Procédé de préparation de sels purs d'antibiotiques de caractère basique, notamment d'antibiotiques du type de la streptomycine. L'invention concerne un procédé de prépa ration de sels purs, solubles dans l'eau, d'anti biotiques de caractère basique, notamment d'antibiotiques du type de la streptomycine, c'est-à-dire du genre - se composant de la streptomycine et de composés basiques à ac tion antibiotique, qui (comme la st.repto- myeine) peuvent former des sels solubles dans l'eau avec des acides, tels que l'acide sulfuri que, et des sels insolubles dans l'eau avec des réactifs organiques précipitant les bases.
En 19-14, Schatz, Bugie et Waksman (Proe. toc. Exp. Biol. lied.
1944, 57, 2-1-1) ont mon tré qu'un antibiotique puissant appelé Strepto- mycine se forme au cours de la croissance de l'organisme Actinomyces Griseus (appelé maintenant. Streptomyces Griseus ), et on a constaté depuis que cet antibiotique est extré- wement utile en thérapeutique.
On a découvert, ensuite, que plusieurs streptomycines se forment en même temps. La première streptomycine obtenue sous forme cristallisée, pure (à l'état de reineekate) et complètement. caractérisée est appelée mainte nant Streptomycine A , et la seconde strepto mycine caractérisée est appelée maintenant Streptomycine B . De plus, on possède des indications d'après lesquelles d'autres strepto mycines se forment et/ou peuvent se former en même temps en changeant les conditions de la culture; au cours du présent exposé, chacun de ces antibiotiques et leurs mélanges seront dénommés streptomycine , à moins d'indications contraires.
La streptomycine et d'autres antibiotiques de caractère basique ont été purifiés jusqu'à présent par divers procédés tous compliqués et/ou inefficaces (et, par conséquent, coû teux). Par exemple, un procédé appliqué dans une large mesure antérieurement comporte, en principe, les opérations suivantes: 1 On traite un liquide primaire contenant la strepto mycine avec du charbon de bois activé qui absorbe sélectivement la streptomycine; 2 on extrait la streptomycine du charbon de bois par un acide minéral aqueux soluble dans l'eau, de préférence en élevant. légèrement la température (par exemple à environ 30 à 50 C);
3 on traite l'extrait avec un réactif acide de précipitation des bases organiques, de préférence l'acide phosphotungstique, pour former un complexe de nature saline, et 4 on décompose le complexe, par exemple avec un acide minéral, pour former un sel purifié, so luble dans l'eau, de la streptomycine.
L'ex pression liquide primaire doit être entendue comme désignant en particulier: a) le liquide de culture obtenu en faisant proliférer un micro-organisme apte à. fournir un antibiotique basique, par exemple le Streptomyces " Gri- seus , dans des conditions et dans un milieu de culture convenant. à. la formation de la streptomycine et en séparant les matières so lides du milieu;
b) le liquide de culture de <B>pouvoir</B> amélioré, obtenu par acidification de la culture (par exemple par l'acide chlor- hydrique <B>ou sulfurique),</B> le liquide étant neu tralisé, et c) le liquide obtenu par extraction par un acide des matières solides séparées de la culture, le liquide étant neutralisé. La présente invention vise à. un perfee- tionnement de ce procédé de purification connu, par le choix de réactifs acides préci pitant les bases particuliers qui donnent de bien meilleurs résultats en ce qui concerne la pureté finale des antibiotiques obtenus que les réactifs utilisés jusqu'à présent. dans ce but.
(acide phosphotunbstique par exemple). L'in vention a pour but. de réaliser de façon simple, efficace et avantageuse la purification des antibiotiques de caractère basique, notamment de la, streptomycine. Il a été découvert que l'on peut, utiliser, comme réactifs acides précipitant les bases, des agents tensioactifs (ou agents de mouil lage) du type des acides inorganiques polF- basiques organiquement substitués, qui réagis sent.
avec des antibiotiques de caractère basi que en formant certaines combinaisons ou com plexes de nature saline peu solubles dans l'eau, et que ces agents tensioactifs acides rempla cent avantageusement les réactifs utilisés jus qu'à présent dans ce but, tels que l'acide phos- photunbstique. Les complexes de nature saline des antibiotiques, obtenus avec ces agents tensioactifs, peuvent être recueillis et trans formés en sels solubles des antibiotiques (le caractère basique.
