JPH0646845A - 精製酵素濃縮物及びその製造法 - Google Patents
精製酵素濃縮物及びその製造法Info
- Publication number
- JPH0646845A JPH0646845A JP5081896A JP8189693A JPH0646845A JP H0646845 A JPH0646845 A JP H0646845A JP 5081896 A JP5081896 A JP 5081896A JP 8189693 A JP8189693 A JP 8189693A JP H0646845 A JPH0646845 A JP H0646845A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- alkaline protease
- acid
- organic compound
- purified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L12/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising contact lenses; Accessories therefor
- A61L12/08—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising contact lenses; Accessories therefor using chemical substances
- A61L12/082—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising contact lenses; Accessories therefor using chemical substances in combination with specific enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/0005—Other compounding ingredients characterised by their effect
- C11D3/0078—Compositions for cleaning contact lenses, spectacles or lenses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/816—Enzyme separation or purification by solubility
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Eyeglasses (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 発酵ブロスから精製酵素を製造する方法を提
供する。 【構成】 以下の工程を含む発酵ブロスから精製酵素を
製造する方法。 （ａ）発酵ブロスに懸濁している細胞及び固形物から酵
素を分離して酵素液を形成する工程。 （ｂ）前記酵素液を濃縮する工程。 （ｃ）前記の濃縮酵素液に有機化合物を添加する工程
（ここで、有機化合物は、少なくとも２個のカルボキシ
ル基を有するカルボン酸、これらカルボン酸の塩または
エステル、アミノ酸、これらアミノ酸の塩またはエステ
ル、またはこれら有機化合物の二つまたはそれ以上の混
合物のいずれかである）。 （ｄ）前記有機化合物を含む前記の濃縮酵素液をインキ
ュベーションする工程。 （ｅ）精製酵素の沈澱を回収する工程。
供する。 【構成】 以下の工程を含む発酵ブロスから精製酵素を
製造する方法。 （ａ）発酵ブロスに懸濁している細胞及び固形物から酵
素を分離して酵素液を形成する工程。 （ｂ）前記酵素液を濃縮する工程。 （ｃ）前記の濃縮酵素液に有機化合物を添加する工程
（ここで、有機化合物は、少なくとも２個のカルボキシ
ル基を有するカルボン酸、これらカルボン酸の塩または
エステル、アミノ酸、これらアミノ酸の塩またはエステ
ル、またはこれら有機化合物の二つまたはそれ以上の混
合物のいずれかである）。 （ｄ）前記有機化合物を含む前記の濃縮酵素液をインキ
ュベーションする工程。 （ｅ）精製酵素の沈澱を回収する工程。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、発酵調製物から酵素を
回収し、精製する方法ならびに得られた精製酵素に関す
る。
回収し、精製する方法ならびに得られた精製酵素に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】洗剤成分としての酵素の利用はよく知ら
れている。一般に洗剤に利用される酵素は、主としてア
ルカリ条件で安定なプロテアーゼ、リパーゼ及びアルフ
ァ−アミラーゼである。アルカリ性プロテアーゼのなか
でも、バチルス属、すなわちバチルス・ズブチリス、バ
チルス・リケニフォルミス及び好アルカリ性のバチルス
属細菌に由来するセリン・プロテアーゼが洗剤調製物に
広く使用されている。（スタラセ，シー．及びバルフォ
ード，エイチ．シー．、エンサイクロペディア・ケム・
テクノロ・９、１３８−１４８（１９８０）；ケー．ホ
リコシ及びティー．アキカ、ア・ニュー・マイクロバイ
アル・ワールド、スプリンジャー−ベラーグ、ニューヨ
ーク、９３頁（１９８２）。
れている。一般に洗剤に利用される酵素は、主としてア
ルカリ条件で安定なプロテアーゼ、リパーゼ及びアルフ
ァ−アミラーゼである。アルカリ性プロテアーゼのなか
でも、バチルス属、すなわちバチルス・ズブチリス、バ
チルス・リケニフォルミス及び好アルカリ性のバチルス
属細菌に由来するセリン・プロテアーゼが洗剤調製物に
広く使用されている。（スタラセ，シー．及びバルフォ
ード，エイチ．シー．、エンサイクロペディア・ケム・
テクノロ・９、１３８−１４８（１９８０）；ケー．ホ
リコシ及びティー．アキカ、ア・ニュー・マイクロバイ
アル・ワールド、スプリンジャー−ベラーグ、ニューヨ
ーク、９３頁（１９８２）。
【０００３】ほとんどの液体洗剤調製物では、酵素の添
加率はわずかである。したがって、かなり濃厚な酵素調
製物を製造する必要がある。酵素濃縮物は、従来限外濾
過及び蒸発等の一般的な方法で、酵素水溶液から水を除
去して調製されている。硫酸アンモニア及び硫酸ナトリ
ウム等の無機塩を添加して、水溶液から酵素を沈殿させ
る方法も、実験室及び工業レベルで広く使用されてい
る。（ディックソン，エム．及びウエッブ，イー．デ
ィ．、エンザイム、アカデミック・プレス、ニューヨー
ク、３９−４１（１９６４）、カーリン、メソッド・オ
ブ・プラズマ・プロテイン・フラクショネーション、ア
カデミック・プレス、ニューヨーク（１９８０）。しか
し、これらの塩類を大規模に広く使用すると、環境に対
して問題があり、複雑な排水処理が必要となる。実際
に、ヨーロッパの国々ではすでにこれらの塩類の大規模
な工業的使用を制限している。また、エタノール及びア
セトン等の有機溶媒も沈殿剤として使用されている（デ
ィックソン及びウエッブ、エンザイム、前出、３７−３
９；バウアーら、イスラエル・ジャーナル・オブ・ケミ
ストリー、５（３）、１１７−１２０（１９６７）。し
かし、コスト及び安全性の点からこれらの溶剤の利用に
は限界がある。
加率はわずかである。したがって、かなり濃厚な酵素調
製物を製造する必要がある。酵素濃縮物は、従来限外濾
過及び蒸発等の一般的な方法で、酵素水溶液から水を除
去して調製されている。硫酸アンモニア及び硫酸ナトリ
ウム等の無機塩を添加して、水溶液から酵素を沈殿させ
る方法も、実験室及び工業レベルで広く使用されてい
る。（ディックソン，エム．及びウエッブ，イー．デ
ィ．、エンザイム、アカデミック・プレス、ニューヨー
ク、３９−４１（１９６４）、カーリン、メソッド・オ
ブ・プラズマ・プロテイン・フラクショネーション、ア
カデミック・プレス、ニューヨーク（１９８０）。しか
し、これらの塩類を大規模に広く使用すると、環境に対
して問題があり、複雑な排水処理が必要となる。実際
に、ヨーロッパの国々ではすでにこれらの塩類の大規模
な工業的使用を制限している。また、エタノール及びア
セトン等の有機溶媒も沈殿剤として使用されている（デ
ィックソン及びウエッブ、エンザイム、前出、３７−３
９；バウアーら、イスラエル・ジャーナル・オブ・ケミ
ストリー、５（３）、１１７−１２０（１９６７）。し
かし、コスト及び安全性の点からこれらの溶剤の利用に
は限界がある。
【０００４】酵素の色及び臭いは、これを添加する洗剤
調製物の品質に悪影響を及ぼす。そのため、酵素濃縮物
から色素を除去する必要があるが、この色素は酵素−色
素複合体の一部と考えられている。ディックソン，エ
ム．及びウエッブ，イー．シー．、エンザイム、前出、
はプロテアーゼ溶液から溶媒沈殿による色素除去法を記
載している。しかし、この方法は製品の収率が低い。水
溶性酵素濃縮物中の色の除去には、活性炭吸着法が工業
的に広く利用されているが、原料の損失、高コスト、廃
棄物処理が大きな欠点である。
調製物の品質に悪影響を及ぼす。そのため、酵素濃縮物
から色素を除去する必要があるが、この色素は酵素−色
素複合体の一部と考えられている。ディックソン，エ
ム．及びウエッブ，イー．シー．、エンザイム、前出、
はプロテアーゼ溶液から溶媒沈殿による色素除去法を記
載している。しかし、この方法は製品の収率が低い。水
溶性酵素濃縮物中の色の除去には、活性炭吸着法が工業
的に広く利用されているが、原料の損失、高コスト、廃
棄物処理が大きな欠点である。
【０００５】洗剤として利用する酵素調製物は、最終製
品に好ましくない着色、濁り、不安定性、アレルギー性
をもたらすような成分を含まないことが望ましい。この
ような成分は、微生物自身または発酵原材料の残渣に由
来する。グラム陽性桿菌の調製物では、細胞生育過程の
細胞膜のターンノーバーによって細胞膜のアニオン性重
合物、ペプチドグリカン類、ガラクトシルポリマー類及
びその他のポリサッカライド夾雑物が溶出する。これら
の細菌の細胞膜重合物が酵素調製物に混在すると、アレ
ルギー性の増加、結合カチオン、例えばＣａ++による酵
素の安定性の低下等の好ましくない影響があり、また洗
剤調製物の濁りの原因になる。
品に好ましくない着色、濁り、不安定性、アレルギー性
をもたらすような成分を含まないことが望ましい。この
ような成分は、微生物自身または発酵原材料の残渣に由
来する。グラム陽性桿菌の調製物では、細胞生育過程の
細胞膜のターンノーバーによって細胞膜のアニオン性重
合物、ペプチドグリカン類、ガラクトシルポリマー類及
びその他のポリサッカライド夾雑物が溶出する。これら
の細菌の細胞膜重合物が酵素調製物に混在すると、アレ
ルギー性の増加、結合カチオン、例えばＣａ++による酵
素の安定性の低下等の好ましくない影響があり、また洗
剤調製物の濁りの原因になる。
【０００６】米国特許第４，６５９，６６７号には、酵
素の過飽和溶液のｐＨをその等電点ｐＨに調整すること
による酵素の結晶化法が開示されている。米国特許第
４，６９９，８８２号には、硫酸アンモニウム及び硫酸
マグネシウムを使用するグルコースイソメラーゼの結晶
化法が開示されている。特許協力条約（ＰＣＴ）出願第
ＷＯ８９／０５８６３号、１９８６年６月２９日発行に
は、イオン交換クロマトグラフィーを用い、プロテアー
ゼ調製物からアレルギー活性を有するガラクトシルポリ
マーを分離する方法が記載されている。
素の過飽和溶液のｐＨをその等電点ｐＨに調整すること
による酵素の結晶化法が開示されている。米国特許第
４，６９９，８８２号には、硫酸アンモニウム及び硫酸
マグネシウムを使用するグルコースイソメラーゼの結晶
化法が開示されている。特許協力条約（ＰＣＴ）出願第
ＷＯ８９／０５８６３号、１９８６年６月２９日発行に
は、イオン交換クロマトグラフィーを用い、プロテアー
ゼ調製物からアレルギー活性を有するガラクトシルポリ
マーを分離する方法が記載されている。
【０００７】米国特許第５，０４１，３７７号には、低
温でアルカリ性プロテアーゼ溶液にハロゲン塩（塩化ナ
トリウム及び塩化カリウム）を添加することによって、
バチルス・ズブチリス及びバチルス・アミロリキュファ
シエンスに由来するスブチリシンを結晶化させ、スブチ
リシンの結晶を得る方法が記載されている。ＰＣＴ出願
第ＷＯ９１／０９９４３号には、酵素純度が比較的高
く、純酵素タンパク濃度が少なくとも５ｇ／ｌの液体を
含む酵素水溶液を出発材料とし、蟻酸、酢酸または硝酸
のＮａ、Ｋ、ＣａまたはＭｇ塩等の非ハロゲン型の易溶
性塩を含む結晶促進剤を出発材料に添加する酵素の結晶
化法が記載されている。プロテアーゼを用いた実施例で
は、出発材料は硫酸ナトリウムで沈澱させて調製されて
いる。
温でアルカリ性プロテアーゼ溶液にハロゲン塩（塩化ナ
トリウム及び塩化カリウム）を添加することによって、
バチルス・ズブチリス及びバチルス・アミロリキュファ
シエンスに由来するスブチリシンを結晶化させ、スブチ
リシンの結晶を得る方法が記載されている。ＰＣＴ出願
第ＷＯ９１／０９９４３号には、酵素純度が比較的高
く、純酵素タンパク濃度が少なくとも５ｇ／ｌの液体を
含む酵素水溶液を出発材料とし、蟻酸、酢酸または硝酸
のＮａ、Ｋ、ＣａまたはＭｇ塩等の非ハロゲン型の易溶
性塩を含む結晶促進剤を出発材料に添加する酵素の結晶
化法が記載されている。プロテアーゼを用いた実施例で
は、出発材料は硫酸ナトリウムで沈澱させて調製されて
いる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】無機塩またはその他の
非生物分解性化合物を使用しないで、夾雑物を含まない
精製酵素調製物を高収率で、簡単に、かつ効果的に製造
するうえで、上記の特許、特許出願または刊行物のいず
れにも大きな利点は認められない。本発明の目的は、市
販酵素調製物中の濁り、着色及び臭いの原因となる色素
及びその他の夾雑物を除去することができる新規な酵素
の精製法を提供することである。
非生物分解性化合物を使用しないで、夾雑物を含まない
精製酵素調製物を高収率で、簡単に、かつ効果的に製造
するうえで、上記の特許、特許出願または刊行物のいず
れにも大きな利点は認められない。本発明の目的は、市
販酵素調製物中の濁り、着色及び臭いの原因となる色素
及びその他の夾雑物を除去することができる新規な酵素
の精製法を提供することである。
【０００９】さらに、本発明はアレルギー性で問題とな
るポリサッカライド類、オリゴサッカライド類及びその
他のガラクトシルポリマー類を除去する簡単で、新規な
酵素精製法の提供を目的とする。また、本発明の目的
は、簡単で、コスト効果が高く、かつ純度の高い酵素の
回収率が高い新規な方法により、上記の目的を達成する
