TW425428B - Enzymatic coupling of L-phenylalanine methyl ester and N-benzyloxycarbonyl-aspartic acid - Google Patents

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經濟部令夬標隼局員工消費合作社印製 ^ - 4254 2 8 A7 _B7五、發明説明（1 ) 本發明有關一種製備N —辛氧幾基~ α - L —天冬胺 酸_ L —苯基丙胺酸甲酯之方法，其係于水性介質中高轉 化酶催性地偶合Ν —笮氧羰基~ L -天冬胺酸和l -苯基 丙胺酸甲酯，形成沉澱。 Ν —經保護£2 — L —天冬胺醯—L —苯基丙胺酸甲醋 ’諸如特別之Ν -笮氧羰基_a — L -天冬胺醯_l 一苯 基丙胺酸甲酯，係'^強甜味劑"阿司巴甜（aspartame ) 之重要先質，阿司巴甜係具有約蔗糖之2 0 〇倍之甜度及 優越味覺特性，而無（例如）其他強甜味劑諸如（例如） 糖精及環己胺磺酸鹽之苦性餘味》甜味劑阿司巴甜特別可 用于多種產品，諸如軟性軟料，甜點，〜桌上型甜味劑" ，藥物等。 已知有各式各樣製備阿司巴甜之方法》除化學製法外 ，亦有酶催性製法，酶催性偶合法之重要性主要奠基于其 立體選擇性及空間選擇性之方式》N —經保護天冬胺酸， 尤其是N_笮氣羰基天冬胺酸（以下亦稱Z — A s p)及 L -(或DL —）苯基丙胺酸甲酯，或由彼衍生之酸鹽， 諸如（例如）鹽酸鹽（以下亦稱爲PM)酶催性L，L — 偶合形成N —經保護阿司巴甜先質之方式目前已經充分研 究並描述K.Oyama 于"Chirality in Industry", John Wiley & Sons Ltd.， 1 9 9 2 之第 1 1 章中發表了 阿司巴甜製法之評論。 所研究之酶催性偶聯反應，通常于由6至7. 5之 p Η下，于中性蛋白酶，尤其是金屬一蛋白酶，諸如（例 本紙張尺度適用中國囤家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ' 一 4 ~* H - - - : ^^1 - m m ^^1 t ^in - -I 11-- - II m 言 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 卜 4254 2 8 A7 _B7五、發明説明（2 ) 如）嗜熱菌蛋白酶存在下進行，爲平衡一控制反應。爲了 在該酶催性偶合反應應中達到高轉化度，技藝界需要特定 裝置。因此，例如，US— A — 416531 1 (公認爲 最近期之技藝狀態）係利用可藉形成N—經保護阿司巴甜 ，尤其是N —笮氧羰基_a — L—天冬胺醯L_苯基丙胺 酸甲酯（以下亦稱爲Z — A s p )與反應混合物中之D — 或L -苯基丙胺酸甲酯形成沈澱加成化合物•使偶合反應 之平衡向右移勖之事實。該阿司巴甜先質之加成化合物亦 個別稱爲 Z-APM.D — PM 或 Z—APM. L - P Μ 。爲形成該加成產物，在目前技藝界狀態下*需使用相對 于Ζ - A s ρ爲至少兩倍莫耳量之L — ΡΜ，或于至少等 量之D — PM存在下進行Z — A s p及L — PM之偶合反 應，以得到高轉化度，即26 0%，較佳έ8 0%之 Z — A s ρ。實際上，該酶催性偶合反應因而通常被描述 成ΡΜ對Z-Asp之比例爲（例如）2. 0至2. 5 : 1或更高。雖然此類實例確實達到高轉化度，但此法有多 項缺點，即： (a )操作並進一步加工微粒以得到最後所需阿司巴甜之 工作極費事，部分原因是添加產物難以過濾，且需徹底洗 滌，以得到僅含少量雜質之APM ; (b )需回收且/或再循環過量組份及由偶合產物之沈澱 加成產物釋出之非一 APM組份，若以D L — PM進行偶 合反應，則殘留之D — PM通常亦應于加工時消旋化，通 常經由D L -苯基丙胺酸"因此’此法較不適于工業量化 本紙張尺度適用中國國家樣隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） — -5 — ^^1 ^^1 ^^1 ^^1 —^1 »11 — m ^^1 I m U3. 、1' (請先閔讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 425 4 2 8 A7 _B7五、發明説明（3 ) 應用。 應注意WO-A— 9 2/0 26 1 7描述于水性介質 中乙酸存在下，于PH = 7下使實質等量之Z_A s p和 L — PM.HCP (莫耳比約1. 2 : 1)酶催性偶合反 應。此情況下，使用藉交聯固定之蛋白酶結晶，但所達之 轉化度僅約20%。EP-A - 01 49 594描述甲醯 —Asp (F-Asp)于水性介質中，F_Asp對L _PM爲1 : 1之比例下于酶催性偶合反應中之用途。然 而，因爲形成F — APM. L — PM加成產物，F — A s p之轉化率仍明顯低于5 0%，且該法中所達之產率 極低（于加工產生F - APM後約12%) » 同樣地，Zhou F.等人（于 Huaxue Fanying Goncheng Yu Gongyi, 1992’ 8(4) ，pp 413 —41 9(中文）；化學摘要（Chemical Abstracts)， 12 0( No. 35) ，31-1 — 94 中之摘要，摘要 48817v)特別描述了于原始pH6下1 : 1酶催性 偶合Z_L— As p和L — PM之實驗。但是，此情況下 ，亦因形成Z — APM. PM加成產物，故Z— Asp轉 化率最高46. 1%。應注意Zhou F.等人所記錄之L - PM轉化率（最高92. 2%)係L-PM (化學）偶合 成Z-ΑΡΜ和1當量L — PM與Z-ΑΡΜ相伴沈澱之 共同成果。該文件未教示L - PM之化學轉化率可達5 0 %以上》 另外，亦應注意偶合反應系統中之酯對化學水解相當 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） n ^— I l·— - I - - « . I ! 丁 I _ _ I n A 0¾-It .. (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ~ 6 - A7 425428 B7 五、發明説明（4 ) 敏感。因此* PM水解成苯基丙胺酸（以下亦稱爲P h e )- APM水解成Z —經保護天冬胺醯苯基丙胺酸（ 有時稱爲Z—AP) »此種不需要之副反應于ρΗ26或 $ 4時特別容易發生，且于Ρ Η愈偏離該值且于反應條件 下之逗留時間愈長時愈強。 目前通常假設無對應量D _ ΡΜ或不採用其他裝置移 動偶合平衡時，由等量或實質等量Z_A s ρ及L_PM 開始之Z—A s p和L — PM酶催性偶合之轉化率基于Z -A s p計算，無法高于5 0%。討論于水性介質中之酶 催性偶合時，Zhou及Huaug (印度化學雜誌）（