La présente invention concerne un procédé de préparation de sels purs, solubles dans l'eau, d'antibiotiques de caractère basique, no tamment d'antibiotiques du type de la strepto- myeine, par réaction, dans un solvant, d'un antibiotique impur de caractère basique ou d'un sel impur d'un tel antibiotique, avec un réactif acide précipitant les bases organiques avec formation d'un complexe de nature sa line dudit antibiotique, et décomposition de ce complexe à l'aide d'un acide formant avec l'antibiotique libéré un sel soluble dans ]'eau de cet. antibiotique, à l'état purifié.
Ce procédé est caractérisé en ce qu'on uti lise, comme réactif acide formant ledit com plexe de nature saline, lin agent tensioactif du type des acides inorganiques polybasiques substitués par au moins un reste organique. Le complexe de nature saline ainsi formé est relativement insoluble dans l'eau et. peut être recueilli par filtration, centrifugation ou autre moyen approprié lorsque l'eau sert de solvant.
Lorsque le solvant est -Lui solvant (tel que le méthanol) dans lequel le complexe de nature saline est soluble, on recueille ce com plexe en éliminant le solvant. et en purifiant le résidu, par exemple par lavage avec de l'eau, ou en ajoutant un agent miscible, non solvant du complexe (tel que l'eau). La solu tion dont on part peut être par exemple lui liquide primaire (liquide de culture) conte nant de la streptomycine, ou une solution aqueuse d'une streptomycine partiellement pu rifiée, telle que l'extrait dont. il a été ques tion précédemment.
On peut aussi utiliser un liquide de culture neutre ou acidifié, c'est- à-dire un liquide de culture dont le pH est ajusté à une valeur d'au ph s égale à 7,0 par adjonction d'un acide minéral. Dans ce liquide de culture, l'antibiotique est. présent, totalement. ou en partie, sous forme du sel de l'acide utilisé. Lorsque ce liquide de culture est neutre ou faiblement acide, une partie de l'antibiotique s'y trouve sous forme de sel, mais si ce liquide de culture est fortement acide, la totalité de l'antibiotique s'y trouve sous forme de sel.
Le sel de l'antibiotique régénéré est, beau coup plus pur que l'antibiotique ou le sel de l'antibiotique traité à l'oi-i\;ine et la récupéra tion de l'activité antibiotique, réalisée au cours du traitement (le purification, est d'un ordre élevé. Dans la mise en oeuvre pratique de l'invention, il est. possible d'obtenir ré.-u- lièrement des rendements élevés en sels de la streptomycine relativement purs, possédant (par exemple) un pouvoir antibiotique supé rieur à 400 unités/ni- environ.
Parmi les agents tensioactifs ou agent de mouillage du type des acides inor-ani- ques polybasiques, organiquement substitués, convenant au procédé suivant.
l'invention, on petit citer ceux qui sont représentés par la formule R-0-X-0-Y, dans laquelle R dé signe le radical d'un composé organique hydroxylé ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau, -0-X-0- désigne le radical acide divalent d'un acide inorganique poly- basique soluble dans l'eau (par exemple titi acide sulfurique ou phosphorique) et Y dési gne titi cation du groupe formé par H-f- et les cations donnant des sels solubles dans l'eau avec l'anion R-O-Y-O-. Parmi ces agents de mouillage, on peut.
citer particu lièrement ceux dans lesquels l'acide inorga nique polybasique est l'acide sulfurique, l'acide étant partiellement estérifié avec un alcool aliphatique supérieur, c'est-à-dire les agents de mouillage du groupe formé par les mono-esters aliphatiques supérieurs d'acide sulfurique, et. leurs sels solubles dans l'eau.
D'autres agents de mouillage utilisables du type des acides inorganiques polybasiques or- ganiquement substitués sont ceux du groupe formé par les acides sul.foniques aromatiques. les huiles sulfonées, les dérivés d'acides gras su périeurs sulfonés et leurs sels solubles dans l'eau.