ことである。
るポリサッカライド類、オリゴサッカライド類及びその
他のガラクトシルポリマー類を除去する簡単で、新規な
酵素精製法の提供を目的とする。また、本発明の目的
は、簡単で、コスト効果が高く、かつ純度の高い酵素の
回収率が高い新規な方法により、上記の目的を達成する
ことである。
【００１０】さらに、本発明の目的は、環境に対して危
険性が高く、高価な化学物質または無機塩類を使用する
ことなく、上記の目的を達成することである。
険性が高く、高価な化学物質または無機塩類を使用する
ことなく、上記の目的を達成することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明に係わる組成物
は、精製した酵素と有機化合物を含む。ここで、有機化
合物は、少なくとも２個のカルボキシル基を有するカル
ボン酸、これらのカルボン酸の塩またはエステル、アミ
ノ酸、これらのアミノ酸の塩またはエステル、またはこ
れらの有機化合物の二つまたはそれ以上の混合物のいず
れかである。
は、精製した酵素と有機化合物を含む。ここで、有機化
合物は、少なくとも２個のカルボキシル基を有するカル
ボン酸、これらのカルボン酸の塩またはエステル、アミ
ノ酸、これらのアミノ酸の塩またはエステル、またはこ
れらの有機化合物の二つまたはそれ以上の混合物のいず
れかである。
【００１２】ここで開示する組成物は、精製したアルカ
リ性のプロテアーゼとリジン、リジン−ＨＣｌ、アスパ
ラギン酸、マロン酸、コハク酸、フマール酸、クエン
酸、またはこれらの酸のＮａまたはＫ塩を含むものが好
ましい。また、本発明に係わる発酵ブロスから精製酵素
を製造する方法は、発酵ブロスに懸濁している細胞及び
固形物から酵素を分離して酵素液を調製する工程と、得
られた酵素液を濃縮する工程と、少なくとも２個のカル
ボキシル基を有するカルボン酸、これらカルボン酸の塩
またはエステル、アミノ酸、これらアミノ酸の塩または
エステル、またはこれら有機化合物の二つまたはそれ以
上の混合物のいずれかを、濃縮した酵素液に添加する工
程を含む。
リ性のプロテアーゼとリジン、リジン−ＨＣｌ、アスパ
ラギン酸、マロン酸、コハク酸、フマール酸、クエン
酸、またはこれらの酸のＮａまたはＫ塩を含むものが好
ましい。また、本発明に係わる発酵ブロスから精製酵素
を製造する方法は、発酵ブロスに懸濁している細胞及び
固形物から酵素を分離して酵素液を調製する工程と、得
られた酵素液を濃縮する工程と、少なくとも２個のカル
ボキシル基を有するカルボン酸、これらカルボン酸の塩
またはエステル、アミノ酸、これらアミノ酸の塩または
エステル、またはこれら有機化合物の二つまたはそれ以
上の混合物のいずれかを、濃縮した酵素液に添加する工
程を含む。
【００１３】ここに開示した方法では、有機化合物とし
て、リジン、リジン−ＨＣｌ、アスパラギン酸、マロン
酸、コハク酸、フマール酸、クエン酸、またはこれらの
酸のＮａまたはＫ塩のいずれかを用いるのが好ましい。
さらに好ましくは、撹拌を含む条件下で約５℃〜５０
℃、さらに好ましくは３０℃〜４０℃で、濃縮した酵素
液に有機化合物を添加する。
て、リジン、リジン−ＨＣｌ、アスパラギン酸、マロン
酸、コハク酸、フマール酸、クエン酸、またはこれらの
酸のＮａまたはＫ塩のいずれかを用いるのが好ましい。
さらに好ましくは、撹拌を含む条件下で約５℃〜５０
℃、さらに好ましくは３０℃〜４０℃で、濃縮した酵素
液に有機化合物を添加する。
【００１４】本発明の１具体例の利点は、第一に酵素精
製法において酵素そのものの構成成分である有機化合物
を用いて酵素を沈澱させることである。さらに本発明の
利点は、環境を損ないまたは環境に対して危険性のある
化学物質を使用することなく酵素調製物の精製が可能で
あるため、環境保全に対する貢献が大きいことである。
製法において酵素そのものの構成成分である有機化合物
を用いて酵素を沈澱させることである。さらに本発明の
利点は、環境を損ないまたは環境に対して危険性のある
化学物質を使用することなく酵素調製物の精製が可能で
あるため、環境保全に対する貢献が大きいことである。
【００１５】本発明は、上記以外の目的及びそれに随伴
する利点ならびに説明、実施例及びここに提示する表を
参照することによって十分に理解することができる。し
かし、本発明は、これに限るものではない。
する利点ならびに説明、実施例及びここに提示する表を
参照することによって十分に理解することができる。し
かし、本発明は、これに限るものではない。
【００１６】精製酵素とは、多分色素の除去により着色
の程度がかなり低い酵素をいう。また、当該精製酵素は
ガラクトシルポリマーの含有量がかなり低く、一般に酵
素タンパクあたり1.００ｍｇ／ｇ未満、好ましくは0.６
５ｍｇ／ｇ未満である。バチルス・アルカロフィルスか
ら精製したアルカリ性プロテアーゼは、活性濃度１，０
００，０００ＤＵ／ｍｌに濃縮したとき、４７０ｎｍで
1.３未満の吸光度を示し、バチルス・リケニフォルミス
から精製したアルカリ性プロテアーゼは、活性濃度４４
０ＤＡＰＵ／ｍｌに濃縮したとき、４７０ｎｍで0.５未
満の吸光度を示すものである。
の程度がかなり低い酵素をいう。また、当該精製酵素は
ガラクトシルポリマーの含有量がかなり低く、一般に酵
素タンパクあたり1.００ｍｇ／ｇ未満、好ましくは0.６
５ｍｇ／ｇ未満である。バチルス・アルカロフィルスか
ら精製したアルカリ性プロテアーゼは、活性濃度１，０
００，０００ＤＵ／ｍｌに濃縮したとき、４７０ｎｍで
1.３未満の吸光度を示し、バチルス・リケニフォルミス
から精製したアルカリ性プロテアーゼは、活性濃度４４
０ＤＡＰＵ／ｍｌに濃縮したとき、４７０ｎｍで0.５未
満の吸光度を示すものである。
【００１７】本発明の１具体例によると、精製アルカリ
性プロテアーゼは以下の工程で製造する。微生物の生育
に必要な成分を含む液体培地で、バチルス・アルカロフ
ィルスの適当な株を培養し、その発酵ブロスを調製す
る。発酵後、一般的な分離手法を用いて、発酵ブロス中
の微生物細胞、各種の懸濁固形物及び発酵原料残渣から
酵素を分離して酵素液を調製する。得られたアルカリ性
プロテアーゼ酵素液を限外濾過により適当なプロテアー
ゼ活性が得られるまで濃縮し、濃縮酵素液を得る。バチ
ルス・アルカロフィルスのアルカリ性プロテアーゼの場
合、このときの活性が約１，０００，０００ Ｄｅｌｆ
ｔ単位／ｍｌ（ＤＵ／ｍｌ）である。
性プロテアーゼは以下の工程で製造する。微生物の生育
に必要な成分を含む液体培地で、バチルス・アルカロフ
ィルスの適当な株を培養し、その発酵ブロスを調製す
る。発酵後、一般的な分離手法を用いて、発酵ブロス中
の微生物細胞、各種の懸濁固形物及び発酵原料残渣から
酵素を分離して酵素液を調製する。得られたアルカリ性
プロテアーゼ酵素液を限外濾過により適当なプロテアー
ゼ活性が得られるまで濃縮し、濃縮酵素液を得る。バチ
ルス・アルカロフィルスのアルカリ性プロテアーゼの場
合、このときの活性が約１，０００，０００ Ｄｅｌｆ
ｔ単位／ｍｌ（ＤＵ／ｍｌ）である。
【００１８】リジン−ＨＣｌからなる有機化合物を最終
濃度が0.５Ｍとなるように、この濃縮酵素液に添加す
る。溶液のｐＨを約5.０に調整し、撹拌しながら３０℃
で２４時間インキュベーションする。リジン−ＨＣｌの
添加と同時に、アルカリ性プロテアーゼの沈澱が始ま
る。１５，０００ｒｐｍで３０分遠心分離し、酵素沈澱
物と上清を分離する。沈澱した酵素のほとんどは結晶状
であり、高度に精製された酵素製品が得られる。沈澱中
のプロテアーゼ回収率は、沈澱させる前の未精製濃縮液
中に存在していたアルカリ性プロテアーゼに対して９４
％以上である。
濃度が0.５Ｍとなるように、この濃縮酵素液に添加す
る。溶液のｐＨを約5.０に調整し、撹拌しながら３０℃
で２４時間インキュベーションする。リジン−ＨＣｌの
添加と同時に、アルカリ性プロテアーゼの沈澱が始ま
る。１５，０００ｒｐｍで３０分遠心分離し、酵素沈澱
物と上清を分離する。沈澱した酵素のほとんどは結晶状
であり、高度に精製された酵素製品が得られる。沈澱中
のプロテアーゼ回収率は、沈澱させる前の未精製濃縮液
中に存在していたアルカリ性プロテアーゼに対して９４
％以上である。
【００１９】本発明の別の具体例は、バチルス・リケニ
フォルミスから精製アルカリ性プロテアーゼを製造する
ものである。微生物の生育に必要な成分を含む液体培地
でバチルス・リケニフォルミスの適当な株を培養し、そ
の発酵ブロスを調製する。発酵後、一般的な分離手法を
用いて、発酵ブロス中の微生物細胞、各種の懸濁固形物
及び発酵ブロス中の発酵原料残渣から酵素を分離して酵
素液を調製する。得られたアルカリ性プロテアーゼ酵素
液を限外濾過により適当なプロテアーゼ活性が得られる
まで濃縮し、濃縮酵素液を得る。バチルス・リケニフォ
ルミスの場合、このときの活性は約８６３洗浄剤アルカ
リ性プロテアーゼ単位／ｍｌ（ＤＡＰＵ／ｍｌ）であ
る。
フォルミスから精製アルカリ性プロテアーゼを製造する
ものである。微生物の生育に必要な成分を含む液体培地
でバチルス・リケニフォルミスの適当な株を培養し、そ
の発酵ブロスを調製する。発酵後、一般的な分離手法を
用いて、発酵ブロス中の微生物細胞、各種の懸濁固形物
及び発酵ブロス中の発酵原料残渣から酵素を分離して酵
素液を調製する。得られたアルカリ性プロテアーゼ酵素
液を限外濾過により適当なプロテアーゼ活性が得られる
まで濃縮し、濃縮酵素液を得る。バチルス・リケニフォ
ルミスの場合、このときの活性は約８６３洗浄剤アルカ
リ性プロテアーゼ単位／ｍｌ（ＤＡＰＵ／ｍｌ）であ
る。
【００２０】コハク酸からなる有機化合物を最終濃度が
0.５Ｍとなるように、この濃縮酵素液に添加する。溶液
のｐＨを約6.０に調整し、一定の速度で撹拌しながら３
７℃で４時間インキュベーションする。コハク酸の添加
と同時に、アルカリ性プロテアーゼの沈澱が始まる。２
０，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、酵素沈澱物と上
清を分離する。沈澱した酵素は部分的に結晶状であり、
高度に精製された酵素製品が得られる。沈澱中のプロテ
アーゼ回収率は、沈澱させる前の未精製濃縮液中に存在
していたアルカリ性プロテアーゼに対して約８６％であ
る。
0.５Ｍとなるように、この濃縮酵素液に添加する。溶液
のｐＨを約6.０に調整し、一定の速度で撹拌しながら３
７℃で４時間インキュベーションする。コハク酸の添加
と同時に、アルカリ性プロテアーゼの沈澱が始まる。２
０，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、酵素沈澱物と上
清を分離する。沈澱した酵素は部分的に結晶状であり、
高度に精製された酵素製品が得られる。沈澱中のプロテ
アーゼ回収率は、沈澱させる前の未精製濃縮液中に存在
していたアルカリ性プロテアーゼに対して約８６％であ
る。
【００２１】その他いろいろな具体例の変形が可能であ
る。例えば、一般に酵素は細菌から調製する。本発明の
一般的な具体例として、当該酵素はプロテアーゼ、リパ
ーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペク
チナーゼ、アミダーゼ、カタラーゼ、イソメラーゼまた
はオキシダーゼのいずれかである。また、遺伝子工学的
にタンパクの一部を修飾したこれらの酵素も、本発明の
範囲に含まれる。本発明の好ましい具体例として、当該
酵素はプロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼまたはこ
れらの酵素を遺伝子工学的に修飾したものである。本発
明のさらに好ましい具体例として、当該酵素はバチルス
属の細菌に由来するアルカリ性プロテアーゼまたはその
遺伝子工学的修飾体である。最も好ましい具体例とし
て、当該酵素はバチルス・リケニフォルミス、バチルス
・アルカロフィルス、バチルス・レンタス、バチルス・
アミロリキュファシエンス、バチルス・ズブチリスが生
産した細菌由来アルカリ性プロテアーゼ、その誘導体ま
たはこれら酵素の遺伝子工学的修飾体である。バチルス
・リケニフォルミスまたはバチルス・アルカロフィルス
に由来するアルカリ性プロテアーゼで良好な結果が得ら
れた。ここでいうバチルス・リケニフォルミスまたはバ
チルス・アルカロフィルス由来アルカリ性プロテアーゼ
とは、天然のプロテアーゼならびにこれら酵素の遺伝子
工学的修飾体を含む。
る。例えば、一般に酵素は細菌から調製する。本発明の
一般的な具体例として、当該酵素はプロテアーゼ、リパ
ーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペク
チナーゼ、アミダーゼ、カタラーゼ、イソメラーゼまた
はオキシダーゼのいずれかである。また、遺伝子工学的
にタンパクの一部を修飾したこれらの酵素も、本発明の
範囲に含まれる。本発明の好ましい具体例として、当該
酵素はプロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼまたはこ
れらの酵素を遺伝子工学的に修飾したものである。本発
明のさらに好ましい具体例として、当該酵素はバチルス
属の細菌に由来するアルカリ性プロテアーゼまたはその
遺伝子工学的修飾体である。最も好ましい具体例とし
て、当該酵素はバチルス・リケニフォルミス、バチルス
・アルカロフィルス、バチルス・レンタス、バチルス・
アミロリキュファシエンス、バチルス・ズブチリスが生
産した細菌由来アルカリ性プロテアーゼ、その誘導体ま
たはこれら酵素の遺伝子工学的修飾体である。バチルス
・リケニフォルミスまたはバチルス・アルカロフィルス
に由来するアルカリ性プロテアーゼで良好な結果が得ら
れた。ここでいうバチルス・リケニフォルミスまたはバ
チルス・アルカロフィルス由来アルカリ性プロテアーゼ
とは、天然のプロテアーゼならびにこれら酵素の遺伝子
工学的修飾体を含む。
【００２２】濃縮酵素液中の酵素濃度は、沈殿が生成す
るほどの濃度でなければならない。一般に、本発明に係
わる組成物中に存在する有機化合物は、少なくとも２個
のカルボキシル基を有するカルボン酸、これらカルボン
酸の塩またはエステル、アミノ酸、これらアミノ酸の塩
またはエステル、またはこれら有機化合物の二つまたは
それ以上の混合物のいずれかである。特に好ましいカル
ボン酸は、飽和または不飽和脂肪族カルボン酸である。
好ましいアミノ酸は、自然界に存在するアミノ酸であっ
て、天然及び合成アミノ酸のいずれでもよい。ここで使
用する有機化合物は水溶性でなければならず、その純水
に対する溶解度は２５℃で５ｇ／Ｌより高い必要があ
る。
るほどの濃度でなければならない。一般に、本発明に係
わる組成物中に存在する有機化合物は、少なくとも２個
のカルボキシル基を有するカルボン酸、これらカルボン
