JPH0423996A - トリペプチド誘導体の連続製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はトリペプチド誘導体の連続製造法、より詳しく
はＮ−保護されたジペプチドの低級アルキルエステルと
アミノ酸アミドとを基質として、酵素法によりエステル
交換反応させてトリペプチド誘導体を連続的に収得する
改良された方法に関する。

従来の技術 現在、数多くの生物学的に活性なペプチド類が発見され
ており、その内の幾つかはカゼイン等の消化態ペプチド
のアミノ酸配列の一部分からなっている。一般にジペプ
チド類及びトリペプチド類等は遊離アミノ酸とはその吸
収機構が異なるため、より早く腸管の刷毛縁膜（ｂｒｕ
ｓｈ−ｂｏｒｄｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ）により吸収され
ることが知られている［Ｖ、Ｇａｎａｐａｔｈｙ、　Ｇ
、　Ｂｕｒｃｋｈａｒｄｔ　ａｎｄ　Ｆ、　Ｈ，Ｌｅｉ
ｂａｃｈＪ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、　２５９．８９５
４　（１９８４）］　。上記の点でペプチド類は之等を
構成する各遊離アミノ酸よりも優れており、また溶液形
態での浸透圧も低く、之等の性質より経腸栄養剤、医薬
品等の分野で注目されつつある。

上記有用ペプチド類の合成法としては、プロテアーゼに
よる加水分解反応の逆反応を利用する方法（酵素法）が
提案されている［Ｊ、　Ｓ、　Ｆｒｕｔｏｎ。

Ａｄｖ、Ｅｎｚ７ｍｏ１．、　５３．　２３９　（１９
８２）］　ｏ　この酵素法は化学合成法に比べて、常温
常圧で反応が進行すること、アミノ酸の側鎖官能基を必
ずしも保護する必要がないこと、反応が立体選択的に進
行し安価なラセミ体原料を使用できること、反応中ラセ
ミ化が起こらないこと等の幾つかの長所を有するが、反
面、酵素の基質特異性より目的とするペプチド合成に使
用できる酵素の選択が容易でないこと、一般に反応の平
衡は基質側（分解反応）に片寄っており、収率、反応速
度等が低いこと等の不利があり、工業的実施は尚殆どな
されておらず、化学合成法が汎用されている現状にある
。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、酵素法によって有用ペプチド類、殊に
トリペプチド類を安定して効率よく製造する新しい方法
を提供することにある。

本発明者らは上記目的より鋭意研究を重ねた結果、α−
キモトリプシンやパパイン等のプロテアーゼを用いたエ
ステル交換反応によるペプチド合成が、同酵素を用いた
縮合反応によるペプチド合成に比べても非常に反応速度
が早く、しかも反応前に基質のＣ末端保護基の脱離を要
さず、また水と混和しない有機溶媒中でのペプチド合成
が目的物の収率向上に有効であるとの知見を得、これに
基づき更に研究の結果、之等の手段を組み合わせ採用す
ると共に、上記エステル交換反応を固定化酵素を充填し
たカラム中で行ない且つ基質の有機溶媒溶液中の水分含
量を特定範囲に調節する時には、非常に高い酵素活性が
長期に亘って持続され、しかも一方の原料基質としてジ
ペプチド誘導体を用いトリペプチドを製造する際に、該
原料基質の加水分解反応による切断や切断により生じる
アミノ酸が合成反応に関与する等の副反応も実質的に起
こらず、上記所望のエステル交換反応が選択的に進行し
、かくして連続的に目的とするトリペプチド誘導体を高
純度、高収率で容易に効率よく製造できることを見出し
た。本発明はこの新しい知見により完成されたものであ
る。

課題を解決するための手段 即ち、本発明はＮ−保護されたジペプチドの低級アルキ
ルエステル（以下［ジペプチド誘導体ｊということがあ
る）とアミノ酸アミドとから酵素法によるエステル交換
反応によってトリペプチド誘導体を得るに当り、上記両
基質を水分含量を１．５〜２．７容量％の範囲とした有
機溶媒溶液形態で、固定化セリンプロテアーゼを充填し
たカラムに連続的に供給して、上記エステル交換反応を
行なうことを特徴とするトリペプチド誘導体の連続製造
法、並びに固定化金属プロテアーゼを充填したカラムに
、Ｎ−保護されたアミノ酸とアミノ酸の低級アルキルエ
ステルとの有機溶媒溶液を連続的に供給してペプチド合
成反応を行なわせてジペプチド誘導体を得、次いで該誘
導体とアミノ酸アミドとを水分含量を１．５〜２．７容
量％の範囲とした有機溶媒溶液形態で、固定化セリンプ
ロテアーゼを充填したカラムに連続的に供給してエステ
ル交換反応を行なうことを特徴とするトリペプチド誘導
体の連続製造法に係わる。

本明細書においてアミノ酸、ペプチド、保護基等の略号
による表示は当該分野における慣用記号に従うものとす
る。

本発明方法は、上記の通りジペプチド誘導体とアミノ酸
アミドとのエステル交換反応を、固定化酵素を充填した
カラム内で特定の有機溶媒溶液形態で連続的に実施する
点にその最大の特徴がある。

