.  Puis on dilue le mélange avec 500     em3    d'acé  tone, et le précipité est séparé par filtration  et dissous dans 100     em3    d'eau.

   On règle le       pli    de la solution à une valeur de 5,.5 par  addition , d'une résine neutre à échange  d'anion, on filtre la solution et on sèche le  filtrat par     congélation    en obtenant environ       -1,96        n    de     elilorliydrate    de streptomycine d'un  pouvoir d'environ 38:î     unités/nlg-    avec un ren  dement de 64,5 0/0.

           Exemple   <I>10:</I>       n)    3785 litres d'un filtrat de culture conte  nant (le la     streptomycine        d'un    pouvoir de  100 unités     /em3    et dont le     pH    a une valeur       comprise    entre 3 et     -1    sont chauffés à<B>-')0, C</B> et         neutralisés    à. une valeur du     pli    de 7,5              0,:

  .'     par addition d'une     solution    de soude causti  que à     1011/o    (17,0 litres environ étant néces  saires à. cet. effet.), et on traite la solution  neutralisée avec 1.1.3,7 kg de charbon activé  et 9,0 kg de matière filtrante. On agite la  bouillie pendant     une    heure et on la filtre. On  lave le tourteau de carbone avec au moins  <B>3<U>3</U></B>     78        litres        d'eau        et        on        le        sèche        par        un        courant     d'air.

    950 litres du second extrait provenant  d'une     extraction        antérieure,        ainsi    qu'il est dé  crit ci-après, sont amenés à un volume de  ''850 litres par addition de l'eau de ville. On  ajoute le tourteau de carbone du paragraphe  précédent, on maintient la bouillie à une tem  pérature de 35 à 40  C en l'agitant. et on règle  le pH de la suspension à une valeur de 2,2   0,2  par     l'addition    d'acide nitrique à. 10 0/0 (une  quantité d'environ 6,39 kg étant nécessaire à  cet effet). Après avoir agité pendant une  heure, on élimine le carbone par filtration et  séchage par un courant d'air et on recueille  le filtrat (ou premier extrait).  



  On introduit le carbone ainsi extrait dans  950 litres d'eau fraîche de ville, en vue d'une  seconde extraction, que l'on effectue de la ma  nière décrite dans le paragraphe précédent     cil     ajoutant une faible quantité d'acide     nitriqué     à 10 0/0 (s'il y a lieu) pour régler de nouveau  le     pli    à une valeur de 2,2   0,2. Le second  extrait ainsi obtenu sert à la première extrac  tion décrite dans le paragraphe précédent. Le  rendement total fourni par le filtrat de cul  ture     est    d'environ 82  /o.  



  On règle le     pli    du premier extrait à une  valeur de 7,5     =    0,1 par addition d'une solu  tion de soude caustique à 10% (15,9 litres  étant nécessaires à cet effet), tout en mainte  nant la température à. 10  C ou au-dessous.  On ajoute 3,40 kg d'une matière filtrante et  on filtre la bouillie.

   On ajoute au filtrat inco  lore (exempt de fer), à une température de 10  à 15  C, la moitié du volume total d'une     solir-          iion    à     25        %        de            C411\)CH(C21-1.' C21I4CH        (SO4Na.)C2H-ICH(C2H5)=         nécessaire à la précipitation de la strepto  mycine (cette quantité étant basée sur l'acti  vité de l'extrait, déterminée par un essai chi  mique en proportion de 1     cm3    par 92400  imités de streptomycine). Une fois cette por  tion de l'agent de mouillage ajoutée, on com  mence l'essai de la détermination de la fin  de la précipitation.

   (On filtre à cet effet un  échantillon de la bouillie et on recueille envi  ron 2     cm-3    du filtrat, puis on ajoute au filtrat  une à deux gouttes d'acide     phosphotungstique     à     50        %        qui        forme        un        précipité,        si        la        précipi-          tation    par l'agent. de mouillage est incom  plète).

   On ajoute alors -Lui complément. de la  solution de l'agent de mouillage par portions  d'un litre, jusqu'à ce que l'essai indique que  la précipitation est terminée (environ 13,0 kg       ou        22,8        litres        d'une        solution    à     25        %        de        l'agent     de mouillage étant nécessaires à cet effet). On  agite la charge pendant -une demi-heure et  on recueille la matière solide (qui est le com  plexe de nature saline) par centrifugation.

    Le rendement fourni par le filtrat de culture       est        d'environ        73,8        %,        le        rendement        de        la        pré-          cipitation        étant        d'environ        90        %.     



       b)    Le complexe ainsi obtenu à l'état  hydraté est dissous dans lé méthanol à 90 0/0,  à     une    température de 20 à 25  C, en propor  tion de 15 g pour 100     cms    de solvant (plus  de 22,7 litres de méthanol, étant nécessaires à  cet effet); on filtre la solution, on ajoute  lentement. au filtrat une quantité d'acide  chlorhydrique concentrée suffisante pour dé  composer le complexe de nature saline et  abaisser le pH à une valeur de 0,8   0,1  (0,408 kg d'acide étant nécessaire à cet effet) ;  et on verse le mélange dans 87,9 kg d'acétone  et on le laisse reposer pendant une heure à  une température de 5 à 10  C.

   Le précipité       (chlorhyrate    de streptomycine) est     filtré    à  l'état aussi sec que     possible    sur un filtre à.  vide, puis est     dissous    dans l'eau avec une pro  portion de 100     ems    d'eau pour 10     g    de com  plexe de nature saline traité (22,7 litres d'eau  environ étant nécessaires à. cet effet).

