JPS6022919B2 - Ｎ―ベンジルオキシカルボニル‐ｌ‐アスパチル‐ｌ‐フエニルアラニンメチルエステルとフエニルアラニンメチルエステルとの付加化合物の製造方法 - Google Patents
Ｎ―ベンジルオキシカルボニル‐ｌ‐アスパチル‐ｌ‐フエニルアラニンメチルエステルとフエニルアラニンメチルエステルとの付加化合物の製造方法Info
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- JPS6022919B2 JPS6022919B2 JP53091835A JP9183578A JPS6022919B2 JP S6022919 B2 JPS6022919 B2 JP S6022919B2 JP 53091835 A JP53091835 A JP 53091835A JP 9183578 A JP9183578 A JP 9183578A JP S6022919 B2 JPS6022919 B2 JP S6022919B2
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- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＮ−ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アス／ぐ
ルチルーＬーフエニルアラニンメチルエステル（以下Ｚ
−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅと略記する）とフヱ
ニルアラニンメチルェステル（以下Ｐｈｅ−ＯＭｅと略
記する）との付加化合物（以下単に付加化合物と云う）
を製造する方法に関するものである。
ルチルーＬーフエニルアラニンメチルエステル（以下Ｚ
−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅと略記する）とフヱ
ニルアラニンメチルェステル（以下Ｐｈｅ−ＯＭｅと略
記する）との付加化合物（以下単に付加化合物と云う）
を製造する方法に関するものである。
更に詳しくはＮーベンジルオキシカルボニルーアスパラ
ギン酸（以下Ｚ−Ａｓｐと略記する）とＰｈｅ−ＯＭｅ
を蛋白分解酵素の存在下に反応させてジベプチドエステ
ルのＺ一Ｌ一Ａｓｐ一Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅを生成させ、
さらにこのジベブチドェステルとＰｈｅ−ＯＭｅとを反
応させて付加化合物を製造する方法に関するものである
。バパィンやキモトリプシンの様な蛋白分解酵素が蛋白
分解（ベプチド結合の切断）の逆反応であるべプチド結
合の生成反応に関与し得ることは古くから知られている
。
ギン酸（以下Ｚ−Ａｓｐと略記する）とＰｈｅ−ＯＭｅ
を蛋白分解酵素の存在下に反応させてジベプチドエステ
ルのＺ一Ｌ一Ａｓｐ一Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅを生成させ、
さらにこのジベブチドェステルとＰｈｅ−ＯＭｅとを反
応させて付加化合物を製造する方法に関するものである
。バパィンやキモトリプシンの様な蛋白分解酵素が蛋白
分解（ベプチド結合の切断）の逆反応であるべプチド結
合の生成反応に関与し得ることは古くから知られている
。
例えば技ｒｇｍａｎらはパパィンを用いてアニリドの合
成を行なっている。またＦｒ虻ｏｎはアミノ基をペンゾ
ィル基等で保護したロィシン等のモノアミノカルボン酸
とカルボキシル基をアミド又はアニリドとして保護した
ロィシンやグリシンを、パパインやキモトリプシンを用
いてべプチド結合させ得ることを明らかにしている（“
ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＰｒｏにｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
，第５巻，３３頁（１９４９），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｉｅｓｓ Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．）。磯和
らはアミノ基をペンジルオキシカルボニル基で保護した
アミノ酸とカルボキシル基をェステル化したアミノ酸と
をパパィン、プロリシン、スブチリシンＢＰＮ′等の酵
素を用いてべプチド合成反応を行なったことを報告して
いる（日本化学会第３５秋期大会予橋集、４８２頁及び
４８６頁（１９７６）、日本化学会）。
成を行なっている。またＦｒ虻ｏｎはアミノ基をペンゾ
ィル基等で保護したロィシン等のモノアミノカルボン酸
とカルボキシル基をアミド又はアニリドとして保護した
ロィシンやグリシンを、パパインやキモトリプシンを用
いてべプチド結合させ得ることを明らかにしている（“
ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＰｒｏにｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
，第５巻，３３頁（１９４９），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｉｅｓｓ Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．）。磯和
らはアミノ基をペンジルオキシカルボニル基で保護した
アミノ酸とカルボキシル基をェステル化したアミノ酸と
をパパィン、プロリシン、スブチリシンＢＰＮ′等の酵
素を用いてべプチド合成反応を行なったことを報告して
いる（日本化学会第３５秋期大会予橋集、４８２頁及び
４８６頁（１９７６）、日本化学会）。
また磯和ら及び本発明者らは、アミノ基を保護したアス
パラギン酸又はグルタミン酸と、カルポキシル基を低級
アルコキシ基等で保護してェステルとした他に官能基を
持たないモノアミノモノカルボン酸とを蛋白分解酵素の
存在下で反応させ、更に反応生成物とこのカルボキシル
基をェステル化した他に官能基を持たないモノアミノモ
ノカルボン酸との付加化合物を形成させ、これを分離採
取する方法を提案した（袴鹿昭５２一７２７９号）。本
発明者らはこの方法のうちＺ−ＡｓｐとＰｈｅ−ＯＭｅ
との反応に関してさらに詳しく研究したところ、反応が
進行して反応媒体中のＬ−Ｐｈｅ一ＯＭｅの濃度が低く
なると触媒である酵素の失活が著しく進むことを発見し
た。
パラギン酸又はグルタミン酸と、カルポキシル基を低級
アルコキシ基等で保護してェステルとした他に官能基を
持たないモノアミノモノカルボン酸とを蛋白分解酵素の