Parmi les alcoyl-esters supérieurs partiels d'acide sulfurique pouvant être utilisés daiLs la mise en aeuvre de l'invention, on petit citer: le groupe des sels de sodium des sulfates des alcools aliphatiques supérieurs synthétiques, tels que C-1H9CH(C'=H5)C"H-ICH(S04 Sa) C2H-ICH(C2H5)'=, C-IH')CH (C2H5) C22H-ICH (S04Na) C EI2CH (CI13 )-', et C4H9CH(C2115)CH2S04Na,
et le groupe des esters partiels d'acide sulfu rique des alcools aliphatiques supérieurs et leurs sels, tels que les sulfates d'octyl-sodium, d'oléy 1- sodium, de e éty 1-sodium, de stéaryl-sodiuni et (le lauryl-sodiuni. Parmi les acides sulfoniques aromatiques, les huiles sulfonées et les dérivés d'acides gras supérieurs sulfonés qui peuvent servir comme agents tensioactifs,
on petit citer les sulfonates de sodium des esters d'acides gras supérieurs et (les amides, tels que le sel de sodium d'oléate d'éthyle sulfoné (ou autre oléate d'alcoyle), par exemple Ct7H33CONFIC2H4S03Na, les sulfonates de sodium (les hydrocarbures de pétrole, le sel (le sodium d'un acide polyalco.0-benzi'lne-sul- fonique contenant 10 atomes de carbone, d'au tres aleoyl-iii,%,
I-sulfonates de sodium et. l'huile < le rouge turc (c'est-à-dire l'huile de ricin sul fonée). Parmi les esters partiels des acides phosphoriques qui peuvent être utilisés, on petit. citer le phosphate dierésylique, la léci thine et un alcool supérieur phosphoré repré senté par la formule (capryle) ) iÇa5p602O. Parmi les acides solubles dans l'eau, reha- tiveiiient forts, qui peuvent servir à transfor nier le complexe de nature saline eir sel Soluble,
on peut citer les acides sulfurique, chlor- hydrique, phosphorique, oxalique, citrique, sulfainique et nitrique.
Pour réaliser un rendement maximum, il convient que l'agent de mouillage soit. sensi blement en excès par rapport à la quantité qui est nécessaire pour combiner la totalité de l'antibiotique contenu dans la solution traitée, la proportion la plus avantageuse de l'agent de mouillage dépendant par suite de la concentration de la solution traitée et du pouvoir de l'antibiotique. En employant la.
quantité stoechiométrique de l'agent de mouil lage (par rapport à l'activité antibiotique de la solution traitée), on peut recueillir utie proportion pratiquement quantitative de l'antibiotique sous forme de complexe de na ture saline; celui-ci est sensiblement pur et permet de recueillir plus facilement l'anti biotique sous forme de sel soluble dans l'eau.
L'agent de mouillage peut être ajouté à une solution de l'antibiotique à l'état solide ou sous forme de solution, ou encore l'anti- biot.ique et l'agent de mouillage peuvent. être toits deux ajoutés à l'état solide à de l'eau (ou autre solvant des réactifs).
Le complexe de nature saline de l'anti biotique et de l'agent (le mouillage peut se séparer dit solvant sous diverses formes: pal, exemple sorts forme de substance huileuse. cireuse ou gélatineuse, ou ne pas se séparer du tout, mais rester à l'état. de suspension clans le solvant (toutes ces formes insoluble, devant être considérées eontme englobées ci après par le terme précipité ).
Suivant sa foiane, on sépare le précipité par filtration, centrifugation, traitement à. l'aide d'un auxi liaire de filtration suivi d'une filtration oa par d'autres moyens ordinaires connus des spécialistes.
La précipitation du complexe de nature saline dépend de la concentration des réac tifs et de la valeur du pli du milieu de la réaction, la précipitation étant niaximuni lorsque la concentration est forte et la valeur du<B>pH</B> comprise entre environ 5 et environ 8 et, de préférence, voisine de 7.
La transformation du complexe de nature saline en un sel soluble dans l'eau de l'anti biotique peut s'effectuer, entre autres, par les moyens suivants: on dissout le complexe dans tin solvant (par exemple le méthanol), on traite la solution avec un acide relativement fort, soluble dans l'eau, et on recueille le sel soluble dans l'eau ainsi foriiié de l'antibioti que, par exemple en ajoutant un agent. misci ble non solvant du sel soluble dans l'eau, tel que l'acétone, ou bien on amène le complexe (en solution) en contact.
intime avec un absor bant (par exemple l'alumine), ou une résine à échange d'anion ayant été antérieurement traitée avec l'acide relativement fort, soluble dans l'eau, choisi, et on recueille le sel soluble dans l'eau ainsi formé de l'antibiotique dans la solution traitée (par exemple en éliminant le solvant) ;
ou bien on dissout le complexe de nature saline dans un solvant organique des savons ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau (par exemple le n-butanol ou l'alcool amylique obtenu par fermentation et raffinage), on amène en contact intime le! solution avec une solution z < < -lueu@e d'un acide relativement fort, soluble dans l'eau, on re cueille la phase aqueuse et on la dessèche (de préférence<I>par</I> congélation,
c'est-à-dire qtt'ou la congèle et on la\souinet à lui vide poussé pour chasser l'eau par sublimation j :
ou bien on dissout le complexe loirs tui solvant dans lequel le sel soluble dans l'eau qu'on désire obtenir est insoluble (par exemple un n ié- lange de méthanol et d'acétone), on traite la solution avec une solution aqueuse d'un acide relativement fort, soluble dans l'eau.
