JPS5943159B2 - アミノ酸エステルの光学分割方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、アミノ酸エステルの光学分割方法に関するも
のであり、更に詳しくは蛋白分解酵素を用いるジペプチ
ドエステル誘導体の生成反応と酸ニヨルその分解反応を
含むアミノ酸エステルの光学分割方法に関するものであ
る。 パパインやキモトリプシンの様な蛋白分解酵素が蛋白分
解（ペプチド結合の切断）の逆反応であるペプチド結合
の生成反応に関与し得ることば古（から知られている。 例えばＢｅｒｇｍａｎ ラはパパインを用いてアニリド
の合成を行なっている。 またＦｒｕｔｏｎはアミノ基をベノゾイル基等で保護し
たロイジノ等のモノアミノカルボッ酸とカルボキシル基
をアミドまたはアニリドとして保護したロイン／やグリ
シノを、パパインやキモトリプシンを用いてペプチド結
合させ得ることを明らかにしている（ Ａｄｖａｎｅｓ
ｉｎ Ｐ ｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ １ｓｔｒｙｔ第
５巻、３３頁（１９４９） 、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓＩｎｃ−ｔＮｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ￥−）。 最近では本発明者のりチ磯和らがアミノ基をベノジルオ
キシ力ルボニル基で保護したアミノ酸とカルボキシル基
をエステル化したアミノ酸とをパパイ／、プロリシノ、
スブチリシノＢＰＮ’等の酵素を用いてペプチド合成反
応を行なったことが報告されている（日本化学会第３５
秋期大会予稿集、４８２頁及び４８６頁（１９７６）１
日本化学会）。 これらの方法では生成物を採取するため、反応生成物が
水溶性基を失って水に不溶となり析出すること（これは
ペプチド合成反応を進行させるためにも必要でちる）を
利用する。 従って生成物になお水溶液を保存する様な基が残る場合
１例えば出発物質としてアスパラギン酸の様にβ位に更
にカルボキシル基がある場合には、この観点からもその
様な基を保護基によって保護するのが好ましいと考えら
れていた。 本発明者らはこの様な系について深（考究した結果、ア
スパラギン酸やグルタミノ酸の様なモノアミノジカルボ
ン酸のアミノ基を保護した（Ｎ末端保護）ものを出発物
質として用いるとジペプチド自体は析出しないが、相手
側の出発物質、即ちカルボキシル基をエステル化したア
ミノ酸（アミノカルボ／酸エステル）として特定のもの
のＤＬ一体を選ぶと生成するジペプチドとアミノカルボ
／酸エステルとの付加化合物が析出すること及びこの付
加化合物を酸で分解することにより、アミノカルボッ酸
エステルの光学活性体カー得られることを見出して本発
明を完成した。 即ち本発明は、一般式 ％式％ 一置換モノアミノカルボッ酸（式中Ｒ１は脂肪族オキシ
カルボニル基、核置換基を有することのあるべ／ジルオ
キシカルボニル基、ベノゾイル基。 芳香族スルフォニル基、又は芳香族スルフィニル基であ
り、ｎは１又は２である）と一般式Ｈ２Ｎ−０Ｈ−Ｃ−
Ｒ，で表わされるアミノカルボ２ ／酸エステル（式中Ｒ２はメチル基、イソプロピル基、
イソブチル基、イソアミル基又はべ／ジル基であり、Ｒ