存在下で反応させ、更に反応生成物とこのカルボキシル
基をェステル化した他に官能基を持たないモノアミノモ
ノカルボン酸との付加化合物を形成させ、これを分離採
取する方法を提案した（袴鹿昭５２一７２７９号）。本
発明者らはこの方法のうちＺ−ＡｓｐとＰｈｅ−ＯＭｅ
との反応に関してさらに詳しく研究したところ、反応が
進行して反応媒体中のＬ−Ｐｈｅ一ＯＭｅの濃度が低く
なると触媒である酵素の失活が著しく進むことを発見し
た。
本発明者らはこの現象についてなお深く研究した結果、
反応媒体中のＰｈｅ−ＯＭｅの濃度を少くとも約１０‐
１モル／夕、好ましくは１．５×１０‐１モル／そ以上
に保つことで酵素の活性を保持あるいは失活を抑制し得
ることを発見して本発明を完成した。
反応媒体中のＰｈｅ−ＯＭｅの濃度を少くとも約１０‐
１モル／夕、好ましくは１．５×１０‐１モル／そ以上
に保つことで酵素の活性を保持あるいは失活を抑制し得
ることを発見して本発明を完成した。
即ち本発はＺ−ＡｓｐとＰｈｅ−ＯＭｅを水性媒体中で
金属プロテアーゼの存在下に反応させて、Ｚ−偽ｐとＰ
ｈｅ−ＯＭｅとのジベプチドェステルを生成させ、さら
にこのジベプチドヱステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化
合物を形成させ、その際反応媒体中のＰｈｅ−ＯＭｅの
濃度が少なくとも約１０‐１モル／〆となる様維持し、
ジベプチドェステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物を
分離採取することを特徴とするＺ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐ
ｈｅ−ＯＭｅとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物の製造方
法を提供するものである。
金属プロテアーゼの存在下に反応させて、Ｚ−偽ｐとＰ
ｈｅ−ＯＭｅとのジベプチドェステルを生成させ、さら
にこのジベプチドヱステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化
合物を形成させ、その際反応媒体中のＰｈｅ−ＯＭｅの
濃度が少なくとも約１０‐１モル／〆となる様維持し、
ジベプチドェステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物を
分離採取することを特徴とするＺ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｐ
ｈｅ−ＯＭｅとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物の製造方
法を提供するものである。
第２発明はＺ−ＡｓｐとＰｈｅ−ＯＭｅを水性媒体中で
金属プロテアーゼの存在下に反応させて、Ｚ−船ｐとＰ
ｈｅ−ＯＭｅとのジベプチドェステルを生成させ、さら
にこのジベプチドエステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化
合物を形成させ、その際反応媒体中のＰｈｅ−ＯＭｅの
濃度が少なくとも約１０‐１モル／〆となる様維持しジ
ベプチドェステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物を分
離採取し、液相中にＺ−船ｐおよびＰｈｅ−ＯＭｅを加
え、さらに必要に応じて金属プロテアーゼを追加してＺ
−ＡｓｐとＰｈｅ−ＯＭｅとの反応をくり返すことを特
徴とするジベブチドェステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加
化合物の製造方法を提供するものである。
金属プロテアーゼの存在下に反応させて、Ｚ−船ｐとＰ
ｈｅ−ＯＭｅとのジベプチドェステルを生成させ、さら
にこのジベプチドエステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化
合物を形成させ、その際反応媒体中のＰｈｅ−ＯＭｅの
濃度が少なくとも約１０‐１モル／〆となる様維持しジ
ベプチドェステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物を分
離採取し、液相中にＺ−船ｐおよびＰｈｅ−ＯＭｅを加
え、さらに必要に応じて金属プロテアーゼを追加してＺ
−ＡｓｐとＰｈｅ−ＯＭｅとの反応をくり返すことを特
徴とするジベブチドェステルとＰｈｅ−ＯＭｅとの付加
化合物の製造方法を提供するものである。
本発明の一方の出発物質であるＺ−Ａｓｐはアミ／基を
ペンジルオキシカルボニル基で保護したＬ−又はＤＬ−
アスパラギン酸である。
ペンジルオキシカルボニル基で保護したＬ−又はＤＬ−
アスパラギン酸である。
ＤＬ体を用いるとそのＤ体は反応せず反応媒体中に残る
。本発明の他方の出発物質であるＰｈｅ−ＯＭｅはカル
ボキシル基をメチルェステルとしたＬ−又はＤＬーフェ
ニルアラニンである。ＤＬ体を用いる場合そのＤ体はジ
ベプチドェステル中には入らないが、Ｌ体同様に生成し
たジベプチドェステルと付加化合物を形成することがで
きる。従ってＤＬ体を使用するとべプチドェステル生成
によって溶液中のＬ−Ｐｈｅ−Ｍｅが消費され、ジベプ
チドェステルとの付加反応には、より○一体に富むＰｈ
ｅ−ＯＭｅが関与することになる。この場合後述する様
に、ＬＬージベプチドヱステルとＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅと
の付加化合物と、ＬＬ−ジベプチドェステルとＤ−Ｐｈ
ｅ−ＯＭｅとの付加化合物の間には水に対する溶解度に
差があり、Ｄ一Ｐｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物が優先的
に折出するので、得られる付加化合物はＤ−Ｐｈｅ−Ｏ
Ｍｅとの間のものがほとんど、又は大部分となる。本発
明の両出発物質はそれぞれ遊離の形で用いてもよいし、
水に可溶な塩の形で用いてもよい。
。本発明の他方の出発物質であるＰｈｅ−ＯＭｅはカル
ボキシル基をメチルェステルとしたＬ−又はＤＬーフェ
ニルアラニンである。ＤＬ体を用いる場合そのＤ体はジ
ベプチドェステル中には入らないが、Ｌ体同様に生成し
たジベプチドェステルと付加化合物を形成することがで
きる。従ってＤＬ体を使用するとべプチドェステル生成
によって溶液中のＬ−Ｐｈｅ−Ｍｅが消費され、ジベプ
チドェステルとの付加反応には、より○一体に富むＰｈ
ｅ−ＯＭｅが関与することになる。この場合後述する様
に、ＬＬージベプチドヱステルとＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅと
