JPH0239895A - ジペプチドの連続製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ｎ−置換アスパラギン酸とフェニルアラニン
低級アルキルエステルとを反応させてジペプチドを連続
的に製造する方法、詳しくは固定化金属プロテアーゼを
充填したカラムを利用した上記ジペプチドの連続的製造
方法に関する。

従来技術とその問題点 近年、蛋白分解酵素の逆反応を利用して有用ペプチドを
合成しようとする試みが活発になってきている。かかる
蛋白分解酵素を利用する反応では、合成反応と分解反応
とが平衡し、この平衡に関与する化合物を系外に除くこ
とにより平衡を移動させることができ、都合のよいこと
にペプチドの合成反応系（平衡系）においては多くの場
合、合成される縮合物の方が原料とする基質よりも疎水
的で、水に対する溶解度が低く、この事実を利用してペ
プチド合成が行ない得る。また最近、水と２相をなす有
機溶媒を加えて生成物を抽出により糸外に除き、平衡を
合成側に移動させる方法が種々提案されている。

ところで酵素法ペプチド合成において、酵素は繰返し利
用されるのがコスト的に有利であり、この面及び安定性
の面から、該酵素を固定化して利用しようとする研究が
なされてきているが、生成物が沈澱として析出すること
を利用した上記方法では、沈澱生成物と固定化酵素との
分離が困難でおることが実用上大きな障害となっている
。これに対し、系に有＠溶媒を加えて生成物を溶解した
り、抽出したりすると固定化酵素の使用が可能になると
考えられ、この着想から例えばクールらは固定化α−キ
モトリプシンを用いて、水−ジクロロメタン２相系にお
いてジペプチドの合成を行なっている（Ｐ、Ｋｕｈｌ、
　Ａ、Ｋｏｎｎｅｃｋｅ、　Ｇ、Ｄｏｒｉｎｇ、　Ｈ。

Ｄａｕｍｅｒ、　Ｈ，−Ｄ、Ｊａｋｕｂｋｅ、　Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

Ｖｏｌ、２１．ρ、８９３〜８９６’（１９８０））。

更に、Ｎ−置換アスパラキン酸とフェニルアラニン低級
アルキルエステルとからジペプチドを製造する方法にお
いて、両者を水と混和しない有機溶媒中、水分を含有す
る固定化金属プロテアーゼ（サーモライシン等）の存在
下で反応させる方法も提案（待聞昭５５−１３５５９５
）されている。

この方法は、酵素が有機溶媒中で活性が極めて低く且つ
不安定でおるため、固定化酵素の細孔内に水を含ませ、
そこで酵素反応を行なわせるものでおる。これは見かけ
上有機溶媒の単一相系反応であるが固定化酵素内部を水
相と考えると、水の容量が有機溶媒容量よりかなり少な
い水−有機溶媒２相系での反応とも考えられる。

本発明者らも上記水−有機溶媒２相系でのペプチド合成
につき鋭意検討を重ねてきたが、かかる合成反応では一
般に酵素の種類は勿論のこと、原料とする基質相互の関
連、２等基質の保護基の種類、用いる有機溶媒の種類と
その濃度乃至使用量（対水比）等の変化により、合成さ
れるペプチドの収率、反応速度等は大きく左右され、ま
た上記各因子の組み合せに依存して使用酵素の失活乃至
活性低下が甚しく、未だに各因子の最適な組み合せは解
明されておらず、従来提案された方法といえども、たま
たま好結果が得られる場合はおっても、再現性に乏しく
、また連続反応を行なう時にはｒｌｐｉの失活が著しく
、工業的実施のための連続化は実際上不適当でおること
を確認した。

本発明者らは引き続く研究の結果、有機相に対する水相
の容積比を１／１前後とし、Ｎ−置換フ工二ルアラニン
を有機相に、Ｎ−１１換アスパラギン酸を水相に添加溶
解させることにより、酵素の失活が抑制（エマルジョン
調製時及び反応の進行を通じて基質の分配による系内Ｄ
Ｈの変動が好ましい範囲に保持される）され、反応系内
基質濃度の向上、反応速度、反応収率の向上等を計り、
しかも固定化酵素を繰返し使用して、非常に効率よく目
的とする所望のジペプチドを収得できるという新しい事
実を発見し、この知見を基礎とする発明を完成した〔特
公昭６０−３３８４０号参照〕。

