JPH0527387B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 （産業上の利用分野） γ−グルタミルドーパ及びγ−グルタミルドー
パ誘導体はドーパ及びドーパ誘導体の徐放剤とし
て使用される有用な医薬品であり、本発明はこの
有用な医薬品の新しい製造法に関するものであ
る。 （従来の技術） γ−グルタミルドーパの製法に関しては該物質
を化学的に合成する方法が知られている（特開昭
53−101330）。しかし、この方法は有機溶媒を使
用し、かつ工程が煩雑であるために該物質の工業
的生産に必ずしも適した方法とはいえない。 γ−グルタミルジペプチドの製法に関してはア
ルカリゲネス属、エルビニア属又はコリネバクテ
リウム属に属する微生物を用いる方法（特公昭56
−5519）、セラチア属、エルビニア属またはコリ
ネバクテリウム属に属する微生物を用いる方法
（特公昭56−5520）及びγ−グルタミルミステイ
ンシンセターゼを用いる方法（特開昭57−99197）
が知られている。しかし、これらの方法はγ−グ
ルタミルドーパ又はγ−グルタミルドーパ誘導体
を製造する方法ではない。また、本発明の方法に
おいて用いられるエシエリヒア属、アエロバクタ
ー属、プロテウス属、アグロバクテリウム属又は
プソイドモナス属に属する微生物によりγ−グル
タミルジペプチドを製造することは知られていな
い。 （発明が解決しようとする問題点） 本発明が解決しようとする問題点は医薬品とし
て有用なγ−グルタミルドーパ又はγ−グルタミ
ルドーパ誘導体を微生物を用いて効率良く工業的
生産に有利な製造方法を開発することにある。 〔発明の構成〕 （問題点を解決するための手段） 本発明者らはグルタミン又はγ−グルタミルペ
プチドとドーパ又はドーパ誘導体からγ−グルタ
ミルドーパ又はγ−グルタミルドーパ誘導体を生
成する能力を有する微生物を探索したところ、エ
シエリシア属、アエロバクター属、プロテウス
属、アグロバクテリウム属又はプソイドモナス属
に属する微生物の中にグルタミン又はγ−グルタ
ミルペプチドとドーパ又はドーパ誘導体からγ−
グルタミルドーパ又はγ−グルタミルドーパ誘導
体を効率よく生成する能力を有する微生物が存在
することを発見した。本発明はこの発見に基づい
てなされたものである。 即ち本発明はグルタミン又はγ−グルタミルペ
プチドとドーパ又はドーパ誘導体からγ−グルタ
ミルドーパ又はγ−グルタミルドーパ誘導体を生
成せしめる能力を有するエシエリヒア属、アエロ
バクター属、プロテウス属、アグロバクテリウム
属又はプソイドモナス属に属する微生物を水性媒
体中でグルタミン又はγ−グルタミルペプチドと
ドーパ又はドーパ誘導体に作用せしめ、γ−グル
タミルドーパ又はγ−グルタミルドーパ誘導体を
生成せしめ、これを採取することを特徴とするγ
−グルタミルドーパ又はγ−グルタミルドーパ誘
導体の製造法に関する。 本発明においてはγ−グルタミルドーパ又はγ
−グルタミルドーパ誘導体を得るための基質とし
てグルタミン又はγ−グルタミルペプチド及びド
ーパ又はドーパ誘導体が使用される。γ−グルタ
ミルペプチドとしてはグルタチオンが使用される
が該物質以外でも本発明で使用する水性媒体に溶
解するようなγ−グルタミルペプチドであればど
のようなものでも使用することができる。本発明
で使用するドーパ誘導体としてはトリハイドロオ
キシフエニルアラニン又はα−メチルドーパが使
用されるが、該物質以外でも本発明で使用する水
性媒体に溶解するドーパ誘導体であればどのよう
なものでも使用することができる。 本発明で使用する微生物は具体的には下記のも
のがある。 エシエリヒアコリ（Esherichia coli）IFO
3301 アエロバクターアエロジエネス
（Aerobacteraerogenes）IFO 3320 プロテウスミラビリス（Proteus mirabilis）
IFO 3849 アグロバクテリウムラジオバクター
