KR20020015742A

KR20020015742A - 단백질 가수분해효소를 이용한 아스파탐 전구체의 제조방법

Info

Publication number: KR20020015742A
Application number: KR1020000048804A
Authority: KR
Inventors: 신철수; 안정은
Original assignee: 신철수
Priority date: 2000-08-23
Filing date: 2000-08-23
Publication date: 2002-03-02

Abstract

본 발명은 L-아스파르트산(L-Asp)의 유도체와 L-페닐알라닌메틸에스테르(L-PheOMe)에 보조제를 첨가하여 융점이 낮아진 공융혼합물을 수득하는 공정; 및, 전기 수득된 공융혼합물에 단백질 가수분해효소를 처리하여 반응시키는 공정을 포함하는 아스파탐 전구체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 공융혼합물을 수득하는 공정에서 보조제를 첨가하여 융점을 낮추게 되면, 고농도 기질의 균일한 액체상태에서 최적온도의 효소반응이 가능해지므로, 아스파탐 전구체의 생산수율을 증진시킬 수 있다. 아울러, 본 발명에서 제조된 아스파탐 전구체는 효소적 합성법에 의해서 제조되므로 화학적 합성법에 의한 펩타이드 제조시 야기되는 비특이성, 유해성, 고에너지 소비 등의 단점을 극복할 수 있으므로, 본 발명은 환경친화형 청정기술로서 다양한 형태의 식품첨가용 및 생리활성 펩타이드의 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

단백질 가수분해효소를 이용한 아스파탐 전구체의 제조방법{Process for Preparing Aspartame Precursors Using Proteases}

본 발명은 아스파탐 전구체의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 L-아스파르트산의 유도체와 L-페닐알라닌메틸에스테르를 혼합하여 낮은 온도에서 융해되는 공융혼합물을 수득하고, 전기 공융혼합물을 기질로 하여 단백질 가수분해효소를 이용하여 다이펩타이드인 아스파탐 유도체(aspartame precursor)를 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

아스파탐(aspartame)은 다이펩타이드 물질로서 감미료로 많이 사용되고 있으며, 식품에 첨가되어 설탕보다 2000배 이상의 단맛을 내는데, 지금까지는 주로 화학적 합성법인 펩타이드 합성법에 의하여 제조되어 왔다(참조: Bodanskky, M.,Peptide Chemistry, Springer-Verlag, 179-188, 1988).

일반적으로, 펩타이드는 고체 지지체상(insoluble polymeric support)을 이용하여 펩타이드 사슬을 연결하는 화학적인 방법에 의하여 합성하여 왔다. 그러나, 전기의 방법은 공정을 단순화한다는 장점이 있으나, 펩타이드 제조시 라세미화 물질(racemic compound)의 분리능(resolution), 아미노산 곁사슬(side chain)에 대한 보호의 필요성, 펩타이드 제조시 사용되는 다량의 결합체(coupling agent) 및 유기용매의 유해성이 문제되었다(참조: Vulfson, E.N., Tren. Food Sci. Technol., 4:209-215, 1993).

이에 따라, 화학적인 방법에 의한 펩타이드 합성시 발생하는 상술한 단점을 극복하기 위하여, 반응의 특이성을 가지는 합성법으로 효소적인 합성방법이 그 대안으로 제시되어, 현재까지 단백질 가수분해의 역반응을 이용한 펩타이드 합성법이 개발되었다. 이러한 효소에 의한 방법은 화학적 합성법과는 달리 단단계의 반응(one step)이므로, 반응 조건이 매우 온화하고, 효소의 특이성으로 인하여 반응산물의 분리가 별도로 필요치 않으므로, 생리활성 물질의 합성법에서 적합한 장점을 갖는다. 그러나, 효소반응에 있어서, 생성물과 효소 또는 고정화 효소를 분리 정제할 목적뿐만 아니라, 미생물의 오염을 감소시키고, 효소의 열안정성을 증가시키는 측면에서 유기용매를 사용하게 되는데, 반응액에 존재하는 유기용매는 기질의 용해성을 낮추거나 효소의 입체형태(conformational change)를 변화시켜 효소가 불활성화될 수 있으므로, 유기용매의 선택성이 가장 큰 문제점으로 지적되었다.