更に本発明者らは上記方法の改良法として、上記と同様
の両基質を水と混和しない有機溶媒に溶解した原料液中
に、固定化金属プロテアーゼを懸濁させ、１宛拌下に上
記原料液を反応系内に供給しつつ反応を行なわせ、反応
液を連続的に回収するジペプチドの連続製造法をも確立
した〔特公昭６２−１７１９＠公報参照〕。

本発明者らが開発した上記連続法は工業的実施に適当な
ものではめったが、カラムを利用するものではなく、尚
理想的な連続合成法とはいえず、しかも該方法はこれを
単にカラムを利用する方法に応用したところで、酵素の
失活が著しく、経時的に目的ペプチドの収量が低下し、
工業化は不適なものであった。

問題点を解決するための手段 本発明は、本発明者らによる先の発明に引き続き開発さ
れたものでおり、カラム利用による理想的ジペプチド連
続製造法を提供するものである。

即ち本発明はＮ−置換アスパラギン酸とフェニルアラニ
ン低級アルキルエステルとを反応させてジペプチドを製
造するに当り、水と混和しない有機溶媒中にカルシウム
イオンを含む緩衝液と上記両基質とを溶解させて基質溶
液を調製し、該基質溶液を固定化金属プロテアーゼを充
填したカラムに連続的に供給して温度３０℃以下で反応
を行なわせ、上記反応の間カラムを間歇的に洗浄してチ
ャシネ１ノングを防止することを特徴とするジペプチド
の連続製造法に係る。

本発明方法において一方の基質とするＮ−置換アスパラ
ギン酸におけるＮ−置換基は、ペプチド合成反応に開用
されるアミン基保護基でおり、その例としては代表的に
はベンジルオキシカルボニル基を例示できる。他の代表
的保護基としては例えばｐ−メトキシベンジルオキシカ
ルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等を例示できる
。他方の基質とするフェニルアラニン低級アルキルエス
テルの低級アルキル基も亦憤用されるアミノ酸のカルボ
キシル保護基であり、その具体例としては炭素数１〜４
のアルキル基、特にメチル基を好ましく例示できる。２
等原料基質は通常り体であるが、ＤＬ体であってもよく
、この場合り体のみが反応に関与する。

本発明方法では、まず上記両原料基質をカルシウムイオ
ンを含むＩＩ液と共に、水と混和しない有機溶媒に溶解
して基質溶液を調製する。ここでカルシウムイオンを含
む緩衝液としては、例えば代表的にはＣａＣ９２を含む
ＭＥＳ［（２−シアノモルホリノ）エタンスルホン［−
ＮａＯ＋−１１衝液を例示できる。これは約２０〜５０
ｍＭの範囲のＣａＣＱ２を含有するのがよく、そのｐＨ
は特に限定されないが通常約６前後でおるのが適当でお
る。該緩衝液は水と混和しない有機溶媒中に、一般に飽
和濃度まで、好ましくは約２．５％前後の濃度で溶解さ
れて用いられる。また上記水と混和しない有機溶媒とし
ては、代表的には酢酸エチルを例示できる。

上記基質溶液における両原料基質の使用量、即ち基質溶
液中の各基質濃度は、適宜に決定され、反応速度の面か
らはできるだけ高濃度とするのが好ましいが、通常フェ
ニルアラニン低級アルキルエステルでは約４０〜２００
ｍＭ濃度、好ましくは約１００ｍＭ濃度前後となる範囲
とするのがよく、これと反応させるべきＮ−置換アスパ
ラギン酸では上記フェニルアラニン低級アルキルエステ
ル濃度の約１／３〜１／２倍濃度となる範囲とするのが
適当でおる。

