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Il Procédé de préparation et de purification de-s a 0- tiques Il.
L'invention a trait aux antibiotiques basiques ou alcalins du type de la streptomycine c'est-à-dire aux éléments du genre se composant de la streptomycine et des composés basiques à action antibiotique qui, comme la strep- tomycine, peuvent former des sels solubles dans l'eau avec des acides tels que l'acide sulfurique et des sels insolu- bles dans l'eau avec des réactifs précipitant les bases organiques, par exemple les dérivés de streptomycine, tels que la dihydrostreptomycine et les antibiotiques à action analogue, tels que la streptothricine.
En 1944, Schats, Bugie et Waksman (Proc. Soc.
Exp. Biol. Med. 1944, 57, 244) ont montré qu'un antibiotique
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puissant appelé "streptomycine" se forme au cours de la or croissance de l'/ganisme "Actinomyces griseus" (appelé maintenant "Streptomyces griseus") et on a constaté, depuis, que cet antibiotique est extrêmement utile en clinique médicale.
On a découvert ensuite que plusieurs strep- tomycines se forment en même temps. La première strepto- mycine obtenue sous forme cristallisée, pure (à l'état de reineckate) et complètement caractérisée est appelée maintenant "streptomycine A" ; laseconde streptomycine caractérisée est appelée maintenant "Streptomycine B".
De plus, on possède des indications d'après lesquelles d'autres streptomycines se forment et/ou peuvent se for- mer en même temps en changeant les conditions de la cul- ture ; et il doit être bien entendu que chacun de ces anti- biotiques et leurs mélanges (sous forme de base libre ou de leurs sels solubles dans l'eau) seront désignés par le mot "streptomycine" à moins d'indication contraire.
La streptomycine a été purifiée jusqu'à présent par divers procédés, tous compliqués et/ou inefficaces (et par conséquent coûteux). Par exemple un procédé ap- pliqué dans une large mesure antérieurement à l'inven- tion comporte, en principe les opérations suivantes : 1 on traite un liquide primaire contenant la streptomy- cine avec du charbon de bois activé qui adsorbe sélecti- vement la streptomycine; 2 on extrait la streptomycine du charbon de bois par un acide minéral aqueux soluble dans l'eau, de préférence en élevant légèrement la tempé- rature (par exemple à environ 30-50 C); 3 on traite l'extrait avec un réactif de précipitation des bases organiques, de préférence l'acide phosphotungstique ; et 4 on décompose le précipité.
L'expression "liquide pri- maire contenant la streptomycine" doit être considérée comme désignant en particulier : a) le liquide de culture
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obtenu en faisant proliférer le streptomyces griseus dans des conditions et dans un milieu de culture convenant à la formation de la streptomycine et en séparant les ma- tières solides du milieu ; le liquide de culture de pouvoir amélioré obtenu par acidification de cette cultu- re (par exemple par 1?acide chlorhydrique ou sulfurique), le liquide étant neutralisé ; etc) le liquide obtenu par extraction par un acide des matières solides séparées de la culture, le liquide étant neutralisé).
Un des objets de l'invention réside en procédés simples, efficaces et avantageux à d'autres points de vue de purification des antibiotiques basiques du type de la streptomycine et en particulier, de la streptomycine; et un autre objet de l'invention réside dans des procédés de préparation de certains dérivés du type salin (réaction d'un acide et d'une base) des antibiotiques basiques du type de la streptomycineo
Il a été découvert que les antibiotiques basi- ques du type de la streptomycine réagissent avec des agents à activité superficielle ou agents de mouillage du type des acides inorganiques polybasiques organique- ment substitués en formant certaines combinaisons du type salin, qui sont beaucoup moins solubles dans l'eau et plus solubles dans certains solvants organiques ne se mé- langeant pas avec l'eau que les antibiotiques;
et il a été encore découvert que ces dérivés du type salin des antibiotiques basiques peuvent être décomposés pour recueillir les antibiotiques.
Les procédés suivant l'invention consistent en principe à amener en.contact intime une solution aqueuse d'un antibiotique basique du type de la streptomycine (en particulier la streptomycine) avec un agent à activité superficielle, ou agent de mouillage, du type d'un acide inorganique polybasique organiquement substitué et un
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solvant organique, ne se mélangeant sensiblement pas à l'eau, des savons (y compris les savons invertis, c'est- à-dire ceux dans lesquels la cation est organique au lieu de l'anion, comme dans les savons ordinaires), de préfé- rence avec un alcool aliphatique ne se mélangeant sensible- ment pas avec l'eau et, en particulier, avec des mélanges d'alcool amylique;
les procédés de purification suivant l'invention consistent, en principe, à amener en contact intime une solution aqueuse d'un antibiotique basique impur du type de la streptomycine, (par exemple un liquide primaire contenant de la streptomycine ou une solution aqueuse de streptomycine partiellement purifiée, tel que l'extrait dont il a été question précédemment) avec un agent à activité superficielle du type d'un acide inorga- nique polybasique organiquement substitué et un solvant organique des savons ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau, à recueillir la phase du solvant organique, et à transformer le dérivé du type salin de l'antibiotique qu'elle contient en un sel soluble dans l'eau de l'anti- biotique,
de préférence en amenant en contact intime la solution dans le solvant organique avec un acide aqueux soluble dans l'eau relativement fort (en particulier avec un acide minéral aqueux soluble dans l'eau, relativement fort), et à recueillir la phase aqueuse. Le sel soluble dans lteau (de l'antibiotique basique du type de la strep- tomycine) recueilli dans la solution aqueuse ainsi obtenue est beaucoup plus pur que l'antibiotique traité, et la récupération de l'activité antibiotique réalisée au cours du traitement de purification est d'un ordre élevé. En appliquant ltinvention dans la pratique, il est possible d'obtenir régulièrement des rendeents élevés en strepto- mycine relativement pure possédant par exemple un pouvoir antibiotique supérieur à 400 unitésjmg environ.
Parmi les agents à activité superficielle du
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type des acides inorganiques polybasiques organiquement substitués convenant au procédé suivant l'invention, on peut citer ceux qui sont représentés par la formule R-O-X-O-Y dans laquelle R désigne le radical d'un composé hydroxyle organique ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau; -0-X-0- désigne le radical acide divalent d'un acide inorganique polybasique soluble dans l'eau, (par exemple l'acide sulfurique ou phosphorique), et Y désigne un élément du groupe formé par H et les sels solu- bles dans l'eau formant des cations avec l'anion R-0-X-0.
Parmi les agents de mouillage convenant au procédé suivant l'invention, on peut citer particulièrement ceux dans les- quels l'acide inorganique polybasique est l'acide sulfuri- que, l'acide étant partiellement estérifié avec un alcool aliphatique supérieur, c'est-4-dire les agents de mouil- lage du groupe formé par les monoesters (aliphatiques su- périeurs) d'acide sulfurique et leurs sels solubles dans l'eau.
D'autres agents à activité superficielle pouvant être choisis de préférence du type des acides x inorgani- ques polybasiques organiquement substitués convenant au procédé suivant l'invention sont ceux du groupe formé par les acides sulfoniques aromatiques, les huiles sulfonées, les dérivés d'acides gras supérieurs sulfonés et leurs sels solubles dans l'eau.