３は低級アルコキシ基、べ／ジルオ※逆キシ基又はベノ
ズヒドリルオキシ基である）のＤＬ一体とを水性媒体中
、蛋白分解酵素の存在下で反応させ、更に生成したジペ
プチドエステルと一般式 Ｈ２Ｎ−ＣＨ−Ｃ−Ｒ３で表わされるアミノカルボ１ ２ ／酸エステル（式中Ｒ２及びＲ３は前記同様である）と
の、一般式 で表わされる付加化合物（式中Ｒ１，Ｒ２ｔＲｓ及びｎ
は前記同様である）を形成させてこれを分離し１分離さ
れたこの付加化合物に酸を加えて分解して、Ｄ−型又は
ｎ−型に富む一般式 Ｈ２Ｎ−ＣＨ−Ｃ−Ｒ，で表わされるアミノカルボン１ ２ 酸エステル（式中Ｒ２及びＲ３は前記同様である）を回
収することを特徴とするアミノ酸エステルの学分割方法
を提供するものである。 本発明で一方の出発物質として用いるＮ−置換モノアミ
ノジカルボノ酸はｎが１のときアスパラギン酸の、ｎが
２のときグルタミノ酸のＮ−置換。 誘導体である。 Ｒ１はアミノ基の保護基であって１本発明の方法におい
てアミノ基を保護するものである。 従って本発明の方法の反応の間安定であることが必要で
あるが、後にアミノ基から離脱させる必要かあ・る場合
には、生成物の骨格に影響を与えることなしに離脱でき
るものであることも必要である。 また本発明の化合物は水性媒体から析出させて分離する
ので、その析出を妨害する様な基１例えばスルホ７基の
様な水溶性を太き（増大させる基を持つものであっては
ならない。 Ｒ３の具体列としては１例えば第３級ブチルオキシカル
ボニル基（（Ｃ）（３） ３Ｃ（）−ＣＯ−）、第３級
アミルオキシカルボニル基 （（ＣＨ３）２Ｃ（Ｃ２，Ｈ，）−（）−Ｃｏ−） の
様な脂肪族オキシカルボニル 基（φーＣＨ２ー０−ＣＯ−）もしくはｐ−メトキシベ
ノンルオキシカルボニル基 （ｐ−ＣＨ３０−釘（Ｒ２−０−ＣＯ−）、３，５−ジ
メトキシペ／ジルオキシカルボニル基 （３．５−（ＣＨ３０）２−φ刊Ｈ２−ＯＨ℃−）、２
，４。 ６−ドリメトキシベノジルオキシカルボニル基（２，４
ｔ６ （Ｃｌｆ（３０）３−φーＣＨ２ー０−ＣＯ−）
等のその核置換誘導体基，ベノゾイル基ｃａーｃｏ→；
ｐートルエ／スルホニル基（ｐ−ＣＨ３−φ−ｓｏ２→
等）芳香族スルホニル基；又は。 −ニトロスルフィニル基（ｏ−ＮＯ□−φ−ｓｏ−）等
の芳香族スルフィニル基などである。 本発明の方法で用いるＮ一置置換モノアミレジカルボ／
酸Ｌ一体又はＤＬ一体の様に、少なくとも実質的な量の
Ｌ一体を含むものであり，これは相当するモノアミノジ
カルボン酸に慣用の方法でアミノ基の保護基Ｒ１ を導
入することにより容易に得ろことができる。 本発明の他方の出発物質であるアミノカルボン酸エステ
ルのＤＬ一体としては側鎖に疎水性の基を持つアミノ酸
のエステルのＤＬ一体を用いるものであり、Ｒ２がメチ
ル基のときはアラ二ノの。 イソアミル基のときはバリ／の、イソブチル基のときは
ロイン／の、イソアミル基のときはインロイシンの、ベ
ノシル基のときはフェニルアラニ／のエステルである。 またＲ３はアルコール残基であって、メトキシ基（ＣＨ
３０−）、エトキシ基（Ｃ２Ｈ，Ｏ−）、プロポキシ基
（Ｃ３Ｈ７）−ブトキシ基（Ｃ４Ｈ９０−） などの低
級アルコキシ基；ベンジルオキシ基；又はぺ／ズヒドリ
ルオキシ基である。 本発明の方法の前段の反応である付加化合物形成反応で