酸の塩またはエステル、アミノ酸、これらアミノ酸の塩
またはエステル、またはこれら有機化合物の二つまたは
それ以上の混合物のいずれかである。特に好ましいカル
ボン酸は、飽和または不飽和脂肪族カルボン酸である。
好ましいアミノ酸は、自然界に存在するアミノ酸であっ
て、天然及び合成アミノ酸のいずれでもよい。ここで使
用する有機化合物は水溶性でなければならず、その純水
に対する溶解度は２５℃で５ｇ／Ｌより高い必要があ
る。
【００２３】本発明に係わる有機化合物は、酵素そのも
のの構成成分として自然界に存在するアミノ酸、これら
アミノ酸の塩またはエステルである。
のの構成成分として自然界に存在するアミノ酸、これら
アミノ酸の塩またはエステルである。
【００２４】自然界に存在するアミノ酸、これらアミノ
酸の塩及びエステルは、一般に酸性アミノ酸、塩基性ア
ミノ酸、これらアミノ酸の塩またはエステル、またはこ
れらアミノ酸の二つまたはそれぞれ以上の混合物のいず
れかである。これらアミノ酸は、リジン、アルギニン、
オルニチン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン
酸、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、セリ
ン、これらのＮａまたはＫ塩、これらの塩酸塩、リジン
−ＨＣｌ（リジンの塩酸塩）、Ｌ−リジン−メチルエス
テル・２ＨＣｌまたはこれら有機化合物の二つまたはそ
れ以上の混合物から選ぶのが好ましい。これらアミノ
酸、その塩及びエステルのうち特に好ましいのは、リジ
ン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸、これらアミノ酸のＮａ塩、リジン−ＨＣｌまた
はこれら有機化合物の二つまたはそれ以上の混合物のい
ずれかである。リジン、リジン−ＨＣｌ及びアスパラギ
ン酸で良好な結果が得られた。最も良好な結果は、リジ
ン及びリジン−ＨＣｌで得られた。
酸の塩及びエステルは、一般に酸性アミノ酸、塩基性ア
ミノ酸、これらアミノ酸の塩またはエステル、またはこ
れらアミノ酸の二つまたはそれぞれ以上の混合物のいず
れかである。これらアミノ酸は、リジン、アルギニン、
オルニチン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン
酸、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、セリ
ン、これらのＮａまたはＫ塩、これらの塩酸塩、リジン
−ＨＣｌ（リジンの塩酸塩）、Ｌ−リジン−メチルエス
テル・２ＨＣｌまたはこれら有機化合物の二つまたはそ
れ以上の混合物から選ぶのが好ましい。これらアミノ
酸、その塩及びエステルのうち特に好ましいのは、リジ
ン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸、これらアミノ酸のＮａ塩、リジン−ＨＣｌまた
はこれら有機化合物の二つまたはそれ以上の混合物のい
ずれかである。リジン、リジン−ＨＣｌ及びアスパラギ
ン酸で良好な結果が得られた。最も良好な結果は、リジ
ン及びリジン−ＨＣｌで得られた。
【００２５】少なくとも２個のカルボキシル基を有する
飽和または不飽和脂肪族カルボン酸及びこれらカルボン
酸の塩及びエステルは、一般に２〜３個のカルボキシル
基を有し、少なくとも３個の炭素原子を含むカルボン
酸、そのＮａ、Ｃａ、ＫまたはＭｇ塩またはこれら有機
化合物の二つまたはそれ以上の混合物のいずれかであ
る。好ましくは、これらの有機化合物は２〜３個のカル
ボキシル基を有し、３〜６個の炭素原子を含むカルボン
酸、そのＮａまたはＫ塩またはこれらの有機化合物の二
つまたはそれ以上の混合物のいずれかである。さらに好
ましくは、当該有機化合物はマロン酸、コハク酸、クエ
ン酸、マレイン酸、フマール酸、またはこれらの酸のＮ
ａまたはＫ塩またはこれら有機化合物の二つまたはそれ
以上の混合物のいずれかである。マロン酸、コハク酸、
クエン酸、これらの酸のＮａ塩またはこれらの有機化合
物の二つまたはそれ以上の混合物で良好な結果が得られ
た。最も良好な結果は、コハク酸、クエン酸またはこれ
らの酸のＮａ塩で得られた。
飽和または不飽和脂肪族カルボン酸及びこれらカルボン
酸の塩及びエステルは、一般に２〜３個のカルボキシル
基を有し、少なくとも３個の炭素原子を含むカルボン
酸、そのＮａ、Ｃａ、ＫまたはＭｇ塩またはこれら有機
化合物の二つまたはそれ以上の混合物のいずれかであ
る。好ましくは、これらの有機化合物は２〜３個のカル
ボキシル基を有し、３〜６個の炭素原子を含むカルボン
酸、そのＮａまたはＫ塩またはこれらの有機化合物の二
つまたはそれ以上の混合物のいずれかである。さらに好
ましくは、当該有機化合物はマロン酸、コハク酸、クエ
ン酸、マレイン酸、フマール酸、またはこれらの酸のＮ
ａまたはＫ塩またはこれら有機化合物の二つまたはそれ
以上の混合物のいずれかである。マロン酸、コハク酸、
クエン酸、これらの酸のＮａ塩またはこれらの有機化合
物の二つまたはそれ以上の混合物で良好な結果が得られ
た。最も良好な結果は、コハク酸、クエン酸またはこれ
らの酸のＮａ塩で得られた。
【００２６】また、本発明は、以下の工程を含む発酵ブ
ロスからの精製酵素の製造法に関するものである。 （ａ）前記の発酵ブロスに懸濁している細胞及び固形物
から酵素を分離して酵素液を調製する工程。 （ｂ）前記酵素液を濃縮する工程。 （ｃ）少なくとも２個のカルボキシル基を有するカルボ
ン酸、これらカルボン酸の塩またはエステル、アミノ
酸、これらアミノ酸の塩またはエステルまたはこれら有
機化合物の二つまたはそれ以上の混合物のいずれかを前
記濃縮酵素液に添加する工程。 （ｄ）前記の有機化合物を含む前記濃縮酵素液をインキ
ュベーションする工程。 （ｅ）精製酵素の沈殿を回収する工程。
ロスからの精製酵素の製造法に関するものである。 （ａ）前記の発酵ブロスに懸濁している細胞及び固形物
から酵素を分離して酵素液を調製する工程。 （ｂ）前記酵素液を濃縮する工程。 （ｃ）少なくとも２個のカルボキシル基を有するカルボ
ン酸、これらカルボン酸の塩またはエステル、アミノ
酸、これらアミノ酸の塩またはエステルまたはこれら有
機化合物の二つまたはそれ以上の混合物のいずれかを前
記濃縮酵素液に添加する工程。 （ｄ）前記の有機化合物を含む前記濃縮酵素液をインキ
ュベーションする工程。 （ｅ）精製酵素の沈殿を回収する工程。
【００２７】発酵、分離及び濃縮の技術は公知であり、
従来の方法を用いて望ましい結果が得られる。
従来の方法を用いて望ましい結果が得られる。
【００２８】本発明の好ましい具体例にしたがって、精
製アルカリ性プロテアーゼ溶液を調製する。本発明は、
特にバチルス・リケニフォルミスまたはバチルス・アル
カロフィルスのいずれかの発酵混合物の調製を目的とし
た。酵素を生産する菌株の培養にあたっては、通常アル
カリ緩衝液ならびに炭素源、窒素源及び無機塩類等の微
生物の成育に必要な成分を含む固体または液体培地を使
用する。勿論、特定の菌株によって栄養素の最適組成が
異なるが、当該技術分野の専門家はこのような情報を容
易に入手することができる。一般に、緩衝液は培地のｐ
Ｈを7.０から１0.０の間に保つものでなければならな
い。炭素源としては、マンノース、フラクトース、マン
ニトール、マルトース、セロビオース、蔗糖、デキスト
リン、澱粉、糖蜜、ぶどう糖、澱粉加水分解物またはこ
れら炭素源の二つまたそれ以上の混合物が適当である。
窒素源としては、大豆粉、カゼイン、トウモロコシ浸出
液、棉実粉末、あらゆるタンパクの酵素加水分解物、乾
燥酵母、酵母抽出物、魚粉、馬鈴薯粉末またはこれらの
窒素源の二つまたはそれ以上の混合物を使用することが
できる。適当なアルカリ緩衝液の例としては、炭酸ナト
リウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム及びリン酸ナ
トリウムが含まれる。上記の成分を含む培地を常法によ
って殺菌し、本発明の酵素生産菌のいずれかを接種す
る。好ましくは３０℃〜４０℃で３０〜１２０時間好気
的条件下で振とう培養または通気撹拌下で培養して、培
養菌を得る。
製アルカリ性プロテアーゼ溶液を調製する。本発明は、
特にバチルス・リケニフォルミスまたはバチルス・アル
カロフィルスのいずれかの発酵混合物の調製を目的とし
た。酵素を生産する菌株の培養にあたっては、通常アル
カリ緩衝液ならびに炭素源、窒素源及び無機塩類等の微
生物の成育に必要な成分を含む固体または液体培地を使
用する。勿論、特定の菌株によって栄養素の最適組成が
異なるが、当該技術分野の専門家はこのような情報を容
易に入手することができる。一般に、緩衝液は培地のｐ
Ｈを7.０から１0.０の間に保つものでなければならな
い。炭素源としては、マンノース、フラクトース、マン
ニトール、マルトース、セロビオース、蔗糖、デキスト
リン、澱粉、糖蜜、ぶどう糖、澱粉加水分解物またはこ
れら炭素源の二つまたそれ以上の混合物が適当である。
窒素源としては、大豆粉、カゼイン、トウモロコシ浸出
液、棉実粉末、あらゆるタンパクの酵素加水分解物、乾
燥酵母、酵母抽出物、魚粉、馬鈴薯粉末またはこれらの
窒素源の二つまたはそれ以上の混合物を使用することが
できる。適当なアルカリ緩衝液の例としては、炭酸ナト
リウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム及びリン酸ナ
トリウムが含まれる。上記の成分を含む培地を常法によ
って殺菌し、本発明の酵素生産菌のいずれかを接種す
る。好ましくは３０℃〜４０℃で３０〜１２０時間好気
的条件下で振とう培養または通気撹拌下で培養して、培
養菌を得る。
【００２９】特定の酵素の収率をあげる必要がある場合
には、当該酵素の表現を増強した微生物を用いて発酵ブ
ロスを調製すると有利である。このような微生物は一般
に細菌であり、このような細菌は当該技術分野の専門家
にとっては公知の遺伝子工学による細菌の形質変換また
は選択的突然変異等の手法を用いて準備することができ
る。
には、当該酵素の表現を増強した微生物を用いて発酵ブ
ロスを調製すると有利である。このような微生物は一般
に細菌であり、このような細菌は当該技術分野の専門家
にとっては公知の遺伝子工学による細菌の形質変換また
は選択的突然変異等の手法を用いて準備することができ
る。
【００３０】発酵後、従来の分離技術をもちいて、微生
物細胞及び発酵原材料の残渣を含むいろいろな懸濁固形
物を除去する。一般に、濾過、遠心分離、ミクロ濾過、
回転真空濾過、限外濾過または遠心分離後に限外濾過を
行なう等で十分である。本発明の好ましい具体例では、
遠心分離、限外濾過または遠心分離後に限外濾過を行な
った。最も良好な結果は、遠心分離で得られた。
物細胞及び発酵原材料の残渣を含むいろいろな懸濁固形
物を除去する。一般に、濾過、遠心分離、ミクロ濾過、
回転真空濾過、限外濾過または遠心分離後に限外濾過を
行なう等で十分である。本発明の好ましい具体例では、
遠心分離、限外濾過または遠心分離後に限外濾過を行な
った。最も良好な結果は、遠心分離で得られた。
【００３１】最も高い回収率を得るためには、酵素液を
濃縮することが望ましい。濃縮しない酵素液を使用する
場合には、精製酵素の沈殿を回収するため、インキュベ
−ション時間を長くする必要がある。従来の濃縮技術を
用いて、目的とする酵素活性が得られるまで酵素液を濃
縮し、濃縮酵素液とする。酵素液の濃縮には、濾過、遠
心分離、ミクロ濾過、回転真空濾過、限外濾過、遠心分
離後限外濾過、蒸発、抽出及びクロマトグラフィーを含
む従来の技術のいずれを用いてもよい。本発明の好まし
い具体例では、遠心分離及び限外濾過のいずれか、また
はそれらを組合せて用いる。本発明の最も好ましい具体
例では、限外濾過を用いる。濃縮酵素液中の酵素濃度
は、沈殿が生成するに十分な濃度でなければならない。
バチルス・アルカロフィルスに由来するアルカリ性プロ
テアーゼの場合、通常少なくとも約２５０，０００ＤＵ
／ｍｌ、好ましくは少なくとも約７５０，０００ＤＵ／
ｍｌの酵素活性が得られるまで酵素液を濃縮して濃縮酵
素液とする。酵素活性が約１，０００，０００ＤＵ／ｍ
ｌの場合、最も良好な結果が得られた。バチルス・リケ
ニフォルミスに由来するアルカリ性プロテアーゼの場
合、少なくとも約２５０ＤＡＰＵ／ｍｌ、好ましくは少
なくとも約３００ＤＡＰＵ／ｍｌの酵素活性が得られる
まで酵素液を濃縮して濃縮酵素液とする。酵素活性が約
４００ＤＡＰＵ／ｍｌの場合、最も良好な結果が得られ
た。
濃縮することが望ましい。濃縮しない酵素液を使用する
場合には、精製酵素の沈殿を回収するため、インキュベ
−ション時間を長くする必要がある。従来の濃縮技術を
用いて、目的とする酵素活性が得られるまで酵素液を濃
縮し、濃縮酵素液とする。酵素液の濃縮には、濾過、遠
心分離、ミクロ濾過、回転真空濾過、限外濾過、遠心分
離後限外濾過、蒸発、抽出及びクロマトグラフィーを含
む従来の技術のいずれを用いてもよい。本発明の好まし
い具体例では、遠心分離及び限外濾過のいずれか、また
はそれらを組合せて用いる。本発明の最も好ましい具体
例では、限外濾過を用いる。濃縮酵素液中の酵素濃度
は、沈殿が生成するに十分な濃度でなければならない。
バチルス・アルカロフィルスに由来するアルカリ性プロ
テアーゼの場合、通常少なくとも約２５０，０００ＤＵ
／ｍｌ、好ましくは少なくとも約７５０，０００ＤＵ／
ｍｌの酵素活性が得られるまで酵素液を濃縮して濃縮酵
素液とする。酵素活性が約１，０００，０００ＤＵ／ｍ
ｌの場合、最も良好な結果が得られた。バチルス・リケ
ニフォルミスに由来するアルカリ性プロテアーゼの場
合、少なくとも約２５０ＤＡＰＵ／ｍｌ、好ましくは少
なくとも約３００ＤＡＰＵ／ｍｌの酵素活性が得られる
まで酵素液を濃縮して濃縮酵素液とする。酵素活性が約
４００ＤＡＰＵ／ｍｌの場合、最も良好な結果が得られ
た。
【００３２】ついで、本発明に係わる有機化合物を濃縮
酵素液に添加する。当該技術分野の専門家には、ここで
開示した技術内容を参照し、簡単な追試を行なうことに
よって、酵素を沈殿させるために必要な有機化合物の最
小添加量及びその最適添加量、及び最高の回収率を得る
ために必要なインキュベーション時間、ｐＨ、温度及び
酵素濃度等の沈殿条件を設定することはきわめて容易な
ことである。
酵素液に添加する。当該技術分野の専門家には、ここで
開示した技術内容を参照し、簡単な追試を行なうことに
よって、酵素を沈殿させるために必要な有機化合物の最
小添加量及びその最適添加量、及び最高の回収率を得る
ために必要なインキュベーション時間、ｐＨ、温度及び
酵素濃度等の沈殿条件を設定することはきわめて容易な
ことである。
【００３３】一般に、有機化合物の濃度は少なくとも0.