Indian J. Chem, ) 3 2 B ’ p p 35—39 * 1 9 9 3 )近來甚至陳述使用固定化蛋白海之最佳反應條 件爲Z_As p對PM比例爲1 : 4。該文章中應注意者 係當使用固定化蛋白酶時（比照，例如，生物工學（ Biotechnology ) ，_2_，PP. 459 — 464， 1 9 8 5 : Nakanishi等人），許多形成之產物吸附于用 以固定之樹脂中，需經個別率取步驟取出。Nakaui shi等 人于水性介質中使用1:1比例之Z—Asp比L—PM 所得結果爲于相當低濃度（8 OmM下）產率最高5 8% ，因此不適于工業應用。而且，于該一般用于測定初反應 速率之低濃度下，進行偶聯反應而不形成沈澱。 另一種移偶合平衡之方式特別描述于（i)有機化學 雜誌（J. Or g, Chem. ) 4 6，p. 5241 (1981 )中：使用固定化之蛋白酶及與水不相溶混之有機溶劑； 本紙浪尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇Χ297公釐) I Λ ^^1 —^1 In (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 -7 - 425428 A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印褽 五、 發明説明（5 ) I 相 同 地 J Ρ 一 B — 8 5 3 3 8 4 0 使 用 1 1 莫 耳 比 時 | 產 率 僅 約 2 0 — 3 0 % ( ϋ ) G B — A — 1 i I 2 2 5 0 0 2 3 使 用 固 定 化 之蛋 白 酶 及 水 可 溶 混 性 之 有 請 1 1 機 溶 劑 相 同 地 E Ρ — A — 0 2 7 2 5 6 4 係 于 乙 睛 中 先 閱 請 1 1 其 中 雖 其 揭 示 N — 經 保 護 之 As P 相 對 于 L — P Μ 之 比 背 面 之 1 例 可 介 于 1 0 1 和 1 1 0 間， 但 實 例 顯 示 僅 考 慮 有 相 注 意 事 1 i 當 過 量 之 L _ P Μ 之 情 況 若 爲化 學 計 量 或 實 質 化 學 計 量 再 1 導 裝 I 之 比 例 則 轉 化 率 及 產 率 差 0 化學 計 量 比 例 亦 稱 爲 等 莫 耳 寫 本 苜 比 〇 G Β — A — 2 2 5 0 0 2 3之 實 例 同 樣 顯 示 L — Ρ Μ I i I 對 N — 經 保 護 A S Ρ 之 比 例 愈 高則 產 率 愈 高 ( 于 2 ： 1 時 I 1 產 率 約 8 5 % 于 1 1 時 ，僅 約 5 0 % ) 〇 另 -- 實 例 1 1 中 形 成 沈 澱 並 不 移 動 平 衡 但形 成 之 偶 合 產 物 移 入 有機 訂 1 相 則 會 〇 使 用 溶 劑 時 除 了 經 常性 不 可 避 免 之 溶 劑 損 失 使 1 l 成 本 增 加 外 ♦ 該 另 一 種 實 例 之 另一 項 缺 點 爲 加 工 產 生 阿 司 1 I 巴 甜 時 需 採 用 特別 裝 置 去 除 偶合 反 聰 中 所使 用 之 有 機 溶 1 1 劑 0 添 加 ( 或 視 情 況 于 其 中 或 其存 在 下 進 行 反 niff m ) 有 機 溶 乂 1 劑 諸 如 例 如 乙 睛 或 二 甲 基 甲醯 胺 或 諸 如 二 及 三 葛 林 等 物 質 ( di — 及 t r igly me ) (參 照 E Ρ — A — Γ 0 2 7 8 1 9 0 ) 時 通 常 僅 可達 到 低 度 之 Z — A Ρ Μ 等 1 1 物 之 產 率 除 非 于 咼 莫 耳 比 之 L - P Μ ( Η C ) 對 Ζ — I A S Ρ 下 進 行 反 應 〇 1 1 另 外 亦 rrfif 應 注 意 若 爲 化 學 偶合 反 應 ( 由 N — 經 保 護 天 1 1 1 冬 胺 酸 酐 例 如 Ν — 甲 醯 衍生 物， 及 L 一 Ρ h e 或 L — 1 I P Μ 開 始 ) * 則 反 應 于 化 學 計 量或 實 際 化 學 計 量 比 例 之 反 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 一 8 - A7

4 2 5 ：! ^ S _B7_____ 五、發明説明（6 ) 應物下進行並非不尋常，但並未教示使用于水中之z — A s p爲原料之酶催性偶合反應。 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 然而，應注意之DE — A— 3 5 1 736 1揭示酶催 性偶合反應中，反應物Z — A s p和L 一 PM確實可爲實 際化學計量比例，但是一形成加成物時——採用（非最少當 量，係根據上述技藝界之過量L — PM或D — PM)至少 等量之有機胺化合物，其中具有至少一個C6烴基。實際 上，該法與A PM製法關連極微，因爲一方面形成之加成 產物需藉酸化切除釋出胺*另一方面，導入^非該法固有 〃之其他有機組份，其于該法之再循環及濾液流中難以與 用于APM合成之原料分離· 因此需要一種可簡單有效（較佳化學計量）地酶催性 偶合Z — A s p和L — PM，同時產生高轉化率及低原料 消耗性與低再循環流限制，並產生易過濾產物，而不需存 在至少等量D_PM (或額外當量L — PM)等，且不需 添加有機溶劑或胺于偶聯反應中之方法。 經濟部中央標隼局負工消费合作社印製 本發明目的是提供一種有高轉化率之簡易酯催性偶合 Z_A s p和L-PM之方法，其避免上述缺點，可採用 化學計量或實際化學計量之反應物，且得到可輕易過濾之 產物。該目的意外地可根據本發明于4. 5至6. 0原始 pH下及（基于總反應混合計算之百分比）由3至2 5% 鹸金靥鹽、鹼土金屬鹽或胺鹽存在下，于充作酶之中性蛋 白酶影響下，使用等莫耳或實質等莫耳之Z_As !5和1 一 P Μ進行偶合反應而達成。考慮反應速率且限制不需要 本紙張尺度適用中國國家標準{ CNS > Α4规格（210X297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 -4 254 2 8 at B7五、發明説明（7 ) 之水解之情況下，較佳于4. 7至5. 5之原始pH下進 行偶合反應。 意外地，亦發現當依本發明進行該方法時，亦可于相 當高濃度之原料下極簡便地進行偶合反應。已知先前技藝 方法無法採用該高濃度，因爲反應系統粘度于反應期間極 度增高于非特定說明下’申請人假設本發明之較佳結果 可能歸因于Z — APM及Z — APM· L — PM于不同 p Η值及鹽濃度下之溶解度不同。 本發明方法使用含有3至2 5% (基于總反應混合物 計算之重量百分比）鹼金屬鹽、鹸土金靥鹽或銨鹽且原始 pH爲4. 5至6. 0之水性介質，使用中性蛋白酶于化 學計量比例或實質化學計量比例之Z-經保護天冬胺酸和 L 一苯基丙胺酸甲酯間進行酶催性偶合反應，形成沈澱。 本發明所述及之水性介質意指任何均勻，極性水性系 統，其可含有少量（最高約3 0%)有機溶劑，諸如，例 如甲醇或乙腈。 