本発明方法では、次いで上記の如くして調製される基質
溶液を、固定化金属プロテアーゼを充填したカラムに供
給して、該カラム内で咳液中の両基質と固定化酵素とを
接触反応させる。ここで用いられる固定化酵素としては
、例えば代表的にはサーモライシン等の金属プロテアー
ゼを常法に従い適当な支持体に固定した各種のものをい
ずれも使用できる。上記支持体としてはメルコーゲル［
Ｈｅｒｃｋｏｇｅｌ　ＳＩ　　１０００人、メルク（）
ｔｅｌ”ｃｋ）社製］、アンバーライトＩＲＣ５０［ロ
ーム　アンド　ハース（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　）ｌａａｓ
　Ｃｏ、）社製］、タウエックスＭＷＡ　［ダウケミカ
ル（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）社製］、ダ
ウエックスＭＳＣ［同上社製］、アンバーライトＸＡＤ
２［ロームアンドハース社製］、アンバーライ１−ＸＡ
Ｄ７［同上社製］、アンバーライトＸＡＤ８　［同上社
製］等の多孔性イオン交換樹脂担体を例示できる。これ
らの内ではアンバーライトＸＡＤ７が最も好ましい。上
記支持体へのサーモライシン等の固定は、当分野でよく
知られている各種方法に従うことができ、特にグルタル
アルデヒド架橋法によるのが好ましい。該グルタルアル
デヒド架橋法におけるグルタルアルデヒド濃度は、従来
一般に採用されている２〜３％に比して約４〜６倍の高
濃度、特に約１２．５％前後とするのがよく、サーモラ
イシン等は例えばＮａＢｒ等の適当な溶液に溶解して支
持体に吸着後固定ざぜるのが好ましい。この方法によれ
ば同酵素を水溶液として支持体に吸着させる場合に比し
溶液濃度を約５０倍高くでき、支持体単位当りの酵素吸
着量を増加でき、通常の方法に比べ活性、安定性の高い
固定化サーモライシンを得ることができる。

かくして調製される固定化サーモライシンは、通常支持
体１Ｃ］（湿潤重量）当り、サーモライシン０．０２〜
０．５Ｑを固定されており、そのＱ当りの力価（合成活
性〉は約０．１５〜３．０単位／湿潤ｑである。尚この
合成活性は、後記実施例１と同一操作により酵素反応さ
せて生成するジペプチド量を高速液体クロマトグラフィ
ーにより測定して求められるものであり、その１単位と
は４０°Ｃ下に１分間に１μモルのジペプチドを生成す
る固定化酵素量（湿潤重量）をいう。

本発明では特に上記固定化サーモライシン等の固定化金
属プロテアーゼを充填したカラム内での基質反応を、温
度３０℃以下、好ましくは約２５℃前後で行なうことを
必須の要件とし、この温度条件の採用及びこの温度下で
のカラム反応に引続くカラムの間歇的洗浄操作の採用に
より、カラム内基質、反応生成物及び固定化酵素、該固
定化酵素内ｐＨが、それぞれカラム内で実質的に均−乃
至一定となり、酵素の失活が確実に防止され、迅速且つ
高収率で目的とするジペプチドを連続的に合成、収得で
きるのである。

上記カラムの間歇的洗浄操作は、前記反応の間にチャン
ネリングが起こらないものとすることを前提として、適
宜実施することができる。この洗浄操作に用いられる洗
浄液としては水、緩衝液例えばＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液
等、水と混和しない有機溶媒例えば酢酸エチル等のいず
れをも利用できるが、基質溶液の調製に利用される例え
ば２０ｍ　Ｍ　　Ｃａ　ＣＱ　２を含む０．０１Ｍ−Ｍ
ＥＳＮａＯＨ緩衝液が好ましく、特に上記緩衝液で飽和
された酢酸エチル等の有機溶媒と該有機溶媒で飽和され
た上記緩衝液との併用が最も好ましい。

また上記洗浄操作は前記連続反応による白濁沈澱物の生
成が認められる以前の適当な時期に行なわれるのが望ま
しく、これは通常連続反応３日位までに少なくとも１回
、好ましくは約１日に１回の間隔で行なわれるのがよい
。洗浄操作はカラムに上記洗浄液を通じることにより実
施でき、その際の温度条件は３０℃以下、好ましくは２
５℃前後とされるのがよく、また通液のための空間速度
（ＳＶ）は約５〜２０／時間程度、通液時間は約１０〜
６０分程度とすることかできる。