Parmi les alkyl-esters supérieurs partiels d'acide sulfurique pouvant être utilisés dans l'applica- tion de l'invention dans la pratique, on peut citer : le groupe des sels de sodium des sulfates des alcools aliphatiques supérieurs synthétiques, tels que C4H9CH
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(C2H5)G2H4CH(S04Na)C2CH(C2H5)2 (par exemple le Tergitol Penetrant 7), C'H9CH(CZHS)CZH'CH(S0*Na)CHZCH(CH3)2 (par exemple le Tergitol Penetrant 4), et C4H9CH(C2H5)CH2SO4Na (par exemple le Tergitol Penetrant 08); et la série des
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esters partiels d'acide sulfurique des alcools aliphati- ques supérieurs et leurs sels, tels que les sulfates d'octyl sodium, d'oleyl sodium, de cétyl sodium, de stéa- ryl sodium et de lauryl sodium (par exemple l'Aurinol, le Wétanol, les Duponols et les Gardinols).
Parmi les acides sulfoniques aromatiques, les huiles sulfonées et les dérivés d'acides gras supérieurs sulfonés qui peuvent servir dans l'application de l'invention dans la pratique, on peut citer les sulfonates de sodium des esters d'aci- des gras supérieurs et des amides, tels que le sel de sodium d'oléate d'éthyle sulfoné (ou autre alkyl oléate) (par exemple l'Igepon AP Extra) et C17H33CONHC2H4SO3Na (par exemple l'Igepon T); les sulfonates de sodium des hydrocarbures de pétrole (par exemple l'Ultrawet); le sel de sodium d'un acide polyalkyl benzène sulfonique conte- nant 10 atomes de carbone (par exemple l'Ultrawet 40A), et d'autres alkyl-aryl-sulfonates de sodium (par exemple le Nacconol NRSF); et l'buile de rouge turc (c'est-à-dire l'huile de ricin sulfonée).
Parmi les esters partiels des acides phosphoriques qui peuvent être utilisés dans la mise en oeuvre pratique de l'invention, on peut citer le phosphate de dicrésyle, la lécithine et un alcool supé- rieur phosphoré représenté par la formule (capryle)5Na5- P 6 0 20 (par exemple le W.A. 58).
Les solvants organiques des savons ne se mélan- geant sensiblement pas avec l'eau, qui peuvent être uti- lisés dans la mise en oeuvre pratique de l'invention sont entre autres : les alcools aliphatiques, tels que l'alcool n-amylique (1-pentanol), n-butanol (1-butanol), butanol secondaire, méthyl-isobutyl-carbinol, méthyl-amyl-carbinol, méthyl-isopropyl-carbinol, isobutyl-carbinol, 2-éthyl- hexanol, et les mélanges d'alcool amylique, tels que l'al- cool amylique de fermentation, les esters d'alcool alipha- tique des acides gras inférieurs, tels que l'acétate de ,
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méthyl-isobutyl-carbinol et l'acétate d'amyle; les cétones aliphatiques, telles que la méthyl-isobutyl-cétone ; éthers aliphatiques, tels que le di-n-butyl éther et le diéthyl éther ; hydrocarbures, tels que le benzène et le toluène;
et les hydrocarbures halogénés, tels que le dichlorure d'éthylène, le chloroforme et le téthrachlorure de carbone.
Parmi les acides solubles dans l'eau, relative- ment forts, qui peuvent servir à recueillir les antibio- tiques dans leurs combinaisons du type salin avec les agents à activité superficielle, on peut citer l'acide sulfurique, chlorhydrique, phosphorique, oxalique, citri- que, sulfamique et nitrique.
Pour réaliser un rendement maximum, il convient que l'agent à activité superficielle soit en excès par rapport à la quantité qui est nécessaire pour combiner la totalité de l'antibiotique contenu dans la solution traitée, la proportion la plus avantageuse dépendant, par suite, de la concentration de la solution traitée et du pouvoir de l'antibiotique.
Suivant une des mises en oeuvre de l'invention, une solution aqueuse d'un antibiotique impur du type de la streptomycine est amenée en contact intime avec une solution de l'agent à activité superficielle dans un sol- vant des savons ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau; la phase du solvant organique est recueillie et est amenée en contact intime avec une solution aqueuse d'un acide relativement fort soluble dans l'eau; la phase aqueuse est recueillie et séchée, de préférence par congé- lation (c'est-à-dire qu'on la congèle et on lui fait subir l'action d'un vide poussé pour séparer l'eau par sublimation).
On peut aussi réaliser le contact intime entre la solution de l'antibiotique, l'agent à activité superficielle et le solvant organique en mélangeant d'a- .
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bord de la solution de l'antibiotique avec l'agent à activité super- ficielle et en amenant ensuite le mélange en contact intime avec le solvant organique; ou en mélangeant d'abord la solution de l'anti- biotique avec le solvant organique et en amenant ensuite le mélange en contact intime avec l'agent à activité superficielle.
De préférence et surtout lorsque le solution aqueuse de l'an- tibiotique impur traité est un filtrat de culture, la solution obte- nue dans le solvant organique est lavée à l'eau avant de la traiter avec la solution :aqueuse d'acide, l'eau de lavage entraînant une quantité considérable de matières solides inactives, mais pratique- ment pas d'antibiotique.
Le coefficient de répartition de la combinaison du type salin de l'antibiotique et de l'agent à activité superficielle entre la phase .' aqueuse et la phase du sol- vant organique dépend de la valeur du pH. Par exemple lorsqu'on emploie une solution dans l'alcool n-amylique de l'Ultrawet 40A, la quantité de streptomycine qui se sépare de la solution aqueuse est maximum lorsque le pH de la phase aqueuse est réglé à une valeur comprise entre environ 2 et environ 8, de préférence entre environ 3 et 4.
Suivant une variante, le combinaison du type salin de l'antibiotique et de l'agent à activité super- ficielle peut être recueillie dans la solution dans le solvant organique et être transformée ensuite en un sel soluble dans l'eau, ou être utilisée telle quelle à titre d'agent thérapeutique. Par exemple, on peut recueillir le dérivé du type salin de l'antibiotique en chassant le solvant organique par évaporation dans le vide (ou lorsque le solvpnt organique se prête à cette manière d'opérer, comme par exemple dans le cas du benzène, en séchant la solution par congélation). On peut aussi obtenir le dé- rivé du type salin de l'antibiotique plus directement par le procédé de précipitation décrit dans le brevet déposé
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en lèlgique, ie é, i/Ài<1 sous le n03f,f1-Par la demande-
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resse.
Ces dérivés du type salin des antibiotiques sont généralement solubles dans l'huile ou peuvent s'y disper- ser ; ils peuvent servir en thérapeutique, par exemple en les administrant par la bouche tels quels ou en milieux huileux pour traiter les maladies intestinales en ayant recours aux fonctions intestinales pour mettre l'antibio- tique en liberté sous forme soluble dans l'eau) ou en les administrant également en milieux huileux (ou par impré- gnation dtune pastille d'une matière solide) pour obtenir une action antibiotique prolongée. Lorsqu'on se propose de préparer le dérivé du type salin de l'antibiotique au lieu de le purifier, on peut employer une solution aqueu- se reconstituée de l'antibiotique (par exemple une solu- tion aqueuse de l'antibiotique très purifié ou pur).
Les diverses opérations dtextraction des procé- dés suivant ltinvention peuvent évidemment s'effectuer par les procédés de la technique à contre-courant ; les solutions épuisées et/ou les extraits peuvent servir de nouveau dans le procédé permettant de recueillir encore l'activité et/ou de concentrer encore le produit extrait.