所有鹼金靥鹽、鹼土金屬鹽或銨鹽皆可用于本發明方 法中。適當鹽有，例如，鉀，鈉，鋰，鈣，鎂及銨之鹵化 物或硫酸鹽，或其混合物》本發明所稱之敍亦意指經-或 多個Ci „3烷基取代之銨；該經取代銨鹽實例有氯化三（ 甲）乙銨、氯化二（甲）乙銨等。就重量百分比言之，本 發明者介于3至2 5w t %間，潛在應用有部分由各鹽之 溶解度決定。鹸金屬及銨鹽通常具有最佳溶解度且較佳》 使用氯化鋰，氯化鈉，氯化鉀，硫酸鈉，硫酸鉀*氯化銨 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） ^^1 ^^1 ^^1 «^^1 —^1 —^1 - i j_ HH ^^1 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -10 - A7 425428 ___B7_ 五、發明説明（8 ) 和/或硫酸銨較佳》 -I— 1 I ^^^1 I n (讀先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 反應中鹽含量愈高，則轉化愈快，而不明顯影響產率 。但是，含量愈高，系統粘度增高愈多且/或會超過一或 多種原料及/或鹽本身之溶解度限制，故所得沉澱非必要 地經該鹽污染，或反應轉化度降低。高于2 5%時，系統 粘度使其基本上無法進行反應。反應系統中鹽含量愈低， 則總反應時間愈長，故（特別是）L — PM之水解增高。 含量低于3%時，鹽之存在對反應實際上無明顯影響。低 鹽濃度對偶合產物之溶解度亦有不良影響。若加成產物（ Z — APM ‘ L — PM)應于早期沉澱，則此者有時不干 擾本發明反應，因爲平衡移動會使所有或部分該產物于反 應期間于特定條件下轉化成Z _A PM沉澱。較佳鹽含量 由1 0至1 8%，因爲于該範圍中得到最有利之a )系統 粘度；b)原料溶解度及最終產物之沉澱形成；及c)反 應時間。此者將于該系統所採用之機械條件的討論中更詳 細地說明。 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 酶催性偶合通常于介于1 0至6 0°C之溫度下進行。 溫度愈低，則偶合反應和副反應，諸如L -PM和Z-A P Μ之水解，進行之速率皆較低。溫度愈高，則酶愈快 滅能。熟習此技藝者可輕易決定所用酶應選擇之溫度，以 達到轉化成Ζ - A ΡΜ及酶壽命之最佳結果。 本發明酶催性偶合使用中性蛋白酶進行。此時之中性 蛋白酶意指任何已知可用于由Z — A s p和L_PM合成 Z _ A PM之中性蛋白水解酶，及其具有類似或甚至更高 本紙張尺·度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐） -11 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 25 4 ：： - Αν _Β7_____五、發明説明（9 ) 之活性之突變體。實例爲B a r. ί 1 1 11 s thermopoteolvticus 所製之金靥蛋白酶，諸如嗜熱菌蛋白酶，及其他（尤其是 )尤各種桿菌屬’諸如 B a c i 1 1 η s st. earothermophi lus.， R a r. i 1 Ins anvlol iauefaciens，臘桿菌，膠原酶等所產生 之其他蛋白酶，通常，此類酶于約6至8之pH下之蛋白 酶活性最佳，但已發現于本發明條件下使用時，于由 4. 5至6. 0之原始pH，尤其是4. 7至5. 5，不 需採用額外量之酶，亦可得到良好結果。應注意，存在少 量C a 2 +離子通常對酶之安定性及作用具有良好影響》 應瞭解本發明說明書所稱之本發明可達良好結果之 pH範圍（稱爲原始pH)爲酶催性偶合開始時水性反應 系統中之pH值；本發明偶合反應期間，發現pH先稍微 降低，之後隨反應之進行增高。降低及增高期間，皆可超 越該限制而不致對結果有不利之影響。但是，偶合反應期 間之較佳PH，尤其是後期者保持低于6. 2,較佳低于5.7· 原始pH低于4. 5時，因酶活性降低，故轉化度及 產率降低。原始pH高于6. 0時，轉化度及產率亦降低 ，尤其因爲酯之不令人期望之水解增高，且形成Z -APM · L — PM，于此情況下則不再轉化成Z-APM 。應注意該P Η限制亦可視所用之酶而小幅變化。因而， 例如，使用于較低Ρ Η下具活性之突變酶時，ρ Η範圍之 下限可進一步降低至，例如3. 5至4= 反應循環結束時，即達最終轉化度時，酶活性通常不 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇Χ297公釐} (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -12 - 425428 A7 B7 五、發明説明（10 ) 變或幾乎不變，可重複使用該酶。.因此，建議一尤其是使 用溶解酶時——于分離所得沉澱後，重複使用該酶于酶催性 偶合反應。如此一來，需稍微調整水性介質之組成，直至 再次達到正確之起始條件。因此，可採用同樣之重複該酶 催性偶合反應數次；若原始活性稍降低，則視需要；添加 新鮮酶，于可接受之時間內達到所需轉化度。 亦應瞭解本發明所述之Z-係指任何一種對Z-具非 極性特性之保護基，諸如，例如苄環中中經一或多個烷基 、烷氧基、醯基或鹵素基取代之苄氧羰基化合物》而亦應 瞭解本發明L 一苯基丙胺酸甲酯（L — PM)亦意指由彼 衍生之酸鹽，諸如，例如鹽酸鹽（L — PM.HCj?)。 亦應瞭解本發明中苄氧羰基天冬胺酸（Z - A s p )亦指 由彼衍生之鹽，諸如，例如，二鈉鹽（Z_A s p ·

N A s p時，顯然需于某限度內調整 學品之量。 已知本發明中化學計量或實質化學計量比例意指Z- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 當使用酸鹽而非L 一 PM及/或鹽而非Z — 欲用以達設定pH之化 d 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Asp:L — PM莫耳比介于1: 。較佳使用1:0. 8至1:1之 A s ρ達到最佳之轉化度及產率。 應原料中之一或二者所需之再循環 已發現本發明方法中，沉澱物 過減性——異于先前技藝法所得之P 明顯較大，因此過濾速率同樣較高 0 間 莫耳比。稍過量之Z - 于1 : 1情況下，未反 減至最少。 ——化學組成和結晶性與 Μ加成產物。所得結晶 ’結果因爲粘附溼氣中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X2S7公釐） 13 425428 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（11 ) 捕集或殘留之雜質較少，故產物純化較簡易 申請人發現，進行反應時，若需要，則可使用多種形 式之裝置及可用于使系統固定或保持運作之設備。偶合反 應可于所有由對反應無不利之干擾之諸如玻璃、不銹鋼等 材料所製之容器及管柱中進行。