この本発明方法において、一方の基質とするジペプチド
誘導体自体は、公知の方法［例えばＫＮａｋａｎｉｓｈ
ｉ、　Ｔ、Ｋａｍｉｋｕｂｏ　ａｎｄ　Ｒ，Ｍａｔｓｕ
ｎ。

ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、　　３．　４５９　（
１９８５）等参照］に従い製造されたものであってもよ
いが、特に本発明方法は上記ジペプチド誘導体をもカラ
ムを用いた酵素法により連続的に合成し、得られる溶液
をそのまま上記特定のエステル交換反応系に原料として
利用する方法（２段カラム連続法）によるのが好ましい
。

この好ましい２段カラム連続法につき、目的トリペプチ
ド誘導体として２−ＧＩ７ＰｈｅＬｅｕＮＨ２を例にと
りその代表的方法を詳述すれば、本発明方法は以下の反
応（１）及び（２）の組み合わせにより実施される。

ｚ−Ｇｌｙ　　＋　　ＰｈｅＯＭｅ ↓固定化金属プロテアーゼ Ｚ−ＧＩｙＰｂｅＯＭｅ　＋　１（２０（１）Ｚ−ＧＩ
７ＰｂｅＯＭｅ　　＋　　ＬｅｕＮＨ２↓α−キモトリ
プシン Ｚ−ＧＩｙＰｈｅＬｅｕＮ［（２＋　ＭｅＯＦｌ　　　
（２）上記各反応式に示す反応に基質として用いられる
Ｚ−Ｇ１７は、Ｎ−保護されたアミノ酸の代表例であり
、これは他の各種Ｎ−保護アミノ酸、例えばＺ−Ａｌａ
　、　２−Ａ５ｐ等であることができる。また２等アミ
ノ酸のＮ−保護基は上記Ｚ（ベンジルオキシカルボニル
基）以外に、ペプチド合成に慣用される各種のＮ−保護
基、例えばｐ−メトキシベンジルベンジルオキシカルボ
ニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等であることができ
る。

他方の基質としてのＰｈｅＯＭｅもまた、通常の各種ア
ミノ酸、特に疎水性のアミノ酸、例えばＴｒｐＯＭｅ等
の低級アルキルエステルであることができ、２等エステ
ルを構成するＣ−保護基としての低級アルキル基も慣用
されるＣ−保護基、例えばメチル、エチル、プロピル、
ｔｃｒｔ−ブチル基等の炭素数１〜４のアルキル基のい
ずれでもよい。

上記反応式（１）に示す反応により得られるジペプチド
誘導体（ｚ−ＧｌｙＰｈｅＯＭｅ　）とのエステル交換
反応［引き続く反応式（２）に示す］に用いられる基質
であるアミノ酸アミドとしては、上記ＬｅｕＮＨ２の他
、各種アミノ酸のアミド、例えばＶａｌＮＨ２、Ｐｈｅ
Ｎ）１２等をいずれも利用できる。

上記各原料基質は有機溶媒溶液形態に調製され各反応に
供される。ここで用いられる有機溶媒としては、代表的
には酢酸エチルを例示できるが、他の水と混和しない有
機溶媒も同様に利用できる。

上記で調製される有機溶媒溶液中の基質濃度は、適宜決
定でき、反応速度の面からはできるだけ高濃度であるの
が好ましく、通常Ｎ−保護されたアミノ酸（ｚ−Ｇｌｙ
　）では、約１〜２００ｍＭ程度、これと反応させるア
ミノ酸低級アルキルエステル（ＰｈｅＯＭｅ）では、上
記Ｚ−Ｇｌｙの約１〜５倍モル程度、また上記反応によ
り得られるジペプチド誘導体（ｚ−ＧｌｙＰｈｅＯＭｃ
　）では、約１〜５ｍＭ程度、該ジペプチド誘導体と反
応させるアミノ酸アミド（ＬｅｕＮＨ２）では、約２〜
１０倍モル程度の範囲から選択される゛のが適当である
。

本発明方法において固定化セリンプロテアーゼ及び固定
化金属プロテアーゼとしては、代表的にはキモトリプシ
ン等のセリンプロテアーゼ及びサーモライシン等の金属
プロテアーゼを、常法に従い適当な支持体（樹脂担体）
に固定した各種のものをいずれも使用できる。上記適当
な支持体としては市販の各種のもの、例えばアンバーラ
イトＸＡＤ−２、アンバーライトＸＡＤ−７、アンバー
−フィトＸＡＤ−８、アンバーライトＩＲＣ−５０、ア
ンバーライト２００Ｃ［以上ローム　アンドハース（Ｒ
ｏｂｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ　　Ｃｏ、）社製］、ダウニ
ック７、ＭＳＣ−１［ダウケミカル（Ｄｏｔ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏ、）社製コ、メルコゲル５Ｉ−１０００
Ａ ［Ｍｅｒｃｋｏｇｅｌ　Ｓｌ　１０００人、メルク（Ｍ
ｅｒｃｋ）社製］等の多孔性樹脂担体を使用できる。之
等の内ではα−キモトリプシンにはダウエックスＭＳＣ
−１（陽イオン交換樹脂）が、サーモライシンにはアン
バーライトＸＡＤ−７が高収率を奏し得るため好ましい
。上記支持体への酵素の固定は、当分野でよ（知られて
いる各種方法に従い得、例えばゲルタールアルデヒド架
橋法によるのがよい。該方法におけるゲルタールアルデ
ヒド濃度は一般に採用されているそれより高濃度、通常
８〜２０％程度、好ましくは１２．５％前後とするのが
よく、酵素はＮａＢｒ等の適当な溶液に溶解後支持体に
吸着固定させるのがよく、かくして、通常支持体１ｇ（
湿潤重量）当り約２〜５０重量％の酵素が固定され、活
性及び安定性の高い所望の固定化酵素を収得できる。