０６Ｍ、通常は約0.０７Ｍから１Ｍの範囲内にある。ア
ルカリ性プロテアーゼの場合、通常最終濃度が約0.０８
Ｍから0.９Ｍの範囲、好ましくは0.０９Ｍから0.８Ｍの
範囲内にあるように有機化合物を添加する。バチルス・
リケニフォルミスに由来するアルカリ性プロテアーゼの
場合、好ましくは最終濃度が約0.０９Ｍから0.７５Ｍの
範囲内にあるように有機化合物を添加する。バチルス・
アルカロフィルスの場合、最終濃度が約0.２５Ｍから0.
８Ｍの範囲内にあるように有機化合物を添加する。
０６Ｍ、通常は約0.０７Ｍから１Ｍの範囲内にある。ア
ルカリ性プロテアーゼの場合、通常最終濃度が約0.０８
Ｍから0.９Ｍの範囲、好ましくは0.０９Ｍから0.８Ｍの
範囲内にあるように有機化合物を添加する。バチルス・
リケニフォルミスに由来するアルカリ性プロテアーゼの
場合、好ましくは最終濃度が約0.０９Ｍから0.７５Ｍの
範囲内にあるように有機化合物を添加する。バチルス・
アルカロフィルスの場合、最終濃度が約0.２５Ｍから0.
８Ｍの範囲内にあるように有機化合物を添加する。
【００３４】目的とする酵素を精製するにあたって、有
機化合物の最適添加濃度は、特定の酵素の性質、その構
造、安定性及び化学的性質によって変化する。例えは、
バチルス・アルカロフィルスに由来するアルカリ性プロ
テアーゼを溶液から沈殿させるためにはリジンの添加濃
度を0.５Ｍとする必要があるが、バチルス・リケニフォ
ルミスに由来する酵素はわずか0.１Ｍを添加してもかな
りの沈殿が生成する。また、目的とする酵素を精製する
場合の有機化合物の最適添加濃度及び反応条件は、使用
する有機化合物、その構造及び化学的性質、特にその疎
水性によって異なる。
機化合物の最適添加濃度は、特定の酵素の性質、その構
造、安定性及び化学的性質によって変化する。例えは、
バチルス・アルカロフィルスに由来するアルカリ性プロ
テアーゼを溶液から沈殿させるためにはリジンの添加濃
度を0.５Ｍとする必要があるが、バチルス・リケニフォ
ルミスに由来する酵素はわずか0.１Ｍを添加してもかな
りの沈殿が生成する。また、目的とする酵素を精製する
場合の有機化合物の最適添加濃度及び反応条件は、使用
する有機化合物、その構造及び化学的性質、特にその疎
水性によって異なる。
【００３５】酵素液のｐＨを調整する。調整するｐＨは
上記のように精製する酵素及び使用する有機化合物によ
って必然的に異なる。アルカリ性プロテアーゼの場合、
酵素液のｐＨを通常約3.５から１0.５の範囲内にあるよ
うに調整する。好ましくは、酵素液のｐＨが約４から１
０の範囲内にあるように調整する。バチルス・リケニフ
ォルミスに由来するアルカリ性プロテアーゼの場合、約
5.５から9.５の範囲内のｐＨで良好な結果が得られた。
バチルス・アルカロフィルスに由来するアルカリ性プロ
テアーゼの場合、約４から9.５の範囲内のｐＨで良好な
結果が得られた。
上記のように精製する酵素及び使用する有機化合物によ
って必然的に異なる。アルカリ性プロテアーゼの場合、
酵素液のｐＨを通常約3.５から１0.５の範囲内にあるよ
うに調整する。好ましくは、酵素液のｐＨが約４から１
０の範囲内にあるように調整する。バチルス・リケニフ
ォルミスに由来するアルカリ性プロテアーゼの場合、約
5.５から9.５の範囲内のｐＨで良好な結果が得られた。
バチルス・アルカロフィルスに由来するアルカリ性プロ
テアーゼの場合、約４から9.５の範囲内のｐＨで良好な
結果が得られた。
【００３６】一般に沈殿の生成は約５℃から約５０℃の
温度範囲で起こるが、本法では通常約２０℃から約４５
℃の温度範囲、好ましくは約２８℃から約４０℃の範囲
内で行なう。沈殿の生成を誘導する最適温度は、溶液の
条件及び使用する酵素または有機化合物によって異な
る。例えば、バチルス・アルカロフィルスに由来するア
ルカリ性プロテアーゼの場合、２０℃から４０℃の温度
範囲で６時間インキュベーションするとかなりの沈殿が
生成する。
温度範囲で起こるが、本法では通常約２０℃から約４５
℃の温度範囲、好ましくは約２８℃から約４０℃の範囲
内で行なう。沈殿の生成を誘導する最適温度は、溶液の
条件及び使用する酵素または有機化合物によって異な
る。例えば、バチルス・アルカロフィルスに由来するア
ルカリ性プロテアーゼの場合、２０℃から４０℃の温度
範囲で６時間インキュベーションするとかなりの沈殿が
生成する。
【００３７】本発明の別の具体例として、加水分解酵素
を濃縮酵素液に添加することもできる。したがって、工
程（ｃ）でさらに少なくとも１種類の加水分解酵素を濃
縮酵素液に添加する操作を行なうこともできる。これら
加水分解酵素の添加は、有機化合物の添加に先立って行
なうか、または同時に行なって、酵素加水分解と有機化
合物の添加を順次行なってもよいし、同時に行なっても
よい。加水分解酵素を添加する目的は、微生物の発酵過
程で溶出する細胞膜のアニオン性重合物、ペプチドグリ
カン類、ガラクトースポリマー、及びその他のポリサッ
カライド及びオリゴサッカライド夾雑物等の望ましくな
い高分子不純物を加水分解するためである。この目的に
適した加水分解酵素は、オリゴサッカライド類を含むポ
リサッカライドを加水分解する酵素、アミラーゼ、アル
ファ−アミラーゼ、プルラナーゼ、トランスフェラー
ゼ、ポリサッカライドヒドロラーゼ、グリコヒドロラー
ゼ、ガラクトシルヒドロラーゼ、ペクチナーゼ、グルコ
ナーゼ、グルコアミラーゼ、またはこれら加水分解酵素
の二つまたはそれ以上の混合物である。好ましい加水分
解酵素の例は、ソルベイ・エンザイム社（インディアナ
州エルカート）製のカラレックス・ペクチナーゼ及びヂ
アジムＬ−２００グルコアミラーゼである。
を濃縮酵素液に添加することもできる。したがって、工
程（ｃ）でさらに少なくとも１種類の加水分解酵素を濃
縮酵素液に添加する操作を行なうこともできる。これら
加水分解酵素の添加は、有機化合物の添加に先立って行
なうか、または同時に行なって、酵素加水分解と有機化
合物の添加を順次行なってもよいし、同時に行なっても
よい。加水分解酵素を添加する目的は、微生物の発酵過
程で溶出する細胞膜のアニオン性重合物、ペプチドグリ
カン類、ガラクトースポリマー、及びその他のポリサッ
カライド及びオリゴサッカライド夾雑物等の望ましくな
い高分子不純物を加水分解するためである。この目的に
適した加水分解酵素は、オリゴサッカライド類を含むポ
リサッカライドを加水分解する酵素、アミラーゼ、アル
ファ−アミラーゼ、プルラナーゼ、トランスフェラー
ゼ、ポリサッカライドヒドロラーゼ、グリコヒドロラー
ゼ、ガラクトシルヒドロラーゼ、ペクチナーゼ、グルコ
ナーゼ、グルコアミラーゼ、またはこれら加水分解酵素
の二つまたはそれ以上の混合物である。好ましい加水分
解酵素の例は、ソルベイ・エンザイム社（インディアナ
州エルカート）製のカラレックス・ペクチナーゼ及びヂ
アジムＬ−２００グルコアミラーゼである。
【００３８】本具体例によると、酵素液に有機化合物を
添加した後、ｐＨ及び温度を一定に保ってインキュベー
ションする。インキュベーションの過程で、加水分解し
た高分子不純物及び色素と酵素が分離する。この具体例
では、加水分解酵素を添加した濃縮酵素液を４８〜７２
時間インキュベーションして、ガラクトシルポリマーを
完全に加水分解させる。
添加した後、ｐＨ及び温度を一定に保ってインキュベー
ションする。インキュベーションの過程で、加水分解し
た高分子不純物及び色素と酵素が分離する。この具体例
では、加水分解酵素を添加した濃縮酵素液を４８〜７２
時間インキュベーションして、ガラクトシルポリマーを
完全に加水分解させる。
【００３９】本発明に係わる精製酵素沈殿物を得るため
に必要なインキュベーション時間は、特定の酵素の性質
及びその濃度のみならず、添加した特定の有機化合物及
びその濃度によっても異なる。沈殿の生成には、一般に
１〜４８時間、通常２〜３２時間、好ましくは３〜２５
時間インキュベーションする必要がある。例えば、バチ
ルス・アルカロフィルスに由来するアルカリ性プロテア
ーゼの場合、沈殿剤としてリジンを0.５Ｍ添加し、ｐＨ
5.０、３０℃の条件で、一般に１５〜２０時間インキュ
ベーションするとかなりの沈殿が得られる。バチルス・
リケニフォルミスに由来するアルカリ性プロテアーゼ
は、沈殿剤としてリジンを0.５Ｍ添加し、ｐＨ6.０、２
５℃の条件で同じ時間インキュベーションすると沈殿が
得られる。沈殿剤としてコハク酸を0.５Ｍ添加した場
合、バチルス・リケニフォルミスに由来するアルカリ性
プロテアーゼは、ｐＨ6.０、温度３７℃の条件下で約４
時間インキュベーションすると沈殿が得られる。
に必要なインキュベーション時間は、特定の酵素の性質
及びその濃度のみならず、添加した特定の有機化合物及
びその濃度によっても異なる。沈殿の生成には、一般に
１〜４８時間、通常２〜３２時間、好ましくは３〜２５
時間インキュベーションする必要がある。例えば、バチ
ルス・アルカロフィルスに由来するアルカリ性プロテア
ーゼの場合、沈殿剤としてリジンを0.５Ｍ添加し、ｐＨ
5.０、３０℃の条件で、一般に１５〜２０時間インキュ
ベーションするとかなりの沈殿が得られる。バチルス・
リケニフォルミスに由来するアルカリ性プロテアーゼ
は、沈殿剤としてリジンを0.５Ｍ添加し、ｐＨ6.０、２
５℃の条件で同じ時間インキュベーションすると沈殿が
得られる。沈殿剤としてコハク酸を0.５Ｍ添加した場
合、バチルス・リケニフォルミスに由来するアルカリ性
プロテアーゼは、ｐＨ6.０、温度３７℃の条件下で約４
時間インキュベーションすると沈殿が得られる。
【００４０】酵素液を撹拌しながらこれに有機化合物を
添加し、またその後のインキュベーションを撹拌しなが
ら行なうことにより、全体的な精製酵素沈殿の回収率及
び工程の効率を向上させることができる。適当な撹拌方
法としては、機械的な撹拌または振とう、通気撹拌、ま
たは従来有効とされているあらゆる方法を用いることが
できる。
添加し、またその後のインキュベーションを撹拌しなが
ら行なうことにより、全体的な精製酵素沈殿の回収率及
び工程の効率を向上させることができる。適当な撹拌方
法としては、機械的な撹拌または振とう、通気撹拌、ま
たは従来有効とされているあらゆる方法を用いることが
できる。
【００４１】インキュベーション後、濾過、遠心分離、
ミクロ濾過、回転真空濾過、限外濾過、圧縮濾過、クロ
スメンブランミクロ濾過、遠心分離後限外濾過等の従来
の分離技術を用いて、分解した色素及びその他の不純物
と精製酵素を分離、回収する。本発明の好ましい具体例
では、濾過を使用する。クロスフローメンブランミクロ
濾過は、この目的で使用した場合、すぐれた効果があっ
た。沈殿を水、好ましくは有機化合物を含む水で洗浄す
ることによって、精製酵素をさらに精製することができ
る。
ミクロ濾過、回転真空濾過、限外濾過、圧縮濾過、クロ
スメンブランミクロ濾過、遠心分離後限外濾過等の従来
の分離技術を用いて、分解した色素及びその他の不純物
と精製酵素を分離、回収する。本発明の好ましい具体例
では、濾過を使用する。クロスフローメンブランミクロ
濾過は、この目的で使用した場合、すぐれた効果があっ
た。沈殿を水、好ましくは有機化合物を含む水で洗浄す
ることによって、精製酵素をさらに精製することができ