用いる蛋白分解酵素としては活性中心に金属イオ／を有
する酵素即ち金属プロテアーゼが最も好ましい。 その列としては微生物起源のもの。例えば、放線菌起源
の中性プロテアーゼ、プロリシ／、サーモライシン、コ
ラゲナーゼ、グロタルスアトロックスプロテアーゼ等を
あげることができる。 粗製の酵素例えばサモアーゼなども使用できる。 その際、夾雑オるエステラーゼ等の作用を避けるため、
ポテトイノヒビターなどの阻害剤を併用してもよい。 パパインなどのチオールプロテアーゼ又はトリプシンな
どのセリ／プロテアーゼも使用不能ではないが、エステ
ラーゼ作用を伴なうので、エステルの加水分解が起きな
い様注意して反応を行なう必要がある。 本発明の方法の前段の付加化合物形成反応は水性媒体中
、好ましくは水溶液中、使用する蛋白分解酵素が酵素活
性を示すｐＨ条件のもとで反応させるものである。 本発明のペプチドとアミノカル昶／酸エステルとの付加
化合物形成反応もｐＨ依存性があり、結局、本発明の方
法はｐＨ約４ないし約゛９．最も好ましくはｐＨ約５な
いし約８で行なうのが望ましい。 従って、出発原料であるＮ−置換モノアミノジ力ルボ／
酸及びアミノカルボ／酸エステルは遊離型でも塩でもよ
いが、この両成分を水性媒体中に溶解したとき、このｐ
、Ｅ（条件に調整する必要がある。 ｐＨ調節剤としては塩酸、硫酸、酢酸の様な慣用の無機
酸又は有機酸及び水酸化ナトリウム。 水酸化カリウムの様な水酸化アルカリ、炭酸ナトリウム
、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウ
ムの様なアルカリ炭酸塩、アンモニア、トリメチルアミ
／、トリエチルアミン、エタノールアミ／の様な有機又
は無機のアミン等の慣用の無機又は有機の塩基を用いる
ことができる。 本発明の方法の前段の反応では放出される水素イオ／の
量と水酸イオ／の量は当量関係にあるので、反応による
ｐＨ変動はあまりない。 しかし勿論その変動を抑えるため、適当な緩衝剤を使用
してもよい。 工業的にはｐＨ検出機構と連動するｐＨ調節機構を設け
て制御するのが便利である。 水性媒体としては通常水溶液を使用する。 その際、水に可溶の有機溶剤を併用してもよい。 本発明の方法の前段の反応は温度１０℃ないし９０℃、
酵素活性を維持する観点から好ましくは２０℃ないし５
０℃で行なうものである。 反応は通常約３０分ないし２４時間程度で完結するが。 この反応時間はなんら限定的でない。 本発明の方法の両出発物質の使用濃度には格別の限定は
ないが、本発明の方法が本質的に生成物を析出させるこ
とに依存するものであるので、この濃度は比較的高い方
が望ましい。 しかし生成物の付加化合物は水に対する溶解度が小さい
ので（Ｎ−べ／ジルオキシカルボニルーＬ−７スパルテ
ルーＬ−フェニルアラニ／メチルエステルとＬ−フェニ
ルアラニ／メチルエステルとの付加化合物の場合、２０
℃での溶解度０．３９／１００ ｇ水程）、かなり小さ
い濃度でも実施が可能である。 具体的には約０．００１Ｍないし７Ｍ程度、好ましくは
Ｏ，１Ｍないし４Ｍである。 この両成分の使用比率も限定的でない。 しかし本発明の方法が結局はＮ−置換−Ｌ−モノアミノ
ジカルボ／酸酸分分子Ｌ−及びＤ−アミノカルボッ酸エ
ステル計２分子とを結合させることにあるので、この両