の付加化合物と、ＬＬ−ジベプチドェステルとＤ−Ｐｈ
ｅ−ＯＭｅとの付加化合物の間には水に対する溶解度に
差があり、Ｄ一Ｐｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物が優先的
に折出するので、得られる付加化合物はＤ−Ｐｈｅ−Ｏ
Ｍｅとの間のものがほとんど、又は大部分となる。本発
明の両出発物質はそれぞれ遊離の形で用いてもよいし、
水に可溶な塩の形で用いてもよい。
従って本明細書では両出発物質についての記載は、実施
例および特記ある場合を徐き、それぞれの水に可溶な塩
を含むものである。本発明の方法の両出発物質の使用濃
度にはＰｈｅ−ＯＭｅの濃度が常に少なくとも約１０‐
１モル／ど、好ましくは１．５×１０‐１モル／〆以上
であること以外格別の限定はないが、本発明の方法が本
質的に生成物を折出させることに依存するものであるの
で、この濃度は比較的高い方が望ましい。
例および特記ある場合を徐き、それぞれの水に可溶な塩
を含むものである。本発明の方法の両出発物質の使用濃
度にはＰｈｅ−ＯＭｅの濃度が常に少なくとも約１０‐
１モル／ど、好ましくは１．５×１０‐１モル／〆以上
であること以外格別の限定はないが、本発明の方法が本
質的に生成物を折出させることに依存するものであるの
で、この濃度は比較的高い方が望ましい。
しかし生成物の付加化合物は水に対する溶解度が４・ご
し、ので（Ｚ−Ｌ一Ａｓｐ−Ｌ一Ｐｈｅ一〇ＭとＬ−Ｐ
ｈｅ−ＯＭｅの付加化合物の場合、２０ｑｏでの溶解度
０．３タノ１００タ水程度、また同じくＤ−Ｐｈｅ−Ｏ
Ｍｅとの付加化合物の場合、２ぴ０で０．２夕／１００
タ水程度）、可成り小さい濃度でも実施が可能である。
具体的にはＺ−Ａｓｐについては約０．００１モル／と
ないし７モルノそ程度、好ましくは０．１モル／Ｚない
し４モル／そである。またＰｈｅ−ＯＭｅについては０
．２モル／夕ないし７モル／〆、好ましくは０．３モル
／そないし４モル／そである。この両成分の使用比率も
限定的でない。
し、ので（Ｚ−Ｌ一Ａｓｐ−Ｌ一Ｐｈｅ一〇ＭとＬ−Ｐ
ｈｅ−ＯＭｅの付加化合物の場合、２０ｑｏでの溶解度
０．３タノ１００タ水程度、また同じくＤ−Ｐｈｅ−Ｏ
Ｍｅとの付加化合物の場合、２ぴ０で０．２夕／１００
タ水程度）、可成り小さい濃度でも実施が可能である。
具体的にはＺ−Ａｓｐについては約０．００１モル／と
ないし７モルノそ程度、好ましくは０．１モル／Ｚない
し４モル／そである。またＰｈｅ−ＯＭｅについては０
．２モル／夕ないし７モル／〆、好ましくは０．３モル
／そないし４モル／そである。この両成分の使用比率も
限定的でない。
しかし、本発明の方法が結局はＺ−Ｌ−心ｐｌ分子とＰ
ｈｅ−ＯＭｅ２分子とを結合させることにあるので、こ
の両原料はＺ−Ｌ‐偽ｐに対するＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ又
はＤＬ一Ｐｈｅ−ＯＭｅ基準で化学量論上１：２のモル
比で、実際上は５：１ないし１：５、最も好ましくは２
：１なし、し１：４のモル比で用いるもものである。本
発明の反応は水性媒体中、使用する金属プロテアーゼが
酵素活性を示すｐＨ条件のもとで反応させるものである
。
ｈｅ−ＯＭｅ２分子とを結合させることにあるので、こ
の両原料はＺ−Ｌ‐偽ｐに対するＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ又
はＤＬ一Ｐｈｅ−ＯＭｅ基準で化学量論上１：２のモル
比で、実際上は５：１ないし１：５、最も好ましくは２
：１なし、し１：４のモル比で用いるもものである。本
発明の反応は水性媒体中、使用する金属プロテアーゼが
酵素活性を示すｐＨ条件のもとで反応させるものである
。
水性媒体としては通常水溶液を使用する。
その際水に可溶の有機溶剤を併用してもよい。本発明の
方法で用いる金属プロテアーゼは活性の中心に金属イオ
ンを有する蛋白分解酵素である。
方法で用いる金属プロテアーゼは活性の中心に金属イオ
ンを有する蛋白分解酵素である。
その例として微生物起源のもの、たとえば放線菌起源の
中性プロテアーゼ、プロリシン、サーモライシン、コラ
ゲナーゼ、クロタルスアストロックスプロテアーゼ等を
挙げることができる。粗製の酵素、たとえばサーモアー
ゼ（商標）なども使用できる。これらのうちサーモライ
シンおよびサーモアーゼ（商標）が最も好ましい。これ
らの酵素の使用は限定的でない。
中性プロテアーゼ、プロリシン、サーモライシン、コラ
ゲナーゼ、クロタルスアストロックスプロテアーゼ等を
挙げることができる。粗製の酵素、たとえばサーモアー
ゼ（商標）なども使用できる。これらのうちサーモライ
シンおよびサーモアーゼ（商標）が最も好ましい。これ
らの酵素の使用は限定的でない。
使用濃度が高ければ反応が短時間で完了するが、濃度が
低いとそれだけ反応時間が長くなる。しかし一般的には
両出発物質（基質）１ミリモルに対して２乃至４００の
ｃ（５×１０‐５乃至１×１０‐２ミリモル）程度、好
ましくは５乃至１００の９（１×１０‐４乃至３×１０
‐２ミリモル）程度である。酵素濃度が高いと反応後酵
素が付加化合物中に包蔵される傾向がある。本発明で使
用する金属プロテアーゼが酵素活性を示すｐＨ範囲は約
ｐＨ約４なし、し９である。
低いとそれだけ反応時間が長くなる。しかし一般的には
両出発物質（基質）１ミリモルに対して２乃至４００の
ｃ（５×１０‐５乃至１×１０‐２ミリモル）程度、好
ましくは５乃至１００の９（１×１０‐４乃至３×１０
‐２ミリモル）程度である。酵素濃度が高いと反応後酵
素が付加化合物中に包蔵される傾向がある。本発明で使
用する金属プロテアーゼが酵素活性を示すｐＨ範囲は約
ｐＨ約４なし、し９である。
一方本発明のジベプチドェステルとＰＭとの付加化合物
形成反応もｐＨ依存性があり、結局本発明の方法はｐＨ
約５なし、し約８、最も好ましくはｐＨ約６ないし約７
で行うのが望ましい。本発明の方法では副反応としてＰ
ｈｅ−ＯＭｅの加水分解反応が起り得る。
形成反応もｐＨ依存性があり、結局本発明の方法はｐＨ
約５なし、し約８、最も好ましくはｐＨ約６ないし約７
で行うのが望ましい。本発明の方法では副反応としてＰ
ｈｅ−ＯＭｅの加水分解反応が起り得る。
この副反応はＰＨの低い方が著しくない。前述した様に
出発原料であるＺ−Ａｓｐ及びＰｈｅ−ＯＭｅは遊離型
でも塩でもよいが、この両成分を水性媒体中に溶解した
とき、このＰＨ条件に調整する必要がある。
出発原料であるＺ−Ａｓｐ及びＰｈｅ−ＯＭｅは遊離型
でも塩でもよいが、この両成分を水性媒体中に溶解した
とき、このＰＨ条件に調整する必要がある。
ｐＨ調節剤としては塩酸、硫酸、酢酸の様な慣用の無機