る。
【００４２】前記のように、有機化合物としてアミノ酸
を用いて酵素を沈殿させた場合、ほとんどが結晶状の精
製酵素製品が得られる。同様に、カルボン酸を添加して
得られた酵素製品も、かなりの結晶を含んでいる。この
ような理由から、結晶収率をあげるために使用されてい
る標準的な技術を利用することができる。例えば、結晶
の核を添加して結晶析出速度を速めることもできる。従
来有効性が知られているある種の表面特性を有する反応
容器を利用してもよい。また、結晶析出容器を撹拌する
と、結晶の成長を促進する利点がある。市販用の製品に
混入するにあたって結晶状の製品は取り扱いが容易であ
るので、沈殿中の結晶の割合を高めるのが有利である。
を用いて酵素を沈殿させた場合、ほとんどが結晶状の精
製酵素製品が得られる。同様に、カルボン酸を添加して
得られた酵素製品も、かなりの結晶を含んでいる。この
ような理由から、結晶収率をあげるために使用されてい
る標準的な技術を利用することができる。例えば、結晶
の核を添加して結晶析出速度を速めることもできる。従
来有効性が知られているある種の表面特性を有する反応
容器を利用してもよい。また、結晶析出容器を撹拌する
と、結晶の成長を促進する利点がある。市販用の製品に
混入するにあたって結晶状の製品は取り扱いが容易であ
るので、沈殿中の結晶の割合を高めるのが有利である。
【００４３】本発明の１具体例としてあげた精製酵素の
固形物または組成物はあらゆる用途に有用で、酵素を固
体状または液体状のいずれの形態でも利用することがで
きる。これらの調製物は、液体、固体、顆粒、粉体また
はスラリー状の最終製品に製造することができる。例え
ば、これらの調製物は洗剤及びしみ取り剤、コンタクト
レンズの酵素洗浄システム、製革用脱毛剤として、また
は食品工業、及び血清検査における不完全抗体の検出用
に使用することができる。
固形物または組成物はあらゆる用途に有用で、酵素を固
体状または液体状のいずれの形態でも利用することがで
きる。これらの調製物は、液体、固体、顆粒、粉体また
はスラリー状の最終製品に製造することができる。例え
ば、これらの調製物は洗剤及びしみ取り剤、コンタクト
レンズの酵素洗浄システム、製革用脱毛剤として、また
は食品工業、及び血清検査における不完全抗体の検出用
に使用することができる。
【００４４】本発明に従って製造したアルカリ性プロテ
アーゼは色素の含有量が低いので、特に洗剤添加物とし
て有用であり、濁りの形成、臭い及び色による汚染が少
ない。さらに、本発明に従って製造した酵素調製物はガ
ラクトシルポリマー及びそれによるアレルギー性が除去
されているので、特にコンタクトレンズの酵素洗浄剤の
調製及びその他の商業的用途、また食品、飼料及び洗剤
の分野に有用である。
アーゼは色素の含有量が低いので、特に洗剤添加物とし
て有用であり、濁りの形成、臭い及び色による汚染が少
ない。さらに、本発明に従って製造した酵素調製物はガ
ラクトシルポリマー及びそれによるアレルギー性が除去
されているので、特にコンタクトレンズの酵素洗浄剤の
調製及びその他の商業的用途、また食品、飼料及び洗剤
の分野に有用である。
【００４５】洗剤に利用する場合、本発明に従って製造
されたアルカリ性プロテアーゼは通常プロピレングリコ
ールを含む液体組成物として使用される。１０％の塩化
カルシウムを含むプロピレングリコールに２５容量％添
加し、循環させることにより、アルカリ性プロテアーゼ
をプロピレングリコールに溶解させる。コンタクトレン
ズの酵素洗浄システムに適用する場合、通常本発明に従
って製造した酵素を乾燥させる。好ましくは、凍結乾燥
する。また、本明細書に比較例として含めた米国特許第
４，６８９，２９７号（グッドら、「ダストを含まない
粒状酵素製剤」、１９８７年８月２５日）に記載されて
いるように本製品を粒状に調製することもできる。さら
に本製品は、酵素を水に溶解させないで、懸濁させ、ス
ラリーとすることもできる。
されたアルカリ性プロテアーゼは通常プロピレングリコ
ールを含む液体組成物として使用される。１０％の塩化
カルシウムを含むプロピレングリコールに２５容量％添
加し、循環させることにより、アルカリ性プロテアーゼ
をプロピレングリコールに溶解させる。コンタクトレン
ズの酵素洗浄システムに適用する場合、通常本発明に従
って製造した酵素を乾燥させる。好ましくは、凍結乾燥
する。また、本明細書に比較例として含めた米国特許第
４，６８９，２９７号（グッドら、「ダストを含まない
粒状酵素製剤」、１９８７年８月２５日）に記載されて
いるように本製品を粒状に調製することもできる。さら
に本製品は、酵素を水に溶解させないで、懸濁させ、ス
ラリーとすることもできる。
【００４６】
【実施例】つぎに実施例及び関連した表を用いて、さら
に本発明を説明する。しかし、本発明はこれら特定の実
施例またはここに示した具体例に限るものではない。 実施例１ リジンの添加濃度を変え、酵素の沈殿に対する影響を試
験した。バチルス・アルカロフィルスを液体培養して、
発酵ブロスを調製した。発酵後、遠心分離及び真空回転
濾過等の従来の手段で微生物細胞、懸濁固形物、その他
の発酵原材料の残渣から酵素を分離し、酵素液を得た。
ついで、得られたアルカリ性プロテアーゼ溶液を限外濾
過して、活性濃度１，０００，０００ＤＵ／ｍｌの濃縮
酵素液を得た。所定の最終濃度となるように、この濃縮
酵素液にリジンを添加した。１０容量％に希釈した酢酸
を用いて、濃縮酵素液のｐＨを５．０に調整した。つい
で、処理した試料をマグネティックスターラーで撹拌し
ながら３０℃でインキュベーションした。
に本発明を説明する。しかし、本発明はこれら特定の実
施例またはここに示した具体例に限るものではない。 実施例１ リジンの添加濃度を変え、酵素の沈殿に対する影響を試
験した。バチルス・アルカロフィルスを液体培養して、
発酵ブロスを調製した。発酵後、遠心分離及び真空回転
濾過等の従来の手段で微生物細胞、懸濁固形物、その他
の発酵原材料の残渣から酵素を分離し、酵素液を得た。
ついで、得られたアルカリ性プロテアーゼ溶液を限外濾
過して、活性濃度１，０００，０００ＤＵ／ｍｌの濃縮
酵素液を得た。所定の最終濃度となるように、この濃縮
酵素液にリジンを添加した。１０容量％に希釈した酢酸
を用いて、濃縮酵素液のｐＨを５．０に調整した。つい
で、処理した試料をマグネティックスターラーで撹拌し
ながら３０℃でインキュベーションした。
【００４７】２４時間インキュベーションした後、１
５，０００ｒｐｍで３０分遠心分離すると、ほとんどが
結晶状の酵素沈殿と上清に分離した。ついで、沈殿をｐ
Ｈ5.０でプロピレングリコールに溶解させ、室温で１２
時間撹拌した。基質としてカゼインを用い、その加水分
解を測定することにより、バチルス・アルカロフィルス
から得た精製アルカリ性プロテアーゼ沈殿の回収率を求
めた。
５，０００ｒｐｍで３０分遠心分離すると、ほとんどが
結晶状の酵素沈殿と上清に分離した。ついで、沈殿をｐ
Ｈ5.０でプロピレングリコールに溶解させ、室温で１２
時間撹拌した。基質としてカゼインを用い、その加水分
解を測定することにより、バチルス・アルカロフィルス
から得た精製アルカリ性プロテアーゼ沈殿の回収率を求
めた。
【００４８】酵素活性はＤｅｌｆｔ単位（ＤＵ）に基づ
いて測定した。温度４０℃、ｐＨ８．５の緩衝液中で、
上清に溶解しているアルカリ性プロテアーゼによってカ
ゼイン溶液を加水分解させた。トリクロロ酢酸を添加し
て未分解のカゼインを沈澱させ、遠心分離して除去し
た。スペクトロフォトメーターを用い、２７５ｎｍでト
リクロロ酢酸可溶性カゼイン加水分解物の吸光度を測定
した。酵素調製物の２％溶液１ｍｌの吸光度の差が試験
条件下で０．４であったとき、プロテアーゼ調製物の活
性は１０００ＤＵである。上清の総アルカリ性プロテア
ーゼ活性（ＤＵ／ｍｌ）を沈殿させる前の対照試料の活
性と比較し、沈殿としての回収率を求めた。
いて測定した。温度４０℃、ｐＨ８．５の緩衝液中で、
上清に溶解しているアルカリ性プロテアーゼによってカ
ゼイン溶液を加水分解させた。トリクロロ酢酸を添加し
て未分解のカゼインを沈澱させ、遠心分離して除去し
た。スペクトロフォトメーターを用い、２７５ｎｍでト
リクロロ酢酸可溶性カゼイン加水分解物の吸光度を測定
した。酵素調製物の２％溶液１ｍｌの吸光度の差が試験
条件下で０．４であったとき、プロテアーゼ調製物の活
性は１０００ＤＵである。上清の総アルカリ性プロテア
ーゼ活性（ＤＵ／ｍｌ）を沈殿させる前の対照試料の活
性と比較し、沈殿としての回収率を求めた。
【００４９】プロテアーゼの沈殿に及ぼすリジン添加濃
度の影響を表１に示す。
度の影響を表１に示す。
【００５０】
【表１】 表１ リジンを用いた場合の精製アルカリ性プロテアーゼ沈殿の回収率 リジン濃度（Ｍ） 精製沈殿中の酵素回収率 ０．１ １．５ ０．２ １．７ ０．３ ６８．０ ０．４ ８５．０ ０．５ ８８．０
【００５１】実施例２ 実施例１で濃縮酵素液にリジンを添加すると、ｐＨの上
昇が起こり、ｐＨ5.０に保つためにｐＨを調整する必要
があった。したがって、リジン−ＨＣｌを用いて酵素の
精製を行い、回収率を遊離のリジンを用いて沈殿させた
試料と比較した。バチルス・アルカロフィルス由来のア
ルカリ性プロテアーゼを用いて、１，０００，０００Ｄ
Ｕ／ｍｌの活性を有する濃縮酵素液を調製した。この溶
液の一部を採り、それぞれリジンまたはリジン−ＨＣｌ
を最終濃度が0.５Ｍとなるように添加した。溶液のｐＨ
を5.０に調整し、撹拌したがら３０℃で２４時間インキ
ュベーションした。遠心分離器を用いて、ほとんどが結
晶状のアルカリ性プロテアーゼ沈殿を分離し、酵素活性
を測定して、回収率を求めた。結果を表２に示す。
昇が起こり、ｐＨ5.０に保つためにｐＨを調整する必要
があった。したがって、リジン−ＨＣｌを用いて酵素の
精製を行い、回収率を遊離のリジンを用いて沈殿させた
試料と比較した。バチルス・アルカロフィルス由来のア
ルカリ性プロテアーゼを用いて、１，０００，０００Ｄ
Ｕ／ｍｌの活性を有する濃縮酵素液を調製した。この溶
液の一部を採り、それぞれリジンまたはリジン−ＨＣｌ
を最終濃度が0.５Ｍとなるように添加した。溶液のｐＨ
を5.０に調整し、撹拌したがら３０℃で２４時間インキ
ュベーションした。遠心分離器を用いて、ほとんどが結
晶状のアルカリ性プロテアーゼ沈殿を分離し、酵素活性
を測定して、回収率を求めた。結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】表２ リジンとリジン−ＨＣｌの沈殿生成効率の比較 有機化合物 沈殿中の酵素回収率 リジン ＞９４ リジン−ＨＣｌ ＞９４ リジンを用いて精製した場合とリジン−ＨＣｌを用いて
精製した場合とで酵素結晶の収率にほとんど差がなかっ
た。したがって、リジン−ＨＣｌを用いると、ｐＨの調
整を行なう必要がない利点がある。
精製した場合とで酵素結晶の収率にほとんど差がなかっ
た。したがって、リジン−ＨＣｌを用いると、ｐＨの調
整を行なう必要がない利点がある。
【００５３】実施例３ 酵素の沈殿に及ぼすｐＨの影響を検討した。バチルス・
アルカロフィルスに由来するアルカリ性プロテアーゼを
用い、１，０００，０００ＤＵ／ｍｌの活性を有する酵
