JPS6033840B2 - ジペプチド類の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＮ−置換フェニルアラニン又はＮ一層襖ァスパ
ラギン酸とフェニルアラニン低級アルキルェステルとを
反応させてジベプチド類を得る改良された方法に関する
。

近年蛋白分解酵素の逆反応を利用して有用べプチドを合
成しようとする試みが活発になってきている。

かかる蛋白分解酵素を利用する反応は、合成反応と分解
反応とが平衡する平衡反応であり、平衡に関与している
化合物を系外に除くことにより平衡を移動させることが
可能である。都合のよいことにべプチドの合成反応系（
平衡系）におＬ・ては、多くの場合合成される縮合物の
ほうが原料とする基質よりも疎水的なので、水に対する
溶解度が低く、多くの酵素法べプチド合成はこの事実を
利用して行なわれている。また最近水と２相をなす有機
溶媒を加えて生成物を抽出により系外に除き、平衡を生
成側に移動させて反応を行なう方法が種々提案されてい
る。ところで酵素法べプチド合成において、酵素はくり
返し再使用しなければコスト上問題があり、また安定性
の面からも酵素を固定化し工業化を可能にしようとする
研究がなされて釆た。

しかしながら生成物が沈殿として析出することを利用し
た上記方法では、沈殿生成物と固定イＱ酵素との分離が
困難なため実用上大きな障害となる。これに対し、系に
有機溶媒を加えて生成物を溶解したり、抽出したりする
と固定イＱ酵素の使用が可能になると考えられ、この着
想からたとえばクール等は固定化Ｑ−キモトリプシンを
用いて、水とジクロロメタンとの２相系においてジベプ
チドの合成を行っている び．Ｋ血１，ＡＫｏｎｎｅｃ
ｋｅ，Ｄ．Ｄｏｒｉｎｇ，日．Ｄａｍｍｅｒ，日．一
Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎｕｔｔ
ｅ岱，Ｖｏｌ．２１，ｐｐ８９３〜８９６（１９８０）
〕。更に、Ｎ−置換アスパラギン酸とフェニルアラニン
低級ァルキルェステルとからジベプチド類を製造する方
法において、両者を水と混和しない有機溶媒中、水分を
含有する固定化金属プロティナーゼ（サーモラィシン等
）の存在下で反応させる方法も提案されている（特関昭
５５一１３５５９５）。この方法は、酵素が有機溶媒中
で活性が極めて低く、かつ不安定であるため、園定イ技
酵素の細孔内に水を含ませ、そこで酵素反応を行なわせ
るものである。これは見かけ上有機溶媒の単一相系反応
であるが固定化酵素内部を水相と考えると、水の容量が
有機溶媒容量よりかなり少ない水−有機溶媒２相系での
反応とも考えられる。本発明者らも上記水−有機溶媒２
相系でのべプチド合成につき鋭意検討を重ねてきたが、
かかる合成反応では一般に酵素の種類は勿論のこと、原
料とする基質相互の関連、之等基質の保護基の種類、用
いる有機溶媒の種類とその濃度乃至使用量（対水比）等
の変化により、合成されるべプチドの収率、反応速度等
は大きく左右され、また上記各因子の組み合せに依存し
て使用酵素の失活乃至活性低下が甚しく、未だ上記各因
子の最適な組み合せは解明されておらず、従来提案され
た方法といえども、たまたま好結果が得られる場合はあ
っても、再現性に乏しく、工業的実施には不適当である
ことを確認した。