當使用諸如經承載酶等固 定酶時，管柱特別適合。裝置大小可廣泛變化。因此，可 于任何所需之規格下進行反應，例如，由試管或燒杯至 1 0 3之規模。 亦可選擇分批或部分連續式反應。若（半）連續地進 行本發明方法，較佳僅于至少約6 0%原始反應混合物轉 化時方才開始連續分離沉澱，之後可再于分離沉澱物後之 內容物中添加實質化學計量比例之原料。 本發明之轉化不需對反應系統進行任何機械影響即可 平順地進行，故存有所謂靜態條件。所選擇之反應器則不 需裝置使反應介質保持某些其他方式之運動之攪拌器或裝 置。若反應系統，例如藉機械攪拌或保持反應器搖動而連 續或斷續地保持或多或少之劇烈運動，則亦得到優越結果 。此處所述之攪拌及搖動包括所有熟習此技藝者所認定之 實例。因此，基本上所有攪拌器皆可用于攪拌；但是，使 用變速攪拌器較佳，因爲可設定攪拌速度于最佳值，甚至 可調整以變化粘度等值。而且，攪拌速度之影響極小。藉 外部泵循環反應器內容物應視爲攪拌形式。泵動速率及反 應器尺寸決定系統混合程度。顯然使用搖動之變化方法更 適于進行極小量之反應，最高約1 Ο 〇 〇 J2。申請人進行 ——---------'裝-- {請先閱讀背面之注項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 14 - 4254 2 8 A7 B7 經清部中央標率局負工消費合作社印製 五、發明説明（12 ) 之實驗顯示使用搖動法^時達到極高轉化度。亦被發現 極適用之另一實例係于靜態條件下進行第一部分反應至約 2 0至6 0%，較佳3 0至5 0%轉化率，並于攪拌條件 下進行至達所需轉化度者。同樣可使用本發明範疇內之該 "機械處理'之所有可能組合。 偁合反應用酶用量不嚴格，通常使用反應達高轉化度 (260，較佳280%)之期間不多于150個小時之 酶量。通常，以基于總反應混合物之重量百分比表示，適 當酶（意指具有所研究酶活性之蛋白質，所謂活性蛋白質 )用量爲0. 08至1. 5%，較佳0 15至0. 75 %。若以所用之（乾燥）酶配方總量，即活性蛋白質及其 他蛋白質和輔劑諸如鹽，表示酶量，則本文所述之百分比 通常對應于約0· 5至10%，或較佳1至5%。該酶通 常以酶製劑形式使用，亦可原樣販售。通常，該製劑中活 性蛋白質量約製劑重之1 5 %。 本發明方法中，該酶可于任何適當形式下使用，即溶 解和囿定形式。較佳使用溶解酶（溶解酶製劑于反應介質 中而製得），因爲此者具有所得沉澱之分離及其再加工與 重複使用該生物觸媒本身之優點。如前述者，亦可使用所 研究之酶之突變體。上述酶量百分比可視所用酶之活性變 動，使用突變體時亦然。 原料Z — A s p和L — PM之濃度同樣可廣泛變化， 尤其由該原料于原始反應混合物中之溶解度決定。但是· 少量未溶解原料之存在並不干擾反應期間，因爲此者可于 -----------裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度逡用中國國家揉準{ CNS > A4規格（210X297公釐） -15 - 425428 A7 經濟部中央樣隼局貝工消費合作社印製 B7 五、發明説明（13 ) 反應中溶于溶液中。先前技藝之方法中，因爲產物抑制及 反應中粘度過度增高之結果，無法于高于約2 0 0至 7 0 OmM之原料莫耳濃度下進行反應，本發明即使于高 莫耳濃度原料及偶合產物下亦可達到良好轉化率，最高約 1 2 0 OmM大小》此意謂另一項本發明方法之優點，因 可達到較佳每份反應器體積之輸出。 茲以下列實例及對照例進一步詳細說明本發明，但非 限制。首先，應注意實例所示之反應混合物組成（原始狀 態之莫耳濃度及重量百分比）係基于所用之精確量及所製 反應混合物之重量及體積計算。轉化度（考慮反應結束時 之L 一 ΡΜ水解結果相同地）藉所謂逆相高效液體層析（ 逆相HPLC)使用275ηΜ之UV分光光譜偵測，使 用充填“£：16〇8 11(：18之管柱及多梯度口113.0洗提 劑系統（水/乙睛/磷酸三乙胺）決定。由反應混合物取 出之試樣各立即攝取于甲醇中，終止酶催性反應，于分析 前儲存于低溫下（自動注射至洗提劑流中）。下列實例中 之酶濃度及原始酶活性各基于所採用之酶製劑計算》于反 應結束時決定L _ ΡΜ水解之特定值，且以基于開始時L - Ρ Μ存在量之百分比之每小時平均水解表示》 實施例I 1^ — ?1\/1*11(：^(4.018;18.6|11111〇1)于 室溫下，1 0 Omp燒杯中，于攪拌下1與于水（ 20. 57g)中之 Z-Asp.diNa (7. 2 8 g 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -16 - A7 425428 _____B7 五、發明説明（Η ) 經濟部中央標率局貝工消費合作杜印製 ， 2 3 4 mmol) 溶 液 摻 和 0 所 得 溶液 同 樣 于 攪 拌 下連續 摻 和 2 - 5 9 g N a C 1 及 0 17 g C a C 9. 2 * 2 Η 2〇 ，藉添加； 3 N HCj?設定pH于丨 5 _ ( 3 =殘留 澄 清 溶 液 與 2 * 9 8 g 嗜 熱 菌 蛋 白 酶（ 粉 狀 ) 來 白 Da i wa ; 含 約 1 5 % 嗜 熱 菌 蛋 白 酶 蛋 白 質 及7 0 % N a C in ^ 得 到 具 有 下 列 組 成 之 反 應 混 合 物 ； 總 重 : 3 9 * 7 g 總 體 積 : 3 3 1 m 9. C Ζ — A S P ] 〇 7 0 7 m Μ ( 基于 L — P Μ 有 2 6% 過 量 ) C L — P Μ ] 〇 ; 5 6 2 m Μ C Ν a C 义 ) 1 4 5 % [ 酶 ) 7 5 % ( 製 劑 ) P Η 5 0 各 約 2 0 m 反 trhf 混 合 物 立 即 送 入1 5 支 試 管 中 ，之後 同 時 置 入 4 0 °c 水 浴 中 ， 懸 吊 于 聯 結于 搖 動 機 ( Gyrotory 水 浴 搖 動 機 * New Br UUSff i C k Sc i ent i f 1 C :Co I n c .，型 號 6 7 6 D ) 之 支 架 中 〇 搖 動 機 設 定于 每 分 鐘 2 0 0轉。 經 特 定 時 間 後 每 次 由 水 浴 取 出 1 支試 管 * 測 定 反 應之進 行 〇 最 後 ， 添 加 約 1 5 m 甲 醇 終 止反 應 後 1 試 管 冷卻至 約 5 °C » 之 後 藉 逆 相 Η P L C 分 析 內容 物 之 組 成 ο 發現酶 製 劑 之 原 始 酶 活 性 3 2 nmol mi η 一 "mg ~ 1 0 此 外 ϊ 確定于 約 3 0 分 鐘 後 存 有 首 批 沈 澱 物 9 而 于2 - 5 小 時 反 應時間 後 達 8 7 % 最 終 轉 化 度 C 基 于 L — P Μ 計 算 ) 〇 若 反應持 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐} ^^1 ^^1 ^^1 ^^1 ^^1 ^^1 ^^1 1 Is - - I ί^— ^^1 an ϋ— HI ^ii U3^ 11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 425428 A7 B7 五、發明说明（15 ) 績較久，則轉化度不再增加。