（Agrobacterium radiobacter）TACC 4718 プソイドモナスソラネシウム
（Pseudomonassolanasearum）IFO 12510 本発明で使用する微生物は、微生物の培養液を
そのまま使用してもよいし、培養液を遠心集菌し
た菌体を使用しても良い。さらに、菌体の破砕液
をそのまま又は該破砕液の遠心上清画分を使用し
ても良い。この際に、該遠心上清画分を通常の酵
素精製法、例えば硫酸アンモニウム分画、DEAE
−セルロースカラムクロマトグラフイー等による
精製、イオン交換樹脂による精製又はゲル過に
よる精製などを組合せることにより得られる精製
された酵素画分を用いれば、水性媒体中に生成す
るγ−グルタミルドーパ又はγ−グルタミルドー
パ誘導体の単離が容易になる。また、これら菌体
又は菌体処理物の固定化物を使用することもでき
る。微生物の培養のために炭素源として、グルコ
ース、シユクロース、フラクトース、澱粉水解物
又はモラセスなどの炭水化物、窒素源として、硫
安、塩安、尿素、酵母エキス、ペプトン、肉エキ
ス、カゼイン水解物又は大豆蛋白水解物などの無
機態又は有機態窒素化合物、無機イオンとして、
リン酸水素カリ、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウ
ムなど、さらに必要に応じ適宜ビタミン類生育促
進剤などの微量栄養素を加えPHを中性附近に調整
した培地を用いる。培養は微生物を上記培地に接
種して、20℃〜40℃の範囲で１日〜６日間振盪又
は通気撹拌などの好気的条件下で行なわれる。 本発明で使用する水性媒体は通常の酵素反応に
用いられているバツハー類である。アルカリ側で
反応を行う場合にはドーパ又はドーパ誘導体の酸
化を抑制するためにアスコルビン酸などの抗酸化
剤を加えると良い結果が得られる。 （作用） γ−グルタミルドーパ又はγ−グルタミルドー
パ誘導体の生成は基質であるグルタミン0.5％〜
20％又はγ−グルタミルペプチド0.1％〜10％及
びドーパ0.1％〜５％又はドーパ誘導体0.1％〜５
％を含むPH6.0〜PH10.0に調整した水性媒体中に
微生物の培養物、菌体、菌体破砕物、精製酵素又
はこれらの固定化物を添加して20℃〜60℃、好ま
しくは30℃〜40℃で１〜48時間保温することによ
り行なわれる。この際に、基質を途中分割添加す
ることにより好結果が得られる。微生物の培養
物、菌体、菌体破砕物又は精製酵素の添加量は水
性媒体中に加える基質の量又は反応時間などによ
つて異なるが、γ−グルタミルドーパ又はγ−グ
ルタミルドーパ誘導体が経済的に効率良く生成さ
れるに必要な量を添加すれば良い。 生成したγ−グルタミルドーパ又はγ−グルタ
ミルドーパ誘導体の単離は水性媒体中に存在する
不溶物質を除去後、イオン交換樹脂、ゲル過又
は高速液体クロマトグラフイー等の通常の方法を
用いることにより行なわれる。 生成物の同定及び定量はアミノ酸分析計を用い
溶出位置より行なう。また、溶出ピークを分取
し、塩酸加水分解後アミノ酸分析計で構成アミノ
酸を同定することもできる。 実施例 １ 肉エキス1.0％、ペプトン1.0％、食塩0.5％、酵
母エキス0.1％、寒天1.5％を含むブイヨン培地を
120℃、15分オートクレーブ殺菌し減菌試験管に
分注して斜面培地を作り、エシエリヒア・コリ
（IFO 3301）、アエロバクター・アエロジエネス
（IFO 3320）、プロテウク・ミラビリス（IFO
3849）、アグロバクテリウム・ラジオバクター
（ATCC 4718）、プソイドモナス・ソラネシラム
（IFO 12510）を接種し28℃、１夜培養する。次
いで上記ブイヨン培地から寒天を除いて液体ブイ
ヨン培地を５ml、綿栓付試験管に取りオートクレ
ーブ減菌後、斜面培地に生育した菌株を１白金耳
接種し28℃１夜振盪培養する（115rpm往復振
盪）。 一方、グルコース１％、ペプトン１％、リン酸
ニカリ１％、リン酸アンモニウム１％、クエン酸