本発明方法に従うペプチド合成反応（例えば前記式（１
）に示す縮合反応）は、例えば代表的にはＮ−保護アミ
ノ酸とアミノ酸低級アルキルエステルとを、後者に対し
て前者が約１〜５倍モル量程度となるように有機溶媒に
溶解させて原料基質溶液を調製し、これを固定化金属プ
ロテアーゼを充填したカラムに連続的に供給して反応さ
せるこ′とにより実施できる。

ここで反応条件としては、例えば原料液の供給速度的０
．５〜２ｘｌ／時間、滞留時間約５〜２０時間、使用カ
ラム大きさ約１０〜２０Ｘ１００〜３００−、カラム内
固定化酵素充填量約１ｇ（湿潤重量）等とするのが適当
である。反応温度としては約２〜５０重量度を採用でき
、原料液は予めｐＨ５〜７．５程度の適当な緩衝液等で
飽和させて用いられるのがよい。

上記縮合反応により目的とするジペプチド誘導体を有機
溶媒溶液として得ることができ、これはそのまま引き続
くエステル交換反応（例えば前記式（２）に示す反応）
に供することができる。また本発明では上記のごとくし
て得られる反応液より通常の分取操作、濃縮操作、抽出
操作等に従いジペプチド誘導体を分離し、必要に応じて
常法に従い精製後、これを引き続くエステル交換反応の
一方の基質として用いることもできる。更にこのジペプ
チド誘導体は、バッチ法及び連続法を問わず公知の各種
方法に従い得られる各種のものであってもよい。

本発明のエステル交換反応は、例えば代表的には上記ジ
ペプチド誘導体とアミノ酸アミドとを、後者に対して前
者が約２〜１０倍モル量程度となるように有機溶媒に溶
解させて原料基質溶液を調製し、これを固定化セリンプ
ロテアーゼを充填したカラムに連続的に供給して反応さ
せることにより実施できる。但し、上記エステル交換反
応においては、原料液の水分含量（水濃度）が、該反応
に用いる酵素の活性、ひいては反応速度、目的物の収量
（収率）等に重大な影響を与え、該水分含量を１．５〜
２．７容量％の範囲に維持することにより、酵素活性の
低下が起こることなく、長期に亘って高純度、高収率で
目的とするトリペプチド誘導体を収得することができる
。しかるに、該水分含量が上記範囲を外れる場合は、本
発明所期の効果は奏し難くなる。即ち水分含量が１．５
容量％を下回る場合、酵素の周りに活性発現に充分な量
の水分が存在し得ず、反応速度が著しく低下することと
なる。逆に水分含量が２．７容量％を越えて余りに多く
なると、担体水相中でエステル基質の物質移動が律速と
なり反応速度が低下する。

尚、前記縮合反応により得られるジペプチド誘導体の有
機溶媒溶液は、通常上記範囲を越える水分含量を有して
いるため、アミド基質を含む水分含量の少ない有機溶媒
溶液を供給して混合することにより、水分の調製を行な
うのが適当である。また、精製されたジペプチド誘導体
等の水分を含有しないものを一方の基質として用いる場
合、原料基質溶液の調製の際に、該誘導体と他方の基質
（アミノ酸アミド）との有機溶媒溶液に所定量の水を加
えて該液中の水分濃度を上記所定範囲となるように調節
しておく必要がある。

本発明の上記エステル交換反応は、例えば原料液のカラ
ム供給速度約３〜１０ｚＩｌ／時間、カラム内滞留時間
約１５分以上、使用カラム大きさ１０〜２０×１００〜
２００Ｍｎ１カラム内酵素充填量１ｇ等の条件下に実施
されるのが好ましく、反応温度は前記縮合反応と同程度
でよい。

前記本発明の特に好ましい２段カラム連続法の実施に適
した反応装置の一例を第１図に示す。

該図に示す装置の利用によれば、本発明方法は固定化金
属プロテアーゼを充填した第１カラム（図の左側カラム
）内に２−Ｇｌ７とＰｈｅＯＭｅとを含む原料基質の有
機溶媒溶液を連続的に供給して、該カラム内で縮合反応
を行なわせ、次いで得られるジペプチド誘導体（Ｚ−Ｇ
ｌｙＰｈｅＯＭｅ　、図中Ｘ−ＧＦ−Ｍと表示）を含む
有機溶媒溶液を、他方の基質とするＬｅｕＮＨ２と共に
、固定化セリンプロテアーゼを充填した第２カラム（図
の右側カラム）に連続的に供給して、該カラム内でエス
テル交換反応を行なわせ、該反応によって目的トリペプ
チド誘導体（ｚ−ＧＩｙＰｈｅＬｅｕＮ４１２　、図中
２−ＧＦＬ−ＮＯ３と表示）を有機溶媒溶液として上記
第２カラムより連続的に取り出すことができる。