et on re cueille le sel, soluble clans l'eau, précipité de l'antibiotique; on bien on traite une solution du eoniplexe de nature saline avec une solu tion aqueuse d'un acide relativement fort, soluble dans l'eau, en présence d'une résine à échange d'anion, ou par divers autres nio,,
-ens permettant de réaliser lin contact intime et (le faire réagir le complexe av ee l'acide relative ment fort, soluble clans l'eau.
L'invention est. illustrée par les exemples suivants (toutes les solutions on dilution dont. il est question étant des solutions ou des dilutions dans l'eau, à. moins que 'le solvant on le diluant ne soit spécialement indiqué): E,.c.iii.ph <I>1:</I> (i.) _1 :
ï00 ciii'3 d'tin filtrat (le culture con tenant de la streptomycine (obtenu en fai sant proliférer le streptomvces griseus en culture submergée en milieux aqueux conte nant de la farine de soja, du dextrose et dit chlorure de sodium, en acidifiant la culture ensemencée et en la filtrant)
a@-ant un pou- voir antibiotique de ?5(i et -Lui )iii de 6,5 sont ajoutés 1? emS, d'une solution à '15 11/o de C4H9CFI(C'2[-15)(y'2FI4CF1(SOi@#ja )C_2IICI3(C2115 i'-. en agitant, et on continue à. agiter pendant une demi-heure.
L'huile qui se sépare est titi complexe de nature saline de streptomycine et de l'agent. de mouillae et contient envi- r, ron 94 % de l'activité du filtrat de culture. Le complexe de nature saline ainsi obtenu est dissous dans le méthanol, puis re- précipit.é encore une fois en ajoutant un vo lume égal d'eau:
on le redissont dans le mé- thanol à. 80 % et on le fait passer dans une colonne d'alumine, antérieurement lavée avec l'acide chlorlivdridne ,jusqu'à un pli de -1,
1. On reetieille le liquide effluent (environ 250 cni.3, v compris le méthanol de lavage), on ajoute un volume égal d'eau, on chasse le méthanol par distillation dans le vide, on éli mine le complexe de nature saline éventuelle ment. non décomposé, on règle le pH de la solution aqueuse restante 'a une valeur de 5,5 et on la sèche par congélation. On obtient environ 1,:
i5 g- de elilorhydrate de strepto- nivcine ayant un pouvoir de 320 unités/iul- (avec mi rendement d'environ 40 11!o).
Exemple <I>2:</I> Un ajoute<B>0,5</B> < , d'un ester partiel d'acide sulfurique d'un alcool aliphatique supérieur dans 20 eniS d'eau à .500 em@ d'un extrait contenant de la streptomycine impure ayant un pouvoir de 300 unit:
és/em3 et un pH de 6,5 (obtenu en traitant un filtrat de culture con tenant de la streptomvcineavec un, charbon de bois activé et en extra@ ant la strepto- ni.-cine du charbon de bois par l'acide chlor- 1ivdrique, sulfurique ou nitrique dilué), on agite la solution trouble pendant une heure et on sépare par filtration le précipité floculant formé.
Le complexe ainsi obtenu, de nature saline, de streptomycine et de l'agent de mouillage, contiens- environ 701/o de l'activité de l'extrait; on le transforme en un sel soluble dans l'eau de streptomycine, par exemple de la manière décrite dans l'exemple 4 ci-après.
<I>Exemple<B>à,:</B></I> <I>(1</I>) 7.6 d'une solution à 2:"> <B>14</B> de (_'-1H9CI-I ( ('22115 ) t "-I-l.@t'1-I (0@@; a ) ( @@lI@CII ( ( ' @IIS ) @, sont ajoutés en agitant, en une heure. à 7 litres d'un extrait contenant du nitrate de streptomycine ayant un pouvoir de 195 uni- tés/em3 et un pH de 7,0;
on laisse le précipité formé reposer pendant 1 à '? heures à 5 C environ et on le filtre. Le complexe de nature saline ainsi obtenu de streptomycine et de l'agent de mouillage contient. environ 93 % de l'activité de l'extrait.
b) On comprime, ou traite de toute auire manière pour éliminer l'eau entraînée, le co@n- plexe obtenu et on le dissout dans une quan tité de méthanol à 90-1001/o suffisante (sui vant la teneur en eau du complexe ainsi pai-- tiellenient déshydraté)
pour foi-nier une solu- tion dans 100 eni3 de méthanol à 90%; puis on fait passer la. solution dans une colonne de 2,5 X 2:5 cni de résine à éclianbe d'anion dont. le pli a été antérieurement réglé à une valeur de ',:5 par addition d'acide clilorlivdrique dilué.