素液を調製した。最終濃度が0.４Ｍとなるように、リジ
ン−ＨＣｌを添加した。この溶液の一部を採り、２０重
量／容量％の水酸化ナトリウム溶液を用いて、ｐＨをそ
れぞれ4.５、5.０、5.５、6.０、7.０、8.０、9.０及び
１0.０に調整した。ｐＨが安定したとき、処理試料を撹
拌しながら３０℃で２４時間インキュベーションした。
遠心分離器を用い、ほとんどが結晶状のアルカリ性プロ
テアーゼ沈殿と上清を分離し、酵素活性を測定して回収
率を求めた。結果を表３に示す。
アルカロフィルスに由来するアルカリ性プロテアーゼを
用い、１，０００，０００ＤＵ／ｍｌの活性を有する酵
素液を調製した。最終濃度が0.４Ｍとなるように、リジ
ン−ＨＣｌを添加した。この溶液の一部を採り、２０重
量／容量％の水酸化ナトリウム溶液を用いて、ｐＨをそ
れぞれ4.５、5.０、5.５、6.０、7.０、8.０、9.０及び
１0.０に調整した。ｐＨが安定したとき、処理試料を撹
拌しながら３０℃で２４時間インキュベーションした。
遠心分離器を用い、ほとんどが結晶状のアルカリ性プロ
テアーゼ沈殿と上清を分離し、酵素活性を測定して回収
率を求めた。結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】 表３ アルカリ性プロテアーゼの沈殿に及ぼすｐＨの影響 インキュベーション中のｐＨ 沈殿中の酵素回収率 ４．５ ８５ ５．０ ８８ ５．５ ９３ ６．０ ８３ ７．０ ７３ ８．０ ６３ ９．０ ６９ １０．０ ５ 表３に示したように、ｐＨが酸性領域にあったとき、バ
チルス・アルカロフィルス由来アルカリ性プロテアーゼ
の沈殿は最も高かった。
チルス・アルカロフィルス由来アルカリ性プロテアーゼ
の沈殿は最も高かった。
【００５５】実施例４ 酵素の沈殿に対するＬ−リジンメチルエステル−２ＨＣ
ｌの影響を検討した。実施例１に記載した条件に従っ
て、１，０００，０００ＤＵ／ｍｌの活性を有するバチ
ルス・アルカロフィルス由来アルカリ性プロテアーゼ酵
素液を調製した。Ｌ−リジン及びＬ−リジンメチルエス
テル−２ＨＣｌを最終濃度が0.５Ｍとなるように、それ
ぞれの試料に添加した。
ｌの影響を検討した。実施例１に記載した条件に従っ
て、１，０００，０００ＤＵ／ｍｌの活性を有するバチ
ルス・アルカロフィルス由来アルカリ性プロテアーゼ酵
素液を調製した。Ｌ−リジン及びＬ−リジンメチルエス
テル−２ＨＣｌを最終濃度が0.５Ｍとなるように、それ
ぞれの試料に添加した。
【００５６】この溶液のｐＨを5.５に調整し、撹拌しな
がら３０℃で２４時間インキュベーションした。１５，
０００ｒｐｍで２０分遠心分離して、プロテアーゼの沈
殿を上清から分離し、酵素活性を測定して回収率を求め
た。結果を表４に示す。
がら３０℃で２４時間インキュベーションした。１５，
０００ｒｐｍで２０分遠心分離して、プロテアーゼの沈
殿を上清から分離し、酵素活性を測定して回収率を求め
た。結果を表４に示す。
【００５７】
【表４】表４ 有機化合物 沈殿中の酵素回収率 Ｌ−リジン ９５ Ｌ−リジンメチルエステル−２ＨＣｌ ７６
【００５８】実施例５ 酵素の沈殿に及ぼすリジン添加濃度の影響を検討した。
バチルス・リケニフォルミスに由来するアルカリ性プロ
テアーゼを用い、５００ＤＡＰＵ／ｍｌの活性を有する
濃縮酵素液を調製した。この濃縮酵素液に、最終濃度が
0.０１Ｍ、0.０５Ｍ、0.１Ｍ、0.２Ｍ及び0.５Ｍとなる
ようにリジンを添加した。各溶液のｐＨを6.０に調整
し、撹拌しながら２５℃で２４時間インキュベーション
した。遠心分離器を用いて、ほとんどが結晶で占められ
たアルカリ性プロテアーゼの沈殿を上清から分離し、酵
素活性を測定して回収率を求めた。結果を表５に示す。
バチルス・リケニフォルミスに由来するアルカリ性プロ
テアーゼを用い、５００ＤＡＰＵ／ｍｌの活性を有する
濃縮酵素液を調製した。この濃縮酵素液に、最終濃度が
0.０１Ｍ、0.０５Ｍ、0.１Ｍ、0.２Ｍ及び0.５Ｍとなる
ようにリジンを添加した。各溶液のｐＨを6.０に調整
し、撹拌しながら２５℃で２４時間インキュベーション
した。遠心分離器を用いて、ほとんどが結晶で占められ
たアルカリ性プロテアーゼの沈殿を上清から分離し、酵
素活性を測定して回収率を求めた。結果を表５に示す。
【００５９】沈殿中のバチルス・リケニフォルミス由来
アルカリ性プロテアーゼの回収率は、カゼインを基質と
して４０℃、ｐＨ8.５（ホウ酸緩衝液）でその加水分解
を測定して求めた。カゼインの加水分解は、沈殿しない
で上清中に残っているアルカリ性プロテアーゼを用いて
行なった。未分解のカゼインをトリクロロ酢酸で沈殿さ
せ、遠心分離して除去した。スペクトロフォトメーター
を用い、２７５ｎｍでトリクロロ酢酸可溶性カゼイン加
水分解物の吸光度を測定した。試験条件下でチロシンの
遊離が４μｍｏｌ／分である活性を１洗浄剤アルカリ性
プロテアーゼ単位（ＤＡＰＵ）とする。上清中の総アル
カリ性プロテアーゼ活性（ＤＡＰＵ／ｍｌ）を沈殿させ
る前の対照試料の活性と比較し、回収率を求めた。
アルカリ性プロテアーゼの回収率は、カゼインを基質と
して４０℃、ｐＨ8.５（ホウ酸緩衝液）でその加水分解
を測定して求めた。カゼインの加水分解は、沈殿しない
で上清中に残っているアルカリ性プロテアーゼを用いて
行なった。未分解のカゼインをトリクロロ酢酸で沈殿さ
せ、遠心分離して除去した。スペクトロフォトメーター
を用い、２７５ｎｍでトリクロロ酢酸可溶性カゼイン加
水分解物の吸光度を測定した。試験条件下でチロシンの
遊離が４μｍｏｌ／分である活性を１洗浄剤アルカリ性
プロテアーゼ単位（ＤＡＰＵ）とする。上清中の総アル
カリ性プロテアーゼ活性（ＤＡＰＵ／ｍｌ）を沈殿させ
る前の対照試料の活性と比較し、回収率を求めた。
【００６０】
【表５】表５ 酵素の沈殿に及ぼすリジン添加濃度の影響 リジン濃度（Ｍ） 沈殿中の酵素回収率 ０．０１ ３ ０．０５ ２９ ０．１０ ４５ ０．２ ６７ ０．５ ８９
【００６１】実施例６ 酵素の沈殿に及ぼすジカルボン酸を含む有機化合物の影
響を検討した。バチルス・リケニフォルミスに由来する
アルカリ性プロテアーゼを用い、８６３ＤＡＰＵ／ｍｌ
の酵素活性を有する酵素液を調製した。この酵素液から
一部を採り、それぞれマロン酸（ＨＯＯＣ−ＣＨ2 −Ｃ
ＯＯＨ）、コハク酸（ＨＯＯＣ（ＣＨ2）2 −ＣＯＯ
Ｈ）及びグルタル酸（ＨＯＯＣ（ＣＨ2 ）3 −ＣＯＯ
Ｈ）を最終濃度が0.５Ｍとなるように添加した。溶液の
ｐＨを6.０に調整し、撹拌しながら３７℃で４時間イン
キュベーションした。酵素の沈殿を上清から分離し、酵
素活性を測定して回収率を求めた。結果を表６に示す。
響を検討した。バチルス・リケニフォルミスに由来する
アルカリ性プロテアーゼを用い、８６３ＤＡＰＵ／ｍｌ
の酵素活性を有する酵素液を調製した。この酵素液から
一部を採り、それぞれマロン酸（ＨＯＯＣ−ＣＨ2 −Ｃ
ＯＯＨ）、コハク酸（ＨＯＯＣ（ＣＨ2）2 −ＣＯＯ
Ｈ）及びグルタル酸（ＨＯＯＣ（ＣＨ2 ）3 −ＣＯＯ
Ｈ）を最終濃度が0.５Ｍとなるように添加した。溶液の
ｐＨを6.０に調整し、撹拌しながら３７℃で４時間イン
キュベーションした。酵素の沈殿を上清から分離し、酵
素活性を測定して回収率を求めた。結果を表６に示す。
【００６２】
【表６】 表６ 酵素の沈殿に及ぼす数種のジカルボン酸の影響 ジカルボン酸 化学構造 沈殿中の酵素回収率 ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ マロン酸 ＨＯＯＣ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ ７３ コハク酸 ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）2−ＣＯＯＨ ７０ グルタル酸 ＨＯＯＣ−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨ ５５
【００６３】実施例７ カルボキシル基の数が異なる有機化合物を添加した場合
の、酵素の沈殿に及ぼす影響を検討した。バチルス・リ
ケニフォルミスに由来するアルカリ性プロテアーゼを用
い、４４０ＤＡＰＵ／ｍｌの酵素活性を有する酵素液を
調製した。この酵素液から一部を採り、１種類のモノカ
ルボン酸（酢酸）、２種類のジカルボン酸（マロン酸及
びコハク酸）及び１種類のトリカルボン酸（クエン酸）
のＮａ塩をそれぞれ最終濃度が0.５Ｍとなるように添加
した。溶液のｐＨを6.０に調整し、撹拌しながら３７℃
で４時間インキュベーションした。酵素の沈殿を上清か
ら分離し、タンパク濃度、プロテアーゼ活性及び回収率
を測定した。結果を表７に示す。
の、酵素の沈殿に及ぼす影響を検討した。バチルス・リ
ケニフォルミスに由来するアルカリ性プロテアーゼを用
い、４４０ＤＡＰＵ／ｍｌの酵素活性を有する酵素液を
調製した。この酵素液から一部を採り、１種類のモノカ
ルボン酸（酢酸）、２種類のジカルボン酸（マロン酸及
びコハク酸）及び１種類のトリカルボン酸（クエン酸）
のＮａ塩をそれぞれ最終濃度が0.５Ｍとなるように添加
した。溶液のｐＨを6.０に調整し、撹拌しながら３７℃
で４時間インキュベーションした。酵素の沈殿を上清か
ら分離し、タンパク濃度、プロテアーゼ活性及び回収率
を測定した。結果を表７に示す。
【００６４】総タンパクの測定には、色素吸着法を用い
た（ブラッドフォード、アナル・バイオキム；７２、２
４８、１９７６）。ピペットを用い、タンパク溶液の一
部（0.１ｍｌ）を試験管に採り、これに５ｍｌのタンパ
ク色素試薬を添加し、マグネティック・スターラーで混
合した。５分後に、0.１ｍｌの水と５ｍｌのタンパク色
素試薬からなる試薬ブランクを基準にして、５９５ｎｍ
における吸光度を測定した。ついで、牛γ−グロブリン
で作製した標準曲線から、タンパク濃度を求めた。
た（ブラッドフォード、アナル・バイオキム；７２、２
４８、１９７６）。ピペットを用い、タンパク溶液の一
部（0.１ｍｌ）を試験管に採り、これに５ｍｌのタンパ
ク色素試薬を添加し、マグネティック・スターラーで混
合した。５分後に、0.１ｍｌの水と５ｍｌのタンパク色
素試薬からなる試薬ブランクを基準にして、５９５ｎｍ
における吸光度を測定した。ついで、牛γ−グロブリン
で作製した標準曲線から、タンパク濃度を求めた。
【００６５】
【表７】 表７ カルボキシル基置換数が増加したときの酵素沈殿に及ぼす影響 カルボン酸 化学構造 タンパク アルカリ性プロテアーゼ （0.５Ｍ） 上清中濃度 沈殿中の 上清中濃度 沈殿中の （ｍｇ／ｍｌ） 回収率 （ＤＡＰＵ／ｍｌ）回収率 対照 − ６3.０ ０ ４４０ ０ 酢酸 ＣＨ3 −ＣＯＯＨ ３9.７ ３７ ２７７ ３７ マロン酸 ＣＨ2 （ＣＯＯＨ）2 １6.０ ７３ １１８ ７３ コハク酸 （ＣＨ2 −ＣＯＯＨ）2 １8.９ ７０ １３２ ７０ クエン酸 ＣＨ（ＣＨ2 ＣＯＯＨ）2 ＣＯＯＨ １0.０ ８４ ６３ ８６ 表７に示したように、酸のカルボキシル基の置換数が増
加するにつれ、酵素の沈殿が増加する。ジカルボン酸及
びトリカルボン酸で、良好な結果が得られた。
加するにつれ、酵素の沈殿が増加する。ジカルボン酸及
びトリカルボン酸で、良好な結果が得られた。