   On neu  tralise la solution en l'agitant avec     environ     0,49 kg de résine neutre à échange d'anion,  dont. le pH est. 6,5, pour régler le pH du ehlor-    hydrate de     streptoniyeine    à une valeur com  prise dans l'intervalle de 6,0 à 6,5, entre les  limites duquel il est le     plus    stable.

   On filtre  le mélange ainsi obtenu; on distille le filtrat  pour le débarrasser du     méthanol    et de l'acé  tone sous une pression de 1<B>5</B> à.20 min et on  le filtre, puis     on.le    sèche par congélation. .Le  rendement en     chlorhydrate    de streptomycine  ainsi     fourni    par le filtrat de culture est     d'en-          viron        51,

  8        %        et        le        rendement        de        la        décom-          position        d'environ        70%.     



  La résine neutre à échange d'anion     petit     être préparée de la manière suivante : On intro  duit 4,53 kg d'une résine à échange d'anion  dans 37,85 litres d'eau de ville. On ajoute  une quantité     suffisante        d'une    solution de  carbonate de sodium à.     1011/o    pour régler le  pH à une valeur de 10,5 - 0,2, et on lave la  résine alcaline avec de l'eau distillée     jusqu'à     ce que le     pH    du milieu aqueux atteigne     6,:5.     On conserve la résine neutre dans le milieu  aqueux jusqu'à. ce qu'on s'en serve à la neu  tralisation, c'est-à-dire qu'on la filtre dans le  milieu aqueux un instant avant de s'en servir.  



       b)    (variante) : 6,88 kg du complexe ale  nature saline déshydraté sont. dissous dans le  méthanol absolu à une température de 20 à  25  C en proportions de 20<B><U>-</U></B> du     complexe          pour        100        cm3        de        méthanol.    à     100%        (34        litres     au moins de méthanol.     étant    nécessaires à cet  effet).

   On filtre la solution; on ajoute au  filtrat 20,63 kg d'une résine     neutre    à échange  d'anion dont le     pH    est. 6,5 et on ajoute     une     quantité d'eau à la bouillie ainsi obtenue,  suffisante pour abaisser la     concentration    du  méthanol à.     9_51/o    (102,2 litres d'eau environ  étant nécessaires à. cet effet.).

   La bouillie,  dont le volume est d'environ 159 litres, est  chauffée à une température de 50 à 55      C    et  est maintenue à cette température     pendant     qu'on y ajoute 1,89 litre d'acide chlorhydri  que     concentré    dans des conditions de nature  à, maintenir le pH du mélange à une valeur com  prise entre 3,0 et 3,5. Puis on agite le mélange  jusqu'à ce que le pH atteigne sa valeur maxi  mum comprise entre 5,6 et. 6,2 (si le     pH    est  inférieur à 6, on ajoute de faibles quantités  de résine neutre à. échange d'anion jusqu'à ce      que la     valeur    finale du     1i11    soit comprise entre  6 et 6,5).

   Puis on filtre la bouillie et on lave  la résine avec     une    quantité d'eau suffisante  pour éliminer le     chlorhydrate    de     strepto-          inveine    qui y adhère     éventuellement;    le filtrat  et l'eau de lavage combinés, dont le volume  est d'environ<B>179,8</B> litres et le pouvoir     d'eji-          viron    6500     unités/em3,    sont alors concentrés à  un     volume    d'environ     11,3.5    litres et. on re  cueille le     chlorhydrate    de     streptomycine    par  séchage par congélation.

   Le     rendement.    de la       décomposition    est de 60 à     80%.     



  Parmi les sels purs d'autres antibiotiques  basiques du type de la streptomycine, autres  que     ïa        streptoniveine    A et la     streptomycine    B  et qui peuvent être préparés suivant le procédé  selon l'invention, on peut citer les sels de la.       dihydrostreptomy        cine    A, de la     dihydro-          streptomycine    B et de la     streptothricine.     



  Les sels purs d'antibiotiques basiques du  type de la     streptomycine    obtenus par le pro  cédé suivant l'invention peuvent être purifiés  encore     eii    appliquant. (le nouveau le même  procédé de purification. De même, ils peuvent  subir une purification préliminaire ou ulté  rieure par d'autres procédés, en particulier  par un (les procédés     suivants:

      1" On amène  en contact intime une solution aqueuse de  l'antibiotique avec un acide carboxylique sen  sibleiiient insoluble dans l'eau et un solvant  organique de l'acide carboxylique ne se     iné-          langeant    sensiblement pas avec l'eau, on re  cueille la     phase    du solvant     organique    et on  transforme le     complexe    de nature saline     ,1e     l'antibiotique qu'elle contient en un sel solu  ble dans l'eau de l'antibiotique. 2" On traite  une solution aqueuse de l'antibiotique avec  un sel soluble dans l'eau     d'un    acide carboxy  lique sensiblement insoluble dans l'eau;

       oii     recueille le complexe précipité de     l'ant.ibio-          t.ique    et de l'acide carboxylique et on le     trans-          forine    en un sel soluble dans l'eau de     l'ant.i-          biot.ique.        R     On amène en contact. intime une  solution aqueuse de l'antibiotique avec un  agent de mouillage du type d'un acide inorga  nique     polybasique        organiquement    substitué et  un solvant. organique     des    savons ne se mélan  geant     sensibieineiit    pas avec l'eau:

   on recueille    la. phase     chi    solvant organique et     oii    trans  forme le dérivé obtenu de l'antibiotique qu'elle  contient en un sel soluble dans l'eau de l'anti  biotique.