上記酵素法によるエステル交換反応によって、本発明の
目的とするトリペプチド誘導体を有機溶媒溶液形態で収
得できる。該反応液からの目的トリペプチド誘導体の分
離は、常法に従い、反応液を濃縮して晶析させるか又は
適当な有機溶媒を用いた抽出操作等によって実施でき、
得られる化合物は更に通常の単離精製手段により精製す
ることができる。

かくして得られるトリペプチド誘導体は、その有するＣ
−保護基、Ｎ−保護基を常法に従い脱離させることによ
ってトリペプチドとすることができ、これは遊離アミノ
酸よりも腸管吸収性に優れ、溶液形態での浸透圧も低く
、従って経腸栄養剤等の構成成分として、食品分野や医
薬品分野で有用である。

実　　　施　　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。尚、各側において用いた固定化酵素は次の方法により
調製した。

〈固定化酵素の調製〉 サーモライシン［ＥＣ３，４，２４，４，大和化成社製
、力価９４７０ＰＵ／ｍｇ］　７．５ｇを５Ｍ−ＮａＢ
ｒ及び１６．６ｍＭ−ＣａＣＡ７２を含む１／４０Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）１２０ｚＡ’に水冷下に
溶解し、この液に固定化担体であるアンバーライトＸＡ
Ｄ−７（オルガノ社製）３０ｇ　（湿潤重量）を加え、
４℃で１７時間静かに振盪しながら酵素を担体に吸着さ
せた。上澄液の残存酵素蛋白量をビューレット法により
定量した結果、初発酵素量の約７０％が担体に吸着され
た。上記上澄液７５１１を除去した残りの固定化酵素懸
濁液に２５％ゲルタールアルデヒド溶液（半片社製）７
５１１を加え、４℃で約３時間振盪して架橋反応を行な
い、その後冷却した０、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５，５ｍＭ−ＣａＣＡ’２含有）約１１及びＬＭ−Ｎ
ａＣＡ’を含む同緩衝液約１１で交互に２回洗浄して、
固定化サーモライシン（以下ｒＩＭＴＪという）を得た
。該ＩＭＴを４℃で保存した。

また、以下の通り固定化α−キモトリプシン（以下ｒＩ
ＭｃＪという）を調製した。

即ち、予め２４及び４２メツシユで篩分し、エタノール
洗浄及び０．０２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５，
２０ｍＭ−Ｃａ　ＣＩＩ　２含有）で洗浄した樹脂担体
［アンバーライトＸＡＤ−２、同ＸＡＤ−７、同ＸＡＤ
−８、同Ｉ　ＲＣ−５０、同ＩＲ−１２０、同２００　
Ｃ，同２５２（以上オルガノ社製）、ダウエックスＭＳ
Ｃ−１（ダウケミカルズ社製）、及びメルコゲル５Ｉ−
１０００（メルク社製）］のそれぞれ１１．５ｇ湿潤重
量）と、α−キモトリプシン（ＥＣ３，４，２１，１，
３回再結晶したもの、シグマ・社製）３７５■を氷冷し
た０、０２５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５，２０ｍ
Ｍ−ＣａＣ／２含有）７．５ｚｌに溶解させた液とを混
合し、４℃で１７時間静かに振盪しながら酵素を担体に
吸着させた。次いで得られた懸濁液より上澄液の半量を
除去し、残りの固定化酵素懸濁液に２５％ゲルタールア
ルデヒド溶液３．７℃Ｍ／を加え、４℃で約３時間振盪
して架橋反応を行ない、その後冷却したＯ、ＬＭ）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５，５ｍＭ−ＣａＣＩ２及びＩＭ
−ＮａＣ１含有）約ＩＡ’及びＩＭ−ＮａＣＩを含まな
い同緩衝液約１１で順次洗浄して、目的のＩＭＣを得た
。該ＩＭＣは４℃で保存した。

更に、上記ＩＭＣの１．３ｇを０．１Ｍ）リス塩酸緩衝
液（２０ｍ　Ｍ　　Ｃａ　Ｃ１２含有、ｐＨ９）中でイ
ンキュベートし、混合物を濾過し、ドライアイスで凍結
乾燥させて、凍結乾燥ＩＭＣを得た。

その重量はＩＭＣ（湿潤重量）の５９．４％であった。

実施例　１ （１）　　Ｐ　ｈ　ｅ　ＯＭ　ｅ及び−ＬｅｕＮ）１２
の製造まずＰｂｅＯＭｅ・ＲＣ７（国産化学社製）５０
ｍＭを、水（２５ｍＭ　　Ｎａ２ＣＯ３含有）１００ｙ
／に溶解し、この液をクロロホルム１００ｚＡ’と混合
し、次いでＰｂｅＯＭｅを含有するクロロホルム溶液を
除去する操作を２回以上繰返し、クロロホルム溶液的３
００１１を得た。これをＭ　ｇ　Ｓ　０４で乾燥し、減
圧蒸留して油状物としてＰｌ＋ｅＯＭｅを得た。