이에 따라, 효소를 변성시키지 않으면서, 기질의 용해도를 증가시키려는 노력이 계속되어 왔고, 그 결과, 두 개 이상의 물질로 구성되어 있으며, 개개 구성 물질의 융점에 비하여 낮은 융점을 가져서 낮은 온도에서 그 상태가 균일한 액체로 존재하는 혼합물인 공융혼합물(eutectic mixture, 참조: Moor, W., Basic Physical Chemistry, Prentice-Hall, 173-197, 1083)을 이용한 무용매계(solvent-free system, 참조: Kuhl, P. et al., Biotechnol. Bioeng., 45:276-278, 1995)의 합성법이 제시되었다. 이러한 무용매계의 합성법은 기존의 유기용매상에서 수행되던 합성법에 비하여 약 30배 정도의 높은 수율과 90% 이상의 전환수율을 나타내므로, 펩타이드 합성에 경제적인 장점을 갖는다.

한편, 공융혼합물이 생성되는 원인이 혼합시에 구성 물질들 사이에 물리적인 힘이 작용하여 자유에너지(free energy)와 상평형에 변화에 기인하기 때문에, 반응에 첨가되는 용매의 존재없이도 극히 미량의 물이나 용매의 첨가로 기질과 효소의 직접적인 접촉으로 인한 반응을 유도하게 되고, 기질이 완전히 용해되어 있는 형태로 존재하지 않더라도 충분히 반응이 일어날 수 있으며, 공융혼합물은 비교적 낮은 온도에서 액상으로 유지된다. 따라서, 이러한 공융혼합물을 이용하여 아스파탐을 합성한다면, 효소의 수율을 극대화시킬 수 있으며, 환경에도 무해한 장점을 가질 것이다.

따라서, 기질들의 공융혼합물을 형성시켜서 효소반응이 가능한 적정온도에서 액상의 고농도 기질을 유지하게 하고, 이러한 공융혼합물을 이용하여 효소적 합성법으로 펩타이드를 제조하는 효율적인 펩타이드 합성방법을 개발하기 위한 노력이 끊임없이 계속되었다.

이에, 본 발명자들은 기질의 공융혼합물을 이용한 효소적 합성법에 의하여 식품첨가용 펩타이드인 아스파탐 전구체를 효과적으로 제조하기 위한 방법을 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, L-아스파르트산(L-aspartic acid)의 유도체와 L-페닐알라닌메틸에스테르(L-phenylalanine methylester)를 혼합하고, 여기에 보조제(adjuvant)를 첨가함으로써 융점이 낮아진 공융혼합물이 수득되며, 전기 수득된 공융혼합물에 단백질 가수분해효소를 처리함으로써, 아스파탐 전구체를 효율적으로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 아스파탐 전구체의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 보조제의 종류 및 L-PheOMe의 몰분율에 따른 본 발명의 공융혼합물의 융점을 나타내는 그래프이다.

본 발명의 아스파탐 전구체 제조방법은 L-아스파르트산의 유도체와 L-페닐알라닌메틸에스테르를 혼합하고 0 내지 90℃에서 반응시킨 후, 보조제를 첨가하여 반응시킴으로써 융점이 낮아진 공융혼합물을 수득하는 공정; 및, 전기 수득된 공융혼합물에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 20 내지 60℃에서 1 내지 7시간 동안 반응시켜 아스파탐 전구체를 수득하는 공정을 포함한다.

이하, 본 발명의 아스파탐 전구체의 제조방법을 공정별로 나누어 구체적으로 설명하고자 한다.

제 1공정: 공융혼합물의 수득

L-아스파르트산의 유도체와 L-페닐알라닌메틸에스테르를 혼합하고 0 내지 90℃에서 5분 내지 30분 동안 반응시킨 후, 보조제를 첨가하여 반응시킴으로써 융점이 낮아진 공융혼합물을 수득한다: 이때, 공융혼합물을 제조하기 위한 기질을 준비하는 과정에서, 친핵체(nucleophile)로 작용하는 L-PheOMe가 염으로 존재하게 되면 반응물의 pH가 저하되어 효소의 안정성이 감소하게 된다. 그 결과, 아스파탐 전구체의 반응수율이 저하되므로, 자유 염기(free base) 상태의 L-PheOMe를 기질로 준비한다.