反應時間2 5小時後’不 再可測得L_Fh e。因此，此情況下之L_PM不水解 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實施例 L — PM-HCj? (3. 34g; 15. 5 m m ο 1 )及 Z — Asp (4. 96g ; 18. 6mmol)于水（ 14. 9g)中之懸浮液于室溫下燒杯中，于攪拌下與 2 2重量％NaOH(6.9 2g;37Ommol NaOH)摻和；形成ρΗ=5· 0之澄清溶液。相同地 ，此溶液于攪拌下連續摻和3. 26g N a C ^ - 〇. 1 2 g CaC 义 2.2H20 及 1. 40g 嗜熱菌蛋 白酶（粉狀，Araano ;含約15%嗜熱菌蛋白酶蛋白質及 34%NaCp)。得到具有下列組成之反應混合物： 總重：3 4 · 7 g 總體積：29. 3m艾 〔Z — Asp〕〇 :634mM (基于 L-PM 有 20% ) C L - P Μ ] 〇 ： 5 2 9 m Μ 〔NaCJM :13. 5 % 〔酶〕 ：4 . 0 % pH :5.0 反應混合物即刻分配于試管間並如實例I般進一步處理》 發現酶製劑之原始酶活性2 7 nmol · min-img-1 。亦發現 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2.97公釐） ~ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 25 4 2 ΰ Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（16 ) 約1 2 0分鐘後可發現首批沉澱，反應時間9小時後達 8 0%之最終轉化度。隨著反應之進行，轉化度不再增加 。反應時間9小時後，已產生少量L-Phe (0. 21 mmol)，對應于每小時0. 16 %L- PM水解。 實施例ΠΙ 重複實例ϋ方法，不同處係採用下述括弧內之原料用 量。 L-PM*HCj? (4. 7 0 g ； 2 1 . 8 mmol)及 Z- A s ρ ( 5 . 2 8 g ； 1 9 . 8 mmol);水（13. 68 g) ；22%NaOH(6. 36g；35. 0 mmol N a Ο H ) ； N a C 5 ( 2 . 9 5 g ) ； C a C i? 2 ( 0. 13g);嗜熱菌蛋白酶（粉狀，Amano ，1. 50 g ;如實例Π )。 產生具下列組成之初反應混合物： 總重：3 4 . 6 g 總體積：2 9 . 0 m义 〔Z — Asp〕〇 ： 6 8 3 m Μ [L - Ρ Μ ) 〇 :752mM (基于 Z-Asp 過量 10 % ) 〔NaC)M :13. 7 % 〔酶〕 ：4.3% pH :5.0 反應混合物即刻分配于試管間並如實例I般進一步處理。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0·〆297公釐） 19 — 425428 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 五、發明説明（π ) 發現酶製劑之原始酶活性3 2nmo1 · minl|Dg-1 °亦發現 于約6 0分鐘後形成首批沉澱’反應時間1 3，5小時後 ，轉化度達（基于L_PM) 5 ’持續反應時’反應 轉化度再增加。反應時間1 3 · 5小時後’發現少量L 一 P h e ( 0 . 3 2 mmo 1 )，相當于每小時約〇. 1%之[ —P Μ水解。 實施例IV a 重複實例Π方法，不同處係採用下述括弧內之原料用 量。 L-PM-HCj? (4. 3 1 g ； 2 0 0 mmol )及 Z -Asp ( 5 - 8 7 g ； 2 2 . 0 mmol ):水（1 4 53 g) ；22%NaOH(6. 89g；37. 9 mmol N a Ο H ) ； N a C ί ( 3 - 2 0 g ) ;CaC^2( 0. 12g);嗜熱菌蛋白酶（Amano ’ 1. 42g，如 實例Π )。 產生具下列組成之初反應混合物： 總重：3 6 . 3 g 總體積：30. 8mi C Z - A s p ] 〇 :714mM (基于 L — PM過量 10% ) 〔L-PM〕0 ： 6 4 9 m Μ 〔NaCJM :13. 4% 〔酶〕 ：3 . 9 % (請先聞讀背面之注^^項再填寫本f) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210 X 297公釐） -20 -

4 25 4 2 S A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 五、· 资明説明（ 1ί 丨） i P Η 5 0 1 反 應 混 合 物 即刻 分 配 于 試 管 間 並 如 實 例 I 般 進 —- 步 處 理 0 1 I 發 現 酶 製 劑 之 原 始 酶 活 性 2 7 9 nmol • mi η 一 1 rag " 1 〇 亦 y*—V 請 1 \ 發 現 反 nbr 應 時 間 1 3 5 小 時 後 > 轉 化 度 達 ( 基 于 L 一 P Μ 先 聞 1 1 ) 8 3 % 持 續 反 應 時 9 反 應 轉 化 度 不 再 增 加 〇 反 應 時 間 背 面 之 1 1 每 小 時 注 1 1 5 小 時 後 僅 發 現 極 少 量 L — Ρ h e 相 當 于 意 蓽 1 Ύ 項 | 0 2 % 水 解 0 再 ji \ 寫 本 装 I 1 1 實 施 例 IV b 1 I 重 複 實 例 IV a 方 法 不 同 處係 採 用 不 同 量 之 水 i 2 2 1 1 1 % Ν a 0 Η 及 Ν a C 1 1 訂 水 ( 1 3 5 8 g ) 2 2 % Ν a 0 Η ( 7 3 0 g t 1 4 0 1 mmol Ν a 0 Η ) Ν a C ( 4 6 e ) 〇 1 1 產 生 具 下 列 組 成 之 初 反 tyfe 應 混 合 物 1 1 總 重 3 7 2 g 1 總 體 積 3 1 2 m I 〔 Ζ — A S Ρ 0 7 0 6 m Μ ( 基 于 L — Ρ Μ 1 0 % I 過 量 ) 1 1 C L — P Μ ) 〇 6 4 1 m Μ 1 1 [ Ν a C 1 7 2 % 1 1 C 酶 ] ; 3 8 % 1 | P Η ： 5 0 1 I 反 應 混 合 物 即 刻 分 配 于 試 管 間 並 如 實 例 I 般 進 步 處 理 〇 1 1 I 發 現 酶 製 劑 之 原 始酶 活 性 4 2 0 nmol • mi η 一 1 mg ' 1 0 亦 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） —21 - 經濟部中失標隼局員工消費合作社印裝 ^ 2 ΰ , ：；五、發明説明（19 ) 發現反應時間約4小時後，轉化度達（基于L - PM) 7 7%，持續反應時，反應轉化度不再增加。