上記においてＰｈｅＯＭｅ　・ＨＣｆに代えてＬｅｕＮ
Ｆ１２　・ＨＣｊ（半片テスク社製）を用いて同様にし
て白色粉末としてＬｅｕＮＨ２を得た。

（２）　　ｚ−ＧｌｙＰｈｅＯＭｅの製造（バッチ法）
５０　ｍＭ−Ｍ　ｅ　ｓ　　［２−（Ｎ−モルホリノ）
エタンスルホン酸、同仁化学研究所製］　ＮａＯＨ緩衝
液（ｐＨ７，５ｒｒ１Ｍ−ＣａＣ１２含有）を酢酸エチ
ルと４０℃で混合し、このＭｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液をＩ
ＭＴのインキュベートに用い、また酢酸エチルを基質の
溶解用液として用いた。

予め飽和Ｍｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液中にてインキュベート
したＩＭＴの０゜２ｇを、４０ｍＭｚ−Ｇ１７及び８０
　ｍ　Ｍ　　ＰｈｅＯＭｅを含む酢酸エチル４ｚｌと混
合し、混合物を振盪下に４０℃でインキュベートして反
応させた。

経時的に上記反応液０，２ｙ／をサンプリングし、以下
の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）にて生
成物量（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル基及びフェニル
アラニン残基）を定量した。また、ＬｅｕＮＨ２濃度を
ニンヒドリン反応により測定した。

＜ＨＰＬＣ条件〉 装　置：ＨＰＬＣ（島津製作所製ＬＣ−６Ａ型）カラム
：ＯＤＳカラム（４，６Ｘ１５０肛）充填剤：コスモシ
ル５Ｃ１ｇ　　Ｐ　（半片社製）流速：０．８ｙ／１分 溶　媒ニアセトニトリルー水（６：　４ｖ／ｖ　、リン
酸にてｐＨ２，５に調整） 検　出：紫外吸収（２５４ｎｍ） その結果ｚ−ＧＩｙＰｈｅＯＭｅの収率は９７％であっ
た。

（３）　　Ｚ−ＧＩ７ＰｈｅＯＭｅの製造（連続法）こ
の連続法は文献［Ｋ、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、　Ｔ、Ｋａ
ｍｉｋｕｂ。

ａｎｄ　Ｒ，Ｍａｊｓｕｎｏ、　　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏＢ、　　３．　４５９　（１９８５）］に従い次
の通り行なった。連続反応の開始前にＩＭＴを飽和Ｍｅ
ｓ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７）で平衡化させた。連続反
応は４０ｍＭ　　２−Ｇｌｙ及び８０　ｍ　Ｍ　　Ｐｈ
ｅＯＭｅを含む飽和酢酸エチル溶液を、ＩＭ７４．６ｇ
　（湿潤重量）を含むガラスカラム（１１φＸ１５０ｍ
ｍ）に、流速０．７５ｘｌ／ｈｒ（滞留時間１０時間）
で供給し、基質溶液及びカラムを水浴上で２５℃に維持
しつつ行なった。

カラム溶出液（反応液）を経時的にサンプリングしＨＰ
ＬＣで定量した。

得られた結果を第２図に示す。図は横軸に連続反応時間
（ｂｒ）を、縦軸に目的物（２−ＧｌｙＰｂｅＯＭｅ　
。

図中［−ＧＦ−Ｍｌと示す）収率をとり、経時的収率を
求めたものであり、核間より、１２０時間後の目的物収
率は８８％以上であることが判る。

（４）　　ｚ−Ｇ１７ＰｈｅＬｅｕＮＨ２の製造（バッ
チ法）まずＩＭＣをＯ，ＩＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ９
，２０ｍＭ−ＣａＣ１２含有）で平衡化（振盪下、２５
℃、２０分間）させ、濾過して緩衝液を除いた。このＩ
ＭＣの０．１ｇを２０１！容バイアル瓶に入れ、次にモ
レキュラーシーブス３Ａを用イテ脱水した酢酸エチルに
５ｍＭ　　ｚ−ＧｌｙＰｂｅＯＭｅ及び５　Ｑ　ｍＭ　
ＬｅｕＮＨ２を溶解させた液の２ｘｌを上記バイアルに
入れ、混合物を振盪下に２５°Ｃでインキュベートして
反応させた。

経時的に反応物０，２ｘｌをサンプリングし、ＨＰＬＣ
分析を行なった。

また反応時間４０分間での目的物収量の増加により酵素
活性を調べた。

上記反応は３時間以内にほぼ終了し、２４時間以降での
収率増加は認められなかったので、この２４時間後の収
率を平衡収率とした。

目的のｚ−Ｇ１７ＰｈｅＬｕｅＮＨ２の同定は、以下の
精製操作の後のアミノ酸分析及びＩＨ−ＮＭＲ分−析に
より行なった。

上記精製は収率が１００％となった時に反応液を集め、
５％クエン酸溶液、水、５％アンモニア溶液及び水で２
回洗浄し、２−ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＮＨ２を含む酢酸エ
チルをＭ　ｇ　Ｓ　Ｏａで乾燥し減圧蒸留した。