  Process for the preparation of pure salts of antibiotics of a basic nature, in particular antibiotics of the streptomycin type. The invention relates to a process for the preparation of pure, water-soluble salts of antibiotics of a basic nature, in particular antibiotics of the streptomycin type, i.e. of the genus - consisting of streptomycin and basic antibiotic-acting compounds, which (like st. reptomyein) can form water soluble salts with acids, such as sulfuric acid, and water insoluble salts with organic reagents precipitating bases.



  In 19-14, Schatz, Bugie and Waksman (Proe. Toc. Exp. Biol. Lied.

       1944, 57, 2-1-1) have shown that a potent antibiotic called Streptomycin is formed during the growth of the organism Actinomyces Griseus (now called Streptomyces Griseus), and it has since been found that this antibiotic is extremely useful in therapy.



  It was then discovered that several streptomycins are formed at the same time. The first streptomycin obtained in crystalline form, pure (in the state of Reineekate) and completely. characterized is now called Streptomycin A, and the second characterized streptomycin is now called Streptomycin B. In addition, there is evidence that other streptomycins are formed and / or may be formed at the same time by changing the conditions of the culture; throughout this discussion, each of these antibiotics and mixtures thereof will be referred to as streptomycin, unless otherwise specified.



  Streptomycin and other antibiotics of a basic character have heretofore been purified by various methods all of which are complicated and / or ineffective (and therefore expensive). For example, a largely previously applied process involves, in principle, the following steps: 1 Treating a primary liquid containing streptomycin with activated charcoal which selectively absorbs streptomycin; 2 Streptomycin is extracted from charcoal with a water-soluble aqueous mineral acid, preferably with elevation. slightly the temperature (eg about 30 to 50 C);

   3 the extract is treated with an acidic reagent for precipitating organic bases, preferably phosphotungstic acid, to form a complex of a saline nature, and 4 the complex is decomposed, for example with a mineral acid, to form a purified salt , soluble in water, streptomycin.

   The primary liquid pressure should be understood as designating in particular: a) the culture liquid obtained by causing a microorganism capable of proliferating. providing a basic antibiotic, for example, Streptomyces &quot; Greses, under conditions and in a culture medium suitable for the formation of streptomycin and separating solids from the medium;

       (b) the culture liquid of improved <B> potency </B> obtained by acidification of the culture (for example by hydrochloric <B> or sulfuric acid), </B> the liquid being neutralized, and c) the liquid obtained by acid extraction of the solids separated from the culture, the liquid being neutralized. The present invention aims to. an improvement of this known purification process, by the choice of acidic reagents precipitating the particular bases which give much better results as regards the final purity of the antibiotics obtained than the reagents used until now. for this purpose.

    (phosphotunbstic acid for example). The aim of the invention is. to carry out the purification of antibiotics of a basic nature, in particular streptomycin, in a simple, efficient and advantageous manner. It has been found that it is possible to use, as acidic base-precipitating reagents, surfactants (or wetting agents) of the type of organically substituted inorganic polF-basic acids, which react.

   with antibiotics of a basic character by forming certain combinations or complexes of a saline nature which are sparingly soluble in water, and that these acidic surfactants advantageously replace the reagents hitherto used for this purpose, such as acid phos- photunbstique. The saline complexes of antibiotics, obtained with these surfactants, can be collected and transformed into soluble salts of antibiotics (the basic character.



  The present invention relates to a process for preparing pure salts, soluble in water, of antibiotics of a basic character, in particular antibiotics of the type streptomyein, by reacting, in a solvent, an impure antibiotic of basic character or of an impure salt of such an antibiotic, with an acid reagent precipitating organic bases with the formation of a complex of the nature of its line of said antibiotic, and decomposition of this complex using an acid forming with the antibiotic released a water soluble salt thereof. antibiotic, in the purified state.

      This process is characterized in that, as acid reagent forming said complex of saline nature, use is made of a surfactant of the type of polybasic inorganic acids substituted by at least one organic residue. The complex of saline nature thus formed is relatively insoluble in water and. can be collected by filtration, centrifugation or other suitable means when water is used as a solvent.

   When the solvent is a solvent (such as methanol) in which the complex of saline nature is soluble, this complex is collected by removing the solvent. and purifying the residue, for example by washing with water, or adding a miscible, non-solvent for the complex (such as water). The solution from which one starts can be, for example, a primary liquid (culture liquid) containing streptomycin, or an aqueous solution of a partially purified streptomycin, such as the extract from which. it was previously questioned.

   It is also possible to use a neutral or acidified culture liquid, that is to say a culture liquid whose pH is adjusted to a value of at ph s equal to 7.0 by adding a mineral acid. In this culture fluid, the antibiotic is. present, totally. or in part, in the form of the salt of the acid used. When this culture fluid is neutral or weakly acidic, part of the antibiotic is in the form of salt, but if this culture fluid is strongly acidic, all of the antibiotic is in the form of salt. .



  The salt of the regenerated antibiotic is much purer than the antibiotic or the salt of the drug treated with alcohol and the recovery of antibiotic activity, achieved during treatment ( The purification is of a high order In the practical practice of the invention, it is possible to obtain really high yields of relatively pure streptomycin salts having (for example) an antibiotic power greater than approximately 400 units / ni.



  Among the surfactants or wetting agents of the type, organically substituted polybasic inor-anic acids suitable for the following process.

   the invention, one can quote those which are represented by the formula R-0-X-0-Y, in which R denotes the radical of a hydroxylated organic compound which does not substantially mix with water, -0- X-0- denotes the divalent acid radical of a water-soluble polybasic inorganic acid (for example titi sulfuric or phosphoric acid) and Y denotes the titi cation of the group formed by Hf- and the cations giving soluble salts in water with the ROYO- anion. Among these wetting agents, one can.

   cite in particular those in which the polybasic inorganic acid is sulfuric acid, the acid being partially esterified with a higher aliphatic alcohol, that is to say the wetting agents of the group formed by aliphatic monoesters higher sulfuric acid, and. their water soluble salts.