Par exemple le liquide épuisé contenant l'antibiotique peut être extrait avec une nouvelle charge d'agent de mouillage et de solvant organique ; solvant organique épuisé peut être extrait avec une nouvelle charge d'une solution aqueuse d'acide relativement fort soluble dans l'eau ou ce solvant peut servir avec une nouvelle charge du liquide contenant l'antibiotique; et/ou l'extrait aqueux d'acide peut servir à traiter une nouvelle charge de la solution dans le solvant organique, pour en augmen- ter la concentration en antibiotique.
L'invention est plus aisée à comprendre d'après les exemples suivants, (toutes les solutions ou dilutions dont il est question étant des solutions ou des dilutions dans l'eau, à moins que le solvant ou le diluant ne soit
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spécialement indiqué):
EXEMPLE 1 a) Un dissout 350 mg de chlorhydrate de strep- tomycine dans 70 cm3 d'eau saturée de n-butanol ; mélan- ge la solution avec 70 cm3 d'une solution à 7 % d'alcool oléylique sulfaté (par exemple d'Aurinol DS) dans le n-butanol saturé avec de l'eau; on agite le mélange dans un entonnoir séparateur pendant 5minutes à la betuperet bu- re ambiante et on recueille la couche de n-butanol formée en laissant reposer le mélange.
On extrait ainsi environ 94,9% de la streptomycine de la solution aqueuse dans le n-butanol (sous forme de combinaison du type salin de streptomycine et d'alcool oléylique sulfaté).
De même, on peut extraire environ 90-98 % de la streptomycine contenue dans les solutions aqueuses en concentrations de 400-4000 unités/cm3 dans le n-butanol à l'aide d'autres esters partiels d'acide sulfurique d'al- cools aliphatiques supérieurs (par exemple de Duponol-C ou d'huile de rouge turc).
En extrayant de la même manière un filtrat de culture contenant de la streptomycine (obtenue en faisant
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proliférer le sbreptomycos grisous eu cu.Liuie bubmyéd en milieux aqueux contenant de la farine de soja, du dex- trose et du chlorure de sodium, en acidifiant la culture ensemencée et en filtrant) ayant un pouvoir de 391 unités/ cm3 et un pH d'environ 5-7, et de préférence d'environ 6,1, on extrait environ 80-95% de l'activité du filtrat de culture dans le n-butanol ;
en extrayant de la même manière un extrait contenant de la streptomycine (obtenu en traitant un filtrat de culture contenant de la strepto- mycine avec du charbon de bois activé et en éliminant la streptomycine du charbon de bois par l'acide chlorhydrique, nitrique ou sulfurique dilué) ayant un pouvoir de 201 unités/cm3 et un pH égal à 6,8, on extrait environ 90-98%
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de l'activité de l'extrait dans le n-butanol. b) 48 cm3 de la solution dans len-butanol de la combinaison du type salin de streptomycine et d'alcool oléylique sulfaté sont agités avec 48 cm3 d'eau dans un entonnoir séparateur à la température ambiante et de l'acide chlorhydrique à 5 % est ajouté goutte à goutte en agitant jusqu'à ce que le pH devienne égal à 2,0.
Un fait passer la phase aqueuse limpide séparée dans une colonne de résine d'échange d'anions (par exemple d'Am- berlite IR-4B, voir le brevet américain n 2.402.384 du 18 juin 1946) pour faire prendre au pH une valeur attei- gnant 7,6, puis on la sèche par congélation. Le pouvoir du chlorhydrate de streptomycine ainsi obtenu avec un rendement d'environ 53 % est d'environ 542 unités/mg.
Les combinaisons du type salin de streptomycine et d'autres esters partiels d'acide sulfurique et d'al- cools aliphatiques supérieurs ou d'huile de rouge turc obtenues de la manière décrite dans le paragraphe a) de l'exemple 1 peuvent être décomposées de la même manière. b : variante) On refroidit 80 cm3 de la solution dans le n-butanol de la combinaison du type salin de- streptomycine et d'alcool oléylique sulfaté ; les fait passer dans une colonne de 127 mm. (32 gr.) d'alumine lavée par l'acide sulfurique (pH = 4,0) par aspiration et on extrait la colonne avec une solution normale à 0,1 d'acide chlorhydrique dans le méthanol anhydre.
On recueille l'extrait par fraction chacune de 10 cm3; les fractions actives (ou fractions 3 à 9 incluses) sont com- binées et traitées avec de l'éther anhydre pour précipiter le chlorhydrate de streptomycine. Le précipité est séparé par centrifugation, dissous dans une quantité minimum de méthanol anhydre et reprécipité avec de l'éther anhydre.
Le précipité, (séparé par centrifugation) est dissous
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dans environ 5 cm3 d'eau et la solution est séchée par congélation. Le pouvoir du chlorhydrate de streptomycine ainsi obtenu (avec un rendement global d'environ 56 %) est d'environ 636 unit6s/mg.
Laécomposition analogue des combinaisons du type salin obtenues avec les streptomycines et les agents de mouillage suivants, donne le chlorhydrate de strepto- mycine possédant à peu près les pouvoirs indiqués avec les rendements approximatifs indiqués ci-dessous :
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Combinaison .dù type s,âl3n de '.Chlorhydrate de streptomycine séché par congélation
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<tb> sulfurique <SEP> et <SEP> d'alcool
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<tb> aliphatique <SEP> supérieur
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<tb> (p. <SEP> ex.
<SEP> Duponol <SEP> C)
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<tb> Extrait, <SEP> 3
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EXEMPLE 2 a) 170 cm3 d'une solution aqueuse à 25 % de l'agent de
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mouillage C4oH9CH{C2H5)C2tA{S04oNa)C2H4oCH{C2H5)2 (par exem- ple Tergitol Penetrant 7) sont ajoutés à 4 litres d'un filtrat de culture (contenant de la streptomycine, ayant un pouvoir de 142 unités/cm3; la valeur du pH du mélange est réglée à 6,35 par une solution de soude caustique à 10 % en agitant, et 670 cm3 dialcool amylique de fermenta- tion raffiné sont ajoutés puis le mélange est agité pendant 5 minutes.
La phase d'alcool amylique séparée par centri- fugation contient environ 85 % de l'activité du filtrat de culture. b) 250 cm3 d'eau sont ajoutés à la solution d'alcool amylique et la valeur du pH du mélange est réglée à une valeur de 0,5 en ajoutant de l'acide sulfurique à 10 yo en agitant. L'extrait aqueux formé par la sépara
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tion des couches est agité avec une résine d'échange d'a- nions du type précité (par exemple l'Amberlite IR-4B) de façon à diminuer le degré d'acidité une valeur du pH de 5,7. L'extrait aqueux qui contient environ 60 % de l'acti- vité du filtrat de culture est séché par congélation, don- nant environ 7,1 gr. de sulfate de streptomycine ayant un pouvoir d'environ 33 unités/mg.
EXEMPLE 3 a) 50 cm3 d'une solution aqueuse saturée d9un sulfonate de monosodium benzène alkylé contenant plusieurs groupes alkyle totalisant 10 atomes de carbone (par exem- ple l'Ultrawet, 40 A) sont mélangés avec 300 cm3 d'alcool amylique obtenu par fermentation et raffinage et on règle la valeur du pH du mélange à 2,0 par l'addition dtacide sulfurique en agitant.