0.7％、硫酸マグネシウム0.02％、Ｌ−ロイシン
0.005％、アルギニン0.005％、スレオニン0.0025
％、プロリン0.0025％、ヒスチジン0.001％、サ
イアミン0.0001％を含む培地PH8.5を500ml肩付フ
ラスコに100ml分注しオートクレーブ減菌後、液
体ブイヨン培地に生育した菌液を２％接種し28
℃、24時間振盪培養した。培養後8000rpm、30分
遠心集菌し、菌体を５ｍＭトリス塩酸緩衝液PH
7.5（５ｍＭの塩化マグネシウムを含む）で２回洗
浄後同緩衝液に懸濁する。この懸濁液（約１％乾
燥菌体を含む）を氷冷下、超音波破砕装置を用い
処理（20kc／ｓ、10分）し菌体を破砕する。 次いで不溶物を10000rpm、30分遠心除去し上
清を5mMトリス塩酸緩衝液、PH7.5（5mM塩化マ
グネシウムを含む）で１夜透析し無細胞抽出液を
調製した。 この無細胞抽出液１mlをグルタチオン５ｍＭ、
ドーパ10ｍＭ、アスコルビン酸5mMを含むPH8.5
の水性媒体９mlに添加し、37℃で16時間保温し
た。生成したγ−グルタミルドーパの量を第１表
に示した。 第１表菌 体 γ−グルタミルドーパ エシエリヒア・コリ 2.2mM アエロバクター・アエロジエネス 2.1 プロテウス・ミラビリス 3.0 アグロバクテリウム・ラジオバクター 4.8 プソイドモナス・ソラネシラム 3.2 実施例 ２ 実施例１と同条件下ドーパ及びドーパ誘導体か
らγ−グルタミル誘導体の生成をプロテウス・ミ
ラビリス無細胞抽出液を用いて行ない第２表に示
した結果を得た。 第２表γ−グルタミル受容体
γ−グルタミルドーパ誘導体 ドーパ 3.4ｍＭ トリハイドロオキシフエニルアラニン 2.9 α−メチルドーパ 0.8 実施例 ３ 実施例１と同様にして得た、プロテウス・ミラ
ビリス無細胞抽出液10ml、グルタミン7.0ｇ、ド
ーパ10ｇ、アスコルビン酸５ｇを100mlの水に溶
解しカ性ソーダでPHを9.0〜9.5に調整しつつ30
℃、24時間反応させた。 反応終了後反応液塩酸でPH6.0としダウエツク
ス−１（X8）醋酸型、50mlに吸着させ、水洗後酷
酸1N、1.5N、2.0N、2.5Nと順次濃度を上げ溶出
する。γ−グルタミルドーパは2.0N〜2.5Nで溶
出される。 このフラクシヨンを濃縮し醋酸を除き再度同樹
脂に吸着させ1.7Nで醋酸で不純物を溶出させ2N
醋酸でγ−グルタミルドーパを溶出する。このフ
ラクシヨンを濃縮、醋酸を除いた後C₁₈ODSカラ
ムを用いる高速液体クロマトにかけ、メタノー
ル：水：醋酸（20：80：0.4）で溶出するγ−グ
ルタミルドーパフラクシヨンを分取し凍結乾燥す
ることにより、0.84ｇのγ−グルタミルドーパを
得た。得られた標品は6N塩酸、110℃、24時間の
加水分解によりグルタミン酸：ドーパのモル比が
１：0.956を示し純度は95％以上であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グルタミン又はγ−グルタミルペプチドとド
   ーパ又はドーパ誘導体からγ−グルタミルドーパ
   又はγ−グルタミルドーパ誘導体を生成せしめる
   能力を有するエシエリヒア属、アエロバクター
   属、プロテウス属又はプソイドモナス属に属する
   微生物を水性媒体中でグルタミン又はγ−グルタ
   ミルペプチドとドーパ又はドーパ誘導体に作用せ
   しめ、γ−グルタミルドーパ又はγ−グルタミル
   ドーパ誘導体を生成せしめ、これを採取すること
   を特徴とするγ−グルタミルドーパ又はγ−グル
   タミルドーパ誘導体の製造法。 ２ γ−グルタミルペプチドがグルタチオンであ
   る特許請求の範囲第１項記載のγ−グルタミルド
   ーパ又はγ−グルタミルドーパ誘導体の製造法。 ３ ドーパ誘導体がトリハイドロオキシフエニル
   アラニンα−メチルドーパである特許請求の範囲
   第１項記載のγ−グルタミルドーパ又はγ−グル
   タミルドーパ誘導体の製造法。