L-Asp의 유도체와 L-PheOMe를 혼합하여 반응시킬 때, L-Asp의 유도체의 몰분율을 1로 하였을 경우 L-PheOMe의 몰분율을 0.1∼0.9로 하여 혼합하며, L-Asp의 유도체로는 N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid(N-CBZ-L-Asp), N-acetyl-L-aspartic acid(N-Ac-L-Asp), N-tert-butyloxycarbonyl-L-aspartic acid(N-Boc-L-Asp), 또는 N-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-L-aspartic acid(N-Fmoc-L-Asp)을 사용한다. 이때, L-Asp는 아실 공여자(acyl donor)로서 아실 수용자(acyl acceptor)인 L-PheOMe에 아실 그룹을 제공하게 되는데, 아실 공여자의 N-말단에 붙게 되는 보호기(protecting group)의 구조에 따라서, 아실 공여자의 물리화학적인 성질이변화되어 공융혼합물의 형성에 영향을 주게 된다. 따라서, 바람직하게는 N-CBZ-L-Asp 및 N-Boc-L-Asp를 사용하는데, 이때 아실 공여자의 N-말단에 결합되어 있는 BZ와 Boc는 화학구조상 수소이온이 많기 때문에 소수성을 띄게 되는 바, CBZ와 BOC는 L-Asp의 용해도(solubility)를 증가시켜 공융혼합물의 형성을 원할하게 하고, 효소반응에서 높은 수율을 갖도록 하는 역할을 한다.

또한, 보조제는 공융혼합물의 형성을 용이하게 하고, 공융혼합물의 액상표면(liquid zone)을 증가시켜, 기질과 효소와의 접촉을 원할하게 하여 효소 전구체의 생산수율을 증가시키는 역할을 하는데, 물, 다이메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, 이하 'DMSO'라 함), 2-메톡시에틸아세테이트(2-methoxyethylacetate, 이하 'MEA'라 함), 에틸아세테이트 (ethylacetate, 이하 EtOAc), 클로로포름(chloroform), 및/또는 헥산(hexane)을 두 기질의 반응혼합물 중량의 5 내지 15%(v/w)가 되도록 첨가한다.

본 발명의 공융혼합물의 형성과 효소반응에 있어서, 전기 N-CBA-L-Asp와 L-PheOMe의 공융혼합물은 L-PheOMe의 몰비율이 45%일때 최저융점인 82℃를 나타내게 되는데, 보조제를 첨가하면 융점이 -10℃까지 저하되어 40℃에서 액상으로 존재하게 되므로, 하기에 후술하는 제 2공정의 효소반응을 효율적으로 수행할 수 있다.

제 2공정: 아스파탐 전구체의 수득

전기 수득된 공융혼합물에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 20 내지 60℃에서 1 내지 7시간 동안 반응시켜 아스파탐 전구체를 수득한다: 이때, 단백질 가수분해효소는 알파-키모트립신(α-chymotrypsin), 섭틸리신칼스버그(subtilisin Carlsberg), 써모리신(thermolysin), 파파인(papain), 펑걸프로테아제(fungal protease), 또는 펩신(pepsin)이 사용되며, 첨가되는 양는 공융혼합물의 1 내지 20%(w/w), 바람직하게는 공융혼합물의 10%(w/w)가 되도록 첨가한다. 전기 아스파탐 전구체가 수득되면, 프리플루오로아세트산과 아세토나이트릴을 첨가하여 효소반응을 정지시킬 수 있다.

이상, 본 발명의 아스파탐 전구체(aspartame precursor)를 제조하는 공정을 기술하였으나, 가장 바람직하게는, N-CBZ-L-Asp과 L-PheOMe를 같은 몰비율로 혼합하고 60℃에서 10분간 수욕상에서 반응시킨 다음, 보조제로서 두 기질의 혼합물에 대하여 물 5%(v/w), DMSO 6%(v/w) 및 MEA 6%(v/w)를 혼합하여 첨가하여 공융혼합물을 제조한 후, 제조된 공융혼합물에 10%(w/w)의 써모리신을 첨가하여 40℃에서 3시간 반응시켰을 때, 기질의 농도가 80%(w/w) 이상이며 최고 전환수율은 74%(mol/mol) 이상을 나타내게 된다.