On sépare la couche d'alcool amylique et on l'ajoute à 3 litres d'un extrait contenant du chlor- hydrate de streptomycine ayant un pouvoir de 296 unités/ cm3; on règle la valeur du pH du mélange à 3,3 par l'addi- tion d'une solution aqueuse de soude caustique en agitant; on agite le mélange pendant 1 heure et on recueille la couche d'alcool amylique. b) L'extrait d'alcool amylique est recueilli à trois reprises avec des portions de 75 cm3 d'une solu- tion aqueuse d'acide sulfurique ayant un pH = 0,5 ; extraits par l'acide sont combinés et traités avec une solution d'hydroxyde de baryum pour obtenir une valeur du pH = 8-10; on sépare le précipité formé par filtrage.
La valeur du pH du filtrat est réglée à 6,2 par addition d'a- cide sulfurique; on sépare le précipité de sulfate de ba- ryum par filtrage et on sèche le filtrat par congélation en obtenant environ 1,0 gr. de sulfate de streptomycine ayant un pouvoir dtenviron 433 unités/mg.
Pour abréger, les détails d'autres exemples d'essais effectués d'une manière analogue à celui de l'e-
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xemple 3, mais représentant des variantes de l'invention sont donnés sous forme de tableau :
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TABLEAU I
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EXEMPLE 9 a) La valeur du pH de 3,5 litres d'extrait de chlorhydrate de streptomycine (280 unités/mg) est réglée à 5,0 avec une solution de soude caustique et on y ajoute 40 gr dthuile de ricin sulfonatée et 500 cm3d'acétate d'amyle. Le mélange est agité pendant 1 heure et la couche d'acétate dtamyle se sépare. b) La solution d'acétate d'amyle est extraite avec une solution d'acide sulfurique à N/10; la couche aqueuse est séparée, neutralisée avec une solution d'hydro- xyde de baryum et filtrée ; le filtrat est séché par congélation, donnant environ 0,3 gr. de sulfate de strep- tomycine (pouvoir environ 337 unités/mg).
EXEMPLE 10 a) Le pH de 4 litres d'un extrait de chlorhy- drate de streptomycine (185 unités/cm3 est réglé à une va- leur de 7,0 par addition d'une solution de soude caustique et on sépare par filtrage le précipité formé. Au filtrat sont ajoutés 20 gr. du sel de sodium solide de sulfonate de polyalkyl benzène (par exemple Ultrawet E), le pH est réglé à une valeur de 3,5 par addition d'acide sulfurique dilué, on ajoute 1 litre d'alcool amylique de fermentation raffiné, on agite le mélange pendant une heure et on re- cueille la couche d'alcool amylique. b) La solution d'alcool amylique est extraite à 4 reprises avec des portions de 50 cm3 d'acide sulfurique dilué (pH = U,5);
les extraits à l'cide eont combinés et réglés à un pH 12,0 par addition d'hydroxyde de baryum. Un sépare par filtrage le précipité formé on règle le pH du filtrat à 5,9 par addition d'acido sulfurique dilué et on filtre ; puis le filtrat est séché par congélation, donnant environ 2 gr. de sulfate de streptomycine (pouvoir environ 291 unités/mg).
Pour abréger, les détails d'autres exemples d'es-
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sais effectués d'une manière analogue à celui de l'exemple 10, mais représentant d'autres variantes de l'invention sont donnés ci-après sous forme de tableau
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TABLEAU II
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EXEMPLE 15
On dissout 1 gr. de streptomycine ayant un pou- voir de 228 unités/mg dans un litre d'eau et on ajoute 25 cm3 d'une solution de Tergitol Penetrant 7 (cf. exem- ple 2), puis 100 cm3 d'alcool amylique obtenu par fermen- tation et raffinage ;
règle le pH du mélange à une va- leur de 3,3 en agitant, et on continue à agiter pendant une demi-heure ; on recueille la couche d'alcool amy- lique formée. La solution d'alcool amylique contenant en- viron 75 % de la streptomycine dans la solution aqueuse traitée est extraite avec l'acide sulfurique dilué (pH = 0,5) et l'extrait aqueux par l'acide, contenant en- viron 80 % de la streptomycine de la solution dans l'al- cool amylique, est à; nouveau traité de la manière décrite précédemment.
EXEMPLE 16 a) 150 cm3 d'une solution aqueuse à 25 % de
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l'agent de mouillage C'H9CH(C2H5)CZH'CH(S0'Na)CHZCH(H3)z (par exemple Tergitol Penetrant 4) et 500 cm3 d'alcool amylique obtenu par fermentation et raffinage sont ajoutés à 3 litres d'un filtrat de culture contenant de la strep- tomycine (pouvoir 50 unités/cm3; pH = 1,5); on règle le pH à 4,0 et on agite le mélange.
On détruit l'émulsion ainsi obtenue par centrifugation et on recueille la couche d'alcool amylique (contenant environ 95 % de l'activité du filtrat de culture). b) On extrait la solution dans l'alcool amyli- que avec l'acide sulfurique à 25 % jusqu'à ce que le pH de la solution atteigne 0,5 ; couche aqueuse formée est recueillie, neutralisée avec l'hydroxyde de baryum à une valeur du pH de 6,8 et filtrée ; lefiltrat est séché par congélation, donnant un solide de couleur blanche dont l'activité représente environ 97 % de celle de la solution dans l'alcool amylique.
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Suivant une variante du procédé détaillé en a) an traitant un filtrat de culture contenant de la strepto- mycine ayant un pouvoir de 115 unités/cm3 et un pH de 1,7 avec 200 cm3 d'une solution à 25 % d'un sulfate d'alcool aliphatique supérieur (par exemple un Duponol) au lieu du Tergitol Penetrant 4, et en réglant le pH à 3,5 au lieu de 4,0, on obtient une solution dans l'alcool amylique conte- nant environ 90 % de l'activité du filtrat de culture.
EXEMPLE 17 a) On ajoute 150 cm3 d'une solution aqueuse à 25 % de Tergitol Penetrant 4 (cf. exemple 16) et 500 cm3 d'alcool amylique obtenu par fermentation et raffinage sont ajoutés à 3 litres d'un filtrat de culture contenant de la streptomycine (pouvoir 150 unités/cm3; pH 1,6).
On règle le pH à une valeur de 3,5 et on continue le trai- temant du mélange de la manière décrite dans les paragra- phes a) et b) de l'exemple 16 de façon à obtenir une cou- che d'alcool amylique épuisée et un extrait acide aqueux. fuis on se sert de l'alcool wnylique épuisé avec un supplé- ment de 50 cm3 de Tergitol Penetrant 4 pour extraire 3 litres dtun nouveau filtrat de culture contenant de la streptomycine et ltalcool amylique épuisé (et cette extrac- tion peut servir à son tour à extraire un nouveau filtrat de culture de la même manière). L'extrait aqueux acide est traité de la manière décrite encore dans le paragraphe b) de l'exemple 16.
Suivant une variante, l'extrait aqueux acide est aussi utilisé pour extraire l'extrait d'alcool amylique obtenu avec une nouvelle charge de filtrat de cul- ture contenant de la streptomycine, en augmentant ainsi la concentration du sulfate de streptomycine dans l'extrait aqueux acide.