酸又は有機酸及び水酸化ナトリウム、水酸化カリウムの
様な水酸化アルカリ、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリ
ウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムの様なアルカリ
炭酸塩、アンモニア「トリメチルアミン、トリェチルア
ミン、エタノールアミンの様な有機又は無機のアミン等
の慣用の無機又は有機の塩機を用いることができる。遊
離のＺ−Ａｓｐ又はＰｈｅ−ＯＭｅもこの目的で酸又は
塩基として使用することがでる。また適当な緩衝剤を使
用してもよい。工業的にはｐＨ検出機構と連動するｐＨ
調節機構を設けて制御するのが便利である。本発明の方
法は温度ｌｏｏ０乃至９０００、酵素活性を維持する観
点から好ましくは２０００乃至５０ｏｏで行うものであ
る。
酸又は有機酸及び水酸化ナトリウム、水酸化カリウムの
様な水酸化アルカリ、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリ
ウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムの様なアルカリ
炭酸塩、アンモニア「トリメチルアミン、トリェチルア
ミン、エタノールアミンの様な有機又は無機のアミン等
の慣用の無機又は有機の塩機を用いることができる。遊
離のＺ−Ａｓｐ又はＰｈｅ−ＯＭｅもこの目的で酸又は
塩基として使用することがでる。また適当な緩衝剤を使
用してもよい。工業的にはｐＨ検出機構と連動するｐＨ
調節機構を設けて制御するのが便利である。本発明の方
法は温度ｌｏｏ０乃至９０００、酵素活性を維持する観
点から好ましくは２０００乃至５０ｏｏで行うものであ
る。
本発明の方法の反応時間は、反応温度および触媒である
酵素の使用量によって変るので、一義的に限定すること
はできないが、通常３０分ないし５０時間が望ましい。
酵素の使用量によって変るので、一義的に限定すること
はできないが、通常３０分ないし５０時間が望ましい。
本発明の方法は反応の際にＰｈｅ−ＯＭｅの濃度を少な
くとも約１０‐１モル／〆、好ましくは１．５×１０‐
１モル／そ以上に維持するものである。Ｐｈｅ−ＯＭｅ
の濃度をこの値以上に保つためにはあらかじめ又は反応
の途中で、必要な過剰量のＰｈｅ−ＯＭｅを添加するか
、或は反応の進行中この濃度条件が満足されている間に
固液分離を行なって付加化合物を分離し、液相を冷却す
る等の手段で反応の進行を事実上停止させるか、若しく
は更にＰｈｅ−ＯＭｅを加えることで液相中の金属プロ
テアーゼの失活を抑制することができる。第１図はＰｈ
ｅ−ＯＭｅの残存濃度と金属プロテアーゼの残存活性を
プロツトした図である。
くとも約１０‐１モル／〆、好ましくは１．５×１０‐
１モル／そ以上に維持するものである。Ｐｈｅ−ＯＭｅ
の濃度をこの値以上に保つためにはあらかじめ又は反応
の途中で、必要な過剰量のＰｈｅ−ＯＭｅを添加するか
、或は反応の進行中この濃度条件が満足されている間に
固液分離を行なって付加化合物を分離し、液相を冷却す
る等の手段で反応の進行を事実上停止させるか、若しく
は更にＰｈｅ−ＯＭｅを加えることで液相中の金属プロ
テアーゼの失活を抑制することができる。第１図はＰｈ
ｅ−ＯＭｅの残存濃度と金属プロテアーゼの残存活性を
プロツトした図である。
上記の操作のうちあらかじめ必要過剰量のＰｈｅ−ＯＭ
ｅを加える方法はＰｈｅ−ＯＭｅの加水分解の量が多く
なる恐れがあり慎重に行なう必要があるので、反応の進
行途中で固液分離する後者の操作が特に望ましい。
ｅを加える方法はＰｈｅ−ＯＭｅの加水分解の量が多く
なる恐れがあり慎重に行なう必要があるので、反応の進
行途中で固液分離する後者の操作が特に望ましい。
なお上述の濃度を維持するためのＰｈｅ−ＯＭｅはＬ体
でもＤ体でもよい。
でもＤ体でもよい。
本発明の方法で反応進行途中で分離された反応媒体は、
活性を残した酵素を含有しているので、これから慣用の
酵素精製回収法により金属プロテァーゼを回収すること
ができる。
活性を残した酵素を含有しているので、これから慣用の
酵素精製回収法により金属プロテァーゼを回収すること
ができる。
またこれに原料のＺ−ＡｓｐおよびＰｈｅ−ＯＭｅを追
加することによって、再びジベプチドェステルを生成さ
せ、さらに付加化合物を形成させることができる。また
さらに必要に応じて酵素を追加してＺ−ＡｓｐとＰｈｅ
一ＯＭｅの反応をくり返すことができる。第２発明はこ
の様にして反応をくり返し酵素を反復使用するものであ
る。本発明の方法によれば、反応媒体中の酵素の活性を
損うことなく化合物を製造することができる。
加することによって、再びジベプチドェステルを生成さ
せ、さらに付加化合物を形成させることができる。また
さらに必要に応じて酵素を追加してＺ−ＡｓｐとＰｈｅ
一ＯＭｅの反応をくり返すことができる。第２発明はこ
の様にして反応をくり返し酵素を反復使用するものであ
る。本発明の方法によれば、反応媒体中の酵素の活性を
損うことなく化合物を製造することができる。
従って付加化合物分離後の母液から酵素を回収再使用す
ることができ、酵素コストを低減させることができる。
また第２発明の方法によれば付加化合物分離後の母液を
酵素液として直ちに次の反応に使用することができるの
で、酵素コストを低減させることができるとともに、付
加化合物製造の工程を短縮することができる。
ることができ、酵素コストを低減させることができる。
また第２発明の方法によれば付加化合物分離後の母液を
酵素液として直ちに次の反応に使用することができるの
で、酵素コストを低減させることができるとともに、付
加化合物製造の工程を短縮することができる。
本発明の方法で得られる付加化合物はＺ−ＡＰＭ酸等に
よりＺ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとして分離したのち、
水素化分解等の方法で、低カロリー甘味剤として期待さ
れているＬーアスパルチルーＬーフェニルアラニンメチ
ルェステルにすることができる。
よりＺ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとして分離したのち、
水素化分解等の方法で、低カロリー甘味剤として期待さ
れているＬーアスパルチルーＬーフェニルアラニンメチ
ルェステルにすることができる。
本発明の方法で原料としてＤＬ体のＺ−Ａｓｐを用いる
とＤ体は反応せず水性媒体中に残るので、これよりＤ体
を回収すれば、Ｚ−Ａｓｐの光学分割を同時に行なうこ
とができる。
とＤ体は反応せず水性媒体中に残るので、これよりＤ体
を回収すれば、Ｚ−Ａｓｐの光学分割を同時に行なうこ