反應時間4 小時後，發現少量L-Phe (〇. 23mmoI)，相當于 每小時約0 . 1 6 %之水解。 啻施例IV c 重複實例IVa方法，不同處係採用不同量之水，2 2 %NaOH 及 NaCJ?: 水（15. 28g) ;22%NaOH(6. 82g; 3 7.5 mmol N a Ο Η ) ； N a C j? ( 2 . 0 0 g )。 產生具下列組成之初反應混合物： 總重：3 6 . 3 g 總體積：3 0 . 8 m及 [Z - A s p ] 〇 :714mM (基于 L-PM 過量 1〇 % ) (L — Ρ Μ ] 〇 ： 6 4 9 m Μ 〔NaCjM :10. 0 % 〔酶〕 ：3.9% pH :5.0 反應混合物即刻分配于試管間並如實例I般進一步處理。 發現酶製劑之原始酶活性18. Onmol.inin_1nig_1 。亦 發現反應時間約1 6小時後，轉化度達（基于L 一 PM) 8 4%，持續反應時，反應轉化度不再增加。反應時間 16小時後，發現少量L-Phe (；L. 1 mmol )，相當 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX 297公釐) ~ -22 - A7 B7 n· ^^^1 1^^— —^1 ^^1 I. ^^1 —^1 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 425428 A7 經濟部中央標準局員工消费合作社印衷 B7五 '發明説明（2〇 ) 于每小時約0 . 3 %之水解β 眚施例v 重複實例Π方法’不同處係採用下述括弧內之原料用 量，測定移動程度效果，亦于不同搖動速度及靜態條件下 進行試驗：L-PM-HC5 (12. 9 3 g ； 6 0 . 0 mmol)及 Z— Asp (18. 3 3 g ; 68. 6 mmol);水（ 43. 86g) ·22%Ν3〇Η(19. 9 9 g ； 109.9 mmol N a Ο H ) ； N a C ^ ( 9 . 7 5 g ) ；C a C ^ 2 ( 0 . 4 2 g ):嗜熱菌蛋白酶（粉狀， Amano ，4 . 2 6 g ;如實例 Π )。 產生具下列組成之初反應混合物： 總重：1 0 9 . 5 g 總體積：9 1 . 2 m i? 〔Z — Asp〕。 ：752mM (基于 L — PM 過量 14 % ) [L - P M ) 〇 ： 6 5 8 m M 〔NaCiM :13. 4 % 〔酶〕 ：3 . 9 % pH :5.0 所製之反應混合物中，15mj?即刻移入直徑3. 3cm 之玻璃反應器中，其置于4 0°C水浴中並懸吊于聯結于搖 動機之支架上。搖動機設定于每分鐘1 5 0轉。 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 1· ^^^1 ^^^1 - 1-1 t ^^^1 nn ^^^1 In 淨 、-e (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -23 - 4 254 2 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（21 ) 同時，第二份1 5mi?相同反應混合物于另一個搖動 機中以相同方式處理，設定于每分鐘2 5 0轉之速度。此 外，第三部分1 Omi?儲存于4 0°C靜態條件下。 經特定時間後由容器取出試樣，測定反應之進行，（ 第一份試樣一P5不含或僅含少量沉澱一使用吸量管；之後 之試樣，當反應混合物粘度因沉澱而增高時，使用刮勺） 。最後，所取樣以約1 5mj?甲醇稀釋，冷卻至約5°C並 藉逆相HPLC分析其組成》該酶製劑各具37. 8， 3 0 . 0及2 1. Onmol.min-1^-1之原漿酶活性（各 于150rpm;250rpm及靜態條件下）。亦發現 于該三種情況下，各經極短之反應時間8小時（1 5 0 r pm)及1 2小時後，達約8 9%轉化度（基于L — P Μ )，且當反應持續時，轉化度不再增加。此三種情況 下，L — ΡΜ水解量約〇. 2%每小時。加以搖動之情況 下經4小時後之沉澱物再分析其化學組成，發現由至少 9 8%Ζ-ΑΡΜ所組成。 眚施例VI 另外5 0m β由實例V所製之反應混合物移入保持 4 0Χ且具有漿片恰位于底部上方且恰低于液面之變速攪 拌器之直徑5 cm之恒溫玻璃反應器中。攪拌器速度設定 于每分鐘6 0轉。經特定時間後如實例V般各以吸量管及 刮勺取樣並分析。發現酶製劑之原始酶活性20.1 nmol · min—1 mg -1 '亦發現經2 5小時反應時間後，達 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（_21〇X297公釐） —II .^^1 ^^1 n^i ^^^1 ^^1 I. ^^^1 ^^^1 ^^1 ^^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 2 5 4 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（22) 6 7%轉化度（基于1-_?]^)，且持續反應會再增加轉 化度。經2 5小時反應時間後，發現少量L 一 Phe ( 0· 5 5ππηο1)，即每小時有0. 07%水解。 分析各于4及2 0小時後所得之沉澱之組成*發現兩 者相異：4小時後，有98%Ζ — ΑΡΜ· L — ΡΜ及2 %Ζ-ΑΡΜ，但2 0小時後，沉澱各已變成6 7%及 3 3%。 啻施例ΥΠ 同于實例V及VI之原料溶液，亦製備原料溶液，其中 鹽含量——主要——藉KCJ?或Na2S04達13. 4重量％ ，其他組成則相同。混合物A中，有12. l%KCiZ及 1. 3%NaC5 ;混合物 B 中，有 8. 9 % N a 2 S 0 4 及4. 5%NaCi?。進行偶合反應時，發現可媲美實例 V及VI之結果。 音施例Μ 以同于實例V之方式，製備新反應混合物。其中， 5 〇m{即刻移入保持4 0°C之實例VI之恒溫玻璃反應器 中。但是，此次，僅于靜態條件下攪拌5小時後方始啓動 攪拌器，之後設定于每分鐘6 0轉。經特定時間後，如實 例V般取樣並分析。發現酶製劑之原始酶活性爲20. 6 nmol· 。5小時後之轉化度爲4 3 %。亦發現 經2 0小時反應時間後，達8 6%轉化度（基于L — PM 本紙張尺度適用中國®家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注^!^項再填寫本頁) -25 - 4 254 2 8 A7 B7 經濟部中央標準局員工消费合作社印装 五、發明説明（23) ),特續反應時該轉化度再增加。經2 5小時反應時間後 ，發現少量L — Phe (1. lmm〇l)，相當于每小時約 〇 . 