EXEMPLE 18 a) 100 cm3 d'une solution aqueuse de chlorhydrate de streptomycine ayant un pouvoir de 10400 unités/cm3 sont
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mélangées intimement avec 50 cm3d'éther contenant 11,3 cm3 de Tergitol Penetrant 7 (solution aqueuse à 25 %). Après avoir laissé reposer le mélange, on recueille la couche d'éther formée qui contient environ 97 % de l'activité de la solution aqueuse traitée.
En remplaçant l'éther par le benzène, on obtient une extraction d'environ 98 % de l'activité. On remédie aux difficultés auxquelles donne lieu l'émulsification par ce solvant en laissant reposer le mélange pendant 12 à 16 heu- res, à froid, avant de séparer les couches. b) Une solution dans l'éther obtenue de la maniè- re décrite dans le paragraphe a) contenant un dérivé de streptomycine équivalent à 1.016.000 unités de streptomy- cine, est mélangée avec une solution de 5 gr. d'Alcl3 dans 25 cm3 d'éther; le précipité formé est éliminé par centri- fugation et dissous dans l'eau ; solution aqueuse est neutralisée avec une solution diluée de potasse caustique; puis la solution est filtrée et séchée par congélation, en donnant environ 3,b2 gr. de chlorhydrate de streptomycine possédant un pouvoir de 222 unités/mg.
(Rendement d'environ 79 %).
Le chlorure d'aluminium AlCl3 servant à la décom- position du dérivé du type salin de streptomycine peut être remplacé par des sels équivalents tels que ZnCl2 ou Fecl3.
Parmi les antibiotiques basiques du type de la streptomycine qu'on peut traiter par les procédés suivant l'invention, on peut citer la streptothricine et la dihydro- streptomycine ; et, parmi d'autres antibiotiques basiques pouvant servir à la préparation des combinaisons du type salin avec les agents de mouillage suivant l'invention, on peut citer la streptomycine A, la streptomycine B, la dihy- drostreptomycine A et la dihydrostreptomycine B pures ou sensiblement pures.
Les antibiotiques basiques du type de la strepto-
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mycine purifiés par le procédé suivant l'invention peuvent être purifiés davantage en répétant le même procédé de pu- rification. De même, ils peuvent subir une purification préliminaire ou ultérieure par d'autres procédés, en parti- culier par un des procédés suivants :
1) On amène en con- tact intime une solution aqueuse de l'antibiotique avec un acide carboxylique sensiblement insoluble dans l'eau et un solvant organique de l'acide carboxylique, ne se mélangeant sensiblement pas avec l'eau, on recueille la phase du solvant organique et on transforme le dérivé du type salin de l'antibiotique qu'elle contient en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique (Voir la demande de brevet déposée aux Etats-Unis d'Amérique le 19 juillet
1947 sous le n 762.205)./On traite une solution aqueuse de l'antibiotique avec un sel soluble dans l'eau d'un acide carboxylique, sensiblement insoluble dans l'eau,
on recueil- le la combinaison précitée du type salin de l'antibiotique et de l'acide carboxylique et on la transforme en un sel soluble dans l'eau de l'antibiotique (Voir la demande de brevet déposée aux Etats-Unis d'Amérique le 19 juillet
1947 sous le n 762.206) et 3) On amène en contact intime une solution aqueuse de l'antibiotique avec un agent de mouillage du type d'un acide inorganique polybasique, or- ganiquement substitué, on recueille la combinaison précipitée du type salin de l'antibiotique et de l'agent de mouillage et on la transfonne en un sel soluble dans l'eau de l'an- tibiotique (Voir la demande de brevet déposée en Belgique par la demanderesse /le sous le n 376.517.
L'invention ne doit pas être considérée comme limitée aux modes de mise en oeuvre décrits ci-dessus, qui n'ont été choisis qu'à titre d'exem- ple.
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II Process for the Preparation and Purification of Abs. II.
The invention relates to basic or alkaline antibiotics of the streptomycin type, i.e. elements of the genus consisting of streptomycin and basic compounds with antibiotic action which, like streptomycin, can form salts. soluble in water with acids such as sulfuric acid and salts insoluble in water with reagents precipitating organic bases, for example derivatives of streptomycin, such as dihydrostreptomycin and antibiotics with similar action, such as streptothricin.
In 1944, Schats, Bugie and Waksman (Proc. Soc.
Exp. Biol. Med. 1944, 57, 244) have shown that an antibiotic
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A potent drug called "streptomycin" is formed during the growth of "Actinomyces griseus" (now called "Streptomyces griseus") and this antibiotic has since been found to be extremely useful in clinical practice.
It was then found that several streptomycins are formed at the same time. The first streptomycin obtained in crystallized, pure (as reineckate) and fully characterized form is now called "streptomycin A"; the second characterized streptomycin is now referred to as "Streptomycin B".
In addition, there is evidence that other streptomycins are formed and / or may be formed at the same time by changing the conditions of the culture; and it should be understood that each of these antibiotics and their mixtures (as the free base or their water soluble salts) will be referred to as "streptomycin" unless otherwise specified.
Streptomycin has heretofore been purified by various methods, all of which are complicated and / or inefficient (and therefore expensive). For example, a process applied to a large extent prior to the invention comprises, in principle, the following steps: 1 treating a primary liquid containing streptomycin with activated charcoal which selectively adsorbs streptomycin. ; 2 streptomycin is extracted from charcoal with a water soluble aqueous mineral acid, preferably by slightly raising the temperature (eg to about 30-50 ° C); 3 the extract is treated with a reagent for precipitating organic bases, preferably phosphotungstic acid; and 4 decomposing the precipitate.
The expression "primary liquid containing streptomycin" should be considered as designating in particular: a) culture liquid
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obtained by proliferating streptomyces griseus under conditions and in a culture medium suitable for the formation of streptomycin and separating the solids from the medium; the potency-enhanced culture liquid obtained by acidifying this culture (eg with hydrochloric or sulfuric acid), the liquid being neutralized; etc) the liquid obtained by acid extraction of the solids separated from the culture, the liquid being neutralized).
One of the objects of the invention lies in simple, effective and advantageous methods from other points of view of purification of basic antibiotics of the streptomycin type and in particular of streptomycin; and another object of the invention resides in processes for preparing certain derivatives of the salt type (reaction of an acid and a base) of basic antibiotics of the streptomycin type.
Basic antibiotics of the streptomycin type have been found to react with surface active agents or wetting agents of the organically substituted polybasic inorganic acid type to form certain salt-type combinations which are much less soluble in water. water and more soluble in some organic solvents that do not mix with water than antibiotics;
and it has been further discovered that these salt-like derivatives of basic antibiotics can be decomposed to collect the antibiotics.