とができる。
また同様にＤＬ体のＰｈｅ−ＯＭｅを用いるとジベブチ
ドェステルとＤ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物が優先
的に得られるので、この付加化合物を酸分解してＤ−Ｐ
ｈｅ−ＯＭｅを回収することにより、Ｐｈｅ−ＯＭｅの
光学分割を同時に行うことができる。以下本発明を実施
例について更に詳細に説明する。
ドェステルとＤ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物が優先
的に得られるので、この付加化合物を酸分解してＤ−Ｐ
ｈｅ−ＯＭｅを回収することにより、Ｐｈｅ−ＯＭｅの
光学分割を同時に行うことができる。以下本発明を実施
例について更に詳細に説明する。
実施例 １
Ｚ‐Ｌ−幣ｐ５３，４５夕（０，２モル）、Ｌ−Ｐｈｅ
‐ＯＭｅ塩酸塩（以下Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩと略
記する）１１８．６２夕（０．５５モル）ならびにＩＮ
水酸化ナトリウム水溶液５５０の‘および水１５０泌を
１その反応器に仕込んだ。
‐ＯＭｅ塩酸塩（以下Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩと略
記する）１１８．６２夕（０．５５モル）ならびにＩＮ
水酸化ナトリウム水溶液５５０の‘および水１５０泌を
１その反応器に仕込んだ。
このとき溶液のｐＨは６．７１であった。これにサーモ
アーゼ（商標、大和化成株式会社製）力価１６０万ＰＵ
／夕 ２夕、ポテトィンヒビター１．２夕および酢酸カ
ルシウム・１水塩１．７６夕を加えて、３８なし、し４
０ｏｏで１独特間かきまぜてた。得られたスラリーをグ
ラスフィルターを用いて吸引炉遇し炉液６１０の‘を得
た。炉液中のＰｈｅ一ＯＭｅは０．１７０モル／そで、
残存酵素活性は０．８０であった。ただし残存酵素活性
は反応初期の酵素量に対する炉液中の酵素量の比を以つ
て表示した。
アーゼ（商標、大和化成株式会社製）力価１６０万ＰＵ
／夕 ２夕、ポテトィンヒビター１．２夕および酢酸カ
ルシウム・１水塩１．７６夕を加えて、３８なし、し４
０ｏｏで１独特間かきまぜてた。得られたスラリーをグ
ラスフィルターを用いて吸引炉遇し炉液６１０の‘を得
た。炉液中のＰｈｅ一ＯＭｅは０．１７０モル／そで、
残存酵素活性は０．８０であった。ただし残存酵素活性
は反応初期の酵素量に対する炉液中の酵素量の比を以つ
て表示した。
炉液中の酵素量はカゼイン消化法で酵素活性を測定し換
算して求めた。以下の実施例でもこの表示法によつた。
一方分離採取したケークはＺ−Ｌ−Ａｓｐ一Ｌ−Ｐｈｅ
−ＯＭｅとＬ一Ｐｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物であり、
高速液体クロマトグラフ分析から比率は７８．１％であ
った。
算して求めた。以下の実施例でもこの表示法によつた。
一方分離採取したケークはＺ−Ｌ−Ａｓｐ一Ｌ−Ｐｈｅ
−ＯＭｅとＬ一Ｐｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物であり、
高速液体クロマトグラフ分析から比率は７８．１％であ
った。
このケークがＺ一Ｌ−ＡＳｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとＬ
−Ｐｈｅ一ＯＭｅとの１：１付加化合物からなることを
以下のことから確認した。このケークを水でよく洗った
のち、酢酸エチル−ｎーヘキサン混合溶媒から再結晶し
て得た物の物性及び元素分析結晶は融点：１２０〜１２
４００ 〔Ｑ〕客：十７‐１（Ｃ＝１，メタノール）元素分析値
：Ｃ３２日３７Ｎ３０２とし 実測値隊）ての計算
値■Ｃ ６３．２４ ６３．３２日
６．１３ ６．２０Ｎ
６．９７ ７．００赤外吸収ス
ブクトル及び核磁気共鳴スペクトルは特腰昭５２−７２
７計弐こ添付されたＺ−Ｌ−偽ｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ
とＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとの１：１付加化合物のそれらと
実質的に一致した。
−Ｐｈｅ一ＯＭｅとの１：１付加化合物からなることを
以下のことから確認した。このケークを水でよく洗った
のち、酢酸エチル−ｎーヘキサン混合溶媒から再結晶し
て得た物の物性及び元素分析結晶は融点：１２０〜１２
４００ 〔Ｑ〕客：十７‐１（Ｃ＝１，メタノール）元素分析値
：Ｃ３２日３７Ｎ３０２とし 実測値隊）ての計算
値■Ｃ ６３．２４ ６３．３２日
６．１３ ６．２０Ｎ
６．９７ ７．００赤外吸収ス
ブクトル及び核磁気共鳴スペクトルは特腰昭５２−７２
７計弐こ添付されたＺ−Ｌ−偽ｐ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ
とＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとの１：１付加化合物のそれらと
実質的に一致した。
即ち赤外吸収スペクトルについては３，２６０肌‐１，
３，０００〜３，２００伽‐１，１，７４０弧‐１，１
，７２０肌‐１，１，６６０仇‐１，１，６３０肌‐１
，１，５４０肌‐１，１，４３０伽‐１，１，４５０肌
‐１，１，３９０肌‐１，１，２２０〜１，２９０肌‐
１，１，０５０伽‐１，７４０仇‐１及び６９５肌‐１
に特徴があり、核磁気共鳴スペクトルについては６値で
２．７５ｐ血，３．０２仰臥 ３．６１匹肌 ３．７脚
皿，４．４〜４．８ｐ風，５．０母肌 ５．８２血及び
７．教肌こ特徴があった。実施例 ２ＩＮ水酸化ナトリ
ウム水溶液および水の使用量をそれぞれ５１３Ｍおよび
１９０泌としたほかは実施例１と同機に行なった。
３，０００〜３，２００伽‐１，１，７４０弧‐１，１
，７２０肌‐１，１，６６０仇‐１，１，６３０肌‐１
，１，５４０肌‐１，１，４３０伽‐１，１，４５０肌
‐１，１，３９０肌‐１，１，２２０〜１，２９０肌‐
１，１，０５０伽‐１，７４０仇‐１及び６９５肌‐１
に特徴があり、核磁気共鳴スペクトルについては６値で
２．７５ｐ血，３．０２仰臥 ３．６１匹肌 ３．７脚
皿，４．４〜４．８ｐ風，５．０母肌 ５．８２血及び
７．教肌こ特徴があった。実施例 ２ＩＮ水酸化ナトリ
ウム水溶液および水の使用量をそれぞれ５１３Ｍおよび
１９０泌としたほかは実施例１と同機に行なった。
溶液のｐＨは６．５であった。１母時間反応を行ったの
ち炉過し、炉液５７０の‘を得た。
ち炉過し、炉液５７０の‘を得た。