原料は化学量論上１：２のモル比で。 実際上は１００：］ないし１：１００．好ましくは５：
１ないし】：５．最も好ましくは２二１ないＬＩ：３の
モル比で用いるものである。 本発明り両原料は必ずしもその全量が、水性媒体中に溶
解していることを要せず、一部懸濁状態のものがあって
もよい。 反応の進行によって両原料の濃度が減少し、その溶は込
みが起こるからである。 ただしこの場合、ｐＨの変動が起こる恐れが大きいので
反応の進行に応じてｐＨ調節の必要があることが多い。 本発明の方法で使用する酵素の量もまた限定的でない。 使用濃度が高ければ前段の反応が短時間で完了するが、
濃度が低いとそれだけ反応時間が長くなる。 しかし一般的には両出発物質（基質）１ミリモルに対し
て２ないし４００ダ（５Ｘ］０−５ないし］Ｘ］０−２
１モル）程度、好ましくは５ないし１００ダ（ＩＸＩＯ
−悄いし３Ｘ］Ｏ−３ミリモル）程度である。 本発明の方法の前段の反応でペプチド生成反応はＬ一体
についてのみ起こり、Ｄ一体はこの反応に関与しない。 一方、付加化合物形成のためのアミノカルボッ酸エステ
ルはＬ−型であるとＤ−型であると？問わない。 従って原料のアミノカルボ侶沖ノ酸エステルのＤＬ一体
のうちペプチド結合生成によってそのＬ一体が消費され
、ジー（プチドエステルとの付加化合物形成には、より
Ｄ−型に富むアミノカルボッ酸エステルが関与すれこと
となる。 本発明の方法の反応は基質濃度が高いとほとんど定量的
に進行するので、Ｌ−型のＮ−置換モノアミノジ力ルボ
／酸１モル量に対して２モル量のＤＬ−型アミノカルボ
／酸エステルを使用したときは、ＬＬ−型のジペプチド
エステルとほとんどＤンー型のアミノカルボ／酸エステ
ルとの付加化合物を与える。 こうして得られる付加化合物は後述する実施列から明ら
かな様に、一般式 で表わすことができる。 そして式中単位はＬＬ−型であり。 １ Ｒ３−Ｃ−ＣＨ−ＮＨ２一単位はＤ−型又はＤ−型に富
２ むものである。 本発明の方法は、こうして中間生成物として得られる付
加化合物を反応系から分離したのち、酸で分解し、遊離
したＤ−型又はＤ−型に富む一般式 Ｈ２Ｎ−ＣＨ−Ｃ−Ｒ３で表わされるアミノカルボ／２ 酸エステルを回収するものである。 反応系からの付加化合物の分離は沢過等の慣用の手段で
容易に行なうことができる。 付加化合物の分解のために用いる酸としては一般に有機
酸のアミン塩を分解して遊離の有機酸とするために慣用
される酸１例えば塩酸などを用いることができる。 その使用量は通常化学量論量以上であり、慣用量を用い
ることができる。 その他の分解条件も慣用の条件でよい。 分解後のアミノ酸エステルの回収も慣用の方法に従って
よい。 例えば、付加化合物を酸の水溶液で分解して、有機溶媒
で抽出すればジベプテドエステルカ抽出除去されアミノ
酸エステルは、用いた酸の塩の形で水溶液中に残る。 この水溶液は必要に応じてアルカリを添加したのち、晶
析等の慣用の方法でアミノ酸エステルを遊離の形で、又
は塩の形で回収することができる。 こうしてアミノ酸エステルを回収することによってアミ
ノ酸エステルのＤＬ一体から光学活性なアミノ酸エステ
ルを得ることができる。 なお、光学活性アミノ酸エステルを単離する必要がない
場合は、水溶液その他の溶液の状態で回収してもよいこ
とは当然である。 本発明の方法によればアミノ酸エステルの光学分割と同