1 7 %水解β 窗施例 製備具下列組成之反應混合物（總重：3 3 9 . 9 6 g;總體積：275. 6 m 5 ): 〔Z - As P〕〇 · 7 45mM (基于 L — PM 過量 1 4 % ) [L - P Μ ] 〇 ： 6 3 5 m Μ [N a C j? ) :13. 0% 〔酶〕 ：3.8%(製劑；Amano之嗜熱菌蛋白酶 ) pH :5.3 混合物分成3份90mi? (A，B，C)，如實例VI般使 用。A部分之pH于偶合反應中不再受影響；B部分之 pH藉逐滴輸入N a 0H溶液（若pH降低）及HC又溶 液（若pH增高）保持約5. 3;若爲C部分，則藉逐滴 添加HCi溶液保持pH約5. 3 (當dH升高至5. 3 )0 A部分之反應及B部分之反應，于3 0分鐘後已形成 結晶，若爲C部分則約1小時。A部分（酶製劑原始酶活 性3 3.〇11111〇1*1114-1呢—1)于2 4小時後達約7 0% 之轉化率，反應持續時不增加；最終pH6.16且每小 --L---„-------装-- (讀先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -26 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 2 5 4 2 R a? ___B7_五、發明説明（24 ) 時PM水解約0. 1%»B及C部分中（具有相同原始酶 活性），各于60及45小時後達95至96%轉化度， 發現每小時約0. 07%PM水解。 對照例A 重複實例Π方法|不同處係此次採用下列括弧中所述 之原料用量並設定PH6. 0 : L — PM.HCJ?( 4 . 0 4 g ； 18. 8 mmol) ; Z - A s ρ ( 5 . 3 4 g ;20. Ommol);水（44. 25g) ; 22% N a Ο H ( 7 . 5 6 g ； 41. 6 mmol N a 0 H ); N a C 1 (8. 0 8 g ) ;CaCl2*2H20( 0. 12g);嗜熱菌蛋白酶（粉末，Amano ，1 · 4 2 g;如實例Π)。原始反應混合物之澄清溶液具下列組成 總重：7 0 . 1 g 總體積：6 1 . 7 m 5 (Z — Asp]〇 :324mM (基于 L — PM過量 6% ) 〔L-PM〕〇 ： 3 0 5 m Μ 〔NaCiM :13. 4 % 〔酶〕 ：1.0% pH :6.0 該反應混合物分配于試管間並如實例I般再處理。發現酶 製劑之原始酶活性爲61 nmol, min — 1^-1 。亦發現反應 -.h i ^^^1 HI n^i I i^i^i V ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4現格（2丨0X297公釐） -27 - 4 2 5 4:.:'.〕 A7 B7 五、發明説明（25 ) 時間3小時後最終轉化度（基于L — PM)達46%，當 反應持續時轉化度不再增加。經3小時反應時間後，亦發 現因L-PM水解形成0. 6 5 mmol L — P h e (即每 小時約1 . 1 5 %，基于原始1 8 mmol ) β mu l^fn I. Bl^i ϋ—^i II 一 V (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中夬標隼局負工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21 ΟΧ 2ί»7公釐） -28 -

Claims (1)

1. 5fOTTlO 年月日 A8 BS -Θβ- D8

   申請專利範圍 附件

   補充 :第84100543號專利申請案 中文申請專利範圔修正本 民國89年11月修正 經濟.#ial0t/t.^rKK工消費合作社印焚 一天冬 介質中 酸及L a - h 6 . 0 計算爲 *于充 耳董或 一苯基 其適ρ Η 苯基丙 2 于4 · 3 鹼土金 4 鹽或銨 氯化銨 —種以高 胺酸及L ~ 轉化率地海催化偶合Ν -笮氧羰基- L 苯基丙胺酸甲酯之方法，其包括于水性 高轉化率地海催性偶合Ν -苄氧羰基一 -苯基丙胺酸甲酯形成沉 -天冬胺醢L 一苯基丙胺 基于總 屬鹽、 之原始ρ Η 3 至 2 5 % 作酶之嗜熱 實質等莫耳 丙胺酸甲酯 中該嗜熱菌 下酶催化偶 胺酸甲酯者 .如申請專 7 至 5 . 5 .如申請專 屬蘧或銨鹽 .如申請專 鹽爲氣化鋰 及/或硫酸 下，于 之驗金 菌蛋白 量之Ν 進行· 澱而製 酸甲酯 反應混 鹼土金 L 一天冬胺 備Ν _笮氧羰基一 ，其係于4 . 5至 合物之重量百分比 屬鹽或銨鼴存在下 酶及其突變體影響下，使用等莫 —笮氧羰基一 L 一天冬胺酸及L 蛋白酶及其突變體係適於在6至8的最 合Ν —笮氧羰基一 L ~天冬胺酸及L 一 〇 利範圍第1項之方法，其中原始pH介 間· 利範圔第1項之方法•其中鹸金颺鹽、 存在量爲10至18%« 利範圍第1項之方法，其中所用鹼金屬 、氯化鈉、氣化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、 銨。 本紙張尺度適用t®困家揉牟（CNS > Α4说搞( 2丨0Χ297公釐） ----------飞-----_lir------% <請先Μ讀背面之注意事項再«.寫本頁) 425428 A8 B8 C8 D8 經濟部t.fcsr^->ejt®工消費合作社印褽 六、申請專利範圍 5 如申請專利範圍第1項之方法’其中于基于總反 應混合物爲0. 08至1. 5，尤其是〇， 15至 〇. 7 5重量百分比之酶（活性蛋白質）存在下進行偶合 6. 如申請專利範圍第1項之方法’其中所使用的酶 爲經溶解的酶* 7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中N—笮氧羰 基- L -天冬胺酸和L _苯基丙胺酸甲釀之使用莫耳比介 于 1:0. 7 至 0. 7:1 間。 8 ·如申請專利範画第1項之方法，其中N -笮氧羰 基一 L -天冬胺酸及L -苯基丙胺酸甲酯之莫耳比介于1 :0 . 8 至 1 : 1 間· 9 .如申請專利範团第1項之方法，其中偶合反應水 性反應系統之pH保持低于6. 2’較佳低于5. 7» 1 0 .如申請專利範圍第1項之方法’其中于反應混 合物至少于部分偶合裎序中保持移動之條件下進行偶合。 1 1 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中偶合反應 係在能使反應混合物至少于部分偶合程序中保持搖動之條 件中進行。 12如申請專利範圍第1_11項中任一項之方法 ，其中偶合反應半連績地進行，于原始反應混合物達至少 6 0 %轉化率時開始連績去除沉澱，並于彼時額外添加實 質化學計置比例之原料。 13.如申請專利範圍第1一11項中任一項之方法 本紙張尺度通用t國國家榡率（CNS > Α4規格（2Ϊ0Χ297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) —裝- 訂 Λ -2 - 8 2 4 5 2 4 8 8 8 8 A8CO 六、申請專利範圍，其中于靜態條件下進行第一部分偶合反應至達2 0 -6 0 %轉化率，之後至少于部分後序偶合程序中使反應混 合物保持移動。 ---------^------ir------i (請先«讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智总財^局员工消費合作社印製 本紙尜足度適用中國國家標牟（CNS > A4現格（210X297公釐） -3 ~