本発明者らは従って特に基質としてＮ一層襖フェニルア
ラニン又はＮ−置換アスパラギン酸とフェニルアラニン
低級アルキルェステルとを選択し、之等をサーモライシ
ンによりべプチド合成させる系につき、更に引き続き検
討を重ねた。その過程でＮーベンジルオキシカルボニル
ーＬーフエニルアラニンとＬーフエニルアラニンメチル
ェステル塩酸塩とを基質とし、之等両基質を有機相例え
ば酢酸エチル溶液に溶かし、これを予めトリス塩酸塩緩
衝撃でｐＨ７．５に調整した水中に分散させて有機相に
対する水相の容積比を１／５とした所、上記各基質の各
相への分配によって水相のＰＨが速やかに低下し、サー
モライシンの安定化ｐＨの下限とされる約５．５をも下
回り、かかる水−有機溶媒２相系では、サーモライシン
の著しい失活が起ることを確めた。即ち従来公知の固定
イ携酵素の級孔内に水を含ませて利用する方法（椿関昭
５５一１３５５９５号）では、固定化酵素内部のｐ川ま
、実際には測定できないが、当然に上記と同様にかなり
低下する可能性があり、これにより酵素の失活が著しく
、固定イは酵素利用による本釆の目的である反応の連続
化は困難であると考えられた。本発明者らは引き続く研
究の結果、上記酵素の失活の程度と共に、ジベプチド合
成の反応速度、反応収率等が、各基質を有機相と水相と
のいずれに添加溶解させるかに依存して、また調製され
るェマルジョンの有機相と水相との容積比に依存して、
特に有機相に対する水相の容積比を１／１前後とするこ
とにより、またＮ−置換フェニルアラニンを有機相に、
Ｎ−置換アスパラギン酸を水相に添加溶解させることに
より、酵素の失活が抑制（ェマルジョン調製時及び反応
の進行を通じて基質の分配による系内ｐＨの変動が好ま
ししい範囲に保持される）され、反応系内基質濃度の向
上、これによる反応速度、反応収率の向上を計り得、し
かも固定化酵素を繰返し使用して、非常に効率よく目的
とする所望のジベプチドを収得できるという新しい事実
を発見した。本発明は上記知見を基礎として完成された
ものである。即ち本発明は、Ｎ−置換フェニルアラニン
又はＮ−置換ァスバラギン酸とフェニルァラニン低級ア
ルキルヱステルとを反応させてジベプチド類を製造する
に当り、‘ａーＮ一層襖フェニルアラニンを水と混和し
ない有機溶媒に添加した液を、フェニルアラニン低級ア
ルキルェステルを含有する水中に分散させるか又は｛ｂ
’Ｎ−置換アスパラギン酸とフェニルアラニン低級アル
キルェステルとを添加した水中に、水と混和しない有機
溶媒を分散させて得られ、水相と有機相との容積比が約
１：１である水中油型ェマルジョンを固定化サ−モラィ
シンと接触させることを特徴とするジベプチド類の製造
方法に係る。

本発明方法において一方の基質とするＮ−置換フェニル
アラニン又はＮ−置換アスパラギン酸におけるＮ−置換
基は、ベプチド合成反応に慣用されるアミノ基保護基で
あり、その例としては代表的にはペンジルオキシカルボ
ニル基を例示できる。他の代表的保護基としては例えば
ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキ
シカルボニル基等を例示できる。他方の基質とするフェ
ニルアラニン低級ァルキルェステルの低級アルキル基も
亦慣用されるアミノ酸のカルボキシル保護基であり、そ
の具体例としては炭素数１〜４のアルキル基、特にメチ
ル基を好ましく例示できる。之等原料基質は通常Ｌ体で
あるが、ＤＬ体であってもよく、この場合Ｌ体のみが反
応に関与する。また本発明において有機相の媒体として
利用する水と混和しない有機溶媒としては、具体的には
酢酸エチルを挙げることができる。水相の媒体は通常水
であるが、これは好ましくは例えばトリス塩酸緩衝液等
の適当な緩衝液とするのがよい。本発明の好ましい一実
施態様によれば、Ｎ−置換フヱニルァラニンを添加溶解
した有機相をフェニルアラニン低級アルキルェステルを
添加溶解した水相に分散させて、水相と有機相との容積
比が約１：１である水中油型ェマルジョンを調製する。
他の好ましい実施態様によれば、基質を添加せず有機溶
媒のみから成る有機相を、Ｎ−魔襖ァスパラギン酸及び
フェニルアラニン低級アルキルェステルを添加溶解した
水相に分散させて水相と有機相との容積比が約１：１で
ある水中油型ェマルジョンとする。上記し、ずれの場合
にも各基質の使用量は、できるだけ高濃度となる童、通
常各媒体の飽和溶液付近、好ましくは４０〜４０仇ｈＭ
濃度となる量とされるのがよい。