炉液中のＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅの濃度は０．２２５モルノ
そで、残存酵素活性は０．７４であった。付加化合物の
収率は７２．０％であった。比較例 １ 反応を１曲時間行ったほかは実施例１と全く同様に行っ
た。
そで、残存酵素活性は０．７４であった。付加化合物の
収率は７２．０％であった。比較例 １ 反応を１曲時間行ったほかは実施例１と全く同様に行っ
た。
炉液６００の‘を得た。残存Ｌ一Ｐｈｅ−ＯＭｅの濃度
は０．０８５モル／そで、残存酵素活性は０．３５であ
った。実施例 ３ Ｌ一Ｐｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩに代えてＤＬ−Ｐｈｅ−Ｏ
Ｍｅ・ＨＣＩＩ１８．６２夕（０．５５モル）を用い反
応時間を１曲時間としたほかは、実施例１と全く同機に
行った。
は０．０８５モル／そで、残存酵素活性は０．３５であ
った。実施例 ３ Ｌ一Ｐｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩに代えてＤＬ−Ｐｈｅ−Ｏ
Ｍｅ・ＨＣＩＩ１８．６２夕（０．５５モル）を用い反
応時間を１曲時間としたほかは、実施例１と全く同機に
行った。
炉液５３０の‘を得た。残存Ｐｈｅ−ＯＭｅの濃度は０
．２５６モル／そで、残存酵素活性は０．７５であった
。付加化合物の収率は５７．９％であった。この付加化
合物がＺ−Ｌ−偽ｐ−Ｌ‐Ｐｈｅ‐ＯＭｅとＤ−Ｐｈｅ
−ＯＭｅとの１：１付加化合物であることを以下のこと
から確認した。分離採取したケークを水でよく洗ったの
ち、酢酸エチル−ｎ−へキサン混合溶媒から再結晶して
得た物の物性及び元素分析結果は融点：１２８〜１３か
○ 〔Ｑ〕客：−６‐５（Ｃ＝１，メタノール）元素分析値
Ｃ３２日３７Ｎ３０２と 実測値係）しての計算値協 Ｃ ６３．２４ ６３．４３日
６．１３ ６．１７Ｎ ６．９７
６．９４赤外吸収スプクトル及び核磁
気共鳴スペクトルは実施例１に示したＺ−Ｌ−松ｐ−Ｌ
‐Ｐｈｅ‐ＯＭｅとＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物
と実質的に同一であった。
．２５６モル／そで、残存酵素活性は０．７５であった
。付加化合物の収率は５７．９％であった。この付加化
合物がＺ−Ｌ−偽ｐ−Ｌ‐Ｐｈｅ‐ＯＭｅとＤ−Ｐｈｅ
−ＯＭｅとの１：１付加化合物であることを以下のこと
から確認した。分離採取したケークを水でよく洗ったの
ち、酢酸エチル−ｎ−へキサン混合溶媒から再結晶して
得た物の物性及び元素分析結果は融点：１２８〜１３か
○ 〔Ｑ〕客：−６‐５（Ｃ＝１，メタノール）元素分析値
Ｃ３２日３７Ｎ３０２と 実測値係）しての計算値協 Ｃ ６３．２４ ６３．４３日
６．１３ ６．１７Ｎ ６．９７
６．９４赤外吸収スプクトル及び核磁
気共鳴スペクトルは実施例１に示したＺ−Ｌ−松ｐ−Ｌ
‐Ｐｈｅ‐ＯＭｅとＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅとの付加化合物
と実質的に同一であった。
付加化合物を塩酸水溶液と混和しスラリーとしてから炉
過分離した。ケークは乾燥後比旋光度を測定した。〔Ｑ
〕客：−１４．４（ｃ＝１，ＭｅｏＨ）で、標品Ｎーベ
ンジルオキシカルボニルーＬーアス／ぐルチル−Ｌーフ
エニルアラニンメチルェステルと一致した。一方、炉液
は炭酸水素ナトリウムでアルカリ性にしてジクロロメタ
ンで抽出し、ジクロロメタン層を乾燥後ジクロロメタン
を蒸発させた。
過分離した。ケークは乾燥後比旋光度を測定した。〔Ｑ
〕客：−１４．４（ｃ＝１，ＭｅｏＨ）で、標品Ｎーベ
ンジルオキシカルボニルーＬーアス／ぐルチル−Ｌーフ
エニルアラニンメチルェステルと一致した。一方、炉液
は炭酸水素ナトリウムでアルカリ性にしてジクロロメタ
ンで抽出し、ジクロロメタン層を乾燥後ジクロロメタン
を蒸発させた。
残さにメタノールを加え、塩化水素ガスを吹き込んでか
ら濃縮しエーテルを加えてＰｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩを得
た。このものは〔Ｑ〕奪三一１６．０（ｃ＝１，Ｍｅｏ
Ｈ）でＤ−体であることを示した。実施例 ４ 反応時間を４餌時間としたほかは、実施例３と全く同様
にした。
ら濃縮しエーテルを加えてＰｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩを得
た。このものは〔Ｑ〕奪三一１６．０（ｃ＝１，Ｍｅｏ
Ｈ）でＤ−体であることを示した。実施例 ４ 反応時間を４餌時間としたほかは、実施例３と全く同様
にした。
炉液５１０の‘を得た。残存Ｐｈｅ−ＯＭｅの濃度は０
．１６６モルノそで、残存酵素活性は０．７１であった
。付加化合物の収率は６１．７％であった。実施例 ５ ＤＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩＩ１８．６２夕に代えて
ＤＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ１３２．６夕（０．７４モル）を
用い、サーモアーゼ（商標）、ポテトィンヒビタ−、酢
酸カルシウム・１水塩および水の使用量をそれぞれ４．
０夕，２．４夕，３．５２夕および７００の‘としたほ
かは、実施例３と全く同様にして反応を行なった。
．１６６モルノそで、残存酵素活性は０．７１であった
。付加化合物の収率は６１．７％であった。実施例 ５ ＤＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩＩ１８．６２夕に代えて
ＤＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ１３２．６夕（０．７４モル）を
用い、サーモアーゼ（商標）、ポテトィンヒビタ−、酢
酸カルシウム・１水塩および水の使用量をそれぞれ４．
０夕，２．４夕，３．５２夕および７００の‘としたほ
かは、実施例３と全く同様にして反応を行なった。
反応初期のｐＨは６．６であった。炉液５００泌を得た
。残存Ｐｈｅ−ＯＭｅの量は０．１５２モル／そで残存
酵素活性は０．７４であった。付加化合物の収率は７７
．１％であつた。比較例 ２ ＤＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩ１８．６２夕に代えてＤ
Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ１４０．１９夕（０．６５モル）を
用い、サーモアーゼ（商標）、ポテトィンヒビター、酢
酸カルシウム・１水塩および水の使用量をそれぞれ３．