本発明の好ましい一実施態様によれば、まず酢酸エチル
中にフェニルアラニンメチルエステルを１００ｍＭ濃度
で、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−アスパラギン酸を
４０ｍＭ１１度で、２０ｍＭＣａＣＧ！２を含む０．０
１Ｍ　　ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６，０＞を２．
５％濃度でそれぞれ溶解させて原料液を調製し、次いで
この原料液を、予め酢酸エチル飽和の０．０１Ｍ　　Ｍ
ＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（２０ｍＭ　　ＣａＣＱ２含有、
ｐＨ６，０＞で平衡化した固定化サーモライシン約５ｇ
を充填したガラスカラムに、約７．５ｍＱ／時間の一定
流量（固定化酵素容積基準のＳＶ：約１．７５／時間）
で供給し、約２５°Ｃの温度で連続反応を行ない、この
反応巾約２４時間毎に１回３０分の割合で、０．０１Ｍ
　　ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（２０ｍＭＣａＣＱ２含有
、ＤＨ６，０＞で飽和された酢酸エチル及び酢酸エチル
で飽和された同緩衝液でそれぞれカラムを洗浄（流速＝
５０ｍＱ／時間、５Ｖ＝１５／時間）シテチャンネリン
グを防止する。

上記により約５００時間以上に亘って常に安定して９５
％を越える高収率で効率よく目的とするジペプチドを得
ることができる。

上記によりカラム出口から流出する反応液は、目的とす
るジペプチド、即ちＮ−置換アスパラギン醒−フェニル
アラニン低級アルキルエステルを有機溶媒溶液として含
有しており、該反応液からの目的ジペプチドの分離は、
例えば上記有機溶媒溶液を分取し、濃縮晶析させるか又
は抽出等の操作を行なうことにより容易に実施できる。

かくしてｊｑられるジペプチドは更に通常の単離精製手
段により精製することができる。

かくして本発明に従い得られるジペプチドは、生理活性
を有するペプチド類の合成反応試薬として、また砂糖の
約２００倍の甘さを持つ合成甘味剤であるＬ−アスパル
チル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（アスパル
テーム）の前駆体として有用でおる。

実　　　施　　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。尚実施例においては、以下の方法により調製した固定
化サーモライシンを用いた。

〈固定化サーモライシンの調製〉 サーモライシン（大和化成株式会社製、力価９４７０Ｐ
ｔＪ／ｍｇ）７．５ＣＩを、５Ｍ−ＮａＢｒ及び１６．
６ｍＭ　　ＣａＣＧ！２を含む１　／４０Ｍトリス塩酸
塩緩衝液（１）Ｈ７，５＞１２０ｍ１２に水冷下に溶解
し、この液に固定化担体であるアンバーライ１〜ＸＡＤ
−７（ローム・アンド・ハース社製）３０ｇ（湿潤重量
）を加え、４℃で１７時間静かに撮盪を行ないながら酵
素を担体に吸着させた。上澄液の残存酵素蛋白遣をビュ
ーレット法で定量した所、初発酵素量の約７０％の酵素
が担体に吸着されていた。

上記上澄液７５鵬を除去した残りの固定酵素懸濁液に２
５％グルタールアルデビド溶液７５回を加え、４°Ｃで
約３時間１辰盪して架橋反応を行なった後、冷却した０
、１Ｍトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７，５，５ｍ　Ｍ　　
Ｃａ　ＣＱ　２含有）約１２及び１Ｍ−ＮａＣＱを含む
同緩漬液約１Ｑで交互に２回洗浄して、固定化サーモラ
イシンを得た。

得られた固定化酵素は４°Ｃで保存した。

実施例　１ モレキュラーシーブ３Ａ１／１０（和光紬薬工業社製）
で脱水された酢酸エチル２００ｍ１２に、２０ｍＭ−Ｃ
ａＣＱ２を含む０．ＯＩＭ−ＹＥＳ［２−シアノモルホ
リノエタンスルホン酸、同仁化学研究所製］−ＮａＯＨ
緩衝液（ｐＨ６，０）５＋ｎＱと、Ｌ−フェニルアラニ
ンメチルエステル（Ｌ−ＰｈｅＯＭｅ　、シグマ社１ｕ
＞３．５８ｑ（１００ｍＭ＞及びＮ−ベンジルオキシカ
ルボニル−し−アスパラギン酸（Ｚ−Ａｓｐ）　２．１
４０（４０ｍＭ＞とを溶解して基質溶液を調製した。