時に有用なジペプチドエステルを製造することができる
。 以下１本発明を実施列により更に詳細に説明する。 実施例 Ｉ Ｎ−ベア ジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギ／酸
５３４〜（２ミリモル）及びＤＬ−フェニルアラニ／メ
チルエステル塩酸塩８６３ダ（４ミリモル）を内容量約
３０ｒｆＬｌのフラスコにとり、水７ｒｎｌで溶解し、
アンモニア水（７重量係） １１ｐＨ６，２に調整した
。 この溶液にサーモライシ１５０９を加えて、３８ないし
４０℃で１夜間振とうした。 析出した沈殿を沢集し、充分に水を切ってから乾燥し、
１０４５ｒｎ９の結晶を得た（融点１０４ないＬ］０８
℃、Ｎ−ベノジルオキシ力ルボニルーＬ−アスパラギ／
酸を基準とする。 Ｎ−ベノジルオキシ力ルポニルーアスパルチルーフェニ
ルアラニノメチルエステルとフェニルアラニンメチルエ
ステルのに１付加化合物としての収率８６．１％）。 これを酢酸エチル−ｎ−ヘキサ／混合溶媒から再結晶し
て下記物性及び元素分析値を示す物質を得た： 融点 １２７〜１３５℃ 〔α〕２も−６，４（Ｃ＝１ｔメタノール）元素分析 この物質は赤外吸収スペクトル図において３２６０（１
７７１−１にＮ−）Ｉ伸縮に、 ３０００〜３２００ｃ
Ｉｎ’にＣ−Ｈ伸縮に、 １７４０ｃｍ ’Ｉ／Ｃｘ
ステ）Ｉｙノｃ＝０に、１７２０ｃｒＩＬ−１につＶり
／のＣ＝ＯＫ、１６００ｒ１にアミド第１吸収に、１６
３０ｃｍ１にカルボキシノートに、１５４０Ｇ＝１にア
ミド第■吸収に。 】４３０及び１４５０ｃｍ ”ＫＣ−Ｈ変角に、１３９
０

【１にカルボキシｖ−）に、１２２０〜１２９０儀−
１にＣ−０−Ｃ伸縮及びアミド第１Ｉ吸収に。 】０５０σ＝１にフェニル面内変角に、７４０及び６９
５の−１にモノ置換ベノゼ／環面外変角に、それぞれ由
来する吸収を与えた。 また同じ化合物の核磁気共鳴スペクトルの特徴はδ：
２．７５ ｐｐｍ、３．０２ ｐｐｍ、 ３．６１ ｐ
ｐｍ、 ３．７ｐｐｍ、 ４・４〜４・８ｐｐｍ、５
・０５ ｐｐｍ、５・８２ ｐｐｍ。 及び７．３ ｐｐｍにあり、これらはそれぞれ下記の様
に帰属させることができる； 従ってこの物質はＮ−ベノジルオキシ力ルボニルーし一
アスパルチルーし一フェニルアラニ／メチルエステルと
Ｄ−フェニルアラニノメテルエステルとの】：１付加化
合物であった。 この物質８００Ｉｎ９を４０ｒｆＬｔの塩酸（１Ｎ）に
溶解し、メチン／シタロリド３０ｒＩＬＡで３回抽出し
。 メチン／ジクロリド層を水洗し、無水硫酸マグネシウム
で脱水し、更にメチＶノジクロリドを蒸発によって除去
したのち、固形分を酢酸エテル−ｎ−ヘキサノ混合溶液
から再結晶した。 得られた結晶は４５０ｍｆＩで、その物性及び元素分析
の結果は。 融点；１２４〜−】３２℃ 〔α）’Ｉ５ −１５．３ （Ｃ＝１．メタノール）で
あり、このものはＮ−ペノジルオキシ力ルボニルーＬ−
７スバルチルーＬ−フェニルアラニノメチルエステルで
アッタ。 また上記メチツノジクロリドで抽出した抽出残の水層に
炭酸水素ナトリウムを加えてｐ Ｈ８，７とし、メチツ
ノジクロリドで３回抽出した。 抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、塩化水素ガス
を約１０分間吹き込んでからメチツノジクロリドを濃縮