尚各基質は溶液状態であることを原則とするが、飽和量
を越えて用いる場合でも、反応により次第に消費され、
これに伴って溶解が進行するため、分散液状態でも利用
できる場合がある。上記により得られる各水中油型ェマ
ルジョン中においては、各基質は一定の濃度比で各相中
に分配され、水相は酢酸ェステル飽和液となり、また有
機相も水もしくはトリス塩酸緩衝液飽和液となる。

本発明はこのように反応に関与する各基質を水相と有機
相とのいずれかに添加すると共に、上記有機相容積に対
し水相の容積を上記所定の割合として、水中油型ェマル
ジョンを調整する時には、該ェマルジョン中において各
基質は水相と有機相とに一定の割合で分配され、これら
は酵素反応の経過に伴い次第に濃度低下が起るに拘らず
、反応系ｐＨを所望の値に維持し、酵素の失活を確実に
防止して、迅速に且つ高収率で目的とするジベプチドが
収得されることを見し、出し完成されている。しかるに
上記各基質の添加方法を本発明以外の組み合せとする時
や水相と有機相との容積比を上記割合以外のものとする
時には、いずれも各相間の分配平衡が乱れ反応系ｐＨが
反応の進行に伴い低下し、このｐＨ低下により酵素反応
が阻害されたり、酵素活性が低下し、良好な結果は得ら
れない。特に酵素活性の低下は、該酵素の繰返し利用を
困鱗とするものであり、固定イＱ酵素利用により本来の
目的であるべプチド合成の連続化、工業化を不可能とす
るものである。本発明方法では、上記の如くして調整さ
れる所定の水中油型ェマルジョンを固定化サーモラィシ
ンと接触させ、これにより各基質の酵素による縮合反応
を行なわせる。

ここで用いられる固定化サーモラィシンは、サーモライ
シンを常法に従い適当な支持体に固定した各種のものを
いずれも使用できる。上記適当な支持体としては例えば
メルコーゲル（ＭｅｒｃｋｏｇｅＩＳＩ１００ＯＡ メ
ルク（ＥＭｅｒｃｋ）社製）、アンバーライト ＩＲＣ
５０（ローム ァンド ハース（Ｒｃｈｍａｎｄ也ａｓ
Ｃｏ．）社製）、ダウェツクス ＮＷＡ（ダウケミカル
（ＤｂｗＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）社製）、ダウェツク
スＭＳＣ（同上社製）、アンバーライト ＸＡＤ２（ロ
ーム アンド ハース社製）、アンバーライト ＸＡＤ
７（同上社製）、アンバーライト ＸＡＤ８（同上社
製）等の多孔性イオン交換樹脂坦体を例示できる。これ
らのうちではアンバーライト ＸＡＤ ７が最も好まし
い。上記支持体へのサーモラィシンの固定は、通常当分
野でよく知られている各種方法に従い行なうことができ
るが．特にグルタルアルデヒド架橋法によるのが好まし
い。この場合サーモライシンをエチレングリコール溶液
に溶解して支持体に吸着後固定させるのが好ましく、こ
の方法によれば同酵素を水溶液として支持体に吸着させ
る場合に比し溶液濃度を約３ぴ音高くでき、支持体単位
当りの酵素吸着量を増加できる利点がある。かくして調
整される固定化サーモラィシンは、通常支持体１夕（湿
潤重量）当り、サーモラィシン０．０２〜０．１夕を固
定されており、その夕当りの力価（合成活性）は約０．
５〜１．８単位／湿潤夕である。

尚この合成活性は、後記実施例１と同一操作により酵素
反応させて生成するジベプチド量を高速液体クロマトグ
ラフィーにより測定することにより求められるものであ
り、その１単位とは４０ｑｏ下、初期水相側ｐＨ７．５
の条件下に１分間に１一モルのジベプチドを生成する固
定イＱ酵素量（湿潤重量）を言う。本発明による上記固
定化サーモラィシンとェマルジョンとの接触は、ェマル
ジョン中に固定イＱ酵素を添加し縄拝する方法もしくは
固定イは酵素、水相を構成すべき水溶液及び有機相を構
成すべき有機溶媒溶液を同時に適当な容器に加え蝿拝す
る方法等のいずれによっても行なうことができる。