アミノ酸分析結果： Ｇｌｙ　：　Ｐｈｅ　：　Ｌｅｕ　＝１．　０２：１：
０．　９９’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ：ＴＭＳ）δｐｐ
ｍ　：０．８９　（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝５．５Ｈｚ）０．９
２　（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝５．８　Ｈｚ）約１．６　（３Ｈ
，ｍ） ２．９６　（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝１４．０．８．５８ｘ）
３．１６　（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝１４．０．５．８Ｈｚ）
３．６７　（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝１６．８Ｈり３．７７　（
ＩＨ，ｄ、Ｊ＝１６．８８り４．３４　（ＩＨ，ｍ） ４．６０　（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝８．２，５．５　Ｈｚ）
５．０７　（２Ｈ，ｓ） ７．２−７．３　（ＩＯＨ，ｍ） 上記において、ＩＭＣとして種々の樹脂担体に固定した
α−キモトリプシンを用い、反応時間を１時間として得
られた目的物（Ｚ−ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＮＨ２）の収率
を下記第１表に示す。

第　　　１ 表 上記表より、ダウエックスＭＳＣ−１（陽イオン交換樹
脂）の利用が最も高い収率を奏し得ることが判る。尚、
溶液中の約３０％の蛋白質が樹脂に吸着し固定された。

また上記において、反応系のｐＨ（）リス塩酸緩衝液に
よる）、反応温度及びＬｅｕＮＨ２濃度を種々変化させ
て得られた結果（相対酵素活性及び平衡収率）を第３図
に示す。

核間より、試験した範囲（ｐＨ７〜９）において緩衝液
のｐＨは、酵素活性に実質的に影響を与えず（第３図左
欄）、反応温度（２０〜４０℃）もＩＭＣの相対酵素活
性及び平衡収率には依存せず（第３図中欄）、ＬｅｕＮ
８２濃度の上昇に伴い酵素活性は増加するが平衡収率は
この濃度には影響されない（第３図右欄）ことが判る。

之等のことより、基質１−Ｇ　ｌマＰｈｅＱＭｅの樹脂
担体中への拡散抵抗が反応速度に影響を与えることが示
唆される。

（５）　　Ｘ−ＧＩｙＰｈｅＬｅｕＮＨ２製造（バッチ
法）における水濃度の酵素活性への影響 上記反応系における水濃度の酵素活性への影響を調べる
ため、ＩＭＣを入れた反応バイアルに基質の脱水酢酸エ
チル溶液を加えると同時に、０〜１００μｌの水をマイ
クロシリンジを用いて同バイアルに加えて、２−Ｇｌｙ
ＰｈｅＬｅｕＮＨ２の合成のためのバッチ反応を開始し
た。

反応溶液の水濃度の測定は、該溶液０．５ｙ／を予め脱
水溶媒ＭＬ　（三菱化成社製）０，５ｙ／を加えておい
た１０１１容バイアルに注ぎ、該混合液の０．２５ｚＡ
’をマイクロシリンジを用いてカールフィッシャーモイ
スチャーメーター（ＭＫＳ−１ｓ。

京都電子工業株式会社製）の滴定用容器に取り出して行
なった。

ＩＭＣの樹脂中の水濃度の測定は、酵素活性の測定のた
めのサンプリングの４０分後に、乾燥Ｇ−２ガラスフィ
ルター上でＩＭＣを濾過し、次いで全ＩＭＣを１０１！
容バイアルに入れ、脱水溶媒Ｍ　Ｌ　１２１’の添加後
、バイアル中の混合物を２０分間振盪し、全混合物（樹
脂及び溶液）を１０１１駒込ピペツトを用いて滴定用容
器に入れた。

上記滴定にはカールフィッシャー試薬ＳＳ（三菱化成社
製）を用いた。

マイクロシリンジにより水１０μｌを加え、カールフィ
ッシャー試薬ＳＳの標準化をＦ＝１０／Ａ（但しＦは試
薬の力価（μ／　Ｈ２０／ｘ／）及びＡは水１０μｌの
滴定に消費された試薬の容積）として求めた。

上記に従い求められた反応溶液の水濃度（μｌ／ｘｉ、
横軸）と樹脂担体中の水量（μＩ／湿潤湿潤重量縦１縦
軸の平衡関係を第４図に示す。

図において○−○、△−△及びローロはいずれも溶液中
の水濃度と樹脂中の水濃度との関連を示しており、・−
・及びムームは各種水濃度での相対酵素活性を示してい
る。また○及び・はＩＭＣを用いた結果であり、△及び
ムは凍結乾燥ＩＭＣを用いた結果であり、０は酵素を含
まない樹脂担体を用いた結果である。

上記第４表より次のことが判る。酵素を含まない樹脂に
ついての結果もＩＭＣ及び凍結乾燥ＩＭＣについてのそ
れらと同様であった。即ち、このことは樹脂自体の性質
が水濃度の平衡を決定していることを示唆している。ま
た溶液中の水濃度が酢酸エチル中の飽和濃度（３２，４
μＩ！／ｘｉ）を越えると、樹脂中の水濃度は急速に増
加する。

更に水を添加すると合成系バイアル内に水相が出現する
。水濃度は１７〜２０μｌ　／　？Ａ！で最大酵素活性
が得られる。溶液中の水濃度がこの最適濃度を越えると
酵素活性は低下していき、これは樹脂中の水濃度が溶液
中の飽和水濃度を越えると樹脂中の水濃度の突然の増加
を伴って急激に低下する。