【００６６】実施例８ 二重結合を有するカルボン酸を添加したときの、酵素の
沈殿に及ぼす影響について検討した。バチルス・リケニ
フォルミスに由来するアルカリ性プロテアーゼを用い、
４５３ＤＡＰＵ／ｍｌの酵素活性を有する酵素液を調製
した。この濃縮酵素液から一部を採り、アクリル酸、マ
レイン酸及びフマール酸のＮａ塩をそれぞれ最終濃度が
0.５Ｍとなるように添加した。溶液のｐＨを6.０に調整
し、撹拌しながら３７℃で４時間インキュベーションし
た。酵素の沈殿を上清から分離し、総タンパク、プロテ
アーゼ活性及び回収率を測定した。結果を表８に示す。
沈殿に及ぼす影響について検討した。バチルス・リケニ
フォルミスに由来するアルカリ性プロテアーゼを用い、
４５３ＤＡＰＵ／ｍｌの酵素活性を有する酵素液を調製
した。この濃縮酵素液から一部を採り、アクリル酸、マ
レイン酸及びフマール酸のＮａ塩をそれぞれ最終濃度が
0.５Ｍとなるように添加した。溶液のｐＨを6.０に調整
し、撹拌しながら３７℃で４時間インキュベーションし
た。酵素の沈殿を上清から分離し、総タンパク、プロテ
アーゼ活性及び回収率を測定した。結果を表８に示す。
【００６７】不飽和ジカルボン酸のマレイン酸及びフマ
ール酸で酵素の沈殿が認められた。しかし、不飽和モノ
カルボン酸のアクリル酸では、アルカリ性プロテアーゼ
の溶解度に影響が認められず、沈殿は得られなかった。
ール酸で酵素の沈殿が認められた。しかし、不飽和モノ
カルボン酸のアクリル酸では、アルカリ性プロテアーゼ
の溶解度に影響が認められず、沈殿は得られなかった。
【００６８】
【表８】 表８ 酵素の沈殿に及ぼす不飽和カルボン酸の影響 不飽和有機酸 化学構造 タンパク アルカリ性プロテアーゼ （０．５Ｍ） 上清中濃度 沈殿中の 上清中濃度 沈殿中の （ｍｇ／ｍｌ） 回収率 （ＤＡＰＵ／ｍｌ）回収率 対照 ５８ ０ ４５３ ０ アクリル酸 H2C=CH-COOH ５７ ２ ４５５ ０ マレイン酸 (=CH-COOH)2 ３０．０ ５２ ２２２ ４９ （シス） フマール酸 (=CH-COOH)2 １８．６ ６８ １６３ ６４ （トランス）
【００６９】実施例９ コハク酸による酵素沈殿に及ぼすｐＨの影響を検討し
た。バチルス・リケニフォルミスに由来するアルカリ性
プロテアーゼを用い、７５０ＤＡＰＵ／ｍｌの酵素活性
を有する酵素液を調製した。この濃縮酵素液に最終濃度
が0.２５Ｍとなるようにコハク酸を添加した。この溶液
から１００ｍｌを採り、２０％の水酸化ナトリウム溶液
を用いてｐＨを4.０、5.０、6.０、7.０、8.０及び9.０
に調整し、撹拌しながら３０℃で２０時間インキュベー
ションした。酵素の沈殿を上清から分離し、酵素活性を
測定し、回収率を求めた。結果を表９に示す。
た。バチルス・リケニフォルミスに由来するアルカリ性
プロテアーゼを用い、７５０ＤＡＰＵ／ｍｌの酵素活性
を有する酵素液を調製した。この濃縮酵素液に最終濃度
が0.２５Ｍとなるようにコハク酸を添加した。この溶液
から１００ｍｌを採り、２０％の水酸化ナトリウム溶液
を用いてｐＨを4.０、5.０、6.０、7.０、8.０及び9.０
に調整し、撹拌しながら３０℃で２０時間インキュベー
ションした。酵素の沈殿を上清から分離し、酵素活性を
測定し、回収率を求めた。結果を表９に示す。
【００７０】
【表９】表９ 酵素の沈殿に及ぼすｐＨの影響 沈殿のｐＨ 沈殿中の酵素回収率 ４．０ ０．８ ５．０ ５．７ ６．０ ７１ ７．０ ８１ ８．０ ９２ ９．０ ９４ 表９に示したように、バチルス・リケニフォルミスに由
来するアルカリ性プロテアーゼの沈殿は、ｐＨがアルカ
リ性領域にある場合に最も高かった。
来するアルカリ性プロテアーゼの沈殿は、ｐＨがアルカ
リ性領域にある場合に最も高かった。
【００７１】実施例１０ リジンによる酵素の沈殿に及ぼすインキュベーション時
間の影響を検討した。バチルス・アルカロフィルスに由
来するアルカリ性プロテアーゼを用い、１，０００，０
００ＤＵ／ｍｌの酵素活性を有する酵素液を調製した。
この濃縮酵素液に最終濃度が0.５Ｍとなるようにリジン
を添加した。この溶液のｐＨを5.０に調整し、撹拌しな
がら３０℃でインキュベーションした。酵素の沈殿を上
清から分離し、酵素活性を測定し、回収率を求めた。結
果を表１０に示す。
間の影響を検討した。バチルス・アルカロフィルスに由
来するアルカリ性プロテアーゼを用い、１，０００，０
００ＤＵ／ｍｌの酵素活性を有する酵素液を調製した。
この濃縮酵素液に最終濃度が0.５Ｍとなるようにリジン
を添加した。この溶液のｐＨを5.０に調整し、撹拌しな
がら３０℃でインキュベーションした。酵素の沈殿を上
清から分離し、酵素活性を測定し、回収率を求めた。結
果を表１０に示す。
【００７２】
【表１０】 表１０ インキュベーション時間（時間） 沈殿中の酵素回収率 １０ ７３ １５ ９０ ２４ ８９．５ ３６ ９１ ４８ ９４ 表１０に示したように、酵素のかなりの部分が１０〜２
０時間で沈殿した。
０時間で沈殿した。
【００７３】実施例１１ リジンによる酵素の沈殿に及ぼす温度の影響を検討し
た。バチルス・アルカロフィルスに由来するアルカリ性
プロテアーゼを用い、１，０００，０００ＤＵ／ｍｌの
酵素活性を有する酵素液を調製した。この酵素濃縮液に
最終濃度が0.５Ｍとなるようにリジンを添加した。この
溶液のｐＨを5.０に調整し、温度を変え撹拌しながら６
時間インキュベーションした。酵素の沈殿を上清から分
離し、酵素活性を測定し、回収率を求めた。結果を表１
１に示す。
た。バチルス・アルカロフィルスに由来するアルカリ性
プロテアーゼを用い、１，０００，０００ＤＵ／ｍｌの
酵素活性を有する酵素液を調製した。この酵素濃縮液に
最終濃度が0.５Ｍとなるようにリジンを添加した。この
溶液のｐＨを5.０に調整し、温度を変え撹拌しながら６
時間インキュベーションした。酵素の沈殿を上清から分
離し、酵素活性を測定し、回収率を求めた。結果を表１
１に示す。
【００７４】
【表１１】 表１１ インキュベーション温度（℃） 沈殿中の酵素回収率 ５ １ ２０ ６５ ３０ ７３ ３５ ９４ ４０ ９１ 表１１に示したように、これらの条件下で、２０℃〜４
０℃でかなりの沈殿が生成した。
０℃でかなりの沈殿が生成した。
【００７５】実施例１２ 適当な培地を用い、バチルス・リケニフォルミスを液体
培養し、発酵ブロスからアルカリ性プロテアーゼを調製
する。発酵後、遠心分離によってアルカリ性プロテアー
ゼから微生物細胞及び懸濁固形物を分離する。ついで、
得られたアルカリ性プロテアーゼ溶液を限外濾過で濃縮
する。酵素活性８８０ＤＡＰＵ／ｍｌのアルカリ性プロ
テアーゼ水溶液が得られる。
培養し、発酵ブロスからアルカリ性プロテアーゼを調製
する。発酵後、遠心分離によってアルカリ性プロテアー
ゼから微生物細胞及び懸濁固形物を分離する。ついで、
得られたアルカリ性プロテアーゼ溶液を限外濾過で濃縮
する。酵素活性８８０ＤＡＰＵ／ｍｌのアルカリ性プロ
テアーゼ水溶液が得られる。
【００７６】ｐＨ6.０に調整した酵素液３０ｍｌに、量
を変えてアミノ酸を添加する。この溶液のｐＨは、水酸
化ナトリウムで調整し、6.０に保つ。水で液量を５０ｍ
ｌに調整し、３７℃で４時間インキュベーションする。
２０，０００ｒｐｍ、５℃で２０分遠心分離し酵素の沈
殿を分離する。透明な上清を用いて、タンパク及び酵素
活性を測定する。結果を表１２に要約する。
を変えてアミノ酸を添加する。この溶液のｐＨは、水酸
化ナトリウムで調整し、6.０に保つ。水で液量を５０ｍ
ｌに調整し、３７℃で４時間インキュベーションする。
２０，０００ｒｐｍ、５℃で２０分遠心分離し酵素の沈
殿を分離する。透明な上清を用いて、タンパク及び酵素
活性を測定する。結果を表１２に要約する。
【００７７】
【表１２】 表１２ 酵素の沈殿に及ぼすアミノ酸の影響 アミノ酸 タンパク アルカリ性プロテアーゼ 濃度（Ｍ） 上清中濃度 沈澱中の 上清中濃度 沈澱中の （ｍｇ／ｍｌ）回収率（ＤＡＰＵ／ｍｌ）回収率 対照 ０ ７4.０ ０ ５００ ０ アスパラギン酸 0.５０ ３6.７ ５０ ２５３ ４９ アスパラギン酸 0.７５ ３0.０ ５９ ２０８ ５８ リジン 0.５０ ３0.０ ５９ ２０８ ５８
【００７８】比較例１３ 添加するモノカルボン酸の酵素沈殿に及ぼす影響を検討
した。バチルス・リケニフォルミスに由来するアルカリ
性プロテアーゼを用い、４４０ＤＡＰＵ／ｍｌの酵素活
性を有する酵素液を調製した。この濃縮酵素液に最終濃
度が0.５Ｍとなるように２種類のモノカルボン酸（酢酸
及び蟻酸）を添加した。この溶液のｐＨを6.０に調整
し、撹拌しながら３７℃で４時間インキュベーションし
た。遠心分離して、酵素の沈殿を上清から分離し、酵素
活性及び回収率を測定した。結果を表１３に示す。
した。バチルス・リケニフォルミスに由来するアルカリ
性プロテアーゼを用い、４４０ＤＡＰＵ／ｍｌの酵素活
性を有する酵素液を調製した。この濃縮酵素液に最終濃
度が0.５Ｍとなるように２種類のモノカルボン酸（酢酸
及び蟻酸）を添加した。この溶液のｐＨを6.０に調整
し、撹拌しながら３７℃で４時間インキュベーションし
た。遠心分離して、酵素の沈殿を上清から分離し、酵素
活性及び回収率を測定した。結果を表１３に示す。
【００７９】
【表１３】 表１３ モノカルボン酸 タンパク プロテアーゼ活性 上清中濃度 沈澱中の 上清中濃度 沈澱中の （ｍｇ／ｍｌ）回収率 （ＤＡＰＵ／ｍｌ）回収率 対照 ７０ ０ ４８８ ０ 酢酸 ４5.０ ３６ ３０６ ３７ 蟻酸 ４2.０ ４０ ２９１ ４０ 比較例１３の結果と同じ条件下で実施した実施例７の結
果を比較すると、本発明の有機化合物を沈殿剤として使
用した場合に、はるかに良好な結果が得られることがわ
かる。
果を比較すると、本発明の有機化合物を沈殿剤として使
用した場合に、はるかに良好な結果が得られることがわ
かる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/56 Ｃ１２Ｒ 1:10） (72)発明者 チマンバイ ピー パテル アメリカ合衆国 インディアナ州 46545 ミシャウォーカー オールド ベッドフ ォード トレイル 54304
Claims (25)
- 【請求項１】 以下の工程を含む発酵ブロスから精製酵
素を製造する方法。 （ａ）発酵ブロスに懸濁している細胞及び固形物から酵
素を分離して酵素液を形成する工程。 （ｂ）前記酵素液を濃縮する工程。 （ｃ）前記の濃縮酵素液に有機化合物を添加する工程
（ここで、有機化合物は、少なくとも２個のカルボキシ
ル基を有するカルボン酸、これらカルボン酸の塩または
エステル、アミノ酸、これらアミノ酸の塩またはエステ
ル、またはこれら有機化合物の二つまたはそれ以上の混
合物のいずれかである）。 （ｄ）前記有機化合物を含む前記の濃縮酵素液をインキ
ュベーションする工程。 （ｅ）精製酵素の沈澱を回収する工程。 - 【請求項２】 工程（ｃ）をｐＨ約3.５〜１0.５で行う
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 撹拌を含む条件下で工程（ｃ）及び
（ｄ）を行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 工程（ｃ）で、最終濃度が少なくとも0.