また反応を連続化させる際には上記固定イ技酵素を適当
なカラムに充填し、それに上記ェマルジョンを流すか、
該ェマルジョンを構成すべき水相及び有機相成分を順次
流すことによっても行なうことができる。上記接触時の
温度、、ｐＨ条件等は、用いる酵素の至造作用条件、通
常ｐＨ約６〜８、温度２０〜４０ｑｏとされるのがよい
。また縄拝はゆるやかな条件で縄拝するか、或は振遼し
ながら行なうのが望ましく、これは反応時間中連続する
必要はなく、断続的に行なうこともできる。上記本発明
方法において上詫間定化サーモライシンの使用量は特に
制限されず、支持体に固定化された酵素の量、その活性
等に応じて適宜決定され、これが多いと反応時間が短縮
され、また少ないとそれだけ反応時間が長くなる。

通常固定化サーモラィシン濃度は０．２〜１夕湿潤／泌
とされる。この酵素の使用により通常約３〜１母音間で
反応は完結する。上記反応により得られるジベプチドは
、有機相に溶解しており反応終了後、該有機相を分取し
、濃縮晶析させるか又は抽出等の操作を行なうことによ
り容易に分離することができ、これは更に通常の単離精
製手段により精製することもできる。

また残りの固定化サーモライシンを含む水相には、新た
に有機溶媒、基質等を本発明方法に従い添加することに
より、繰返し使用することができる。かくして本発明方
法によれば、Ｎ一層襖フェニルアラニンとフェニルアラ
ニン低級アルキルェステルとの反応によりＮ−置換フェ
ニルアラニル−フヱニルアラニン低級アルキルヱステル
を、またＮ−贋換アスパラギン酸とフェニルァラニン低
級ァルキルェステルとの反応によりＮ一層襖ァスパルチ
ルーフェニルアラニン低級アルキルェステルを夫々効率
よく収得でき、之等は生理活性を有する種々のべプチド
の合成反応試薬として、また特に後者は砂糖の約２０び
音の甘さを持つ合成甘味剤であるＬ−アスパルチルーＬ
ーフエニルアラニンメチルェステルの前駆体として有用
なものである。

以下本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。

尚実施例においては、以下の方法により調製した固定化
サ−モラィシンを用いた。＜固定化サーモラィシンの調
製＞ １．２〜２．４夕のサーモラィシン（大和化成株式会社
製、力価９４７肥Ｕ／の９）を４０％エチレンダラィコ
ール８０奴を含む０．０９Ｍトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ
７．ふ １６．８ｈＭＣａ２十を含む）１２０肌に溶解
し、この液に固定化担体であるアンバーライト ＸＡＤ
−２（ローム・アンド・ハース社製）２５夕（湿潤重量
）を加え、４℃で１拍時間静かに振濠を行ないながら酵
素を担体に吸着させた。

振濠終了後、上澄み液２０私を除去し、酵素蛋白量をビ
ューレット法で定量した所、約６５％の酵素量が担体に
吸着されていた。

更に上記で得た固定酵素懸濁液に２５％グルタールアル
デヒド溶液５０の‘を加え、４℃で約３時間振麹を行な
い、その後冷却した０．１Ｍトリス塩酸塩緩衝液（ＰＨ
７．５、郎ＭＣａ２十を含む）約１そで洗浄して、固定
化サーモラィシンを得た。

実施例 １ 等容積の０．２９Ｍトリス塩酸塩緩衝液（８ｈＭＣａ２
十を含む）と、酢酸エチルとを分液漏斗を用いて平衡化
（４０ｏｏ）させ、酢酸エチルで飽和されたトリス塩酸
塩緩衝液と、同緩衝液で飽和された酢酸エチル溶液とを
調製した。

上記で得た酢酸エチル飽和のトリス塩酸塩緩衝液１２羽
に、Ｌーフェニルアラニンメチルェステル塩酸塩０．２
０６４夕（０．９６ミリモル）を加えて溶解し、鮒塩酸
でＰＨを７．５（４０ｑ０）に調整して水相側基質溶液
を調製した。