０９，１．８夕，２．６４夕および７００の‘としたほ
かは、実施例３と全く同様にして反応を行なった。
。残存Ｐｈｅ−ＯＭｅの量は０．１５２モル／そで残存
酵素活性は０．７４であった。付加化合物の収率は７７
．１％であつた。比較例 ２ ＤＬ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩ１８．６２夕に代えてＤ
Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ１４０．１９夕（０．６５モル）を
用い、サーモアーゼ（商標）、ポテトィンヒビター、酢
酸カルシウム・１水塩および水の使用量をそれぞれ３．
０９，１．８夕，２．６４夕および７００の‘としたほ
かは、実施例３と全く同様にして反応を行なった。
反応初期のｐＨは６．８であった。炉液４４０の‘を得
た。残存Ｐｈｅ−ＯＭｅの量は０．０９９モル／そであ
った。残存酵素活性は０．３３であった。実施例 ６ Ｚ一Ｌ一ＡＳｐ６４．１夕（０．２４モル）、ＤＬ一Ｐ
ｈｅ一ＯＭｅ．ＨＣＩ１７４．７夕（０．８１モル）、
サーモアーゼ（商標）２．４夕、酢酸カルシウム・１水
塩２．１夕，１皿水酸化ナトリウム水溶液８１泌および
水６００の‘を１その反応器に仕込んだ。
た。残存Ｐｈｅ−ＯＭｅの量は０．０９９モル／そであ
った。残存酵素活性は０．３３であった。実施例 ６ Ｚ一Ｌ一ＡＳｐ６４．１夕（０．２４モル）、ＤＬ一Ｐ
ｈｅ一ＯＭｅ．ＨＣＩ１７４．７夕（０．８１モル）、
サーモアーゼ（商標）２．４夕、酢酸カルシウム・１水
塩２．１夕，１皿水酸化ナトリウム水溶液８１泌および
水６００の‘を１その反応器に仕込んだ。
ｐＨ６．６５，４０ｏｏで２０時間かきまぜてから遠心
炉過（Ｇ＝１０００）で分離した。炉液を５１５凧【得
た。炉液中の残存Ｐｈｅ−ＯＭｅ濃度は０．１８８モル
ノそで、残存酵素活性は０．７１であった。付加化合物
の収率は８３．８％であった。比較例 ３４餌時間かき
まぜたほかは、実施例６と全く同様に行って、炉液４４
５の‘を得た。
炉過（Ｇ＝１０００）で分離した。炉液を５１５凧【得
た。炉液中の残存Ｐｈｅ−ＯＭｅ濃度は０．１８８モル
ノそで、残存酵素活性は０．７１であった。付加化合物
の収率は８３．８％であった。比較例 ３４餌時間かき
まぜたほかは、実施例６と全く同様に行って、炉液４４
５の‘を得た。
炉液中の残存Ｐｈｅ−ＯＭｅの濃度は０．０９５モルノ
そで、酵素活性は全く残っていなかった。実施例 ７ Ｚ−Ｌ一ＡＳｐ５３．４５夕（０．２モル）、ＤＬ−Ｐ
ｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩ１４０．１９夕（０．６５モル）
ならびにＩＮ水酸化ナトリウム水溶液６５０の【および
水５０私を１その反応器に仕込んだ。
そで、酵素活性は全く残っていなかった。実施例 ７ Ｚ−Ｌ一ＡＳｐ５３．４５夕（０．２モル）、ＤＬ−Ｐ
ｈｅ−ＯＭｅ・ＨＣＩ１４０．１９夕（０．６５モル）
ならびにＩＮ水酸化ナトリウム水溶液６５０の【および
水５０私を１その反応器に仕込んだ。
これにサーモアーゼ（商標）２．０夕および酢酸カルシ
ウム・１水塩１．７６夕を加えて４０℃で２餌時間かき
まぜた。遠心炉過で炉液を分離し、これにはじめの仕込
みと同じ量の原料および０．６５モルの水酸化ナトリウ
ムを含む水溶液を炉液との合計が７００の‘になるよう
に加え、さらにサーモアーゼ（商標）と酢酸カルシウム
を追加して、反応をくり返した。同様な操作を５回くり
返した。結果を第１表に示した。第１表 反応 追加サ−モ＊塚機姿葱奪２空；亡２必ア残存酵素
活性 収率像）＊＊日数 アーゼ（夕）１
− ５５０ ０．１６４
０．７３ ８０．２２ ０．
８ ５２０ ０．２６４ ０．８
４ ８５．９３ ０．８ ５
１０ ０．２９０ ０．８９
９１．６４ ０．７２ ４９０ ０
．２８６ ０．８１ ９４．４５
０．７２ ５３５ ０．３０２
０．８３ ８８．４６ ０．
７２ ５０５ ０．３２４ ０．
７８ ９４．４＊ 酢酸カルシウム・１水塩は
サーモアーゼ（商標）に対して０．８鶴重量比加えた。
ウム・１水塩１．７６夕を加えて４０℃で２餌時間かき
まぜた。遠心炉過で炉液を分離し、これにはじめの仕込
みと同じ量の原料および０．６５モルの水酸化ナトリウ
ムを含む水溶液を炉液との合計が７００の‘になるよう
に加え、さらにサーモアーゼ（商標）と酢酸カルシウム
を追加して、反応をくり返した。同様な操作を５回くり
返した。結果を第１表に示した。第１表 反応 追加サ−モ＊塚機姿葱奪２空；亡２必ア残存酵素
活性 収率像）＊＊日数 アーゼ（夕）１
− ５５０ ０．１６４
０．７３ ８０．２２ ０．
８ ５２０ ０．２６４ ０．８
４ ８５．９３ ０．８ ５
１０ ０．２９０ ０．８９
９１．６４ ０．７２ ４９０ ０
．２８６ ０．８１ ９４．４５
０．７２ ５３５ ０．３０２
０．８３ ８８．４６ ０．
７２ ５０５ ０．３２４ ０．
７８ ９４．４＊ 酢酸カルシウム・１水塩は
サーモアーゼ（商標）に対して０．８鶴重量比加えた。
＊＊新らたに加えたＺ−Ｌ−＄ｐに対する付加化合物の
収率実施例 ８ Ｚ−Ｌ一郎ｐ５．３５夕（２０ミリモル）、Ｌ−Ｐｈｅ
−ＯＭｅ・ＨＣＩＩＩ．８６２（５５ミＩＪモル）を１
００の‘のフラスコに仕込み、水酸化ナトリウム水溶液
を約５０叫（ＮａＯＨ約５５ミリモル）加えてｐＨ６．
７とした。
収率実施例 ８ Ｚ−Ｌ一郎ｐ５．３５夕（２０ミリモル）、Ｌ−Ｐｈｅ
−ＯＭｅ・ＨＣＩＩＩ．８６２（５５ミＩＪモル）を１
００の‘のフラスコに仕込み、水酸化ナトリウム水溶液
を約５０叫（ＮａＯＨ約５５ミリモル）加えてｐＨ６．
７とした。
これにサーモラィシン５０雌および酢酸カルシウム・１
水塩２０の夕を加え、４０ｑｏで１幼時間かきまぜた。
得られたスラリーを吸引炉過し炉液５９叫を得た。炉液
中の残存Ｐｈｅ−ＯＭｅ濃度は０．２１モル／そで、残
存酵素活性は０．７９であった。付加化合物の収率は８
３．７％であった。比較例 ４ サーモライシンおよび酢酸カルシウム・１水塩の使用量
をそれぞれ７０の９および３０の９とし、反応時間を１
母時間としたほかは、実施例１０と同様にして反応およ
び分離を行ない、炉液５４の‘を得た。
水塩２０の夕を加え、４０ｑｏで１幼時間かきまぜた。
得られたスラリーを吸引炉過し炉液５９叫を得た。炉液
中の残存Ｐｈｅ−ＯＭｅ濃度は０．２１モル／そで、残
存酵素活性は０．７９であった。付加化合物の収率は８
３．７％であった。比較例 ４ サーモライシンおよび酢酸カルシウム・１水塩の使用量
をそれぞれ７０の９および３０の９とし、反応時間を１
母時間としたほかは、実施例１０と同様にして反応およ
び分離を行ない、炉液５４の‘を得た。
炉液中の残存Ｐｈｅ−ＯＭｅの濃度は０．０９２モル／