전기 2단계의 공정을 포함하는 본 발명의 아스파탐의 합성방법의 특징은 반응 용액중 기질이 차지하는 비율이 매우 높은 무용매(solvent-free) 효소반응이며, 효소의 특이성으로 인하여 라세미화 문제가 일어나지 않으며, 효소의 위치특이성(regio-selectivity)으로 인하여 기질의 관능기에 대한 최소한의 보호를필요로 하고, 합성시에 다량의 유기용매와 결합제를 필요로 하지 않으므로, 식품첨가용 펩타이드 합성에 널리 이용될 수 있다는데 있다. 아울러, 비교적 낮은 온도에서 반응을 진행시키므로 에너지를 절약할 수 있고, 고정화 효소를 사용하는 경우 반응 후 회수하여 되풀이하여 사용할 수 있는 장점을 가진다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 두가지 기질의 공융혼합물 수득

실시예 1-1: 기질의 수득

암버라이트 IRA-400(Amberlite IRA-400, Sigma Chemical. Co., U.S.A.)를 4℃의 메탄올로 수회 세척한 후, 전기 암버라이트 IRA-400을 4℃ 메탄올 200㎖에 용해된 L-PheOMe·HCl(2g/resin/mmol L-PheOMe·HCl)에 첨가하여 15분간 섞어줌으로써 염소를 제거하여 중화하였다. 이어, 염소의 잔존 여부를 질산은(silver nitrate)과 반응시켜 염화은의 침전물로 확인하고, L-PheOMe를 수득하여 여과한 다음, 용액을 45℃에서 증발시켰다.

실시예 1-2: 써모라이신에 의한 두가지 기질로부터 N-CBZ-L-Asp-L-PheOMe의 합성

아스파탐 전구체를 효율적으로 제조할 수 있는 두 기질의 공융혼합물을 수득하기 위하여, 기질인 N-CBZ-L-Asp와 L-PheOMe를 각각 다른 L-PheOMe의 몰분율 (XPheOMe)로 준비하고 보조제를 첨가한 다음, 온도를 20℃ 내지 200℃에서 분당 10℃씩 증가시키면서 시차주사 열량계(differential scanning calorimeter, DSC)로 각 시료의 융점을 측정하였다. 이때, N-CBZ-L-Asp와 L-PheOMe의 융점은 각각 119℃, 162℃였는데, 두 기질에 보조제를 첨가하여 공융혼합물을 수득했을 때, 융점이 각 기질 본래의 융점보다 훨씬 낮아졌다. 도 1은 보조제의 종류 및 L-PheOMe의 몰분율에 따른 본 발명의 공융혼합물의 융점을 나타내는 그래프이다: 이때, (●)는 보조제를 첨가하지 않았을 때 혼합물의 융점; (▲)는 기질 중량의 5%(v/w)에 해당하는 물을 첨가하였을 때 혼합물의 융점; 및, (■)는 기질 중량의 5%(v/w)에 해당하는 물, 6(v/w)%에 해당하는 DMSO, 6%(v/w)에 해당하는 MEA를 혼합하여 보조제로 첨가했을 때 혼합물의 융점을 나타낸다.

도 1에서 보듯이, 보조제로서 물을 5%(v/w) 첨가했을 때 L-PheOMe의 몰분율(XPheOMe)이 0.45일 때 최저 융점인 32℃를 나타냈으며, 물 5%(v/w)와 DMSO 및 MEA가 각각 6(v/w)% 첨가했을 때 융점은 최저 -10℃까지 낮아졌다. 결과적으로, 각각 다른 융점을 나타내는 두 기질의 혼합물에 보조제가 첨가되면, 기질혼합물의 융점을 낮추어 공융혼합물의 수득이 용이해지며, 공융혼합물의 융점은 첨가되는 보조제의 종류와 농도에 따라 다른 것으로 나타났다.

실시예 2: 써모리신을 이용한 아스파탐 전구체의 합성

아스파탐 전구체를 제조하기 위하여, N-CBZ-L-Asp와 L-PheOMe의 두 기질을 각각 0.5mmol이 되도록 바닥이 둥근 10㎖의 바이얼(vial)에 넣어 혼합하고, 60℃ 수조(water bath)에서 10분간 중탕한 다음, 여기에 보조제로서 기질 중량의 5%(v/w)에 해당하는 물, 6(v/w)%에 각각 해당하는 DMSO 와 MEA를 혼합하여 첨가함으로써 공융혼합물을 수득하였다.