The methods of the invention consist in principle of bringing an aqueous solution of a basic antibiotic of the streptomycin type (in particular streptomycin) into intimate contact with a surface active agent, or wetting agent, of the type of streptomycin. an organically substituted polybasic inorganic acid and a
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organic solvent, not substantially mixing with water, soaps (including invert soaps, i.e. those in which the cation is organic instead of the anion, as in ordinary soaps), preferably with an aliphatic alcohol which does not substantially mix with water and, in particular, with mixtures of amyl alcohol;
the purification processes according to the invention consist, in principle, in bringing into intimate contact an aqueous solution of an impure basic antibiotic of the streptomycin type, (for example a primary liquid containing streptomycin or an aqueous solution of streptomycin partially purified, such as the extract discussed above) with a surface active agent of the type of an organically substituted polybasic inorganic acid and an organic solvent for the soaps which do not substantially mix with water, to be collected the organic solvent phase, and converting the salt-like derivative of the antibiotic it contains into a water-soluble salt of the antibiotic,
preferably by bringing the solution in the organic solvent into intimate contact with a relatively strong water-soluble aqueous acid (particularly with a relatively strong water-soluble aqueous mineral acid), and collecting the aqueous phase. The water soluble salt (of the basic antibiotic of the streptomycin type) collected in the aqueous solution thus obtained is much purer than the treated antibiotic, and the recovery of the antibiotic activity achieved during the treatment of purification is of a high order. By applying the invention in practice, it is possible to consistently obtain high yields of relatively pure streptomycin having, for example, an antibiotic potency greater than about 400 units / mg.
Among the agents with surface activity of
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type of organically substituted polybasic inorganic acids suitable for the process according to the invention, there may be mentioned those which are represented by the formula R-O-X-O-Y in which R denotes the radical of an organic hydroxyl compound which does not substantially mix with water; -0-X-0- denotes the divalent acid radical of a water-soluble polybasic inorganic acid, (for example sulfuric or phosphoric acid), and Y denotes a member of the group formed by H and the soluble salts. bles in water forming cations with the anion R-0-X-0.
Among the wetting agents suitable for the process according to the invention, there may be mentioned in particular those in which the polybasic inorganic acid is sulfuric acid, the acid being partially esterified with a higher aliphatic alcohol, that is, Ie wetting agents from the group formed by monoesters (higher aliphatic) of sulfuric acid and their water soluble salts.
Other agents with surface activity which may preferably be chosen from the type of organically substituted polybasic inorganic acids suitable for the process according to the invention are those from the group formed by aromatic sulfonic acids, sulfonated oils, acid derivatives. higher sulfonated fats and their water soluble salts.
Among the partial higher alkyl esters of sulfuric acid which may be used in the application of the invention in practice, there may be mentioned: the group of sodium salts of sulfates of synthetic higher aliphatic alcohols, such as C4H9CH
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(C2H5) G2H4CH (S04Na) C2CH (C2H5) 2 (for example Tergitol Penetrant 7), C'H9CH (CZHS) CZH'CH (S0 * Na) CHZCH (CH3) 2 (for example Tergitol Penetrant 4), and C4H9CH (C2H5) CH2SO4Na (eg Tergitol Penetrant 08); and the series of
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sulfuric acid partial esters of higher aliphatic alcohols and their salts, such as octyl sodium, oleyl sodium, cetyl sodium, stearyl sodium and lauryl sodium sulfates (e.g. Aurinol, Wetanol, Duponols and Gardinols).
Among the aromatic sulfonic acids, sulfonated oils and sulfonated higher fatty acid derivatives which may be used in the application of the invention in practice, there may be mentioned sodium sulfonates of higher fatty acid esters and amides, such as the sodium salt of sulfonated ethyl oleate (or other alkyl oleate) (eg Igepon AP Extra) and C17H33CONHC2H4SO3Na (eg Igepon T); sodium sulphonates from petroleum hydrocarbons (eg Ultrawet); the sodium salt of a polyalkylbenzene sulfonic acid containing 10 carbon atoms (eg Ultrawet 40A), and other sodium alkyl aryl sulfonates (eg Nacconol NRSF); and Turkish red oil (i.e. sulfonated castor oil).
Among the partial esters of phosphoric acids which can be used in the practical implementation of the invention, there may be mentioned dicresyl phosphate, lecithin and a higher phosphorus alcohol represented by the formula (capryl) 5Na5- P 6. 0 20 (for example the WA 58).
Organic solvents for soaps which do not substantially mix with water which can be used in the practice of the invention are inter alia: aliphatic alcohols, such as n-amyl alcohol ( 1-pentanol), n-butanol (1-butanol), secondary butanol, methyl-isobutyl-carbinol, methyl-amyl-carbinol, methyl-isopropyl-carbinol, isobutyl-carbinol, 2-ethyl-hexanol, and mixtures of amyl alcohol, such as amyl alcohol from fermentation, aliphatic alcohol esters of lower fatty acids, such as acetate,
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methyl-isobutyl-carbinol and amyl acetate; aliphatic ketones, such as methyl isobutyl ketone; aliphatic ethers, such as di-n-butyl ether and diethyl ether; hydrocarbons, such as benzene and toluene;
and halogenated hydrocarbons, such as ethylene dichloride, chloroform, and carbon tethrachloride.
Among the relatively strong water-soluble acids which can be used to collect antibiotics in their salt-type combinations with surface active agents, there may be mentioned sulfuric, hydrochloric, phosphoric, oxalic acid, citric, sulfamic and nitric.
To achieve maximum yield, the surface active agent should be in excess of the amount which is required to combine all of the antibiotic contained in the treated solution, the most advantageous proportion depending, therefore, on the concentration of the treated solution and the potency of the antibiotic.
According to one of the embodiments of the invention, an aqueous solution of an impure antibiotic of the streptomycin type is brought into intimate contact with a solution of the agent with surface activity in a solvent of the soaps which do not mix substantially. not with water; the organic solvent phase is collected and is brought into intimate contact with an aqueous solution of a relatively strong water soluble acid; the aqueous phase is collected and dried, preferably by freezing (ie, frozen and subjected to the action of a high vacuum to separate the water by sublimation).
The intimate contact between the antibiotic solution, the surface active agent and the organic solvent can also be achieved by mixing a-.
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edging the solution of the antibiotic with the surface active agent and then bringing the mixture into intimate contact with the organic solvent; or by first mixing the solution of the antibiotic with the organic solvent and then bringing the mixture into intimate contact with the surface active agent.
Preferably and especially when the aqueous solution of the treated impure antibiotic is a culture filtrate, the solution obtained in the organic solvent is washed with water before treating it with the solution: aqueous acid, the wash water entrains a considerable amount of inactive solids, but hardly any antibiotic.
The partition coefficient of the combination of the saline type of the antibiotic and the surface active agent between the phase. aqueous and the phase of the organic solvent depends on the pH value. For example, when a solution in n-amyl alcohol of Ultrawet 40A is used, the amount of streptomycin which separates from the aqueous solution is maximum when the pH of the aqueous phase is adjusted to a value between approximately 2 and about 8, preferably between about 3 and 4.
Alternatively, the salt-like combination of the antibiotic and the surface active agent can be collected in the solution in the organic solvent and subsequently converted to a water soluble salt, or used as such. which as a therapeutic agent. For example, the derivative of the saline type of the antibiotic can be collected by expelling the organic solvent by evaporation in a vacuum (or when the organic solvent lends itself to this way of operating, as for example in the case of benzene, in drying the solution by freezing). The salt-like derivative of the antibiotic can also be obtained more directly by the precipitation process described in the patent pending.
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in legal, ie é, i / Ài <1 under the n03f, f1-By demand-
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resse.
These saline derivatives of antibiotics are generally soluble in oil or may disperse therein; they can be used therapeutically, for example by administering them by mouth as is or in oily media to treat intestinal diseases by having recourse to the intestinal functions to release the antibiotic in water-soluble form) or in administering them also in oily media (or by impregnating a pellet with a solid material) in order to obtain a prolonged antibiotic action. When it is proposed to prepare the salt-like derivative of the antibiotic instead of purifying it, a reconstituted aqueous solution of the antibiotic may be employed (for example a highly purified aqueous solution of the antibiotic or pure).