   II專利説明書 發明 _ 新型名稱 中 英 L一苯基丙胺酸甲酯與N—苄氣羰基天冬胺酸之酶催性偶合方法

   Enzyaatic coupling of L-phenylalanine methyl ester and -benzyloxycarbonyl-aspartic acid 姓 名 (1)人野滋哲 Irino，Shigeaki ¢2)中村伸一郎 Nakamur'a，Shin-ichiro (3)小 ill 清孝〇yana, Kiyotaka 國 發明 創作 人 籍 住 '居所 (1) (1) 日本 (23曰本 (3 日本 裝 (3) 曰本山口県熊毛郡平生町大字平生村二八八番 地 · 288， Oaza-Hirao-mura, Hirao-cho, Kimage gun, Yaiaguchji Japan 日本山口県新南陽市宮前一丁目一之三十一 Miyanoiae 1-chome 1-31, Shinnanyo-cho, Yamaguchi 145, Japan 日本國東京都大田區南雷谷四丁目24_2 Minamiyukigaya 4-24-2, Ohta-ku, Tokyo-pref., Japan 訂 經濟部智楚財4灼員工消骨合作杜印製 申請人 姓 名 (名稱） 國 藉 住 、居所 (事務所） 代 表人 姓 名 ⑴荷酺蜜糖公司 Holland Sweetener Conpany V.o.F. ⑴荷閙 ⑴荷蘭羅傑蘭高伊路一號 Koestraat 1, 6167 RA Geleen, The Netherlands (1)喬勒夫 * 道頓桕格 Dautzenberg, Jozef Marie Andreas 本纸張尺度it用國家轉（CNS )織格（2似297公釐） 線 f ；： . - ^ ^ 4 2 5 4 2 8 A5 四、中文發明摘要（發明之^稱： L 一苯基丙胺酸甲酯與N —苄氧)羰 基天冬胺酸之酶催性偶合方法 本發明有關一種製備N _苄氧羰基_ a _ L _天冬胺 醯_ L -苯基丙胺酸甲酯之方法，其係于水性介質存在下 酶催性偶合Ν -笮氧羰基~ L -天冬胺酸與L —苯基丙胺 酸甲酯而形成沉澱’該偶合反應係于由4，5至6 · 〇之 原始ρ Η下，基于總反應混合物計算之重量百分比有3至 2 5 %鹼金靥鹽、鹼土金屬.鹽或銨鹽存在下’于中性蛋白 酶影響下，使用（實質上）等莫耳量之Ν -笮氧羰基- L -天冬胺酸和L -苯基丙胺酸甲酯進行。 —^in ^^^^1 ^^^^1 1^1^1 t. ^^^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁各欄J 英文發明摘要（發明之名稱：™2YMATIC COUPLING OF L-PHENYLALANIWE ^THYL ESTER AND N-BENZYLOXYCARBONyL-ASPARTIC ACID IT 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 The invention relates to a process foe the preparation of N-benzyloxycarbonyl-a-*L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester by enzymatic coupling of N-benzyloxycacbonyl-L-aspartic acid and L-phenylalanine methyl ester in an aqueous medium with formation of a precipitate, the coupling reaction being effected with (virtually) equiraolac quantities of N—benzyloxycarbony!-L-aspartic acid and L-phenylalanine methyl ester under the influence of a neutral protease at an initial pH of from 4·5 to 6,0 and in the presence of from 3 to 25%, calculated as per cent by weight based on the total reaction mixture, 〇f an alkali metal salt, alkaline earth metal salt or ammonium salt. 本紙張尺度適用中國國家榡牟（CNS〉A4規格（210X297公釐） 5fOTTlO 年月日 A8 BS -Θβ- D8

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   補充 :第84100543號專利申請案 中文申請專利範圔修正本 民國89年11月修正 經濟.#ial0t/t.^rKK工消費合作社印焚 一天冬 介質中 酸及L a - h 6 . 0 計算爲 *于充 耳董或 一苯基 其適ρ Η 苯基丙 2 于4 · 3 鹼土金 4 鹽或銨 氯化銨 —種以高 胺酸及L ~ 轉化率地海催化偶合Ν -笮氧羰基- L 苯基丙胺酸甲酯之方法，其包括于水性 高轉化率地海催性偶合Ν -苄氧羰基一 -苯基丙胺酸甲酯形成沉 -天冬胺醢L 一苯基丙胺 基于總 屬鹽、 之原始ρ Η 3 至 2 5 % 作酶之嗜熱 實質等莫耳 丙胺酸甲酯 中該嗜熱菌 下酶催化偶 胺酸甲酯者 .如申請專 7 至 5 . 5 .如申請專 屬蘧或銨鹽 .如申請專 鹽爲氣化鋰 及/或硫酸 下，于 之驗金 菌蛋白 量之Ν 進行· 澱而製 酸甲酯 反應混 鹼土金 L 一天冬胺 備Ν _笮氧羰基一 ，其係于4 . 5至 合物之重量百分比 屬鹽或銨鼴存在下 酶及其突變體影響下，使用等莫 —笮氧羰基一 L 一天冬胺酸及L 蛋白酶及其突變體係適於在6至8的最 合Ν —笮氧羰基一 L ~天冬胺酸及L 一 〇 利範圍第1項之方法，其中原始pH介 間· 利範圔第1項之方法•其中鹸金颺鹽、 存在量爲10至18%« 利範圍第1項之方法，其中所用鹼金屬 、氯化鈉、氣化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、 銨。 本紙張尺度適用t®困家揉牟（CNS > Α4说搞( 2丨0Χ297公釐） ----------飞-----_lir------% <請先Μ讀背面之注意事項再«.寫本頁)