이와 같이 제조한 공융혼합물의 온도를 40℃로 조절한 다음, 써모리신을 기질의 10%(w/w)가 되게 첨가하여 40℃, 160rpm의 진탕수조(shaking water bath)에서 반응시켰다. 8시간 후에 5%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) 0.4㎖와 아세토나이트릴(acetonitrile) 10㎖를 가하여 반응을 멈추게 하고, N-CBZ-L-Asp와 L-PheOMe 및 N-CBZ-L-Asp-L-PheOMe(N-CBZ-aspartame)를 HPLC로 정량분석하였다. HPLC는 μ-본더팩(Bondapack) C18 컬럼(Waters, U.S.A.)을 사용하였고, 이동상으로는 물과 아세토나이트릴을 각각 7.5와 2.5의 비율(v/v)로 혼합하여 1ml/min의 유속으로 용출시켰다. 결과적으로, 보조제로서 기질혼합물 중량의 5%(v/w)에 해당하는 물, 6(v/w)%에 각각 해당하는 DMSO 와 MEA를 혼합하여 첨가하고, 단백질 가수분해효소로 공융혼합물 중량의 10%(w/w)에 해당하는 써모리신을 첨가하여 반응시킬 때, 아스파탐 전구체에 대한 최대 전환수율이 74%(mol/mol)로 높게 나타났으며, 이때 제조된 아스파탐 전구체의 구조는 N-CBZ-L-Asp-L-PheOMe이었다.

실시예 3: 보조제의 종류에 따른 공융혼합물 수득과 펩타이드의 제조

5%(v/w)의 물이 첨가된 기질혼합물에 보조제로 물, DMSO, MEA, EtOAc, 클로로포름, 헥산을 각각 기질 중량의 5% 되게 첨가하여 실시예 1과 같은 방법으로 공융혼합물을 수득하고, 실시예 2와 같은 방법으로 아스파탐 전구체를 제조하였을 때, 아스파탐 전구체인 N-CBZ-L-Asp-L-PheOMe에 대해 친수성(hydrophilic) 유기용매인 DMSO와 MEA를 첨가하였을 때 60% 이상의 높은 전환수율을 나타내었고, 소수성(hydrophobic) 유기용매인 클로로포름(chloroform), 헥산(hexane)을 첨가하였을 때 40% 정도의 낮은 전환수율을 나타내었다. 결과적으로, 보조제를 첨가하였을 때, 공융혼합물의 수득을 통한 아스파탐 전구체의 제조가 용이해짐을 확인할 수 있었고, 특히 보조제로 물, DMSO, MEA를 첨가하였을 때 가장 효과적으로 아스파탐 전구체를 제조할 수 있었다. 하기 표 1에 DMSO 및 MEA의 백분율에 따른 아스파탐 전구체의 수율을 기재하였다.

DMSO 및 MEA의 백분율에 따른 아스파탐 전구체의 수율

수율(%, mol/mol)	DMSO(%, v/w)
수율(%, mol/mol)	3	6	9	12
MEA(%, v/w)	3	58.6	71.4	69.4	62.6
	6	68.4	73.8	70.9	63.3
	9	65.3	71.1	68.2	64.2
	12	52.5	68.3	67.7	59.1

실시예 4: 기질의 종류에 따른 펩타이드의 제조

L-아스파르트산(L-Asp)의 유도체로 N-CBZ-L-Asp 대신에 N-acetyl-L-aspartic acid(N-Ac-L-Asp), N-tert-butyloxycarbonyl-L-aspartic acid(N-Boc-L-Asp), N-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-L-aspartic acid(N-Fmoc-L-Asp)를 첨가하여 실시예 2와 유사한 방법으로 아스파탐 전구체를 제조하였을 때, 35 내지 78%(mol/mol)의 전환수율로 여러 가지 구조의 아스파탐 전구체를 수득할 수 있었다. 이로서, L-아스파르트산(L-Asp)의 유도체로 N-CBZ-L-Asp를 사용했을 때보다는 대체로 낮은 수율이었으나, 상기의 여러 기질로부터 아스파탐 전구체의 제조가 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 효소의 종류에 따른 펩타이드의 제조