The various extraction operations of the methods according to the invention can of course be carried out by the methods of the countercurrent technique; the exhausted solutions and / or the extracts can be used again in the process making it possible to further collect the activity and / or to further concentrate the extracted product.
For example, the spent liquid containing the antibiotic can be extracted with a new load of wetting agent and organic solvent; spent organic solvent can be extracted with a new charge of a relatively strong water soluble acid aqueous solution or this solvent can be used with a new charge of the liquid containing the antibiotic; and / or the aqueous acid extract can be used to treat a new charge of the solution in the organic solvent, to increase the antibiotic concentration.
The invention is easier to understand from the following examples, (all the solutions or dilutions in question being solutions or dilutions in water, unless the solvent or the diluent is
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specially indicated):
EXAMPLE 1 a) 350 mg of streptomycin hydrochloride are dissolved in 70 cm3 of water saturated with n-butanol; mixes the solution with 70 cm3 of a 7% solution of sulfated oleyl alcohol (eg Aurinol DS) in n-butanol saturated with water; The mixture is stirred in a separatory funnel for 5 minutes under ambient betuperet and the resulting n-butanol layer is collected by allowing the mixture to stand.
Approximately 94.9% of the streptomycin is thus extracted from the aqueous solution in n-butanol (in the form of a salt-type combination of streptomycin and sulfated oleyl alcohol).
Likewise, about 90-98% of the streptomycin contained in aqueous solutions in concentrations of 400-4000 units / cm3 in n-butanol can be extracted with the aid of other partial esters of al- sulfuric acid. higher aliphatic cools (eg from Duponol-C or Turkish Red Oil).
By extracting in the same way a culture filtrate containing streptomycin (obtained by making
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proliferate sbreptomycos grisous eu cu.Liuie bubmyéd in aqueous media containing soybean flour, dextrose and sodium chloride, acidifying the seeded culture and filtering) having a power of 391 units / cm3 and a pH of about 5-7, and preferably about 6.1, about 80-95% of the activity of the culture filtrate is extracted in n-butanol;
by extracting in the same way an extract containing streptomycin (obtained by treating a culture filtrate containing streptomycin with activated charcoal and removing streptomycin from the charcoal with hydrochloric, nitric or sulfuric acid diluted) having a power of 201 units / cm3 and a pH equal to 6.8, about 90-98% is extracted
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of the activity of the extract in n-butanol. b) 48 cm3 of the len-butanol solution of the salt-type combination of streptomycin and sulfated oleyl alcohol is stirred with 48 cm3 of water in a separating funnel at room temperature and 5% hydrochloric acid is added dropwise with stirring until the pH becomes equal to 2.0.
Passing the separated clear aqueous phase through an anion exchange resin column (e.g. Amberlite IR-4B, see U.S. Patent No. 2,402,384 dated June 18, 1946) to set the pH to a value reaching 7.6 and then freeze-dried. The potency of the streptomycin hydrochloride thus obtained in a yield of about 53% is about 542 units / mg.
The salt-like combinations of streptomycin and other partial esters of sulfuric acid and higher aliphatic alcohols or Turkish red oil obtained as described in paragraph a) of Example 1 can be decomposed. in the same way. b: variant) 80 cm3 of the solution in n-butanol of the salt-type combination of streptomycin and sulfated oleyl alcohol are cooled; passes them through a 127 mm column. (32 gr.) Of alumina washed with sulfuric acid (pH = 4.0) by suction and the column is extracted with a normal solution of 0.1 hydrochloric acid in anhydrous methanol.
The extract is collected in portions each of 10 cm3; the active fractions (or fractions 3 to 9 inclusive) are combined and treated with anhydrous ether to precipitate the streptomycin hydrochloride. The precipitate is separated by centrifugation, dissolved in a minimum amount of anhydrous methanol and reprecipitated with anhydrous ether.
The precipitate (separated by centrifugation) is dissolved
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in about 5 cm3 of water and the solution is dried by freezing. The potency of the streptomycin hydrochloride thus obtained (with an overall yield of about 56%) is about 636 units / mg.
The analogous decomposition of the salt-like combinations obtained with the streptomycins and the following wetting agents gives streptomycin hydrochloride having approximately the potencies shown with the approximate yields shown below:
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Freeze Dried Streptomycin Hydrochloride Combination.
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EXAMPLE 2 a) 170 cm3 of a 25% aqueous solution of the
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wetting C4oH9CH {C2H5) C2tA {S04oNa) C2H4oCH {C2H5) 2 (eg Tergitol Penetrant 7) are added to 4 liters of a culture filtrate (containing streptomycin, having a potency of 142 units / cm3; the The pH value of the mixture is adjusted to 6.35 with 10% sodium hydroxide solution with stirring, and 670 cm3 of refined fermentation amyl alcohol is added and the mixture is then stirred for 5 minutes.
The amyl alcohol phase separated by centrifugation contains about 85% of the activity of the culture filtrate. b) 250 cm3 of water are added to the amyl alcohol solution and the pH value of the mixture is adjusted to a value of 0.5 by adding 10% sulfuric acid with stirring. The aqueous extract formed by the separa
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The layers are stirred with an anion exchange resin of the aforementioned type (eg Amberlite IR-4B) so as to reduce the degree of acidity to a pH value of 5.7. The aqueous extract which contains about 60% of the activity of the culture filtrate is freeze dried, yielding about 7.1 g. of streptomycin sulfate having a potency of about 33 units / mg.
EXAMPLE 3 a) 50 cm3 of a saturated aqueous solution of an alkylated monosodium benzene sulphonate containing several alkyl groups totaling 10 carbon atoms (eg Ultrawet, 40 A) are mixed with 300 cm3 of amyl alcohol obtained by fermentation and refining and the pH value of the mixture is adjusted to 2.0 by the addition of sulfuric acid with stirring.
The amyl alcohol layer is separated and added to 3 liters of an extract containing streptomycin hydrochloride having a potency of 296 units / cm3; the pH value of the mixture is adjusted to 3.3 by the addition of an aqueous solution of caustic soda with stirring; the mixture is stirred for 1 hour and the amyl alcohol layer is collected. b) The amyl alcohol extract is collected three times with 75 cm3 portions of an aqueous solution of sulfuric acid having a pH = 0.5; the acid extracts are combined and treated with a solution of barium hydroxide to obtain a pH value = 8-10; the precipitate formed is separated by filtration.
The pH value of the filtrate is adjusted to 6.2 by adding sulfuric acid; the barium sulphate precipitate is filtered off and the filtrate dried by freezing to obtain about 1.0 g. of streptomycin sulphate having a potency of about 433 units / mg.
For brevity, details of other examples of tests carried out in a manner analogous to that of e-
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xample 3, but representing variants of the invention are given in table form:
<Desc / Clms Page number 15>
TABLE I
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<Desc / Clms Page number 16>
EXAMPLE 9 a) The pH value of 3.5 liters of streptomycin hydrochloride extract (280 units / mg) is adjusted to 5.0 with a caustic soda solution and 40 gr of sulfonated castor oil and 500 gr. cm3 of amyl acetate. The mixture is stirred for 1 hour and the tamyl acetate layer separates. b) The amyl acetate solution is extracted with an N / 10 sulfuric acid solution; the aqueous layer is separated, neutralized with a solution of barium hydroxide and filtered; the filtrate is dried by freezing, giving about 0.3 g. streptomycin sulfate (potency about 337 units / mg).