このことは以下の通り説明される。即ち水濃度が低い場
合酵素周囲には水が少量しか存在せず酵素は作用し得な
い。水濃度が高い場合反応速度は樹脂中の水相への２−
ＧｌｙＰｈｅＯＭｅの拡散速度により制御される。この
ことは捕り潰したＩＭＣの場合は水濃度が３２．３μｌ
／ｘｉでも反応速度は、ＩＭＣの至適水濃度１７〜２０
μＩＩ／ｚ（ｌにおける反応速度の９７．４％を示すこ
とからも示唆される。これに反して平衡収率は水濃度に
係わらす１００％となり得る。

（６）　　２−ＧＩ７ＰｂｅＬｅｕＮＨ２の連続製造（
連続法）この反応に先立って、ＩＭＣを０．１Ｍ）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ９，０，２０ｍＭ−ＣａＣ／２含有）
で平衡化させた。

５ｍＭ　　２−ＧｌｙＰｈｅＯＭｅ　、　２５ｍＭ　Ｌ
ｅｕＮ［１２及び水１．８％（ｖ／ｖ　）を含む乾燥酢
酸エチルを、ｌＭＣ１，５ｇ　（湿潤重量）を含むガラ
スカラム（１１Ｘ１５０ｍｍ）に、流速４．　　ｌｚ／
／ｈｒ　（滞留時間２８分）で供給した。基質溶液とカ
ラムとを水浴上で２５℃に保持し、カラム溶出物を経時
的にサンプリングし、ＨＰＬＣ分析により目的とする２
−Ｇｌ７ＰｈｅＬｅｕＮＨ２の収率を求め、またカール
フィッシャーモイスチャーメーターにより水分量を、ニ
ンヒドリン法によりＬｅｕＮＨ２濃度をそれぞれ求めた
。

１６０時間後、ＩＭＣを取り出し、樹脂中の水量をモイ
スチャーメーターにより測定し、その後残りのＩＭＣを
０．０２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５，２０ｍＭ
　　ＣａＣ／２含有）でよく洗浄しＩＭＣの残存活性を
、２−Ｇｌ）ＰｈｅＬｅｕＮｔ（２をバッチ法により合
成して調べた。

第５図に２−２−Ｇ１７ＰｈｅＯ及びＬｅｕＮ）１２か
らのｚ−ＧＩｙＰｂｅＬｅｕＮ）（２の収率（〇−〇、
縦軸）及び上記連続系での反応液中の水濃度（△−△、
縦軸）を、反応時間（横軸）に対して求めた結果を示す
。

核間よりｚ−Ｇ１７ＰｈｅＬｅａＮＦＩ２の高収率が１
６０時間維持されていることが判る。

反応の初期段階においてはＩＭＣから水が流出し、反応
液中の水濃度は基質溶液中のそれと同一となる。反応終
了後、ＩＭＣ中の水濃度は１０８μ／／ｇ（ＩＭＣ湿潤
重量）であった。この濃度はほぼ最大酵素活性に相当す
る。

上記結果より、反応系内とＩＭＣ中との水濃度の平衡が
確立され、これがＩＭＣ活性の保持に有効であることが
判る。

尚、０．７５％（ｖ／ｖ　）の水を含む基質溶液を用い
た比較実験においては、２−ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＮ）Ｉ
２の白色結晶がＩＭＣ床に沈殿析出し、流れを停止させ
た。

（７）　　ｚ−Ｇｌｙ、　　Ｐｈｅ−ＯＭｅ及びＬｅｕ
ＮＨ２からの２−ＧＩｙＰｈｅＬｅｕＮｔ１２の連続製
造（連続法）この方法の概略は第１図に示す通りである
。

反応に先立ち、ＩＭＣ及びＩＭＴを上記（６）及び（３
）と同様にして平衡化させた。

４０ｍＭ　　２−Ｇｌｙ及び８０　ｍ　Ｍ　　ＰｂｅＯ
Ｍｅを含む飽和酢酸エチルを、ＩＭＴ　　５゜Ｏｇ（湿
潤重量）を含む第１のガラスカラム（１１Ｘ１５０ｍｍ
）に、流速１．　２ｘｌ／ｈｒ　（滞留時間６．８時間
）で供給した。

２−ＧＩＹＰｈｅＯＭｅの収率が一定となった時点で、
２８、　６ｍＭ　ＬｅｕＮＨ２及び１．６％（ｖ／ｖ　
）水を含む酢酸エチルと上記第１のカラムからの溶出液
とを、ｌＭＣ２，５ｇ　（湿潤重量）を含む第２のガラ
スカラム（１１Ｘ１５０ｍｍ）に供給した。該第２のカ
ラムからの溶出液の流速は８．　　Ｑ　ｙ／　／　ｈ　
ｒであり、ＩＭＣ中の滞留時間は１９分であった。

上記第２のカラムにおける基質溶液中の水濃度は計算上
１．８０〜１．８５％（ｖ／ｖ　）であった。

基質溶液と上記両力ラムとを水浴上で２５℃に保持し、
カラム溶出物を経時的にサンプリングし、）（ＰＬＣ分
析により目的とする　２−ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＮＨ２の
収率、水分量及びＬｅｕＮＨ２濃度をそれぞれ前記（６
）と同様にして求めた。