  Other suitable wetting agents of the organically substituted polybasic inorganic acid type are those from the group consisting of aromatic sulphonic acids. sulfonated oils, sulfonated fatty acid derivatives and their water soluble salts.



  Among the partial higher alkyl esters of sulfuric acid which can be used in the implementation of the invention, there may be mentioned: the group of sodium salts of sulfates of synthetic higher aliphatic alcohols, such as C-1H9CH (C ' = H5) C "H-ICH (S04 Sa) C2H-ICH (C2H5) '=, C-IH') CH (C2H5) C22H-ICH (S04Na) C EI2CH (CI13) - ', and C4H9CH (C2115) CH2S04Na ,

         and the group of sulfuric acid partial esters of higher aliphatic alcohols and their salts, such as octyl-sodium, oley-sodium, ethyl 1-sodium, stearyl-sodiuni and (the lauryl-sodiuni. Among the aromatic sulfonic acids, sulfonated oils and sulfonated higher fatty acid derivatives which can serve as surfactants,

      we can mention sodium sulfonates of higher fatty acid esters and (amides, such as the sodium salt of sulfonated ethyl oleate (or other alkyl oleate), for example Ct7H33CONFIC2H4S03Na, sodium sulfonates ( petroleum hydrocarbons, salt (sodium of a polyalco. 0-benzine-sulphonic acid containing 10 carbon atoms, other aleoyl-iii,%,

  Sodium I-sulfonates and. oil <Turkish red (i.e. sulphonated castor oil). Among the partial esters of phosphoric acids which can be used, one small. cite dieresyl phosphate, lecithine and a higher phosphorus alcohol represented by the formula (capryl)) iÇa5p602O. Among the soluble acids in water, there are strong enhancers, which can be used to transform the complex from saline nature to Soluble salt,

       there may be mentioned sulfuric, hydrochloric, phosphoric, oxalic, citric, sulphainic and nitric acids.



  To achieve maximum yield, the wetting agent should be. substantially in excess of that which is required to combine all of the antibiotic contained in the treated solution, the more advantageous proportion of the wetting agent depending on the concentration of the treated solution and the potency antibiotic. By using the.

    stoichiometric amount of the wetting agent (relative to the antibiotic activity of the treated solution), a practically quantitative proportion of the antibiotic can be collected in the form of a natural salt complex; this is substantially pure and allows the anti-biotic to be collected more easily in the form of a water-soluble salt.



       The wetting agent can be added to a solution of the antibiotic in solid state or as a solution, or the antibiotic and the wetting agent can. both be added in the solid state to water (or other solvent for the reagents).



  The complex of saline nature of the anti-biotic and of the agent (the wetting can separate said solvent in various forms: pal, for example in the form of an oily substance. Waxy or gelatinous, or not to separate at all, but remain in the form of a suspension in the solvent (all these insoluble forms, to be considered as included hereinafter by the term precipitate).

   Depending on its foiane, the precipitate is separated by filtration, centrifugation, treatment with. the aid of a filtration auxiliary followed by filtration by other ordinary means known to specialists.



  The precipitation of the complex of saline nature depends on the concentration of the reagents and the value of the fold of the reaction medium, the precipitation being niaximuni when the concentration is high and the value of <B> pH </B> between approximately 5 and about 8 and, preferably, close to 7.



  The transformation of the complex of saline nature into a water-soluble salt of the anti-biotic can be carried out, inter alia, by the following means: the complex is dissolved in a solvent (for example methanol), the mixture is treated. solution with a relatively strong, water-soluble acid, and the water-soluble salt thus formed from the antibiotic is collected, for example by adding an agent. miscible non-solvent for the water-soluble salt, such as acetone, or else the complex (in solution) is brought into contact.

   intimate with an absorber (e.g. alumina), or anion exchange resin that has been previously treated with the relatively strong, water-soluble acid selected, and the water-soluble salt is collected thus formed antibiotic in the treated solution (eg by removing the solvent);

   or else the complex of saline nature is dissolved in an organic solvent for the soaps which do not substantially mix with water (for example n-butanol or amyl alcohol obtained by fermentation and refining), it is brought into intimate contact! solution with a z <<-lueu @ e solution of a relatively strong acid, soluble in water, the aqueous phase is collected and dried (preferably <I> by </I> freezing,

          that is to say qtt'or freezes it and it is \ souinet to him a deep vacuum to expel the water by sublimation j:

   or else the complex dormouse is dissolved in a solvent in which the water-soluble salt which is desired to be obtained is insoluble (for example a mixture of methanol and acetone), the solution is treated with an aqueous solution of 'a relatively strong acid, soluble in water.

   and collecting the salt, soluble in water, precipitated from the antibiotic; a solution of the saline eoniplex is well treated with an aqueous solution of a relatively strong acid, soluble in water, in the presence of an anion exchange resin, or with various other nio ,,

  -ens making it possible to achieve intimate contact and (make the complex react with the relatively strong acid, soluble in water.