EXAMPLE 10 a) The pH of 4 liters of an extract of streptomycin hydrochloride (185 units / cm3 is adjusted to a value of 7.0 by adding a solution of caustic soda and the mixture is filtered off. precipitate formed To the filtrate are added 20 g of the solid sodium salt of polyalkylbenzene sulfonate (for example Ultrawet E), the pH is adjusted to a value of 3.5 by addition of dilute sulfuric acid, 1 liter is added. of refined fermentation amyl alcohol, the mixture is stirred for one hour and the amyl alcohol layer is collected b) The amyl alcohol solution is extracted 4 times with 50 cm3 portions of sulfuric acid diluted (pH = U, 5);
the acid extracts were combined and adjusted to pH 12.0 by the addition of barium hydroxide. The precipitate formed is filtered off, the pH of the filtrate is adjusted to 5.9 by addition of dilute sulfuric acid and filtered; then the filtrate is dried by freezing, giving approximately 2 g. of streptomycin sulfate (potency approximately 291 units / mg).
For brevity, the details of other examples of es-
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Known carried out in a manner analogous to that of Example 10, but representing other variants of the invention are given below in table form
<Desc / Clms Page number 18>
TABLE II
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EXAMPLE 15
1 gr is dissolved. of streptomycin having a power of 228 units / mg in a liter of water and 25 cm3 of a solution of Tergitol Penetrant 7 (cf. example 2) are added, then 100 cm3 of amyl alcohol obtained by fermen - tation and refining;
adjust the pH of the mixture to a value of 3.3 with stirring, and stirring is continued for half an hour; the amyl alcohol layer formed is collected. The amyl alcohol solution containing about 75% of the streptomycin in the treated aqueous solution is extracted with dilute sulfuric acid (pH = 0.5) and the aqueous extract with the acid, containing about 80 % of the streptomycin in the solution in amyl alcohol is at; again treated as described above.
EXAMPLE 16 a) 150 cm3 of a 25% aqueous solution of
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the wetting agent C'H9CH (C2H5) CZH'CH (S0'Na) CHZCH (H3) z (for example Tergitol Penetrant 4) and 500 cm3 of amyl alcohol obtained by fermentation and refining are added to 3 liters of a culture filtrate containing streptomycin (potency 50 units / cm3; pH = 1.5); the pH is adjusted to 4.0 and the mixture is stirred.
The emulsion thus obtained is destroyed by centrifugation and the amyl alcohol layer (containing approximately 95% of the activity of the culture filtrate) is collected. b) The amyl alcohol solution is extracted with 25% sulfuric acid until the pH of the solution reaches 0.5; aqueous layer formed is collected, neutralized with barium hydroxide to a pH value of 6.8 and filtered; lefiltrate is dried by freezing, yielding a white solid whose activity represents approximately 97% of that of the solution in amyl alcohol.
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According to a variant of the process detailed in a) by treating a culture filtrate containing streptomycin having a potency of 115 units / cm3 and a pH of 1.7 with 200 cm3 of a 25% solution of a sulfate of higher aliphatic alcohol (eg Duponol) instead of Tergitol Penetrant 4, and adjusting the pH to 3.5 instead of 4.0 gives an amyl alcohol solution containing about 90% of the activity of the culture filtrate.
EXAMPLE 17 a) 150 cm3 of a 25% aqueous solution of Tergitol Penetrant 4 (cf. Example 16) and 500 cm3 of amyl alcohol obtained by fermentation and refining are added to 3 liters of a culture filtrate containing streptomycin (potency 150 units / cm3; pH 1.6).
The pH is adjusted to a value of 3.5 and the treatment of the mixture is continued as described in paragraphs a) and b) of Example 16 so as to obtain an alcohol layer. depleted amyl and aqueous acid extract. Leak, spent wnyl alcohol with an additional 50 cc of Tergitol Penetrant 4 is used to extract 3 liters of a new culture filtrate containing streptomycin and spent amyl alcohol (and this extraction can be used in turn. to extract a new culture filtrate in the same way). The acidic aqueous extract is treated as further described in paragraph b) of Example 16.
Alternatively, the acidic aqueous extract is also used to extract the amyl alcohol extract obtained with a fresh load of culture filtrate containing streptomycin, thereby increasing the concentration of streptomycin sulfate in the extract. aqueous acid.
EXAMPLE 18 a) 100 cm3 of an aqueous solution of streptomycin hydrochloride having a potency of 10400 units / cm3 are
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mixed thoroughly with 50 cm3 of ether containing 11.3 cm3 of Tergitol Penetrant 7 (25% aqueous solution). After allowing the mixture to stand, the formed ether layer is collected which contains about 97% of the activity of the treated aqueous solution.
By replacing the ether with benzene, an extraction of about 98% of the activity is obtained. The difficulties to emulsification with this solvent are overcome by allowing the mixture to stand for 12 to 16 hours in the cold before separating the layers. b) A solution in ether obtained as described in paragraph a) containing a derivative of streptomycin equivalent to 1,016,000 units of streptomycin, is mixed with a solution of 5 g. Alcl3 in 25 cm3 of ether; the precipitate formed is removed by centrifugation and dissolved in water; aqueous solution is neutralized with a dilute solution of caustic potash; then the solution is filtered and dried by freezing, giving approximately 3, b2 gr. of streptomycin hydrochloride having a potency of 222 units / mg.
(Yield about 79%).
The aluminum chloride AlCl3 used for the decomposition of the saline derivative of streptomycin can be replaced by equivalent salts such as ZnCl2 or Fecl3.
Among the basic antibiotics of the streptomycin type which can be treated by the methods according to the invention, there may be mentioned streptothricin and dihydro-streptomycin; and, among other basic antibiotics which can be used for the preparation of combinations of the salt type with the wetting agents according to the invention, there may be mentioned pure streptomycin A, streptomycin B, dihydrostreptomycin A and dihydrostreptomycin B or substantially pure.
Basic strep-type antibiotics
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mycin purified by the method according to the invention can be further purified by repeating the same method of purification. Likewise, they can undergo a preliminary or subsequent purification by other methods, in particular by one of the following methods:
1) An aqueous solution of the antibiotic is brought into intimate contact with a substantially water-insoluble carboxylic acid and an organic solvent for the carboxylic acid, substantially not mixing with water, the phase is collected. organic solvent and transforming the salt-like derivative of the antibiotic it contains into a water-soluble salt of the antibiotic (See the patent application filed in the United States of America on July 19
1947 under No. 762.205) ./ An aqueous solution of the antibiotic is treated with a water-soluble salt of a carboxylic acid, substantially insoluble in water,
the above salt-like combination of the antibiotic and the carboxylic acid is collected and converted into a water-soluble salt of the antibiotic (See the patent application filed in the United States of America July 19
1947 under No. 762.206) and 3) An aqueous solution of the antibiotic is brought into intimate contact with a wetting agent of the type of a polybasic, organically substituted inorganic acid, the precipitated combination of the salt type of l antibiotic and wetting agent and transformed into a water-soluble salt of the antibiotic (See the patent application filed in Belgium by the applicant under No. 376,517.
The invention should not be considered as limited to the embodiments described above, which were chosen only by way of example.