一方、予め固定化酵素（湿重量５ｇ）を酢酸エチル飽和
の２０ｍＭ−ＣａＣＱ２を含む０．０１Ｍ−ＭＥＳ−Ｎ
ａＯｌ−１緩衝液（ｐＨ６，０＞で平衡化し、これをガ
ラスカラム（１１ｍｍ直径×１５０ｍｍ、山善株式会社
〉に充填した。

上記固定化酵素を充填したガラスカラムに、前記基質溶
液を約７．５鴨／時間（固定化酵素容積基準の５Ｖ＝１
．７５／時間〉の一定流法で供給し、２５°Ｃ下に連続
反応を開始した。

上記連続反応中、２３．５時間毎に１回、２０ｍＭ　　
ＣａＣＱ２を含む０．０１Ｍ−ＭＥＳＮａＯＨ緩衝液（
ｐＨ６，０＞で飽和された酢酸エチルで１５分間、次い
で同緩衝液で１５分間それぞれカラムを洗浄する操作（
流速：各５ＱｍＱ／時間、温度＝２５°Ｃ）を行なった
。

上記連続反応中、適当な時間間隔てカラム出口の反応液
をサンプリングし、下記に示す条件で高速液体クロマト
グラフィーを行ない、生成物量を定量した。

〈高速液体クロマトグラフィー〉 試　料二カラム出口でサンプリングした基質溶液を真空
乾燥後、アセトニトリル−水 混合溶媒（７０：３０、リン酸でｐＨ ２，５に調整）に溶解して調製した。

装　置：高速流体クロマトグラフ （島津製作所製　ＬＣ−３Ａ型） カラム；内径４．６ｍｍｘ長ざ１５０ｍｍ充填剤：コス
モシル（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ）　５ＣＩＢ−Ｐ（ＯＤＳ−
シリカゲル） 溶　媒ニアセトニ］〜リルー水（６０：　４０、リン酸
でｐＨを２，５に調整） 検　出二紫外吸収（２５４１ｍ） 溶出溶媒流速：０．８誰／分 結果を第１図に示す。第１図において横軸は連続反応時
間（時間）を、＠ＸＩＮＩは生成物収率（％）を示す。

第１図より明らかな通り、本発明方法によれば５００時
間以上に亘って、９５％以上の収率が維持された。

比較例　１ 実施例１において反応の温度を４０℃とする以外は同様
にして、連続反応を実施した。

カラム出口で反応液をサンプリングし、実施例１と同一
条件で高速液体クロマトグラフィーを行ない、生成物量
を定量した。その結果、目的ジペプチドの収率は、反応
時間の経過と共に低下し、１５０時間後には約８０％に
低下した。

比較例　２ 実施例１においてカラム洗浄操作を実施しない以外は同
様にして、連続反応を行なった。

その結果を第１図と同様にして第２図に示す。

第２図より、反応初期においては約９７％の収率が認め
られたが、８０時間経過後より収率低下の見られること
か判る。また１６０時間後にはカラム内自沈の蓄積によ
るチャンネリングが著しくなり、液の流れが著しく遅延
され、連続反応困難となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１に示す方法における連続反応時間と収
率の関係を示ずグラフであり、第２図は比較例２に示す
方法にあける同グラフでおる。 （以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｎ−置換アスパラギン酸とフェニルアラニン低級
   アルキルエステルとを反応させてジペプチドを製造する
   に当り、水と混和しない有機溶媒中にカルシウムイオン
   を含む緩衝液と上記両基質とを溶解させて基質溶液を調
   製し、該基質溶液を固定化金属プロテアーゼを充填した
   カラムに連続的に供給して温度３０℃以下で反応を行な
   わせ、上記反応の間カラムを間歇的に洗浄してチヤンネ
   リングを防止することを特徴とするジペプチドの連続製
   造法。