  The invention is. illustrated by the following examples (all solutions or dilution referred to being solutions or dilutions in water, unless the solvent being diluted is specially indicated): E, .c.iii. ph <I> 1: </I> (i.) _1:

  ï00 ciii'3 d'tin filtrate (the culture containing streptomycin (obtained by making streptomvces griseus proliferate in submerged culture in aqueous media containing soybean meal, dextrose and sodium chloride, by acidifying the seeded culture and filtering it)

       a @ -ant an antibiotic power of? 5 (i and -He) iii of 6.5 are added 1? emS, of a 15 11% solution of C4H9CFI (C'2 [-15) (y'2FI4CF1 (SOi @ # ja) C_2IICI3 (C2115 i'-. with stirring, and stirring is continued for a period of half an hour.

   The oil which separates is a complex of saline nature of streptomycin and the agent. of wetness and contains approximately 94% of the activity of the culture filtrate. The complex of saline nature thus obtained is dissolved in methanol, then precipitated again by adding an equal volume of water:

   it is redissolved in methanol. 80% and is passed through an alumina column, previously washed with chlorlivdridne acid, to a fold of -1,

  1. The effluent liquid is reetieille (approximately 250 cni. 3, including the washing methanol), an equal volume of water is added, the methanol is removed by vacuum distillation, the complex of possible saline nature is removed. is lying. undecomposed, the pH of the remaining aqueous solution is adjusted to a value of 5.5 and dried by freezing. We obtain approximately 1:

  15 g of streptoevcin hydrofluoride having a potency of 320 units / µl (with a half yield of about 40%).



       Example <I> 2: </I> Un adds <B> 0.5 </B> <, of a partial sulfuric acid ester of a higher aliphatic alcohol in 20 eniS of water at .500 em @ of an extract containing impure streptomycin having a power of 300 units:

  es / em3 and a pH of 6.5 (obtained by treating a culture filtrate containing streptomycin with activated charcoal and extracting streptoni- cine from the charcoal with chloric acid. - 1ivdrique, sulfuric or nitric dilute), the cloudy solution is stirred for one hour and the flocculating precipitate formed is separated by filtration.

   The complex thus obtained, of saline nature, of streptomycin and the wetting agent, contains approximately 701% of the activity of the extract; it is converted into a water-soluble salt of streptomycin, for example as described in Example 4 below.

      <I>Example<B>à,:</B> </I> <I> (1 </I>) 7.6 of a solution to 2: "> <B> 14 </B> of (_ ' -1H9CI-I (('22115) t "-Il. @ T'1-I (0 @@; a) (@@ lI @ CII ((' @IIS) @, are added with stirring, over one hour. to 7 liters of an extract containing streptomycin nitrate having a potency of 195 units / em3 and a pH of 7.0;

   the precipitate formed is left to stand for 1 to '? hours at about 5 C and filtered. The saline complex thus obtained of streptomycin and the wetting agent contains. about 93% of the activity of the extract.



       b) The complex obtained is compressed, or treated in any way to remove the entrained water, and dissolved in a sufficient quantity of 90-1001% methanol (depending on the water content of the complex thus pai-- tiellenient dehydrated)

      to faith-deny a solution in 100 eni3 of 90% methanol; then we pass it. solution in a 2.5 X 2 column: 5 cni of anion flash resin including. the fold has previously been adjusted to a value of: 5 by addition of dilute clilorlivdric acid.

   The effluent liquid is collected in two portions of 125 e nia (including the washing methanol) and each portion is treated by adding an equal volume of water, removing the metlianol by vacuum distillation, in reglazit. the remaining aqueous solution folded to a value of <B> 5.5 </B> by treatment with a neutral anion exchange resin, filtering it and freeze drying it.

   With the first and second portions of the effluent liquid are obtained, respectively, approximately 0.8 g of streptomycin hydrochloride with a power of approximately 679 nrlltés / mg and approximately 0.1. g of a potency of about 425 units / mg, with a total yield of about 73.1%.



       b) (variant): A complex of nature sa line thus obtained starting from an extract charge with an activity of <B> 860,000 </B> units (weighing approximately 4 g) is. dissolved in 150 eni3 of 90% methanol;

          the solution is stirred with 50 g of an anion scavenging resin, the pH of which has previously been adjusted by addition (dilute elilorhvdi-ic aeide.

       After filtration and freezing drying of the filtrate, approximately 0.8 \ <B> - </B> of streptonivein elilorhvdrate with a potency of about 616 units / mg is obtained and additional around 0,

  14 g of streptomycin hydrochloride with a potency of 635 units / mg in 90% methanol wash. resin, with a total yield of 68%.



       Example <I> 1: </I> 1.5 g of a complex of saline nature of streptomycin and a partial ester. sulfuric acid from a higher aliphatic alcohol, obtained for example as described in Example 2 (of which streptomycin has an activity of 376,000 units determined by a chemical test) is dissolved in 25 cnis of methanol, and 25 em3 of acetone are added.

   Then added 0.5 cm-3 of concentrated hydrochloric acid (up to a pH = about 1.2) and then 50 cms more acetone. The precipitate obtained (streptomycin hydrochloride) is filtered off and dissolved in water.



  The pH value of the solution is adjusted to 6.8 by adding neutral anion exchange resin and freeze dried. In this way, approximately 0.7 g of streptomycin hydrochloride is obtained with a potency of approximately 425 units / mg (yield, approximately 79%). Exei3Lp / f @: <B><U>'</U> </B> 80 em3 of a solution at <B> <U> '</U> </B> 5 / o of a partial ester of sulfuric acid of a higher aliphatic alcohol are added slowly to. a solution of 50 g of sulphate of:

  streptomycin partially. purified in? 4- liters of distilled water, with a capacity of 1000 units / em3: the white flocculant precipitate, which has formed, is isolated by centrifugation and dried in vacuum (10 mm) at room temperature pen from 1 p.m. The thus obtained salt complex weighing about 57 g has a power of about 221 units / mg.