On recueille le liquide effluent en deux portions de 125 e nia (v compris le méthanol de lavage) et on traite chaque portion en ajou tent un volume d'eau égal, en chassant le mé- tlianol par distillation dans le vide, en ré glazit le pli de la solution aqueuse restante à une valeur de<B>5,5</B> par un traitement avec une résine à échange d'anion neutre, en la filtrant et en la séchant par congélation.
On obtient, avec la, première et avec la seconde portion du liquide effluent respectivement environ 0,8 g de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 679 nrlltés/mg et environ 0,1. g d'un pouvoir d'environ 425 unités/mg, avec un rendement total d'environ 73,1%.
b) (variante) : Un complexe de nature sa line ainsi obtenu en partant d'une charge d'extrait d'une activité de<B>860000</B> unités (pe sant environ 4 g) est. dissous dans 150 eni3 de méthanol à 90%;
la solution est agitée avec 50 g d'une résine à échariT e d'anion, dont le pH a été antérieurement réglé par addition (l*aeide elilorhvdi-ique dilué.
Après filtration et séchage par congélation du filtrat, on ob tient environ 0,8\<B>-</B> de elilorhvdrate de streptoniveine d'un pouvoir d'environ 616 uni tés/mg et on peul, obtenir un supplément d'en viron 0,
14 g de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir de 635 unités/mg dans le métha- nol à 90 % de lavage de la. résine, avec un rendement total de 68 0/0.
Exemple <I>1:</I> 1,5 g d'un complexe de nature saline de streptomycine et d'un ester partiel. d'acide sulfurique d'un alcool aliphatique supérieur, obtenu par exemple de la manière décrite dais l'exemple 2 (dont la streptomycine a Une acti vité de 376 000 unités déterminée par un essai chimique) est dissous dans 25 cnis de métha nol, et on ajoute 25 em3 d'acétone.
Puis on ajoute 0,5 cm-3 d'acide chlorhydrique concen.. tré (jusqu'à un pH = environ 1,2) et ensuite 50 cms de plus d'acétone. On filtre le préci pité obtenu (chlorhydrate de streptomycine) et on le dissout dans l'eau.
On règle la valeur du pH de la solution à 6,8 par addition d'Une résine neutre à échange d'anion et on la sèche par congélation. On obtient ainsi environ 0,7 g de chlorhydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 425 uni tés/mg (rendement, environ 79 0/0). Exei3Lp/f @: <B><U>'</U></B>80 em3 d'une solution à<B><U>'</U></B>5 /o d'un ester partiel d'acide sulfurique d'un alcool alipha tique supérieur sont ajoutés lentement à. une solution de 50 g de sulfate de :
streptomycine partiellement. purifiée dans ?4- litres d'eau distillée, d'un pouvoir de 1000 unités/em3: le précipité floculant blanc, qui s'est formé, est isolé par centrifugation et séché dans le vide (10 mm) à la température ambiante pen dant 13 heures. Le complexe de nature saline ainsi obtenu pesant environ 57 g a un pou voir d'environ 221 unités/mg.
En employant <B>310</B> cm-', d'unie solution clarifiée (traitée par le carbone) à 25 % de l'agent de mouillage C4H9CH(C2H5)C2H4CH(S04Na)C2H4CH(C2H5 )2, à titre de solution de l'agent de mouillage de l'exemple précédent, on obtient un complexe de nature saline d'un pouvoir d'environ 293 unités/mg avec un rendement d'environ 50 g.
Exeynple <I>6:</I> On ajoute, en agitant, 2,1 cm- d'une solu- tion à 25 % de C4H9CH(C2H5)C2H4CH(S04Na)C2H4CH(C'2H5 )2, à une solution de 0,5 g de sulfate de dihydro- streptomycine dans ?50 eni3 d'eau, ayant un pouvoir de 1210 unités/cm?,,
et on recueille par filtration le complexe de nature saline précipité (contenant plais de 83 % de l'acti- vité de la solution traitée).