２２０時間後、ＩＭＣ約０．５ｇを取り出し、樹脂中の
水量をモイスチャーメーターにより測定し、その後０．
０２５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５，２０ｍＭ　　
ＣａＣＡ’２含有）でＩＭＴ及び残りのＩＭＣをよく洗
浄し、ＩＭＴの残存活性を２−ＰｂｅＰｈｅＯＭｃの合
成により調べた。またＩＭＣの残存活性を前記（６）と
同様にして調べた。尚、上記Ｚ−ＰｈｅＰｈｅＯＭｅの
合成は二相系で行なった［ＫＮａｋａｎｉｓｂｉ　　Ｔ
、Ｋａｍｉｋｕｂｏ　ａｎｄ　Ｒ，Ｍａｔｓｕｎｏ　　
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ７．　３．４５９　（１９
８５）参照］。

上記２−Ｇｌｙ、、ＰｈｅＯＭｅ及びＬｅｕＮＨ２から
の１−Ｇｌ！ＰｈｅＬｅｕＮＨ２の連続合成の経緯を、
第５図と同様にして第６図に示す。

上記図に示す通り９日間に亘ってｚ−ＧｌｙＰｈｅＬｅ
ｕＮＩ２のｚ−ＧＩ７ＰｈｅＯＭｅに対する収率は８９
％以上に維持されていた。またｚ−Ｇｌｙに対する収率
は８０％以上であり、反応溶液中の水濃度は１６，１〜
１９．１μｌ／１／の伺にあった。

上記連続合成後、ＩＭＣ中の水濃度は９４μｌ／ｇ　（
ＩＭＣ）であり、これは最大値より若干低かった。また
ＩＭＴの残存活性は９４％であり、ＩＭＣのそれは１０
０％であった。

尚、上記連続反応の最終段階での収率の若干の低下は、
ＩＭＴの何らかの不活性化及びＩＭＣ中の水濃度の低下
に基づくものと考えられるが、この不活性化（サーモラ
イシンからのカルシウムの除去）は基質溶液中にＣａＣ
／２を添加存在させることにより解消され、また水の欠
乏は前記２−ＧＩ７ＰｂｅＬｅｕＮｆ１２の連続合成の
項で述べたように、第２のカラムへの供給に先立って基
質溶液中の水濃度をチエツクすることにより解消し得、
之等によれば収率はほぼ１００％に達すると考えられる
。

か＜シテ得られる目的物ｚ−ＧＩｙＰｈｅＬｅｕＮＨ２
は、酢酸エチル溶液に完全に溶解し、また適当な酸もし
くは塩基性溶液での洗浄により、容易にｚ−Ｇ　Ｉ　！
。

ＰｂｅＯＭｅ及びＬｅｕＮＨ２と分離できる。

以上のように、本発明方法によれば３種のアミノ酸誘導
体から、エステル交換反応及び有機溶媒系を利用して、
室温下に安全に、目的とするトリペプチドを連続的に合
成可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の２段カラム連続法の実施に適した反応
装置の一例を示す概略図である。 第２図は実施例１（３）に従う方法で得られる化合物の
経時的収率をプロットしたグラフである。 第３図は実施例１（４）に従い、反応系のｐＨ，反応温
度及び基質濃度を種々変化させて得られた相対酵素活性
及び平衡収率を示すグラフである。 第４図は実施例１（５）で求めた溶液の水濃度と樹脂担
体中の水量との平衡関係を示すグラフである。 第５図は実施例１（６）に従いｚ−ＧｌｙＰｈｅＯＭｅ
及びＬｅｕＮＨ２から２−ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＮＩ（２
を得る反応の収率及び反応液中の水濃度を反応時間に対
して求めたグラフである。 第６図は実施例１（７）に従い２−Ｇｌｙ、　ＰｈｅＯ
Ｍｅ及びＬｅｕＮＨ２から２−Ｇｌｙ　ＰｈｅＬｅｕＮ
Ｈ２を連続合成した時の反応収率と反応液中の水濃度と
を反応時間に対して求めたグラフである。 （以　上） 第 図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｎ−保護されたジペプチドの低級アルキルエステ
   ルとアミノ酸アミドとから酵素法によるエステル交換反
   応によってトリペプチド誘導体を得るに当り、上記両基
   質を水分含量を１．５〜２．７容量％の範囲とした有機
   溶媒溶液形態で、固定化セリンプロテアーゼを充填した
   カラムに連続的に供給して、上記エステル交換反応を行
   なうことを特徴とするトリペプチド誘導体の連続製造法
   。
2. （２）固定化金属プロテアーゼを充填したカラムに、Ｎ
   −保護されたアミノ酸とアミノ酸の低級アルキルエステ
   ルとの有機溶媒溶液を連続的に供給してペプチド合成反
   応を行なわせてＮ−保護されたジペプチドの低級アルキ
   ルエステルを得、次いで得られるＮ−保護されたジペプ
   チドの低級アルキルエステルとアミノ酸アミドとを水分
   含量を１．５〜２．７容量％の範囲とした有機溶媒溶液
   形態で、固定化セリンプロテアーゼを充填したカラムに
   連続的に供給してエステル交換反応を行なうことを特徴
   とするトリペプチド誘導体の連続製造法。