  Using <B> 310 </B> cm- ', a 25% clarified (carbon treated) solution of the wetting agent C4H9CH (C2H5) C2H4CH (S04Na) C2H4CH (C2H5) 2, as of solution of the wetting agent of the preceding example, a complex of saline nature with a potency of about 293 units / mg is obtained with a yield of about 50 g.

           Example <I> 6: </I> 2.1 cm- of a 25% solution of C4H9CH (C2H5) C2H4CH (S04Na) C2H4CH (C'2H5) 2 are added with stirring to a solution of 0.5 g of dihydro-streptomycin sulphate in? 50 eni3 of water, having a potency of 1210 units / cm? ,,

      and the precipitated salt complex (containing 83% of the activity of the treated solution) was collected by filtration.



  By treating in the same manner an aqueous solution of streptothricin hydrochloride with a potency of 500 units / mg, the corresponding salt complex of streptothricin is obtained. By converting these complexes into soluble salts of dihydrostreptom® - cine and streptothricin respectively, these salts are obtained in a purified state.



       Example <I> i </I> 60 g of a complex of streptomycin and the wetting agent obtained as described in paragraph a) of Example 1, having a potency of 243 units / mg, are said in 400 cms of methylamyl acetate (2-acetate of 4-methylpentyl); 40 cm3 of concentrated hydrochloric acid are added and the mixture is stirred vigorously. Then 40 cm3 of water are added and the process continues. stir for 10 minutes.

   The aqueous layer which forms on separation is collected, neutralized with a neutral anion-flashing terminus and filtered. The filtrate and washing liquid with a total volume of about 190 eni have a potency of about 65,000 units / em3 (with a yield of about 85%). By washing the layer of methyl acetate with 60 em3 of water, neutralizing the washing liquid and filtering,

      an additional filtrate is obtained with a capacity of 16,000 units / cm3 (the total yield being about 970%). The solid streptomycin hydrochloride obtained by freeze drying has a potency of about 575 units / mg.



  <I> Example 8: </I> 20 g of a complex of saline nature of streptomycin and the wetting agent obtained as described in paragraph a) of Example 1 (streptomycin from this complex having an activity of .12-10,000 units) are dissolved in 100 ems of methanol. and Lille hoitillie 40 g of an anion exchange resin in 300 em3 of water is added, with a pll of 6.5. Then, while stirring, and maintaining the mixture at a temperature of 50 to.

         55 ° C., concentrated hydrochloric acid is added dropwise under conditions such as to maintain the pl at a value of 3.0 to 3.5. (The point at which decomposition is complete can be determined by observing the increase in the precursor of inaltol in the aqueous solution).

   After an hour, during. which was added about 3.5 em3 of concentrated hydrochloric acid, the pH is allowed to reach a value of 5.0 to 5.5, the solution is filtered, the methanol is removed from the filtrate by evaporation in vacuo and. the residual solution was dried by freezing, obtaining approximately 6.5 g of streptoinycin hydrochloride with a potency of approximately <B> 578 </B> units / m2 # with a yield of approximately 901 / o. <I> Example 9:

  </I> 15 g of a complex of saline nature of streptomycin and a wetting agent obtained as described in paragraph a) of Example 1 (the streptomycin of the complex having an activity of 2960 000 units) are dissolved in 1.00 cln3 of methanol and dry 1-ICI is passed through the solution, until no more precipitate forms. Then the mixture is diluted with 500 em3 of acetone, and the precipitate is filtered off and dissolved in 100 em3 of water.

   The fold of the solution is adjusted to a value of 5.5 by the addition of a neutral anion exchange resin, the solution is filtered and the filtrate is dried by freezing, obtaining about -1.96 n of elilorliydrate. of streptomycin with a potency of about 38: 1 units / nlg- with a yield of 64.5%.

           Example <I> 10: </I> n) 3785 liters of a culture filtrate containing (streptomycin with a power of 100 units / em3 and whose pH has a value between 3 and -1 are heated at <B> - ') 0, C </B> and neutralized at. a fold value of 7.5 0 ,:

  . ' by adding a 1011 / o caustic soda solution (approximately 17.0 liters being necessary for this.), and the neutralized solution is treated with 1.1.3.7 kg of activated carbon and 9, 0 kg of filter material. The slurry is stirred for one hour and filtered. The carbon cake is washed with at least <B>3<U>3</U> </B> 78 liters of water and dried by a current of air.

    950 liters of the second extract from a previous extraction, as described below, are brought to a volume of '' 850 liters by addition of tap water. The carbon cake from the previous paragraph is added, the slurry is maintained at a temperature of 35 to 40 ° C. while stirring. and the pH of the suspension is adjusted to a value of 2.2 0.2 by the addition of nitric acid to. 10% (an amount of about 6.39 kg being required for this purpose). After stirring for one hour, the carbon is removed by filtration and drying with a stream of air and the filtrate (or first extract) is collected.



  The carbon thus extracted is introduced into 950 liters of fresh tap water, with a view to a second extraction, which is carried out in the manner described in the preceding paragraph, adding a small amount of nitric acid to 10 0 / 0 (if applicable) to reset the fold to a value of 2.2 0.2. The second extract thus obtained is used for the first extraction described in the previous paragraph. The total yield from the culture filtrate is about 82%.



  The fold of the first extract is adjusted to a value of 7.5 = 0.1 by adding a 10% caustic soda solution (15.9 liters being necessary for this purpose), while maintaining the temperature at . 10 C or below. 3.40 kg of filter material is added and the slurry is filtered.