En traitant de la même manière une solu tion aqueuse de chlorhydrate de streptothri- cine d'un pouvoir de 500 unités/mg, on obtient le complexe de nature saline correspondant de streptothricine. En transformant ces com plexes en sels solubles de dihy drostreptom @-- cine et de streptothricine respectivement, on obtient ces sels à l'état purifié.
Exemple <I>i</I> 60 g d'un complexe de streptomycine et de l'agent de mouillage obtenu de la manière dé crite dans le paragraphe a) de l'exemple 1, ayant un pouvoir de 243 unités/mg, sont dis sous dans 400 cms d'acétate de méthylamyle (acétate-2 de 4-méthylpentyle); on ajoute 40 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et on agite vigoureusement le mélange. Puis on ajoute 40 cm3 d'eau et on continue à. agiter pendant 10 minutes.
On recueille la couche aqueuse qui se forme en se séparant, on la neutralise avec Une résilie neutre à éclian-e d'anion et on la filtre. Le filtrat et le liquide de lavage d'un volume total d'environ 190 eni ont un pouvoir d'environ 65 000 unités/em3 (avec un rendement d'eilviron 85%). En lavant la couche d'acétate de métliylam@-le avec 60 em3 d'eau, en neutralisant le liquide de lavage et en filtrant,
on obtient un filtrat supplémentaire d'un pouvoir de 16 000 uni tés/cm3 (le rendement total étant d'environ 970/0). Le chlorhydrate de streptomycine so lide obtenu par séchage par congélation a Un pouvoir d'environ 575 unités/mg.
<I>Exemple 8:</I> 20 g d'un complexe de nature saline de streptomycine et de l'agent de mouillage ob tenu de la manière décrite dans le paragra phe a) de l'exemple 1 (la streptomycine de ce complexe ayant une activité de .12-10 000 uni tés) sont dissous dans 100 ems de méthanol. et on ajoute Lille hoitillie de 40 g d'une résine à échange d'anion dans 300 em3 d'eau, avec un pll de 6,5. Puis, tout en agitant, et mainte- tiant le mélange à une température de 50 à.
55 C, on '- ajoute de l'acide chlorhydrique concentré goutte à goutte dans des conditions de nature à maintenir le pl, à une valeur de 3,0 à 3,5. (On peut déterminer le moment où la décomposition est terminée en observant l'augmentation du précurseur de inaltol dan: la solution aqueuse).
Au bout d'une heure, pendant. laquelle on a ajouté environ 3,5 em3 d'acide chlorhydrique concentré, on laisse le pH atteindre une valeur de 5,0 à 5 ,5, on filtre la solution, on élimine le méthanol du filtrat par évaporation dans le vide et. on sèche par congélation la solution résiduelle en obtenant environ 6,5 g de chlorhydrate de strepto- inycine d'un pouvoir d'environ<B>578</B> unités/m2# avec un rendement d'environ 901/o. <I>Exemple 9:
</I> 15 g d'un complexe de nature saline de streptomycine et d'un agent de mouillage ob tenu de la manière décrite dans le paragra phe a) de l'exemple 1 (la streptomycine du complexe ayant une activité de 2 960 000 uni tés) sont dissous dans 1.00 cln3 de méthanol et on fait passer 1-ICI sec dans la solution, jusqu'à ce qu'il ne se forme plus de précipité. Puis on dilue le mélange avec 500 em3 d'acé tone, et le précipité est séparé par filtration et dissous dans 100 em3 d'eau.
On règle le pli de la solution à une valeur de 5,.5 par addition , d'une résine neutre à échange d'anion, on filtre la solution et on sèche le filtrat par congélation en obtenant environ -1,96 n de elilorliydrate de streptomycine d'un pouvoir d'environ 38:î unités/nlg- avec un ren dement de 64,5 0/0.
Exemple <I>10:</I> n) 3785 litres d'un filtrat de culture conte nant (le la streptomycine d'un pouvoir de 100 unités /em3 et dont le pH a une valeur comprise entre 3 et -1 sont chauffés à<B>-')0, C</B> et neutralisés à. une valeur du pli de 7,5 0,:
.' par addition d'une solution de soude causti que à 1011/o (17,0 litres environ étant néces saires à. cet. effet.), et on traite la solution neutralisée avec 1.1.3,7 kg de charbon activé et 9,0 kg de matière filtrante. On agite la bouillie pendant une heure et on la filtre. On lave le tourteau de carbone avec au moins <B>3<U>3</U></B> 78 litres d'eau et on le sèche par un courant d'air.