そで、残存酵素活性は０．１１であった。
そで、残存酵素活性は０．１１であった。
第１図はＰｈｅ−ＯＭｅと金属プロテアーゼとの関係を
示した図表である。
示した図表である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−アスパラギン酸と
フエニルアラニンメチルエステルを水性媒体中で金属プ
ロテアーゼの存在下で反応させて、Ｎ−ベンジルオキシ
カルボニル−アスパラギン酸とフエニルアラニンメチル
エステルとのジペプチドエステルを生成させ、さらにこ
のジペプチドエステルとフエニルアラニンメチルエステ
ルとの付加化合物を形成させ、その際反応媒体中のフエ
ニルアラニンメチルエステルの濃度が少なくとも約１０
＾−＾１モル／ｌとなる様維持し、ジプペチドエステル
とフエニルアラニンメチルエステルとの付加化合物を分
離採取することを特徴とするＮ−ベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチル
エステルとフエニルアラニンメチルエステルとの付加化
合物の製造方法、２ 水性媒体が水溶液である特許請求
の範囲第１項記載の製造方法。 ３ 反応をｐＨ６ないし７で行う特許請求の範囲第１項
記載又は第２項記載の製造方法。 ４ Ｌ体又はＤＬ体のＮ−ベンジルオキシカルボニル−
アスパラギン酸およびＬ体のフエニルアラニンメチルエ
ステルを用いてＬＬ体のジペプチドエステルとＬ体のフ
エニルアラニンメチルエステルとの付加化合物を形成さ
せる特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１
項記載の製造方法。 ５ Ｌ体又はＤＬ体のＮ−ベンジルオキシカルボニル−
アスパラギン酸およびＤＬ体のフエニルアラニンメチル
エステルを用いてＬＬ体のジペプチドエステルとＤ体又
はＤ体に富むフエニルアラニンメチルエステルとの付加
化合物を形成させる特許請求の範囲第１項から第３項ま
でのいずれか１項記載の製造方法。 ６ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−アスパラギン酸と
フエニルアラーンメチルエステルを水性媒体中で金属プ
ロチアーゼの存在下で反応させて、Ｎ−ベンジルオキシ
カルボニル−アスパラギン酸とフエニルアラニンメチル
エステルとのジペプチドエステルを生成させ、さらにジ
ペプチドエステルとフエニルアラニンメチルエステルと
の付加化合物を形成させ、その際反応媒体中のフエニル
アラニンメチルエステルの濃度が少なくとも約１０＾−
＾１モル／ｌとなる様維持し、ジペプチドエステルとフ
エニルアラニンメチルエステルとの付加化合物を分離採
取し、液相にＮ−ベンジルオキシカルボニル−アスパラ
ギン酸およびフエニルアラニンメチルエステルを加え、
さらに必要に応じて金属プロテアーゼを追加してＮ−ベ
ンジルオキシカルボニル−アスパラギン酸とフエニルア
ラニンメチルエステルとの反応および付加化合物の分離
採取を繰り返すことを特徴とするＮ−ベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメ
チルエステルとフエニルアラニンメチルエステルとの付
加化合物の製造方法。 ７ 水性媒体が水溶液である特許請求の範囲第６項記載
の製造方法。 ８ 反応をｐＨ６ないし７で行う特許請求の範囲第６項
又は第７項記載の製造方法。 ９ Ｌ体又はＤＬ体のＮ−ベンジルオキシカルボニル−
アスパラギン酸およびＬ体のフエニルアラニンメチルエ
ステルを用いてＬＬ体のジペプチドエステルとＬ体のフ
エニルアラニンメチルエステルとの付加化合物を形成さ
せる特許請求の範囲第６項から第８項までのいずれか１
項記載の製造方法。 １０ Ｌ体又はＤＬ体のＮ−ベンジルオキシカルボニル
−アスパラギン酸およびＤＬ体のフエニルアラニンメチ
ルエステルを用いてＬＬ体のジペプチドエステルとＤ体
又はＤ体に富むフエニルアラニンメチルエステルとの付
加化合物を形成させる特許請求の範囲第６項から第８項
までのいずれか１項記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53091835A JPS6022919B2 (ja) | 1978-07-27 | 1978-07-27 | Ｎ―ベンジルオキシカルボニル‐ｌ‐アスパチル‐ｌ‐フエニルアラニンメチルエステルとフエニルアラニンメチルエステルとの付加化合物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53091835A JPS6022919B2 (ja) | 1978-07-27 | 1978-07-27 | Ｎ―ベンジルオキシカルボニル‐ｌ‐アスパチル‐ｌ‐フエニルアラニンメチルエステルとフエニルアラニンメチルエステルとの付加化合物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5519052A JPS5519052A (en) | 1980-02-09 |
| JPS6022919B2 true JPS6022919B2 (ja) | 1985-06-04 |
Family
ID=14037642
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53091835A Expired JPS6022919B2 (ja) | 1978-07-27 | 1978-07-27 | Ｎ―ベンジルオキシカルボニル‐ｌ‐アスパチル‐ｌ‐フエニルアラニンメチルエステルとフエニルアラニンメチルエステルとの付加化合物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6022919B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3203292A1 (de) * | 1981-02-02 | 1982-09-16 | G.D. Searle & Co., 60076 Skokie, Ill. | Verfahren zur herstellung von aminogeschuetzten l-aspartyl-l-phenylalanin-alkylestern |
-
1978
- 1978-07-27 JP JP53091835A patent/JPS6022919B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5519052A (en) | 1980-02-09 |
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