   To the colorless (iron-free) filtrate is added at a temperature of 10 to 15 ° C, half the total volume of a 25% solution of C411) CH (C21-1. C21I4CH (SO4Na. ) C2H-ICH (C2H5) = necessary for the precipitation of streptomycin (this quantity being based on the activity of the extract, determined by a chemical test in proportion of 1 cm3 per 92,400 imitated of streptomycin). Once this portion of the wetting agent has been added, the test for the determination of the end of precipitation is started.

   (A sample of the slurry is filtered for this purpose and about 2 cm-3 of the filtrate is collected, then one to two drops of 50% phosphotungstic acid is added to the filtrate which forms a precipitate, if the precipitation by the wetting agent is incomplete).

   We then add -He complement. of the wetting agent solution in one-liter portions, until the test indicates that precipitation is complete (approximately 13.0 kg or 22.8 liters of a 25% solution of l (wetting agent being necessary for this). The charge is stirred for half an hour and the solid material (which is the complex of saline nature) is collected by centrifugation.

    The yield from the culture filtrate is about 73.8%, the yield from the precipitation being about 90%.



       b) The complex thus obtained in the hydrated state is dissolved in 90% methanol, at a temperature of 20 to 25 ° C., in a proportion of 15 g per 100 cms of solvent (more than 22.7 liters of methanol, being necessary for this purpose); the solution is filtered and added slowly. in the filtrate a quantity of concentrated hydrochloric acid sufficient to decompose the complex of saline nature and lower the pH to a value of 0.8 0.1 (0.408 kg of acid being necessary for this purpose); and the mixture is poured into 87.9 kg of acetone and allowed to stand for one hour at a temperature of 5-10 C.

   The precipitate (streptomycin chlorhyrate) is filtered as dry as possible on a filter. empty, then dissolved in water with a pro portion of 100 ems of water for 10 g of complex of saline nature treated (approximately 22.7 liters of water being necessary for this purpose).

   The solution is neutralized by stirring it with about 0.49 kg of neutral anion exchange resin, including. the pH is. 6.5, to adjust the pH of streptonylyein hydrochloride to a value in the range of 6.0 to 6.5, between the limits of which it is most stable.

   The mixture thus obtained is filtered; the filtrate is distilled to free it from methanol and acetone under a pressure of 1 <B> 5 </B> at 20 min and filtered, then dried by freezing. The yield of streptomycin hydrochloride thus supplied by the culture filtrate is about 51%.

  8% and the decomposition yield of about 70%.



  The neutral anion exchange resin can be prepared as follows: 4.53 kg of an anion exchange resin are introduced into 37.85 liters of tap water. A sufficient amount of sodium carbonate solution is added to. 1011 / o to adjust the pH to a value of 10.5 - 0.2, and the alkaline resin is washed with distilled water until the pH of the aqueous medium reaches 6,: 5. The neutral resin is stored in the aqueous medium until. that it is used for neutralization, that is to say that it is filtered in the aqueous medium for a moment before using it.



       b) (variant): 6.88 kg of the dehydrated natural salt ale complex are. dissolved in absolute methanol at a temperature of 20 to 25 C in proportions of 20 <B> <U> - </U> </B> of the complex per 100 cm3 of methanol. at 100% (at least 34 liters of methanol. being necessary for this purpose).

   The solution is filtered; 20.63 kg of a neutral anion exchange resin, the pH of which is. 6.5 and an amount of water is added to the slurry thus obtained, sufficient to lower the concentration of methanol to. 9_51 / o (approximately 102.2 liters of water being required for this purpose.).

   The slurry, the volume of which is about 159 liters, is heated to a temperature of 50-55 C and is maintained at this temperature while adding 1.89 liters of hydrochloric acid that concentrated under such conditions under natural conditions. à, maintain the pH of the mixture at a value between 3.0 and 3.5. Then the mixture is stirred until the pH reaches its maximum value of between 5.6 and. 6.2 (if the pH is less than 6, small amounts of neutral anion exchange resin are added until the final value of 1111 is between 6 and 6.5).

   The slurry is then filtered and the resin washed with a sufficient quantity of water to remove the streptoinvein hydrochloride which may adhere thereto; the combined filtrate and washing water, the volume of which is about <B> 179.8 </B> liters and the power of eji- about 6500 units / em3, are then concentrated to a volume of about 11,3.5 liters and. the streptomycin hydrochloride is collected by freeze drying.

   The yield. of the decomposition is 60 to 80%.



  Among the pure salts of other basic antibiotics of the streptomycin type, other than streptonivein A and streptomycin B and which can be prepared according to the process according to the invention, there may be mentioned the salts of the. dihydrostreptomy cin A, dihydro-streptomycin B and streptothricin.



  The pure salts of basic antibiotics of the streptomycin type obtained by the process according to the invention can be further purified by applying. (the new the same purification process. Likewise, they can undergo a preliminary or subsequent purification by other methods, in particular by a (the following methods:

      1. An aqueous solution of the antibiotic is brought into intimate contact with a sensitive water-insoluble carboxylic acid and an organic solvent for the carboxylic acid which does not substantially mix with water, the residue is collected. phase of the organic solvent and the complex of saline nature, the antibiotic it contains is converted into a water soluble salt of the antibiotic. 2 "An aqueous solution of the antibiotic is treated with a soluble salt. in water of a substantially water-insoluble carboxylic acid;

       where the precipitated complex of the antibiotic and the carboxylic acid is collected and converted to a water soluble salt of the antibiotic. R We bring in contact. intimate an aqueous solution of the antibiotic with an organically substituted polybasic inorganic acid type wetting agent and a solvent. organic soaps that do not mix sensitively with water:

   we collect it. chi phase organic solvent and oii trans forms the derivative obtained from the antibiotic which it contains in a water soluble salt of the antibiotic.