950 litres du second extrait provenant d'une extraction antérieure, ainsi qu'il est dé crit ci-après, sont amenés à un volume de ''850 litres par addition de l'eau de ville. On ajoute le tourteau de carbone du paragraphe précédent, on maintient la bouillie à une tem pérature de 35 à 40 C en l'agitant. et on règle le pH de la suspension à une valeur de 2,2 0,2 par l'addition d'acide nitrique à. 10 0/0 (une quantité d'environ 6,39 kg étant nécessaire à cet effet). Après avoir agité pendant une heure, on élimine le carbone par filtration et séchage par un courant d'air et on recueille le filtrat (ou premier extrait).
On introduit le carbone ainsi extrait dans 950 litres d'eau fraîche de ville, en vue d'une seconde extraction, que l'on effectue de la ma nière décrite dans le paragraphe précédent cil ajoutant une faible quantité d'acide nitriqué à 10 0/0 (s'il y a lieu) pour régler de nouveau le pli à une valeur de 2,2 0,2. Le second extrait ainsi obtenu sert à la première extrac tion décrite dans le paragraphe précédent. Le rendement total fourni par le filtrat de cul ture est d'environ 82 /o.
On règle le pli du premier extrait à une valeur de 7,5 = 0,1 par addition d'une solu tion de soude caustique à 10% (15,9 litres étant nécessaires à cet effet), tout en mainte nant la température à. 10 C ou au-dessous. On ajoute 3,40 kg d'une matière filtrante et on filtre la bouillie.
On ajoute au filtrat inco lore (exempt de fer), à une température de 10 à 15 C, la moitié du volume total d'une solir- iion à 25 % de C411\)CH(C21-1.' C21I4CH (SO4Na.)C2H-ICH(C2H5)= nécessaire à la précipitation de la strepto mycine (cette quantité étant basée sur l'acti vité de l'extrait, déterminée par un essai chi mique en proportion de 1 cm3 par 92400 imités de streptomycine). Une fois cette por tion de l'agent de mouillage ajoutée, on com mence l'essai de la détermination de la fin de la précipitation.
(On filtre à cet effet un échantillon de la bouillie et on recueille envi ron 2 cm-3 du filtrat, puis on ajoute au filtrat une à deux gouttes d'acide phosphotungstique à 50 % qui forme un précipité, si la précipi- tation par l'agent. de mouillage est incom plète).
On ajoute alors -Lui complément. de la solution de l'agent de mouillage par portions d'un litre, jusqu'à ce que l'essai indique que la précipitation est terminée (environ 13,0 kg ou 22,8 litres d'une solution à 25 % de l'agent de mouillage étant nécessaires à cet effet). On agite la charge pendant -une demi-heure et on recueille la matière solide (qui est le com plexe de nature saline) par centrifugation.
Le rendement fourni par le filtrat de culture est d'environ 73,8 %, le rendement de la pré- cipitation étant d'environ 90 %.
b) Le complexe ainsi obtenu à l'état hydraté est dissous dans lé méthanol à 90 0/0, à une température de 20 à 25 C, en propor tion de 15 g pour 100 cms de solvant (plus de 22,7 litres de méthanol, étant nécessaires à cet effet); on filtre la solution, on ajoute lentement. au filtrat une quantité d'acide chlorhydrique concentrée suffisante pour dé composer le complexe de nature saline et abaisser le pH à une valeur de 0,8 0,1 (0,408 kg d'acide étant nécessaire à cet effet) ; et on verse le mélange dans 87,9 kg d'acétone et on le laisse reposer pendant une heure à une température de 5 à 10 C.
Le précipité (chlorhyrate de streptomycine) est filtré à l'état aussi sec que possible sur un filtre à. vide, puis est dissous dans l'eau avec une pro portion de 100 ems d'eau pour 10 g de com plexe de nature saline traité (22,7 litres d'eau environ étant nécessaires à. cet effet).
On neu tralise la solution en l'agitant avec environ 0,49 kg de résine neutre à échange d'anion, dont. le pH est. 6,5, pour régler le pH du ehlor- hydrate de streptoniyeine à une valeur com prise dans l'intervalle de 6,0 à 6,5, entre les limites duquel il est le plus stable.