し、エチルチーチルを加えて再結晶した。 Ｄ−フェニルアラニノメチルエステル塩酸塩２９０〜を
得た。 融点；１４９〜１５１℃ 実施列 ２ Ｎ−べ／ジルオキシカルボニルーＤＬ−７スパラギノ酸
１０６９〜（４ミリモル）及びＤＬ−フェニルアラニノ
メチルエステル塩酸塩８６３〜（４ミリモル）を内容量
約３０ｒｎｌのフラスコにとり、水２ｒｎｌを加えて溶
解し、アンモニア水（７重量係でｐＨ６に調整した。 この溶液にサーモライシｙ５０１ｎ＆を加えて３８ない
し４０℃で２時間振とうした。 析出沈殿を沢集し、水２０−で洗浄後乾燥してＮ−べ／
ジルオキシカルボニルーし一アン スパルチルーＬ−フ
ェニルアラニノメチルエステルとＤ−フェニルアラニン
メチルエステルトノ１薯付加化合物７５６〜を得た。 このものを酢酸エチル−ｎ−ヘキサノ混合溶媒から再結
晶したものは融点；１２６ないし１３４０ｃ、（α〕甘
せ−６．５（Ｃ＝１．メタノール）を示した。 一方１反応残液からはＤ−型に富むＮ−ベノジルオキシ
カルボニルーアスパラギノ酸を回収することができた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １（１）一般式 ％式％ るＮ−置換モノアミノジ力ルボノ酸（式中Ｒ１は脂肪族
   オキシカルボニル基、核置換基を有することのあるべ／
   ジルオキシカルボニル基、ぺ／ジイル基、芳香族スルフ
   ォニル基又は芳香族スルフィニル基であり、ｎは１又は
   ２である）と、一般式Ｈ２Ｎ−ｃＨ−ｃ−Ｒ３で表わさ
   れるアミノカル２ ボン酸エステル（式中Ｒ２はメチル基、イソプロピル基
   、イソブチル基、イノアミル基又はベノジル基であり、
   Ｒ３は低級アルコキシ基、べ／ジルオキシ基又はベンズ
   ヒドリルオキ７基である）のＤＬ一体とを水性媒体中蛋
   白分解酵素の存在下で反応させ、更に生成したジペプチ
   ドエステルと一般式 Ｒ３−Ｃ−ＣＨ−ＮＨ２で表わされるアミノカル２ ボン酸エステル（式中Ｒ２，Ｒ３は前記同様である）と
   の、一般式 で表わされる付加化合物（式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びｎ
   は前記同様である）を形成させてこれを分離し分離され
   たこの付加化合物に酸を加えて分解して。 Ｄ−型又はＤ−型に富む一般式 Ｒ３−Ｃ−ＣＨ→■２で表わされるアミノカル２ ボ／酸エステル（式中Ｒ２及びＲ３は前記同様である）
   を回収することを特徴とするアミノ酸エステルの光学分
   割方法。 ２ 付加化合物の一般式中の 単位がＬＬ−型である特許請求の範囲第１項記載の光学
   分割方法。 ・３ Ｒ１がベノジルオキシカルボニル基であり。 Ｒ２がベノジル基であり、Ｒ３がメトキシ基であり、ｎ
   が１である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の光学
   分割方法。 ４ 水性媒体が水溶液である特許請求の範囲第１項ない
   し第３項のいずれかの項記載の光学分割方法。 ５ 蛋白分解酵素が金属プロテアーゼである特許請求の
   範囲第１項ないし第４項のいずれかの項記載の光学分割
   方法。 ６ 反応をｐＨ５ないし８で行なう特許請求の範囲第１
   項ないし第５項のいずれかの項記載の光学分割方法。