一方、上記で得たトリス塩酸塩飽和の酢酸エチル溶液１
２泌に、Ｎ−ペンジルオキシカルボニル−Ｌーフヱニル
アラニン０．２８７４夕（０．９６ミリモル）を溶解し
て、有機相側基質溶液を調製した。

次いで予め酢酸エチルで飽和した０．２９Ｍトリス塩酸
塩緩衝液（ｐＨ７．ふ ５ｈＭＣａ２十を含む）で平衡
化した固定化酵素０．３夕、１タ又は２夕（いずれも湿
潤重量）を、夫々バィャル瓶に秤取し、これに上記で調
製した水相側基質溶液４叫及び有機相側基質溶液４の‘
を加え、４０００で振縄を行ない、ェマルジョン状態で
反応を行なわせた。反応中経時的に振函を中断し、バィ
ャル瓶をいまら〈静直して有機相と水相とを二相に分け
、有機相側溶液１００ムーをサンプリングして、生成物
量の測定を行なった。生成物量は、上記サンプリング液
を蒸発乾固後、残溝をアセトニトリルー水温合溶液（７
０：３０ｐＨ２．５）に溶解し、以下の条件下高速液体
クロマトグラフ法により定量した。

装 置：高速流体クロマトグラフ （島津製作所製 ＬＣ−３Ａ型） カラム：内径１仇奴×長さ３０仇舷 充填剤：ＴＳＫ−ＧＥＬＬＳ−４１帆 （ＯＤＳーシリカ 東洋曹達社製） 溶 媒：アセトニトリル−水（６０：４０リン酸でｐＨ
を２．５に調整）検 出：紫外吸収（２５４ｎｍ） 結果を第１図に示す。

第１図において機軸は反応時間（時間）を、縦軸は生成
物収率（％）を示す。また図において｛１｝は固定化酵
素０．３タ使用の場合、‘２）は同１タ使用の場合及び
｛３｝‘ま２タ使用の場合を夫々示す。第１図より、上
記本発明方法によれば、Ｎ−ペンジルオキシカルボニル
一Ｌ−フエニルアラニルーＬ−フヱニルアラニンメチル
ェステルを、比較的短時間に高収率で収得できることが
判る。

比較例 １実施例１と同様にして調製したトリス塩酸塩
飽和酢酸エチル溶液８の‘にＬーフェニルアラニンメチ
ルェステル塩酸塩０．１３７６夕（０．６４ミリモル）
と、Ｎ−ペンジルオキシカルボニル一Ｌーフエニルアラ
ニン０．１９１６夕（０．６４ミリモル）とを溶解して
有機相側基質溶液を調製した。

次いで予め酢酸エチル飽和のトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ
７．５又は８．５に調整、８ｈＭＣａ２十を含む）で平
衡化した固定イは酵素をグラスフィルターを通して吸引
炉過して付着液を除去後、その夫々１夕（湿潤重量）を
バィャル瓶に秤取し、これに上記有機相側基質溶液４の
‘を加えて反応を開始し（４０℃）、以後実施例１と同
様にしたサンプリング及び生成物収量を定量した。

結果を第２図に示す。

第２図において機軸及び縦軸は第１図と同じであり、図
中１は初期ｐＨ８．５の場合及び２は同ｐＨ７．５の場
合を夫々示す。実施例 ２実施例１と同様にして、４０
℃下に酢酸エチルで飽和された０．０９Ｍトリス塩酸塩
緩衝液（跡ＭＣａ２十を含む）及び同緩衝液で飽和され
た酢酸エチル溶液を調製した。

上記酢酸エチル飽和のトリス塩酸塩緩衝液４の‘にＬー
フェニルアラニンメチルェステル塩酸塩０．０６８８夕
（０．３２ミリモル）と、Ｎ−ペンジルオキシカルボニ
ル−Ｌーアスパラギン酸０．雌５５夕（０．３２ミリモ
ル）とを溶解させ、更に磯塩酸でｐＨを６．５に調整し
て水相側基質溶液を調製した。