On filtre le mélange ainsi obtenu; on distille le filtrat pour le débarrasser du méthanol et de l'acé tone sous une pression de 1<B>5</B> à.20 min et on le filtre, puis on.le sèche par congélation. .Le rendement en chlorhydrate de streptomycine ainsi fourni par le filtrat de culture est d'en- viron 51,
8 % et le rendement de la décom- position d'environ 70%.
La résine neutre à échange d'anion petit être préparée de la manière suivante : On intro duit 4,53 kg d'une résine à échange d'anion dans 37,85 litres d'eau de ville. On ajoute une quantité suffisante d'une solution de carbonate de sodium à. 1011/o pour régler le pH à une valeur de 10,5 - 0,2, et on lave la résine alcaline avec de l'eau distillée jusqu'à ce que le pH du milieu aqueux atteigne 6,:5. On conserve la résine neutre dans le milieu aqueux jusqu'à. ce qu'on s'en serve à la neu tralisation, c'est-à-dire qu'on la filtre dans le milieu aqueux un instant avant de s'en servir.
b) (variante) : 6,88 kg du complexe ale nature saline déshydraté sont. dissous dans le méthanol absolu à une température de 20 à 25 C en proportions de 20<B><U>-</U></B> du complexe pour 100 cm3 de méthanol. à 100% (34 litres au moins de méthanol. étant nécessaires à cet effet).
On filtre la solution; on ajoute au filtrat 20,63 kg d'une résine neutre à échange d'anion dont le pH est. 6,5 et on ajoute une quantité d'eau à la bouillie ainsi obtenue, suffisante pour abaisser la concentration du méthanol à. 9_51/o (102,2 litres d'eau environ étant nécessaires à. cet effet.).
La bouillie, dont le volume est d'environ 159 litres, est chauffée à une température de 50 à 55 C et est maintenue à cette température pendant qu'on y ajoute 1,89 litre d'acide chlorhydri que concentré dans des conditions de nature à, maintenir le pH du mélange à une valeur com prise entre 3,0 et 3,5. Puis on agite le mélange jusqu'à ce que le pH atteigne sa valeur maxi mum comprise entre 5,6 et. 6,2 (si le pH est inférieur à 6, on ajoute de faibles quantités de résine neutre à. échange d'anion jusqu'à ce que la valeur finale du 1i11 soit comprise entre 6 et 6,5).
Puis on filtre la bouillie et on lave la résine avec une quantité d'eau suffisante pour éliminer le chlorhydrate de strepto- inveine qui y adhère éventuellement; le filtrat et l'eau de lavage combinés, dont le volume est d'environ<B>179,8</B> litres et le pouvoir d'eji- viron 6500 unités/em3, sont alors concentrés à un volume d'environ 11,3.5 litres et. on re cueille le chlorhydrate de streptomycine par séchage par congélation.
Le rendement. de la décomposition est de 60 à 80%.
Parmi les sels purs d'autres antibiotiques basiques du type de la streptomycine, autres que ïa streptoniveine A et la streptomycine B et qui peuvent être préparés suivant le procédé selon l'invention, on peut citer les sels de la. dihydrostreptomy cine A, de la dihydro- streptomycine B et de la streptothricine.
Les sels purs d'antibiotiques basiques du type de la streptomycine obtenus par le pro cédé suivant l'invention peuvent être purifiés encore eii appliquant. (le nouveau le même procédé de purification. De même, ils peuvent subir une purification préliminaire ou ulté rieure par d'autres procédés, en particulier par un (les procédés suivants:
1" On amène en contact intime une solution aqueuse de l'antibiotique avec un acide carboxylique sen sibleiiient insoluble dans l'eau et un solvant organique de l'acide carboxylique ne se iné- langeant sensiblement pas avec l'eau, on re cueille la phase du solvant organique et on transforme le complexe de nature saline ,1e l'antibiotique qu'elle contient en un sel solu ble dans l'eau de l'antibiotique. 2" On traite une solution aqueuse de l'antibiotique avec un sel soluble dans l'eau d'un acide carboxy lique sensiblement insoluble dans l'eau;
oii recueille le complexe précipité de l'ant.ibio- t.ique et de l'acide carboxylique et on le trans- forine en un sel soluble dans l'eau de l'ant.i- biot.ique. R On amène en contact. intime une solution aqueuse de l'antibiotique avec un agent de mouillage du type d'un acide inorga nique polybasique organiquement substitué et un solvant. organique des savons ne se mélan geant sensibieineiit pas avec l'eau:
on recueille la. phase chi solvant organique et oii trans forme le dérivé obtenu de l'antibiotique qu'elle contient en un sel soluble dans l'eau de l'anti biotique.