보조제로 기질 중량의 5%(v/w)에 해당하는 물, 6%(v/w)에 각각 해당하는 DMSO와 MEA를 혼합하여 첨가하고, 단백질 가수분해효소로 써모리신 외에 α-키모트립신, 섭틸리신칼스버그, 파파인, 펑걸프로테아제, 펩신을 각각 공융혼합물의10%(w/w)가 되도록 첨가하여 아스파탐 전구체를 합성하였을 때, α-키모트립신이 48%, 섭틸리신칼스버그가 50%, 파파인이 22%, 펑걸프로테아제가 59%, 펩신이 41%(mol/mol)의 전환수율을 나타내었는 바, 이는 써모리신을 첨가했을때의 72%보다는 낮은 값이지만, 비교적 높은 전환수율을 나타냄을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 L-아스파르트산(L-Asp)의 유도체와 L-페닐알라닌메틸에스테르(L-PheOMe)에 보조제를 첨가하여 공융혼합물을 수득하는 공정; 및, 전기 수득된 공융혼합물에 단백질 가수분해효소를 처리하고 효소적으로 반응시켜 아스파탐 전구체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 공융혼합물을 수득하는 공정에서 보조제를 첨가하여 융점을 낮추게 되면, 고농도 기질의 균일한 액체상태에서 최적온도의 효소반응이 가능해지므로, 아스파탐 전구체의 생산수율을 증진시킬 수 있다. 아울러, 본 발명에서 제조된 아스파탐 전구체는 효소적 합성법에 의해서 제조되므로 화학적 합성법에 의한 펩타이드 제조시 야기되는 비특이성, 유해성, 고에너지 소비 등의 단점을 극복할 수 있으므로, 본 발명은 환경친화형 청정기술로서 다양한 형태의 식품첨가용 및 생리활성 펩타이드의 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims

L-아스파르트산의 유도체와 L-페닐알라닌메틸에스테르를 혼합하고 0 내지 90℃에서 5분 내지 30분 동안 반응시킨 후, 보조제를 첨가하여 반응시킴으로써 융점이 낮아진 공융혼합물을 수득하는 공정; 및, 전기 수득된 공융혼합물에 단백질 가수분해효소를 첨가하여 20 내지 60℃에서 1 내지 7시간 동안 효소적으로 반응시켜 아스파탐 전구체를 수득하는 공정을 포함하는 아스파탐전구체(aspartame precursor)의 제조방법.
제 1항에 있어서,

L-아스파르트산의 유도체와 L-페닐알라닌메틸에스테르의 몰분율은

1: 0.1∼0.9인 것을 특징으로 하는

아스파탐 전구체의 합성방법.
제 1항에 있어서,

L-아스파르트산(L-Asp)의 유도체는 N-CBZ-L-Asp, N-Ac-L-Asp, N-Boc-L-

Asp 또는 N-Fmoc-L-Asp인 것을 특징으로 하는

아스파탐 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

보조제는 물, 포름아마이드, 다이메틸설폭사이드(DMSO), 2-메톡시에틸

아세테이트(MEA), 클로로포름 및 헥산으로 구성된 그룹으로부터

선택되는 1종 이상을 L-아스파르트산의 유도체와

L-페닐알라닌메틸에스테르의 반응 혼합물의 5 내지 50%(v/w)가 되도록

첨가하는 것을 특징으로 하는

아스파탐 전구체의 제조방법.
제 1항에 있어서,

단백질 가수분해효소는 써모리신, α-키모트립신, 섭틸리신칼스버그,

파파인, 펑걸프로테아제 또는 펩신을 공융혼합물의 5 내지 20%(w/w)가

되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는

아스파탐 전구체의 제조방법.
N-CBZ-L-Asp와 L-PheOMe를 같은 몰비율로 혼합하고 60℃에서 10분간 반응시킨 후, 보조제로서 물 5%(v/w), DMSO 6%(v/w) 및 MEA 6%(v/w)를 혼합하여 첨가함으로써 공융혼합물을 수득하고, 단백질 가수분해효소로서 10%(w/w)의 써모리신을 첨가하여 40℃에서 3시간 동안 반응시켜 아스파탐 전구체를 제조하는 방법.