０６Ｍとなるように有機化合物を添加することを特徴と
する請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 工程（ｃ）を約５℃〜約５０℃の温度範
囲で行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 工程（ｅ）にひき続いて、有機化合物を
含む水で精製酵素の沈澱を洗浄する工程（ｆ）を行うこ
とを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 有機化合物が自然界に存在するアミノ酸
またはこれらアミノ酸の塩またはエステルのいずれかで
あることを特徴とする請求項１に記載の方法（ここで、
アミノ酸またはこれらの塩またはエステルは酸性アミノ
酸、塩基性アミノ酸、これらの塩またはエステル、また
はこれら有機化合物の二つまたはそれ以上の混合物のい
ずれかである）。 - 【請求項８】 有機化合物がリジン、アルギニン、ヒス
チジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、これらのＮａ
塩、リジン−ＨＣｌまたはこれら有機化合物の二つまた
はそれ以上の混合物のいずれかであることを特徴とする
請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 有機化合物がアスパラギン酸、リジンま
たはリジン−ＨＣｌのいずれかであることを特徴とする
請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 有機化合物がカルボン酸またはその塩
またはこれらの二つまたはそれ以上の混合物のいずれか
であることを特徴とする請求項１に記載の方法（ここ
で、カルボン酸は２〜３個のカルボキシル基を有し、少
なくとも３個の炭素原子を含み、その塩はＮａ、Ｃａ、
ＫまたはＭｇ塩である）。 - 【請求項１１】 有機化合物がマロン酸、コハク酸、ク
エン酸、マレイン酸フマール酸またはそれらのＮａまた
はＫ塩またはこれら有機化合物の二つまたはそれ以上の
混合物のいずれかであることを特徴とする請求項１０に
記載の方法。 - 【請求項１２】 有機化合物がコハク酸、クエン酸また
はそのＮａ塩のいずれかであることを特徴とする請求項
１０に記載の方法。 - 【請求項１３】 酵素がプロテアーゼ、リパーゼ、アミ
ラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、
アミダーゼ、カタラーゼ、イソメラーゼまたはオキシダ
ーゼのいずれかであることを特徴とする請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１４】 酵素がアルカリ性プロテアーゼまたは
遺伝子工学的に修飾したアルカリ性プロテアーゼである
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】 酵素がバチルス・アルカロフィルスま
たはその遺伝子工学変異株に由来するアルカリ性プロテ
アーゼであり、工程（ｂ）で酵素液の酵素活性が少なく
とも約２５０，０００ＤＵ／ｍｌとなるまで酵素液を濃
縮することを特徴とする請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 酵素がバチルス・リケニフォルミスま
たはその遺伝子工学変異株に由来するアルカリ性プロテ
アーゼであり、工程（ｂ）で酵素液の酵素活性が少なく
とも約２５０ＤＡＰＵ／ｍｌとなるまで酵素液を濃縮す
ることを特徴とする請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１７】 工程（ｃ）で少なくとも１種類の加水
分解酵素を前記の濃縮酵素液に添加することを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項１８】 以下の工程を含む、バチルス・アルカ
ロフィルスまたはバチルス・リケニフォルミスの発酵ブ
ロスから精製アルカリ性プロテアーゼを製造する方法。 （ａ）前記発酵ブロスに懸濁している細胞及び固形物か
らアルカリ性プロテアーゼを分離してアルカリ性プロテ
アーゼ溶液を調製する工程。 （ｂ）前記アルカリ性プロテアーゼ溶液を濃縮する工
程。 （ｃ）前記アルカリ性プロテアーゼ溶液に有機化合物を
添加する工程（ここで、有機化合物は少なくとも２個の
カルボキシル基を有するカルボン酸、これらカルボン酸
の塩またはエステル、アミノ酸、これらアミノ酸の塩ま
たはエステルまたはこれら有機化合物の二つまたはそれ
以上の混合物のいずれかである）。 （ｄ）前記の有機化合物を含む前記の濃縮アルカリ性プ
ロテアーゼ溶液をインキュベーションする工程。 （ｅ）精製アルカリ性プロテアーゼの沈澱を回収する工
程（ここで、前記のアルカリ性プロテアーゼは酵素タン
パクあたり1.００ｍｇ／ｇ未満のガラクトシルポリマー
を含むものとする）。 - 【請求項１９】 前記のアルカリ性プロテアーゼがバチ
ルス・アルカロフィルスの発酵ブロスに由来し、工程
（ｅ）で回収した前記精製アルカリ性プロテアーゼが約
１，０００，０００ＤＵ／ｍｌの活性濃度に濃縮したと
き４７０ｎｍで1.３未満の吸光度を示すことを特徴とす
る請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記の精製アルカリ性プロテアーゼが
バチルス・リケニフォルミスの発酵ブロスに由来し、工
程（ｅ）で回収した前記の精製アルカリ性プロテアーゼ
が４４０ＤＡＰＵ／ｍｌの活性濃度に濃縮したとき４７
０ｎｍで0.５未満の吸光度を示すことを特徴とする請求
項１８に記載の方法。 - 【請求項２１】 洗剤組成物の成分として、請求項１４
または１８に記載の方法で製造した精製アルカリ性プロ
テアーゼの利用。 - 【請求項２２】 コンタクトレンズの酵素洗浄システム
の成分として、請求項１４または１８に記載の方法で製
造した精製アルカリ性プロテアーゼの利用。 - 【請求項２３】 請求項１に記載の方法で製造した精製
酵素を含む固形組成物。 - 【請求項２４】 請求項１に記載の方法で製造した精製
酵素を含む液体組成物。 - 【請求項２５】 請求項１に記載の方法で製造した精製
酵素とプロピレングリコールを含む液体組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/865252 | 1992-04-08 | ||
| US07/865,252 US5405767A (en) | 1992-04-08 | 1992-04-08 | Purified enzyme concentrate and method of preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646845A true JPH0646845A (ja) | 1994-02-22 |
Family
ID=25345051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5081896A Pending JPH0646845A (ja) | 1992-04-08 | 1993-04-08 | 精製酵素濃縮物及びその製造法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5405767A (ja) |
| EP (1) | EP0565168B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0646845A (ja) |
| KR (1) | KR930021781A (ja) |
| AR (1) | AR248165A1 (ja) |
| AT (1) | ATE206158T1 (ja) |
| BR (1) | BR9301489A (ja) |
| CA (1) | CA2093624C (ja) |
| DE (1) | DE69330807T2 (ja) |
| DK (1) | DK0565168T3 (ja) |
| ES (1) | ES2164060T3 (ja) |
| FI (1) | FI109808B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5484041B2 (ja) * | 2007-02-23 | 2014-05-07 | 学校法人関西学院 | 蛋白質結晶化剤および蛋白質結晶化剤を用いた蛋白質結晶化方法 |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10511549A (ja) * | 1994-12-28 | 1998-11-10 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | 酵素の安定化 |
| US6207437B1 (en) * | 1996-03-11 | 2001-03-27 | Genencor International, Inc. | Crystalline protease and method for producing same |
| US6045588A (en) * | 1997-04-29 | 2000-04-04 | Whirlpool Corporation | Non-aqueous washing apparatus and method |
| US7534304B2 (en) * | 1997-04-29 | 2009-05-19 | Whirlpool Corporation | Non-aqueous washing machine and methods |
| FR2821086B1 (fr) * | 2001-02-21 | 2003-12-12 | Sederma Sa | Procede de fabrication de proteines par fermentation de microorganismes de la famille thermus, melange de proteines ainsi obtenu et composition cosmetique les contenant |
| EP1403274A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-03-31 | Meristem Therapeutics | Process for the purification of recombinant proteins from complex media and purified proteins obtained thereby |
| DE10304066B4 (de) * | 2003-01-31 | 2007-01-18 | Henkel Kgaa | Verfahren zur Veredelung konzentrierter Enzymlösungen |
| US7695524B2 (en) * | 2003-10-31 | 2010-04-13 | Whirlpool Corporation | Non-aqueous washing machine and methods |
| US7513004B2 (en) * | 2003-10-31 | 2009-04-07 | Whirlpool Corporation | Method for fluid recovery in a semi-aqueous wash process |
| US20050150059A1 (en) * | 2003-10-31 | 2005-07-14 | Luckman Joel A. | Non-aqueous washing apparatus and method |
| US20050096243A1 (en) * | 2003-10-31 | 2005-05-05 | Luckman Joel A. | Fabric laundering using a select rinse fluid and wash fluids |
| US20050091755A1 (en) * | 2003-10-31 | 2005-05-05 | Conrad Daniel C. | Non-aqueous washing machine & methods |
| US20050222002A1 (en) * | 2003-10-31 | 2005-10-06 | Luckman Joel A | Method for a semi-aqueous wash process |
| US7739891B2 (en) | 2003-10-31 | 2010-06-22 | Whirlpool Corporation | Fabric laundering apparatus adapted for using a select rinse fluid |
| US20050096242A1 (en) * | 2003-10-31 | 2005-05-05 | Luckman Joel A. | Method for laundering fabric with a non-aqueous working fluid using a select rinse fluid |
| DE10360841A1 (de) * | 2003-12-20 | 2005-07-14 | Henkel Kgaa | Helle, stabile, staub- und geruchsarme Enzymgranulate |
| US20050224099A1 (en) * | 2004-04-13 | 2005-10-13 | Luckman Joel A | Method and apparatus for cleaning objects in an automatic cleaning appliance using an oxidizing agent |
| EP1740757A1 (en) | 2004-04-29 | 2007-01-10 | Unilever N.V. | Dry cleaning method |
| US7966684B2 (en) | 2005-05-23 | 2011-06-28 | Whirlpool Corporation | Methods and apparatus to accelerate the drying of aqueous working fluids |
| CN108048426B (zh) * | 2017-12-10 | 2021-02-26 | 济南百斯杰生物工程有限公司 | 一种酶活稳定的酸性果胶酶后处理工艺 |
| CN111321126A (zh) * | 2020-02-26 | 2020-06-23 | 湖南苏仙瑶岭生态休闲农业开发有限公司 | 一种生物酶制作方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3050445A (en) * | 1958-08-13 | 1962-08-21 | Armour Pharma | Stabilized trypsin solution |
| JPS5726587A (en) * | 1980-07-24 | 1982-02-12 | Toyobo Co Ltd | Stabilization of ascorbic acid oxidase |
| JPS58134991A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-08-11 | Takeda Chem Ind Ltd | セラチオペプチタ−ゼの安定化法 |
| US4497897A (en) * | 1982-12-09 | 1985-02-05 | Novo Industri A/S | Liquid proteinase concentrate and method for preparation |
| US4507219A (en) * | 1983-08-12 | 1985-03-26 | The Proctor & Gamble Company | Stable liquid detergent compositions |
| US4747977A (en) * | 1984-11-09 | 1988-05-31 | The Procter & Gamble Company | Ethanol-free liquid laundry detergent compositions |
| DD237522A1 (de) * | 1985-05-21 | 1986-07-16 | Inst Tech Mikrobiologie | Verfahren zur reinigung von enzymkonzentraten |
| JPS6274285A (ja) * | 1985-09-28 | 1987-04-06 | Kikkoman Corp | モノメチルアミン酸化酵素の安定化法 |
| JP2545231B2 (ja) * | 1987-06-18 | 1996-10-16 | 日本ケミカルリサ−チ株式会社 | ウロキナ−ゼの加熱による低分子化抑制法 |
| JPH06506597A (ja) * | 1991-03-29 | 1994-07-28 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | アルカリ性プロテアーゼ３７３３、その産生およびコンタクトレンズの洗浄への使用 |
| US5371198A (en) * | 1991-12-16 | 1994-12-06 | Novo Nordisk A/S | Method for protection of proteolysis-susceptible protein during protein production in a fluid medium |
-
1992
- 1992-04-08 US US07/865,252 patent/US5405767A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-03-30 DK DK93200912T patent/DK0565168T3/da active
- 1993-03-30 EP EP93200912A patent/EP0565168B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-30 DE DE69330807T patent/DE69330807T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-30 AT AT93200912T patent/ATE206158T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-03-30 ES ES93200912T patent/ES2164060T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-06 AR AR93324694A patent/AR248165A1/es active
- 1993-04-07 KR KR1019930005779A patent/KR930021781A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-04-07 FI FI931582A patent/FI109808B/fi not_active IP Right Cessation
- 1993-04-07 CA CA002093624A patent/CA2093624C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-07 BR BR9301489A patent/BR9301489A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-04-08 JP JP5081896A patent/JPH0646845A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5484041B2 (ja) * | 2007-02-23 | 2014-05-07 | 学校法人関西学院 | 蛋白質結晶化剤および蛋白質結晶化剤を用いた蛋白質結晶化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2093624C (en) | 2007-06-19 |
| BR9301489A (pt) | 1993-10-13 |
| ES2164060T3 (es) | 2002-02-16 |
| EP0565168A2 (en) | 1993-10-13 |
| FI109808B (fi) | 2002-10-15 |
| DE69330807D1 (de) | 2001-10-31 |
| KR930021781A (ko) | 1993-11-23 |
| DE69330807T2 (de) | 2002-03-28 |
| DK0565168T3 (da) | 2002-01-14 |
| FI931582A0 (fi) | 1993-04-07 |
| AR248165A1 (es) | 1995-06-30 |
| US5405767A (en) | 1995-04-11 |
| FI931582A (fi) | 1993-10-09 |
| CA2093624A1 (en) | 1993-10-09 |
| EP0565168A3 (ja) | 1994-04-13 |
| ATE206158T1 (de) | 2001-10-15 |
| EP0565168B1 (en) | 2001-09-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0646845A (ja) | 精製酵素濃縮物及びその製造法 | |
| US5281526A (en) | Method of purification of amylase by precipitation with a metal halide and 4-hydroxybenzic acid or a derivative thereof | |
| JP2898158B2 (ja) | 精製されたアルカリプロテアーゼ濃厚物及びその調製法 | |
| US5371198A (en) | Method for protection of proteolysis-susceptible protein during protein production in a fluid medium | |
| JPH07504564A (ja) | 新規プロテアーゼ | |
| CN113862244A (zh) | 一种高比活的碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用 | |
| JPH07115969A (ja) | 加水分解蛋白質の製造方法 | |
| US5192677A (en) | Alkali and heat stable protease from thermomonospora fusca | |
| US3909358A (en) | Insolubilized enzymes | |
| US3386888A (en) | Resolution of racemic amino acids | |
| JP7198261B2 (ja) | 発酵生成物の製造方法 | |
| AU3393800A (en) | Method for rapidly obtaining crystals with desirable morphologies | |
| US6207437B1 (en) | Crystalline protease and method for producing same | |
| US5623059A (en) | Method for protection of proteolysis-susceptible protein during protein production in a fluid medium | |
| KR100245619B1 (ko) | 새로운 프로테아제 | |
| JPS61219393A (ja) | 高分子有機物の酵素による加水分解方法 | |
| JPH0646885A (ja) | 光学活性なアミノ酸誘導体の製造法および新規酵素 | |
| JPH05304949A (ja) | シュードモナス エスピー ｓ１０−０７１株及び該微生物の生産するリパーゼ | |
| JPS61249386A (ja) | 高分子加水分解酵素の精製方法 | |
| JPH01247084A (ja) | 新規耐熱性アルカリ性プロテアーゼ及びその製法 | |
| JPS62253397A (ja) | 光学活性なα−メチルアミノ酸およびα−メチルアミノ酸アミドの取得法 | |
| JPH0527387B2 (ja) | ||
| JP2000166546A (ja) | β−１，３−キシラナーゼの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20050203 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050215 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20050426 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050726 |