 

Claims (1)

REVENDICATION Procédé de préparation de sels purs, soiii- bles dans l'eau, d'antibiotiques de caractère basique, notamment d'antibiotiques dit type de la streptomycine, par réaction, dans iiii solvant, d'un antibiotique impur de caractère basique ou d'un sel impur d'un tel. CLAIM Process for the preparation of pure salts, soluble in water, of antibiotics of a basic character, in particular of so-called streptomycin type antibiotics, by reaction, in a solvent, of an impure antibiotic of basic character or of a 'an unclean salt of such. antibio tique, avec un réactif acide précipitant les bases organiques avec formation d'un com plexe de nature saline dudit antibiotique, cet décomposition de ce complexe à l'aide d'Lin acide formant avec l'antibiotique libéré un sel soluble dans l'eau de cet antibiotique, à l'état purifié, caractérisé en ce qu'on utilise, comme réactif acide formant ledit complexe de na ture saline, un agent tensioactif du type des acides inorganiques polybasiques substitués par ait moins Lui reste organique. antibiotic, with an acid reagent precipitating organic bases with formation of a complex of saline nature of said antibiotic, this decomposition of this complex using acid Lin forming with the antibiotic released a water soluble salt of this antibiotic, in the purified state, characterized in that one uses, as acid reagent forming said natural salt complex, a surfactant of the type of polybasic inorganic acids substituted with less organic residue. 50U 5-REVLNDICATIONS 1. Procédé selon la revendication, carac térisé en ce que l'on opère en solution aqueuse, le complexe formé de nature saline étant in soluble dans l'eau. ?. Procédé selon la revendication, caracté risé en ce que la solution utilisée de l'anti- biot.ique est le liquide de culture obtenu en faisant proliférer dans des conditions et dans un milieu de culture convenant à. la forma tion d'un antibiotique de caractère basique un micro-organisme apte à fournir un tel antibiotique, et après séparation des matières solides de ce milieu. 3. 50U 5-REVLNDICATIONS 1. A method according to claim, charac terized in that it is carried out in aqueous solution, the complex formed of saline nature being insoluble in water. ?. A method according to claim, characterized in that the used solution of the antibiotic is the culture liquid obtained by proliferating under conditions and in a culture medium suitable for. the formation of an antibiotic of a basic character a microorganism capable of providing such an antibiotic, and after separation of the solids from this medium. 3. Procédé selon la revendication et la sous -revendication ?, caractérisé en ce que, avant d'effectuer la réaction avec ledit agent. tensio-aetil acide dans ladite solution, on ajuste le pif du liquide de culture à une va leur au plus égale à. 7,0, par adjonction d'un acide minéral, de sorte que l'antibiotique im pur soit présent dans la. solution utilisée au moins en partie sous forme d'un sel soluble dans l'eau. 4. A method according to claim and subclaim ?, characterized in that, before carrying out the reaction with said agent. tensio-aetil acid in said solution, the pif of the culture liquid is adjusted to a value at most equal to. 7.0, by adding a mineral acid, so that the im pure antibiotic is present in the. solution used at least in part in the form of a water soluble salt. 4. Procédé selon la revendication et. la sous-revendication 2, caractérisé en ce qu'on traite ledit. liquide de culture contenant un antibiotique impur avec dïi--charbon de bois activé, en ce qu'on extrait l'àntib'iotique du charbon de bois par une solution aqueuse d'un acide minéral soluble dans.l'eau, en ce qu'on traite l'extrait avec ledit. agent tensioactif et en ce qu'on recueille le complexe formé inso luble de nature saline avant de le transformer en un sel purifié, soluble clans l'eau, de l'anti biotique. 7. Method according to claim and. the sub-claim 2, characterized in that the said. culture liquid containing an impure antibiotic with activated charcoal, in that the antibiotic is extracted from the charcoal by an aqueous solution of a water soluble mineral acid, in that 'the extract is treated with said. surfactant and collecting the complex formed insoluble in saline nature before converting it into a purified water soluble salt of the anti-biotic. 7. Procédé selon la revendication, carac térisé en ce qu'on utilise un agent, tensio-acrif de formule généraleR-0--0-Y, dans laquelle R représente le radical d'un composé organique hyclroxylé, -0--t)- repré sente le radical divalent. d'un acide inorga nique polybasique soluble dans l'eau et représente un cation formant. avec l'anion R-0--X-0- des sels solubles dans l'eau. et en ce qu'on utilise un solvant aqueux. 6. Process according to claim, characterized in that one uses an agent, surfactant of general formula R-0--0-Y, in which R represents the radical of a hydroxylated organic compound, -0 - t) - represents the divalent radical. of a water-soluble polybasic inorganic acid and represents a cation forming. with the anion R-0 - X-0- of the water soluble salts. and in that an aqueous solvent is used. 6. Procédé selon la revendication, caracté risé en ce qu'on utilise comme agent tensio- actif un monoester aliphatique supérieude l'acide sulfurique. 7. Procédé selon la revendication, earacté- risé en ce qu'on utilise comme agent tensio- actif un sel soluble dans l'eau d'un mono- ester aliphatique supérieur de l'acide sulfu- rique. Process according to claim, characterized in that a higher aliphatic monoester of sulfuric acid is used as the surfactant. 7. A process according to claim, characterized in that a water-soluble salt of a higher aliphatic monester of sulfuric acid is used as the surfactant.
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