０ 次に上記水相側基質溶液に、予め酢酸エチル飽和０
．０９Ｍトリス塩酸塩緩衝液（靴ＭＣａ２十を含む）で
平衡化された固定イ協酵素１夕と、トリス塩酸塩緩飽和
の酢酸エチル溶液４の‘とを加え振濠下ェマルジョン状
態で反応を開始（４０二○）し、以後実施例１と同様に
してサンプリングし、生成物（Ｎ−ペンジルオキシカル
ボニル−ＬーアスパラチルーＬーフエニルアラニンメチ
ルエステル）を定量した。

結果を第３図に示す。

第３図において機軸及び縦軸は第１図と同じである。比
較例 ２ 実施例２と同様にして得たトリス塩酸塩飽和の酢酸エチ
ル溶液４の‘に、Ｌーフェニルアラニンメチルェステル
塩酸塩０．０皮※夕（０．３２ミリモル）と、Ｎーベン
ジルオキシカルボニルーＬーアスパラギン酸０．０８５
５夕（０．３２ミリモル）とを溶解して有機相側基質溶
液を得た。

次に、予め酢酸エチル飽和のトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ
８．５、丘ｈＭＣａ２十を含む）で平衡化した固定イ技
酵素をグラスフィルターを通して吸引炉過して付着液を
除去後、その１夕（湿潤重量）をバィャル瓶に秤取し、
これに、上記有機相側基質溶液４Ｍを加えて振溢し、反
応を開始した（４０ｏｏ）。

サンプリング及び生成物の定量を実施例１と同様な方法
で行なった結果を第４に示す。実施例 ３ この例では実施例２と同様の反応に用いた固定化酵素を
繰返し利用して同様の反応を行なった。

即ち実施例２と同様にして酢酸エチル飽和トリス塩酸塩
緩衝液８の‘にＬ−フェニルアラニンメチルェステル塩
酸塩０．１３７６夕（０．６４ミリモル）と、Ｎーベン
ジルオキシカルボニルーＬ−アス／ぐラギン酸０．１７
１夕（０．６４ミリモル）とを溶解させ、更に鮒塩酸で
ＰＨを６．５に調整して水相側基質溶液を調整した。次
にこの溶液に、予め酢酸エチル飽和の０．０８Ｍトリス
塩酸塩緩衝液（９ｎＭＣａ２十を含む）で平衡化された
固定イ捉酵素２夕とトリス塩酸塩飽和の酢酸エチル溶液
８ｗ‘とを加え、縄梓下ェマルジョン状態で反応を開始
した（４ぴ０）。

尚反応は礎梓器及びガラスフィルターの付いたガラス容
器中で行なった。反応開始後５時間の生成物（ベンジル
オキシカルボニルーＬーアスバラチル−Ｌ−フエニルア
ラニンメチルェステル）の収率は約２７％であった。

その後反応容器に付したガラスフィルターにより外液を
除去し、新たに上記と同機にして調製した水相側基質溶
液８の【及びトリス塩酸塩飽和の酢酸エチル溶液８泌を
加え、再度反応を行なった。上記の如くして６回線返し
て夫々５時間づつ反応を行なった。最終反応（第６回目
）における生成物の収率は２４．４％であり、第１回反
応における収率の約９０％を保持していた。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第４図は夫々本発明方法（実施例１及び２）
及び比較方法における経時的ジベプチド収率を示すグラ
フである。 第１図 第２図 第３図 第４図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｎ−置換フエニルアラニン又はＮ−置換アスパラギ
   ン酸とフエニルアラニン低級アルキルエステルとを反応
   させてジペプチド類を製造するに当り、（ａ）Ｎ−置換
   フエニルアラニンを水と混和しない有機溶媒に添加した
   液を、フエニルアラニン低級アルキルエステルを含有す
   る水中に分散させるか又は（ｂ）Ｎ−置換アスパラギン
   酸とフエニルアラニン低級アルキルエステルとを添加し
   た水中に、水と混和しない有機溶媒を分散させて得られ
   、水相と有機相との容積比が約１：１である水中油型エ
   マルジヨンを固定化サーモライシンと接触させることを
   特徴とするジペプチド類の製造法。